本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種焦磷酸測(cè)序檢測(cè)clade2.1.3分支H5N1亞型禽流感病毒的方法。

背景技術(shù)：

傳統(tǒng)的禽流感病毒檢測(cè)方法為接種雞胚進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)(需時(shí)2-3天)，然后采用血凝抑制試驗(yàn)進(jìn)行流感病毒亞型的鑒定(需時(shí)1天)。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法具有費(fèi)時(shí)、費(fèi)力的弊端，難以做出快速而及時(shí)的診斷，且傳統(tǒng)的檢測(cè)方法對(duì)同源性較高的病毒不能做出準(zhǔn)確的區(qū)分。

高致病H5N1亞型禽流感病毒已在亞洲、歐洲、非洲15個(gè)國(guó)家的家禽中流行，并引發(fā)人的感染。在這些國(guó)家中，印尼的發(fā)病數(shù)及死亡率居全世界首位。截止2015年9月，印尼已有199人確診感染H5N1禽流感病毒，167人死亡，發(fā)病數(shù)及死亡率居全世界首位。印尼地區(qū)主要流行的H5N1毒株為clade 2.1分支，包括2.1.1，2.1.2，2.1.3。自2005年以來(lái)，calde 2.1.1和clade2.1.2所占比例明顯減少，而clade 2.1.3逐漸成為印尼主要流行毒株，且?guī)缀跛懈腥救说亩局昃鶎儆赾lade 2.1.3分支。表明clade2.1.3分支病毒相比于其他分支H5亞型流感病毒對(duì)人類的感染性、致病性更強(qiáng)。目前為止，我國(guó)尚未有人或禽類感染clade 2.1.3分支H5N1禽流感病毒的報(bào)道，但是禽產(chǎn)品貿(mào)易交流以及候鳥遷徙都可能將clade2.1.3分支H5N1禽流感病毒傳入我國(guó)。因此，建立一種快速有效的診斷該分支病毒的方法，對(duì)于監(jiān)測(cè)clade2.1.3分支H5N1禽流感病毒入境傳播具有重要意義。

對(duì)于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，如病毒分離、血凝抑制試驗(yàn)、神經(jīng)氨酸酶試驗(yàn)等，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，不能做出快速而及時(shí)的診斷。對(duì)于相關(guān)分子生物學(xué)檢測(cè)方法，如單一RT-PCR方法及多重RT-PCR方法，無(wú)法僅僅通過(guò)PCR電泳結(jié)果對(duì)同源性較高的病毒做出準(zhǔn)確的區(qū)分，還需要進(jìn)行Sanger測(cè)序，并進(jìn)行基因進(jìn)化分析。因此，建立一種針對(duì)clade 2.1.3分支H5N1禽流感病毒的新型檢測(cè)方法非常重要。

焦磷酸測(cè)序技術(shù)作為近年來(lái)發(fā)明的一種新型序列分析技術(shù)，它通過(guò)核苷酸與模板結(jié)合后釋放的焦磷酸引發(fā)酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使熒光素發(fā)光并進(jìn)行檢測(cè)，能夠針對(duì)已知的短序列，在很短的時(shí)間內(nèi)對(duì)目的序列進(jìn)行基因序列分析，具有快速、準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，其重復(fù)性和精確性能夠與sanger DNA測(cè)序法相媲美。另外，Sanger法的優(yōu)勢(shì)在于可以分析未知DNA的序列，且單向反應(yīng)的所讀序列較長(zhǎng)。在實(shí)際工作中，很多情況需要對(duì)已知序列的DNA片段進(jìn)行序列驗(yàn)證，而這種分析往往測(cè)幾十對(duì)堿基就可以滿足需要。在這種情況下，Sanger法未必是最合適的DNA序列分析技術(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)clade 2.1.3分支H5N1禽流感病毒的成套引物，包括如下引物對(duì)：

所述引物對(duì)由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示的單鏈DNA分子組成。

上述成套引物中，所述引物對(duì)中的一條引物末端生物素標(biāo)記。

上述成套引物還包括核苷酸序列為序列表中序列3的測(cè)序引物。

含有上述成套引物的成套PCR試劑或含有所述成套引物或所述成套PCR試劑的試劑盒也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述成套PCR試劑中，所述成套PCR試劑由PCR試劑1和PCR試劑2組成；

