專利名稱：：核酸測(cè)序的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及核酸序列分析領(lǐng)域。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及到高通量平行DNA測(cè)序的方法與器件。本發(fā)明同時(shí)提供一種方法篩選樣品中的序列，用于富集靶序列或去除特定分子，尤其是測(cè)序樣品中不需要的序列模板。
背景技術(shù)：
：DNA基因組為基礎(chǔ)生物學(xué)系統(tǒng)提供編碼，RNA轉(zhuǎn)錄組為蛋白質(zhì)和其它功能上具有科研價(jià)值的RNA元件提供足跡。DNA/RNA測(cè)序領(lǐng)域?qū)饷苓@些系統(tǒng)來(lái)說(shuō)是至關(guān)重要的，因此在過(guò)去幾十年里測(cè)序經(jīng)歷了指數(shù)型增長(zhǎng)。幾種新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)明不僅刺激了megabase通量的發(fā)展，同時(shí)還刺激了與基因組和轉(zhuǎn)錄組相關(guān)的多種應(yīng)用的發(fā)展，如全基因組快速測(cè)序和重測(cè)序，SNP檢測(cè)，長(zhǎng)鏈DNA基因突變分析(表觀遺傳學(xué)分析)，smallRNA、ncRNA、蛋白質(zhì)和具有重要生物學(xué)意義的RNA分子的檢測(cè)與表達(dá)譜分析，加速了基因組學(xué)和基因組學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。這些更加深入和全面的遺傳學(xué)和轉(zhuǎn)錄組分析可以應(yīng)用于基礎(chǔ)研究(功能鑒定，通路構(gòu)建，相互作用圖譜，系統(tǒng)生物學(xué)，生態(tài)進(jìn)化，疾病機(jī)理研究等)也可以應(yīng)用于臨床領(lǐng)域(疾病早期檢測(cè)、預(yù)測(cè)、預(yù)防和治療的生物標(biāo)記)。在微陣列獨(dú)占鰲頭的領(lǐng)域里，測(cè)序的應(yīng)用正在逐漸增多。Sanger測(cè)序法(Sangeretal.(1975)J.Mol.Biol.94,441-448；Sangeretal.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA74,5463-5467；Sangeretal.(1977)Nature265，687-695；Maxametal.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA74,560-564；Szekelyetal.(1977)Nature267，104)已經(jīng)是人類基因組測(cè)序(Landeretal.(2001)Nature409，860-921；Venteretal.(2001)Science291,1304-1351；InternationalHumanGenomeSequencingConsortium(2004)Nature431,931-945；Levyetal.(2007)PLoSBiol5,e254)之后的主力，相比于其它測(cè)序方法，它的優(yōu)勢(shì)是讀長(zhǎng)更長(zhǎng)(常規(guī)讀長(zhǎng)達(dá)到700bp)，精確度更高(單通道精確度達(dá)到99.0%)，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果可靠。該方法包括樣品以及通常PCR產(chǎn)物或擴(kuò)增子的制備；隨后，擴(kuò)增子通過(guò)測(cè)序反應(yīng)，如AB’sBigDyeterminatorcyclereaction，DNA聚合酶用dNTP和少量()2’，3’-雙脫氧-ddNTP終止子結(jié)合，通過(guò)堿基識(shí)別延伸鏈長(zhǎng)。以上反應(yīng)生成一系列長(zhǎng)度相差一個(gè)核苷酸的鏈終止DNA片段，并帶有終止熒光染料結(jié)合產(chǎn)生的熒光標(biāo)記。利用時(shí)間板(timeslab)或過(guò)后用毛細(xì)管電泳分離混合序列，利用垂直的激光或光線照射進(jìn)電泳束來(lái)檢測(cè)單個(gè)堿基交錯(cuò)長(zhǎng)度的讀序，信號(hào)由光電倍增器或CCD器件獲取，并以色譜圖表示來(lái)產(chǎn)生basecalls。