本發(fā)明屬于藥物化學領域，具體涉及到權利要求中所述的一種亞乙基聯(lián)結的哌啶基噁二唑與吲哚-2-甲酰胺類化合物及其生理上可接受的鹽，它們的制備及它們在預防和/或治療疼痛、炎癥、炎性腸病、青光眼、糖尿病、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、動脈粥樣硬化、老年性黃斑退化癥、急性肝衰竭、肝纖維化、肺纖維化、腎纖維化、系統(tǒng)性纖維化、缺血-再灌注損傷、急性同種異體移植排斥、慢性同種異體移植腎病、糖尿病腎病、腎小球腎病、心肌病、心力衰竭、心肌缺血、心肌梗死、系統(tǒng)性硬化、熱損傷、燒傷、肥大性疤痕、齦炎發(fā)熱、肝硬化或腫瘤、骨質(zhì)疏松、神經(jīng)變性、卒中等大麻素受體2(CB2)激動劑相關疾病中的用途。

技術背景

大麻素(cannabinoid，CB)是大麻中起治療作用和精神作用的化學物質(zhì)，1964年，Gaoni等首次對植物大麻的主要活性成分四氫大麻酸，進行了分離及立體結構的確證(Gaoni,Y.et.al,J.Am.Chem.Soc,1964,86,1646)。隨后研究者們又分離和合成得到一系列大麻素類化合物(Felder,C.C.et.al,Mol.Interv,2006,6,149)。傳統(tǒng)的大麻素類化合物主要包括五類：1、以四氫大麻酸為代表的經(jīng)典大麻素類化合物,該類化合物是從天然植物中提取的大麻素類物質(zhì)及其類似物，三環(huán)母核為其共同結構特征；2、以AEA和2-AG為代表的內(nèi)源性大麻素；3、以CP55940為代表的非經(jīng)典大麻素類化合物，該類化合物為經(jīng)典大麻素的開環(huán)衍生物；4、以WIN55212-2為代表的氨烷基吲哚類化合物；5、以SR141716A為代表的二芳基吡唑類化合物(Howlett,A.C.et.al,Pharmacol.Rev,2002,54,161)。

同時，人們對大麻素類化合物的作用機制也進行了廣泛的研究。大麻素類物質(zhì)作用于大麻素受體(cannabinoid receptor，CB-R)以實現(xiàn)其生理活性，目前研究證明，大麻素受體包括兩個亞型：大麻素受體1(cannabinoid receptor 1,CB1受體)和大麻素受體2(cannabinoid receptor 2，CB2)。1990年，Matsuda等在大鼠大腦皮質(zhì)cDNA文庫中成功克隆出CB1受體(Matsuda,L.A.et.al,Nature,1990,346,561)；CB2受體則于1993年由Munro等在人類的早幼粒細胞白血病細胞HL60CDNA文庫中成功克隆(Munro,S.et.al,Nature,1993,365,61)。CB1受體和CB2受體同屬G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptor,GPCR)的視紫紅質(zhì)樣家族,具有典型的7段a-螺旋跨膜結構，兩種受體完整的氨基酸序列有44％的同源性，在相對保守的跨膜區(qū)兩者的氨基酸序列有68％的同源性(Pacher,P.et.al,Pharmacol.Rev,2006,58,389)。其中，CB2主要在免疫系統(tǒng)的細胞，如巨噬細胞和T-細胞和胃腸系統(tǒng)外周表達，CB2受體還廣泛分布在腦中，其中它主要發(fā)現(xiàn)于小膠質(zhì)細胞而非神經(jīng)元上。

CB2受體激動劑相關的化合物已經(jīng)在許多疾病中表現(xiàn)出較好的活性，這些疾病包括疼痛(Beltramo,M.Mini Rev Med Chem,2009,9,11)、炎癥(Cabral,G.A.et.al,J Leukoc Biol,2005,78,1192)、結腸炎(林思思等，中國病理生理雜志，2015,10,195)、青光眼(Hampson,A.J.et.al,PNAS,1998,95,8268)、肝纖維化(Julien,B.et.al.Gastroenterology,2005,128,742)、腦缺血再灌注損傷(Lopez,R.A,Cereb Cortex,2011,21,2046；孫競等，中國藥科大學學報，2013,44,167)、腫瘤(鄧遠斐，廣東醫(yī)學，2016,8,1109)、心肌病(胡文星等，心臟雜志，2014,3,265)等。