所述PCR試劑1為含有上所述成套引物中所述引物對(duì)的試劑；

或，所述引物對(duì)中每條引物在所述PCR試劑1中的濃度為20μM；

所述PCR試劑2為含有上述成套引物中所述測(cè)序引物的試劑；

或，所述測(cè)序引物在所述PCR試劑2中的濃度為0.3μM。

上述成套引物或上述的成套PCR試劑或試劑盒在檢測(cè)clade 2.1.3分支H5N1禽流感病毒中的應(yīng)用；

或，上述成套引物或上述的成套PCR試劑或試劑盒在制備檢測(cè)clade 2.1.3分支H5N1禽流感病毒產(chǎn)品中的應(yīng)用；

或，上述成套引物或上述的成套PCR試劑或試劑盒在檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有clade 2.1.3分支H5N1禽流感病毒中的應(yīng)用；

或，上述成套引物或上述的成套PCR試劑或試劑盒在制備檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有clade 2.1.3分支H5N1禽流感病毒產(chǎn)品中的應(yīng)用；

或，上述成套引物或上述的成套PCR試劑或試劑盒在檢測(cè)H5N1亞型禽流感病毒HA蛋白裂解位點(diǎn)P6位氨基酸殘基中的應(yīng)用；

或，上述成套引物或上述的成套PCR試劑或試劑盒在制備檢測(cè)H5N1亞型禽流感病毒HA蛋白裂解位點(diǎn)P6位氨基酸殘基產(chǎn)品中的應(yīng)用；

所述HA蛋白裂解位點(diǎn)P6位氨基酸序列為序列表中序列4第325位。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有clade 2.1.3分支H5N1禽流感病毒的方法。

上述方法中，包括如下步驟：

1)用序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示的單鏈DNA分子組成的引物對(duì)對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

2)用核苷酸序列為序列表中序列3的測(cè)序引物對(duì)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果；

3)對(duì)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果進(jìn)行反向互補(bǔ)，得到反向互補(bǔ)鏈；將所述反向互補(bǔ)鏈翻譯得到所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物氨基酸序列；若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物氨基酸序列中從C端起第8位為S，則待測(cè)樣本中含有或候選含有clade 2.1.3分支H5N1禽流感病毒；若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物氨基酸序列中從C端起第8位不為S，則待測(cè)樣本中不含有或候選不含有clade 2.1.3分支H5N1禽流感病毒。

本發(fā)明第三個(gè)目的是提供一種檢測(cè)待測(cè)樣本中的HA蛋白裂解位點(diǎn)P6位氨基酸殘基的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：

1)用序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示的單鏈DNA分子組成的引物對(duì)對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

2)用核苷酸序列為序列表中序列3的測(cè)序引物對(duì)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果；

3)對(duì)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果進(jìn)行反向互補(bǔ)，得到反向互補(bǔ)鏈；將所述反向互補(bǔ)鏈翻譯得到所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物氨基酸序列，得到待測(cè)樣本中的HA蛋白裂解位點(diǎn)P6位氨基酸殘基。

上述方法中，所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為55℃。

上述方法中，所述PCR擴(kuò)增的模板為所述待測(cè)樣本的cDNA。

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的方法較病毒分離、RT-PCR方法和血清學(xué)分型方法更為快捷，且能夠檢測(cè)大量樣本。本方法的特異性強(qiáng)、靈敏度高，與病毒分離和血凝抑制實(shí)驗(yàn)等常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法的鑒定結(jié)果相比，符合率達(dá)100％，可以及時(shí)對(duì)禽染病情況及區(qū)域、環(huán)境的病毒污染情況作出及時(shí)快捷的檢測(cè)和確診，這對(duì)于及時(shí)監(jiān)測(cè)clade2.1.3分支H5N1禽流感病毒入境傳播具有重要意義。

附圖說(shuō)明

圖1為rg325GPCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果、rg325IPCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果、rg325RPCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果、rg325*PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果，A-E為焦磷酸測(cè)序波峰圖，F(xiàn)為焦磷酸測(cè)序序列結(jié)果。