用高溫下的線性聚丙烯酰胺成分混合物和優(yōu)化的電場(chǎng)在1個(gè)到2個(gè)小時(shí)內(nèi)以低誤碼率(精確度>99%)檢出超長(zhǎng)序列(1，000-1，300bp)(Zhouetal.(2000)AnalChem72,1045-1052；Carrilhoetal.(1996)5AnalChem68,3305-3313)。在自動(dòng)測(cè)序儀中，AB(AppliedBioSystems)96通道毛細(xì)管電泳(CE)分析的一次運(yùn)行可生成96X700，或67.2Kbp堿基對(duì)讀序(表1)。一些國(guó)立人類基因組序列中心，如BaylorHumanGenomeSequencingCenter禾口WashingtonUniversityGenomeSequenceCenter,已經(jīng)以ABI的測(cè)序儀為主力完成了人類基因組或大規(guī)模測(cè)序；每臺(tái)儀器的價(jià)格是35萬(wàn)美元(AB3730x196毛細(xì)管測(cè)序儀)。自動(dòng)化的ABI毛細(xì)管電泳測(cè)序儀包含一個(gè)由8，24或96個(gè)毛細(xì)管通道組成的ID毛細(xì)管陣列。檢測(cè)是從陣列的側(cè)邊開(kāi)始的。ID陣列能分析的樣品數(shù)量是有限的。專利WO2007/084702介紹了生物分子的測(cè)序、分離、檢測(cè)和鑒定所使用的方法與器件。針對(duì)DNA測(cè)序，專利說(shuō)明書(shū)中介紹了一種基于循環(huán)合成測(cè)序的系統(tǒng)，反應(yīng)在微珠上的三維容器里進(jìn)行，使用整體(monolithic)毛細(xì)管陣列進(jìn)行檢測(cè)。說(shuō)明書(shū)中介紹了利用量子點(diǎn)和多種冷光(luminescence)標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。說(shuō)明書(shū)介紹了從整體式多重毛細(xì)管陣列的管道中通過(guò)的微珠中檢測(cè)熒光信號(hào)。利用激光或LED作為照明源和快速CCD相機(jī)作為檢測(cè)器件，可在陣列頂端實(shí)時(shí)檢測(cè)單個(gè)微珠。科研人員一直在努力將PCR、樣品制備、毛細(xì)管電泳和信號(hào)檢測(cè)的器件小型化、集成化(Dolniketal.(2000)Electrophoresis21,41-54；Liuetal.(2000)ProcNatlAcadSciUSA97,5369-5374；Blazejetal.(2006)ProcNatlAcadSciUSA103,7240-7245；Liuetal.(2006)AnalChem78,5474-5479；Blazejetal.(2007)AnalChem79,4499-4506；Kumaresanetal.(2008)AnalChem80,3522-3529；Liuetal.(2007)AnalChem79，1881-1889)。在他們的優(yōu)化配置里，微加工芯片可以以attomolar的靈敏度快速(幾分鐘至1到2小時(shí))檢測(cè)300bp到kbp長(zhǎng)度的DNA片段。在一個(gè)四個(gè)擴(kuò)增樣品的試驗(yàn)中，輕便型的PCR-CE器件已經(jīng)可以檢測(cè)20個(gè)拷貝的DNA。因?yàn)閭鹘y(tǒng)的CE過(guò)程可以更進(jìn)一步的小型化，靈敏度也可以進(jìn)一步的提高，提高測(cè)序容量是很有希望的，Sanger測(cè)序法遇到的瓶頸是缺少工具而無(wú)法滿足gigabase測(cè)序需求?；蚪M測(cè)序的主力軍曾是Sanger測(cè)序法。該方法包括樣品，通常還有PCR產(chǎn)物或擴(kuò)增子的制備。之后，擴(kuò)增子通過(guò)經(jīng)過(guò)一個(gè)測(cè)序反應(yīng)(即AB，sBigDyeterminatorcyclereaction),DNA聚合酶用dNTP和2’，3’-雙脫氧-ddNTP終止子結(jié)合，生成早期鏈終止DNA片段。以上反應(yīng)混合物用電泳法分析和用色譜圖表示測(cè)序結(jié)果。在自動(dòng)的測(cè)序儀中，一次ABI的96通道毛細(xì)管電泳(CE)分析可以生成總共96X700，或67個(gè)千堿基(kbp)讀序?