CB2受體激動劑多種多樣的臨床應用價值顯示出其在醫(yī)藥領域的廣闊前景，然而到目前為止，尚無CB2受體激動劑成為上市藥物，因此，發(fā)現(xiàn)新型高活性、高選擇性且具有較好成藥性的CB2受體激動劑對于該領域具有非常重要的意義。

發(fā)明概述

本發(fā)明描述了式I化合物，和/或它們的可藥用鹽

其中，R¹為芳基、雜環(huán)芳基，R²為H、(C₁-C₆)直鏈或支鏈烷基。

優(yōu)選的，R¹選自2-三氟甲氧基苯基、4-三氟甲氧基苯基、2,4-二三氟甲氧基苯基、2-甲氧基苯基、4-甲氧基苯基、2,4-二甲氧基苯基、2-甲基苯基、4-甲基苯基、2,4-二甲基苯基、2-氟苯基、4-氟苯基、2,4-二氟苯基、2-氯苯基、4-氯苯基、2,4-二氯苯基、2-吡啶基；R²選自H、甲基；R³選自吲哚-2-基、3-硝基吲哚-2-基、5-硝基吲哚-2-基、6-硝基吲哚-2-基、3-甲基吲哚-2-基、4-甲基吲哚-2-基、5-甲基吲哚-2-基、7-甲基吲哚-2-基、5-甲氧基吲哚-2-基、5-溴吲哚-2-基、5-氯吲哚-2-基、5-氟吲哚-2-基、5-三氟甲基吲哚-2-基、吲哚-3-基。

對于R¹取代基來說，有代表性的例子如下，

星號(*)表示該鍵與哌啶環(huán)4位的碳原子相連。

對于R³取代基來說，有代表性的例子如下，

星號(*)表示該鍵與羰基上的碳原子相連。

本發(fā)明還涉及用作藥物(或藥劑)的式I化合物和/或其可藥用鹽用于預防和/或治療疼痛、炎癥、炎性腸病、青光眼、糖尿病、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、動脈粥樣硬化、老年性黃斑退化癥、急性肝衰竭、肝纖維化、肺纖維化、腎纖維化、系統(tǒng)性纖維化、缺血-再灌注損傷、急性同種異體移植排斥、慢性同種異體移植腎病、糖尿病腎病、腎小球腎病、心肌病、心力衰竭、心肌缺血、心肌梗死、系統(tǒng)性硬化、熱損傷、燒傷、肥大性疤痕、齦炎發(fā)熱、肝硬化或腫瘤、骨質(zhì)疏松、神經(jīng)變性、卒中。

本發(fā)明還涉及藥物制劑(或藥物組合物)，其含有有效量的至少一種式I化合物和/或其可藥用鹽、生理學耐受的賦形劑和載體，以及在適當時還有其他添加劑和/或其他活性成分。藥物可以口服施用，例如以丸劑、片劑、噴涂片、包衣片、顆粒劑、硬和軟明膠膠囊、溶液、糖漿、乳劑、混懸劑或氣霧混合物形式。但是，施用也可以如下進行：經(jīng)直腸給藥，例如以栓劑形式；或胃腸外給藥，例如經(jīng)靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下以注射溶液或輸注溶液、微囊、植入劑或植入棒的形式；或經(jīng)皮或局部給藥，例如以軟膏劑、溶液或酊劑形式；或以其他途徑給藥、例如以氣霧劑或鼻噴霧劑形式。

本發(fā)明的藥物制劑以本身已知并且為本領域技術人員所熟悉的方式制備，除了式I化合物和/或它們的可藥用鹽和/或它們的前藥外，使用可藥用的惰性無機和/或有機載體物質(zhì)和/或添加劑。對于丸劑、片劑、包衣片和硬明膠膠囊的制備而言，可能使用例如乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、硬脂酸或其鹽等。軟明膠膠囊和栓劑的載體物質(zhì)有例如脂肪、蠟、半固體和液體多元醇、天然或硬化油等。適合于制備溶液、例如注射溶液或乳劑或糖漿劑的載體物質(zhì)有例如水、鹽水、醇、甘油、多元醇、蔗糖、轉(zhuǎn)化糖、葡萄糖、植物油等。適合用于微囊、植入劑或植入棒的載體物質(zhì)，例如羥乙酸和乳酸的共聚物。藥物制劑通常含有約0.5至約90％重量的式I化合物和/或它們的可藥用鹽和/或它們的前藥。藥物制劑中的活性成分式I化合物和/或它們的可藥用鹽和/或它們的前藥的量通常約0.5至約1000mg、優(yōu)選約1至約500mg。