圖2為利用MAGA6.0將rg325GPCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果、rg325IPCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果、rg325RPCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果、rg325*PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果和rg325SPCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果翻譯成氨基酸比對(duì)結(jié)果，其中1代表H5N1標(biāo)準(zhǔn)序列A/Anhui/1/2005(序列4)、2為rg325*、3為rg325I、4為rg325R、5為rg325S；6為rg325G；可以看出，蛋白序列從C端起(即右數(shù))第8列，被檢樣品中HA蛋白裂解位點(diǎn)P6位分別含有對(duì)應(yīng)的G,I,R,*和S，表明本發(fā)明的方法正確。

圖3為靈敏度測(cè)序結(jié)果，其中，A、B、C、D代表病毒含量分別為1×10³、1×10²、10、1TCID₅₀/mL的rg325S病毒HA裂解位點(diǎn)焦磷酸測(cè)序波峰圖；圖E為靈敏度檢測(cè)所得焦磷酸測(cè)序序列。Well A1,B1,C1,D1代表病毒含量分別為1×103、1×102、10、1TCID50/mL的rg325S病毒檢測(cè)序列。

圖4為氨基酸序列比對(duì)結(jié)果，其中1代表H5N1標(biāo)準(zhǔn)序列A/Anhui/1/2005、2、3、4分別代表病毒含量為1×10³、1×10²、10、1TCID₅₀/mL的rg325S病毒；可以看出，蛋白序列從C端起(即右數(shù))第8列，2、3、4中HA蛋白裂解位點(diǎn)P6位為S，表明10TCID₅₀/mL及以上濃度樣品可以檢測(cè)到HA蛋白裂解位點(diǎn)P6位含有S。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中clade2.1.3分支H5N1禽流感病毒記載在如下文獻(xiàn)中：Zhang,Y.,Sun,Y.,Sun,H.,Pu,J.,Bi,Y.,Shi,Y.,Lu,X.,Li,J.,Zhu,Q.,Gao,G.F.2012.A single amino acid at the hemagglutinin cleavage site contributes to the pathogenicity and neurovirulence of H5N1influenza virus in mice.J.Virol.86,6924-31.

實(shí)施例1、焦磷酸測(cè)序引物的設(shè)計(jì)和方法的建立

一、焦磷酸測(cè)序引物的設(shè)計(jì)

HA蛋白的氨基酸序列為序列4，核苷酸序列為序列5。

根據(jù)GenBank中上傳的H5N1禽流感病毒序列，針對(duì)H5N1亞型禽流感病毒HA蛋白裂解位點(diǎn)區(qū)域核苷酸為靶序列設(shè)計(jì)了特異PCR引物(靶序列為序列5第920-1092位)及測(cè)序引物(靶序列為序列5第997-1044位)，具體如下：

特異上游引物H5-F：5’-TCC ACA ACA TAC ACC CTC TCAC-3’(序列1)(5’生物素標(biāo)記)

特異下游引物H5-R：5’-TAC CAT TCC CTg CCA TCC TC-3’(序列2)

焦磷酸測(cè)序引物：5’-CCT gCT ATA gCT CCA AA-3’(序列3)

二、焦磷酸測(cè)序引物檢測(cè)clade 2.1.3分支H5N1禽流感病毒的方法

1、樣品RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

提取樣品的RNA并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，具體如下：

1)、樣品的采集

組織樣品可以為如下幾種：病死或撲滅病禽，取肝、腦、肺等組織；棉拭子：鼻腔拭子、泄殖腔拭子。2-8℃保存，送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。要求送檢病料新鮮。

2)、樣品處理：每份樣品分別處理

(1)組織樣品處理：稱取待檢病料100mg置研磨器中，加入0.8ml裂解液(硫氰酸胍，0.8M；硫氰酸銨，0.4M；醋酸鈉緩沖液，0.1M；甘油5％和苯酚38％，混勻)研磨，把研磨好的病料移至1.5ml離心管中，4℃8000rpm離心5min，取上清250μl，置于1.5ml滅菌離心管中，加入750μl上述裂解液，劇烈振蕩混勻，室溫放置5min。

(2)棉拭子處理：將浸液中的棉拭子充分捻動(dòng)，擰干后棄去拭子，4℃8000rpm離心5min，取上清液250μl，置于1.5ml滅菌離心管中，加入750μl裂解液(硫氰酸胍，0.8M；硫氰酸銨，0.4M；醋酸鈉緩沖液，0.1M；甘油5％和苯酚38％，混勻)，劇烈振蕩混勻，室溫放置5min。

(3)陰性對(duì)照(RNase free水)：取滅菌雙蒸水250μl，置于1.5ml滅菌離心管中，加入750μl裂解液(硫氰酸胍，0.8M；硫氰酸銨，0.4M；醋酸鈉緩沖液，0.1M；甘油5％和苯酚38％，混勻)，劇烈振蕩混勻，室溫放置5min。

3)、病毒RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

(1)取處理后的樣本液300μl，加900μlTRIZOL，輕輕顛倒混勻數(shù)次，冰浴10min。

(2)加200μl氯仿，顛倒混勻15s，冰浴5min，4℃離心，13000r/m，15min。

(3)取700μl上清移入新的離心管，加入等量的異丙醇，輕輕顛倒混勻，混勻后，4℃離心，13000r/m，15min。

(4)棄上清，貼壁緩緩加1ml75％DEPC處理過(guò)的酒精，加完后輕轉(zhuǎn)兩圈。

(5)4℃，13000r/m，5min。

(6)倒上清，置于冰上風(fēng)干5～10min。

(7)用50μl RNase free水和1μl RNA酶抑制劑(規(guī)格為30U/μl，Genview公司生產(chǎn))溶解沉淀，即用或-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

RT體系為：每管反應(yīng)體系為20μl，反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)程序如下：

加完無(wú)RNA酶水和oligo后，瞬離，65℃5min后立冰。加完后面四樣后，瞬離，放于37℃1h，之后70℃5min，4℃保存。

得到各樣品的cDNA。

2、焦磷酸測(cè)序法鑒定

1)PCR擴(kuò)增反應(yīng)

以上述1獲得的cDNA為模板，用上述一設(shè)計(jì)合成的特異上游引物和特異下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增體系每管25μl，反應(yīng)體系如下：

加雙蒸水至終體積為25μl，混勻，并作好標(biāo)記。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序如下：

94℃5min；

94℃30s；

55℃30s；

72℃30s

從第二步開始進(jìn)行30個(gè)循環(huán)

72℃10min；

4℃10h。

得到分子量大小為170bpPCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

2)、焦磷酸單鏈模板的制備

(1)在PCR板中加入3μl sepharose beads(Streptavidin Sepharose High Performance,GE，71500440AD)和47μl binding buffer(PyroMark Binding Buffer,QIAGEN,979006)，使得平均每個(gè)樣品為50μl的體積，將混合物混勻，震蕩；

(2)向以上混合物中加入10μl上述1)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

(3)將上述(2)處理后的混合物在常溫下水平震蕩15分鐘，使得beads與生物素結(jié)合；

(4)在Vacuum prep workstation中，四個(gè)樣品板中依次加入高純水、70％乙醇、washing buffer(PyroMark Wash Buffer,QIAGEN,979008)和Denaturation buffer(PyroMark Denaturation Sol,QIAGEN,979007)，每個(gè)至少100ml；

(5)在PSQ 96板中預(yù)先加入45μl含有焦磷酸測(cè)序引物(10μM)的annealing buffer(PyroMark Annealing Buffer,QIAGEN,979009，測(cè)序引物在最終的孔中的終濃度為0.3μM)；

(6)打開vacuum prep workstation的泵，將vacuum prep tool在高純水中清洗30秒；

(7)然后將vacuum prep tool移到步驟(3)處理后的PCR板中，抓取sepharose beads；拿起PCR板，檢查是否大部分beads都被吸附在了vacuum prep tool上；

(8)將vacuum prep tool放入70％乙醇中5-10秒；

(9)移到denaturation buffer中5-10秒；

(10)移到washing buffer中清洗5-10秒；

(11)關(guān)掉泵；

(12)將vacuum prep tool對(duì)齊PSQ 96板，立即放入含有測(cè)序引物的板中，輕輕搖動(dòng)探頭，釋放sepharose beads；