除了式I的活性成分和/或它們的可藥用鹽以及載體物質(zhì)外，藥物制劑可含有一種或多種添加劑，如填充劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、潤濕劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、防腐劑、甜味劑、著色劑、矯味劑、芳香劑、增稠劑、稀釋劑、緩沖物質(zhì)、溶劑、增溶劑、獲得儲庫效果的試劑、改變滲透壓的鹽、包衣劑或抗氧化劑。它們也可以含有兩種或多種式I化合物和/或它們的可藥用鹽。在藥物組合物含有兩種或更多種式I化合物時，對個別化合物的選擇可依據(jù)藥物制劑的特定總體藥理學性質(zhì)。例如，作用持續(xù)時間較短的高度強效化合物可以與功效較低的長效化合物組合。就式I化合物中取代基選擇而言所允許的靈活性使得能夠?qū)衔锏纳飳W和物理化學性質(zhì)進行眾多控制，由此能夠選擇這類所需化合物。此外，除了至少一種式I化合物和/或其可藥用鹽外，藥物制劑還可含有一種或多種其他治療性或預防性的活性成分。

當使用式I化合物時，劑量可在寬限度內(nèi)并且按照常規(guī)的和醫(yī)生已知的而變化，劑量應適合于每種個例的個體情況。其取決于例如所應用的具體化合物、所治療疾病的性質(zhì)和嚴重程度、施用方式和方案或所治療的是急性還是慢性病癥或是否進行預防。適合的劑量可利用醫(yī)學領域已知的臨床方法建立。一般而言，在重約75kg的成人中獲得所需結果的日劑量是約0.01至約100mg/kg、優(yōu)選約0.1至約50mg/kg、特別約0.1至約10mg/kg(在每種情況下以mg/kg體重計)。特別在施用相對大量的情況下，日劑量可以分為若干部分，例如2、3或4部分施用。通常，根據(jù)個體行為，可能有必要向上或向下偏離所述的日劑量。

此外，式I化合物可用作制備其他化合物、特別是其他藥物活性成分的合成中間體，其可由式I化合物例如通過引入取代基或修飾官能團獲得。

在大多數(shù)情況下，對含有式I的最終化合物或中間體的反應混合物進行后處理，如果有必要，將產(chǎn)物通過本領域技術人員已知的常規(guī)方法純化。例如，所合成的化合物可利用熟知的方法如結晶、色譜或反相高效液相色譜法(RP-HPLC)或基于例如化合物大小、電荷或疏水性的其他分離方法進行純化。類似地，熟知的方法如NMR、IR和質(zhì)譜法(MS)可以用于表征本發(fā)明化合物。

因此，以下實施例是本發(fā)明的一部分，用于闡明而非限制本發(fā)明。

應當指明的是，未實質(zhì)性影響本發(fā)明各種實施方案活性的修飾包括在本文所公開的本發(fā)明范圍內(nèi)。

實施例：

第一步：4-[2-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-腈的制備

將4-[2-(三氟甲氧基)苯基]哌啶(10.0g，40.8mmol)，碳酸鉀(11.1g，80.2mmol)加于100mL二氯甲烷/水(1:1)中，攪拌，降溫至0℃。將溶于20mL二氯甲烷的氰基溴(5.3g，50.0mmol)緩慢滴入上述溶液中，0℃下反應30min，恢復至室溫繼續(xù)反應2h，分離有機層，用飽和碳酸氫鈉溶液，飽和氯化鈉溶液洗滌有機層，無水硫酸鎂干燥，減壓濃縮有機相，粗產(chǎn)品用硅膠柱層析(石油醚/乙酸乙酯＝7/3)得4-[2-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-腈8.7g(收率：80％)。

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.12-7.03(m,2H),6.69-6.51(m,2H),3.52(d,J＝12.0Hz,2H),3.17-3.04(m,2H),2.70-2.68(m,1H),1.98-1.83(m,2H),1.70-1.61(m,2H)；LC/MS(M+1)⁺＝271.1.