(13)使用高純水清洗vacuum prep tool；得到焦磷酸單鏈模板；

3)、焦磷酸測(cè)序

(1)將放有上述焦磷酸單鏈模板的PSQ 96板放在Thermo Plate上加熱到80℃2分鐘，再冷卻到室溫；

(2)將酶混合物、底物混合物和四類dNTP(dATPαS、dTTP、dCTP、dGTP)分別加入試劑艙(PyroMark Q96Cartridge(3)，QIAGEN,979004)固定位置。設(shè)定程序，將試劑艙和96孔測(cè)序板放入機(jī)箱中進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。

得到待測(cè)樣本PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果(序列5第997-1044位)。

用EditSeq軟件將測(cè)得序列進(jìn)行Reverse Complement，得到反向互補(bǔ)序列，用MAGE 6.0軟件將該反向互補(bǔ)序列翻譯為待測(cè)樣本PCR產(chǎn)物編碼氨基酸序列(序列4第333位-348位)，若待測(cè)樣本PCR產(chǎn)物編碼氨基酸序列從C端起第8位則待測(cè)樣本的HA蛋白裂解位點(diǎn)P6為S，表明待測(cè)樣本中含有或候選含有clade 2.1.3分支H5N1禽流感病毒，若待測(cè)樣本PCR產(chǎn)物編碼氨基酸序列從C端起第8位不為S，則待測(cè)樣本的HA蛋白裂解位點(diǎn)P6不為S，表明待測(cè)樣本中不含有或候選不含有clade 2.1.3分支H5N1禽流感病毒。

實(shí)施例2、焦磷酸測(cè)序引物的特異性檢測(cè)

1、樣品RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

H5N1禽流感病毒rg325G(6)、rg325I(3)、rg325R(4)、rg325*(2)和rg325S(5)記載在如下文獻(xiàn)中：Zhang,Y.,Sun,Y.,Sun,H.,Pu,J.,Bi,Y.,Shi,Y.,Lu,X.,Li,J.,Zhu,Q.,Gao,G.F.2012.A single amino acid at the hemagglutinin cleavage site contributes to the pathogenicity and neurovirulence of H5N1influenza virus in mice.J.Virol.86,6924-31.rg325G、rg325I、rg325R、rg325*和rg325S病毒分別代表不同clade H5N1禽流感病毒，其中rg325S HA裂解位點(diǎn)P6位(HA氨基酸殘基第325位)為絲氨酸，與clade2.1.3分支H5N1一致，其他病毒所代表分支見上述已發(fā)表的文獻(xiàn)。

采用實(shí)施例1的二的步驟1方法分別提取H5N1禽流感病毒rg325G、rg325I、rg325R、rg325*和rg325S病毒尿囊液和陰性對(duì)照樣品的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，得到各個(gè)病毒樣本的cDNA和陰性對(duì)照樣本的cDNA。

2、焦磷酸測(cè)序法鑒定焦磷酸測(cè)序引物的特異性

1)PCR擴(kuò)增反應(yīng)

以上述1獲得的cDNA為模板，用上述一設(shè)計(jì)合成的H5-F，H5-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，方法與實(shí)施例1的二的方法相同，得到PCR產(chǎn)物。

2)、焦磷酸單鏈模板的制備

采用實(shí)施例1的二的方法，用焦磷酸測(cè)序引物擴(kuò)增上述1)得到的PCR產(chǎn)物，得到焦磷酸單鏈模板。

3)、焦磷酸測(cè)序

采用實(shí)施例1的二的方法，進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，得到rg325GPCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果、rg325IPCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果、rg325RPCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果、rg325*PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果和rg325SPCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果。

將rg325GPCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果、rg325IPCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果、rg325RPCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果、rg325*PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果和rg325SPCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果利用EditSeq軟件將測(cè)得序列進(jìn)行Reverse Complement，得到反向互補(bǔ)序列，利用MAGA6.0軟件將該反向互補(bǔ)序列與標(biāo)準(zhǔn)序列A/Anhui/1/2005(H5N1)HA基因編碼編碼蛋白序列4進(jìn)行比對(duì)。

圖1為rg325GPCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果、rg325IPCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果、rg325RPCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果、rg325*PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果，A-E為焦磷酸測(cè)序波峰圖，F(xiàn)為焦磷酸測(cè)序序列結(jié)果。

圖2為利用MAGA6.0將rg325GPCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果、rg325IPCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果、rg325RPCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果、rg325*PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果和rg325SPCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果翻譯成氨基酸比對(duì)結(jié)果，其中1代表H5N1標(biāo)準(zhǔn)序列A/Anhui/1/2005(序列4)、2為rg325*、3為rg325I、4為rg325R、5為rg325S；6為rg325G；可以看出，蛋白序列從C端起(即右數(shù))第8列，被檢樣品中HA蛋白裂解位點(diǎn)P6位分別含有對(duì)應(yīng)的G,I,R,*和S，表明本發(fā)明的方法正確。

同時(shí)利用對(duì)照引物F’：5’-CAA ACA AAT TAG TCC TTG CGA CTG-3’,R’：5’-CGG CCT CAA ACT GAG TAT TCA-3，采用步驟1)的方法對(duì)上述1獲得的cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，沒(méi)有擴(kuò)增條帶，編碼本發(fā)明的特異引物效果好。

實(shí)施例3、焦磷酸測(cè)序引物的靈敏度檢測(cè)

1、各個(gè)稀釋液的制備和總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

靈敏度檢測(cè)的樣品為，rg325S毒株病毒含量分別為1×10³、1×10²、10、1TCID₅₀/mL時(shí)的病毒稀釋液。分別提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄方法同實(shí)施例1的二的步驟1)。

2、焦磷酸測(cè)序法鑒定焦磷酸測(cè)序引物的靈敏度

1)PCR擴(kuò)增反應(yīng)

分別以上述1獲得的cDNA為模板，用上述一設(shè)計(jì)合成的H5-F，H5-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，方法與實(shí)施例1的二的方法相同，得到PCR產(chǎn)物。

2)、焦磷酸單鏈模板的制備

采用實(shí)施例1的二的方法，用焦磷酸測(cè)序引物擴(kuò)增上述1)得到的PCR產(chǎn)物，得到焦磷酸單鏈模板。

3)、焦磷酸測(cè)序

采用實(shí)施例1的二的方法，進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，分別得到病毒含量分別為1×10³、1×10²、10、1TCID₅₀/mL的rg325S病毒PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果。

將病毒含量分別為1×10³、1×10²、10、1TCID₅₀/mL的rg325S病毒PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果利用EditSeq軟件將測(cè)得序列進(jìn)行Reverse Complement，得到反向互補(bǔ)序列，利用MAGA6.0軟件將該反向互補(bǔ)序列與標(biāo)準(zhǔn)序列A/Anhui/1/2005(H5N1)HA編碼蛋白(序列4)進(jìn)行比對(duì)。

圖3為測(cè)序結(jié)果，其中，A、B、C、D代表病毒含量分別為1×10³、1×10²、10、1TCID₅₀/mL的rg325S病毒HA裂解位點(diǎn)焦磷酸測(cè)序波峰圖；圖E為靈敏度檢測(cè)所得焦磷酸測(cè)序序列。Well A1,B1,C1,D1代表病毒含量分別為1×10³、1×10²、10、1TCID50/mL的rg325S病毒檢測(cè)序列。

圖4為氨基酸序列比對(duì)結(jié)果，其中1代表H5N1標(biāo)準(zhǔn)序列A/Anhui/1/2005、2、3、4分別代表病毒含量為1×10³、1×10²、10、1TCID₅₀/mL的rg325S病毒；可以看出，蛋白序列左數(shù)第三列，2、3、4中HA蛋白裂解位點(diǎn)P6位(HA蛋白325位)為S，表明10TCID₅₀/mL及以上濃度樣品可以檢測(cè)到HA蛋白裂解位點(diǎn)P6位(HA蛋白325位)含有S。說(shuō)明該焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法具有很高的靈敏度。