第二步：(E)-N-羥基-4-[2-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-甲脒的制備

將4-[2-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-腈(8.0g，30.0mmol)溶于異丙醇/水(4/1)30mL中，室溫下加入鹽酸羥胺(10.4g，150.0mmol)，90℃下攪拌5h，冷卻至室溫，向溶液中加入6N HCl水溶液，乙醚洗滌，用碳酸鈉水溶液將水相調(diào)pH值至弱堿性，乙醚萃取，收集有機相，干燥，減壓濃縮得(E)-N-羥基-4-[2-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-甲脒8.0g(收率：89％)。LC/MS(M+1)⁺＝304.1。

第三步：2-[3-[4-[2-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基氨基甲酸叔丁基酯的制備

向含有羰基二咪唑(4.5g，27.6mmol)的50mL無水N,N-二甲基甲酰胺中，緩慢滴加含有3-(N-叔丁氧羰基氨基)丙酸(5.7g，30.0mmol)的30mL無水N,N-二甲基甲酰胺溶液，室溫下攪拌1h，向溶液中緩慢加入(E)-N-羥基-4-[2-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-甲脒(7.0g，23.0mmol)，反應在110℃下攪拌5h，冷卻后，減壓蒸餾除去溶劑。剩余物用硅膠柱層析(PE/EA＝1/1)得2-[3-[4-[2-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基氨基甲酸叔丁基酯6.7g(收率：64％)。

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.14-7.05(m,2H),6.63-6.51(m,2H),6.45(br,1H),3.47-4.43(m,2H),3.17(t,J＝7.6Hz,2H),3.12-3.04(m,2H),2.72-2.70(m,1H),2.67(t,J＝7.6Hz,2H),1.98-1.71(m,4H),1.42(s,9H)；LC/MS(M+1-100)⁺＝357.1.

第四步：2-[3-[4-[2-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙胺基三氟乙酸鹽的制備

2-[3-[4-[2-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基氨基甲酸叔丁基酯(6.5g，14.2mmol)加入80mL三氟乙酸/二氯甲烷(1:5)中，在室溫下攪拌6h，減壓除去溶劑得到2-[3-[4-[2-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙胺基三氟乙酸鹽6.4g(收率：100％)。LC/MS(M+1)⁺＝357.1。

第五步：N-[2-[3-[4-[2-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基]-1H-吲哚-2-甲酰胺的制備

將1H-吲哚-2-甲酸(2.5g，15.6mmol)加入到60mL二氯甲烷中，向溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDCI，3.0g，15.6mmol)，1-羥基苯并三唑(HOBt,2.1g,15.6mmol)，三乙胺(3.2g，31.2mmol)，室溫攪拌30min，向反應液中加入2-[3-[4-[2-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙胺基三氟乙酸鹽(6.4g，14.2mmol)，反應在室溫下攪拌過夜，停止反應，二氯甲烷相用水，飽和食鹽水洗滌，收集有機相，無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮得粗品，粗品經(jīng)硅膠柱層析(石油醚/乙酸乙酯＝2/1)純化得N-[2-[3-[4-[2-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基]-1H-吲哚-2-甲酰胺5.9g(收率：83％)。

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):δ9.62(s,1H),7.66-7.05(m,7H),6.67-6.58(m,2H),6.42(s,1H),3.48-3.41(m,2H),3.19(t,J＝7.2Hz,2H),3.12-3.04(m,2H),2.71-2.69(m,1H),2.62(t,J＝7.2Hz,2H),1.99-1.88(m,2H),1.81-1.78(m,2H)；LC/MS(M+1)⁺＝500.2.

符合專利權要求的式I化合物均可以采用與上述實施例近似的合成方法得到，只需變更不同的起始物料即可。有代表性的化合物如下：

N-[2-[3-[4-[2-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；

N-[2-[3-[4-[4-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；

N-[2-[3-[4-[2,4-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；

N-[2-[3-[4-[2-(甲氧基)苯基]哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；

N-[2-[3-[4-[4-(甲氧基)苯基]哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；

N-[2-[3-[4-[2,4-(甲氧基)苯基]哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；

N-[2-[3-[4-(2-甲基苯基)哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；

N-[2-[3-[4-(4-甲基苯基)哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；

N-[2-[3-[4-(2,4-甲基苯基)哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；

N-[2-[3-[4-(2-氯苯基)哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；

N-[2-[3-[4-(4-氯苯基)哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；

N-[2-[3-[4-(2,4-氯苯基)哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；

N-[2-[3-[4-(2-氟苯基)哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；

N-[2-[3-[4-(4-氟苯基)哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；

N-[2-[3-[4-(2,4-氟苯基)哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；

N-[2-[3-[4-(2-吡啶基)哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；

3-硝基-N-[2-[3-[4-[2-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；

5-硝基-N-[2-[3-[4-[2-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；

6-硝基-N-[2-[3-[4-[2-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；

3-甲基-N-[2-[3-[4-[2-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；

4-甲基-N-[2-[3-[4-[2-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；

5-甲基-N-[2-[3-[4-[2-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；

7-甲基-N-[2-[3-[4-[2-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；

5-甲氧基-N-[2-[3-[4-[2-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；

5-溴-N-[2-[3-[4-[2-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；

5-氯基-N-[2-[3-[4-[2-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；

5-氟基-N-[2-[3-[4-[2-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；

5-三氟甲氧基-N-[2-[3-[4-[2-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基]-1H-吲哚-2-甲酰胺；

N-[2-[3-[4-[2-(三氟甲氧基)苯基]哌啶-1-基]-1,2,4-噁二唑-5-基]乙基]-1H-吲哚-3-甲酰胺。

活性測定

進行以下試驗以確定式(I)化合物的活性。

放射性配體結合測定

本發(fā)明化合物對大麻素CB1受體的親和性使用建議量的表達人CNR1或CNR2受體的人胚胎腎(HEK)細胞的膜制品(PerkinElmer)各自分別結合1.5或2.6nM[3H]-CP-55，940(Perkin Elmer)作為放射性配體確定。結合在總體積為0.2ml的結合緩沖液(對于CB1受體：50mM Tris，5mMMgCl2，2.5mM EDTA，和0.5％(wt/vol)無脂肪酸BSA，PH7.4，和對于CB2受體：50mM Tris，5mM MgCl2，2.5mM EGTA，和0.1％(wt/vol)無脂肪酸BSA，pH 7.4)中進行，在30℃震蕩1h。通過經(jīng)涂布有0.5％聚乙烯亞胺的微過濾板(UniFilter GF/B過濾板；Packard)快速過濾將反應終止。對于Ki使用非線性回歸分析(Activity Base,ID Business Solution,Limited)來分析結合的放射性，對于[3H]CP55,940的Kd值從飽和試驗確定。式(I)化合物顯示對于CB2受體的優(yōu)異的親和性，親和性低于20μM。

根據(jù)式I的化合物在上述測定中的活性(Ki)特別是1nM至10μM，更特別是1nM至2μM。

cAMP測定

將表達人CB1或CB2受體的CHO細胞在實驗之前17-24小時以50.000細胞/孔接種在具有透明平底的黑色96孔平板(Corning Costar#3904)中、在DMEM(Invitrogen No.31331)中，補充1x HT，具有10％胎牛血清，并在濕潤的培養(yǎng)箱中在5％CO2和37℃下溫育30分鐘。加入化合物至最終測定體積為100μl，并且在30℃溫育30分鐘。使用cAMP-Nano-TRF檢測試劑盒(Roche Diagnostics)，通過加入50μl裂解試劑(Tris，NaCl，1.5％Triton X100，2.5％NP40，10％NaN3)和50μl檢測溶液(20μM mAb Alexa700-cAMP 1：1，和48μM釕-2-AHA-cAMP)終止測定，并且室溫振蕩2h。通過裝備有ND：YAG激光器作為激光源的TRF讀出器(Evotec Technologies GmbH)測量時間分辨能量轉(zhuǎn)移。將平板測量兩次，在355nm激發(fā)和分別在730(帶寬30nm)或645nm(帶寬75nm)以100ns的延遲和100ns的門(gate)發(fā)射，總暴露時間是10s。FRET信號計算如下：FRET＝T730-Alexa730-P(T645-B645)，P＝Ru730-B730/Ru645-B645，其中T730是在730nM測量的測試孔，T645是在645nM測量的測試孔，B730和B645是分別在730nM和645nM的緩沖液對照。cAMP含量從跨度為從10μM至0.1nM cAMP的標準曲線的函數(shù)來測定。

使用Activity Base分析(ID Business Solution，Limited)測定EC50值。從該測定產(chǎn)生的寬范圍的大麻素激動劑的EC50值與科學文獻中公開的值吻合。根據(jù)本發(fā)明的所有化合物均為CB2激動劑，其EC50低于5uM，特別地低于2uM。例如，以下化合物在上述功能cAMP測定中顯示以下人EC50值(以uM表達)：