；蚪M規(guī)模或大規(guī)模的測(cè)序曾經(jīng)需要大量的測(cè)序儀，每個(gè)測(cè)序儀耗費(fèi)$350，000才能完成(ABI3730x196CapillarySequencer)。在CE測(cè)序中，需要為每條序列制備測(cè)序樣品，再加載到96孔板上。曾有報(bào)道稱芯片上的CE可以得到更快、更簡(jiǎn)單的結(jié)果，但是操作模式基本上與自動(dòng)CE測(cè)序儀相似。使用傳統(tǒng)方法的基因組測(cè)序工作需要上百萬(wàn)美元的器件，數(shù)天的時(shí)間和5百萬(wàn)到1千萬(wàn)美元的材料消耗。另外，隨著序列數(shù)量的增長(zhǎng)，PCR和熒光終止序列反應(yīng)的數(shù)量也隨之增長(zhǎng)。處理大量的反應(yīng)所需的自動(dòng)化設(shè)備和樣品處理及儲(chǔ)存代價(jià)高昂。很明顯，為了解決DNA分析的許多應(yīng)用，通過(guò)技術(shù)革明顯降低測(cè)序的經(jīng)費(fèi)和提高DNA讀序速度是十分有必要的。包括美國(guó)專利6，210,891，7，264，929和7，335，762在內(nèi)的許多文獻(xiàn)和專利中都報(bào)道了焦磷酸測(cè)序。在焦磷酸測(cè)序中，模板是由附著在PTP孔板內(nèi)的一百萬(wàn)到兩百萬(wàn)個(gè)微珠內(nèi)通過(guò)乳液PCR進(jìn)行制備。帶有磺化酶和熒光素酶的小微珠向內(nèi)附著在模板微珠的周圍，繼而單獨(dú)的脫氧磷酸核苷酸(dNTP)分布在孔室之間。當(dāng)與模板鏈互補(bǔ)的一個(gè)dNTP結(jié)合到6延伸的鏈中時(shí)，釋放出一個(gè)焦磷酸(PPi)并轉(zhuǎn)化成ATP。ATP將熒光素氧化成氧化熒光素，發(fā)出熒光。探測(cè)器檢測(cè)到釋放出的熒光并將此關(guān)聯(lián)到dNTP的結(jié)合。這一技術(shù)可以達(dá)到將近400堿基的讀長(zhǎng)，并且可以檢測(cè)約為6個(gè)堿基的均聚物。該技術(shù)易受插入或缺失錯(cuò)誤的影響。許多文獻(xiàn)和專利中都報(bào)道了連接法測(cè)序，包括美國(guó)專利5，912，148和6，130，073。在連接法測(cè)序中，載玻片表面附著了近一千萬(wàn)個(gè)乳液PCR模板微珠，通用引物退火，與模板雜交。探針包含2個(gè)訊問(wèn)堿基(interrogationbases)，結(jié)合了特定染料的訊問(wèn)堿基(interrogationbases)雜交到模板上，與靶序列互補(bǔ)的被退火。用4種不同的染料標(biāo)記探針中16種不同的二核苷酸。在以4種顏色成像后，通過(guò)化學(xué)方法剪切連接的二核苷酸并生成磷酸基團(tuán)。雜交、鏈接、成像和剪切共循環(huán)重復(fù)7次，鑒定正確的雙堿基序列。接下來(lái)，從模板上切下通用引物，用5’端帶有一個(gè)未知堿基的n-1引物進(jìn)行進(jìn)行第二輪連接。再次進(jìn)行7次雜交、連接、成像和剪切的循環(huán)和3次剪切和連接的過(guò)程，產(chǎn)生以顏色區(qū)間編碼的一系列35數(shù)據(jù)位。這些數(shù)據(jù)與相應(yīng)的基因組進(jìn)行比對(duì)來(lái)解析DNA序列。該技術(shù)的局限性是讀長(zhǎng)有限，35個(gè)堿基，而且易發(fā)生替代錯(cuò)誤。另外還有2種技術(shù)利用可逆終止子來(lái)實(shí)現(xiàn)DNA測(cè)序。首先，在載玻片的8個(gè)通道之間進(jìn)行隨機(jī)的DNA片段的橋式擴(kuò)增，高密度分布正向和反向引物共價(jià)結(jié)合。固相擴(kuò)增共生成約8千萬(wàn)個(gè)來(lái)自于同一條模板鏈的分子簇。引物退火，與每個(gè)分子簇的模板的自由端結(jié)合。通過(guò)聚合酶開(kāi)始延伸鏈，并在四種帶有不同染料的可逆終止子的作用下終止DNA合成。洗脫未結(jié)合的可逆終止子，通過(guò)4種顏色的成像鑒定連接的堿基。利用化學(xué)剪切可除去封閉和熒光基團(tuán)，進(jìn)而進(jìn)行另一個(gè)循環(huán)。該技術(shù)的局限性是讀長(zhǎng)有限-35個(gè)堿基，而且易于發(fā)生替代錯(cuò)誤。利用可逆終止子的第二種技術(shù)中，將poly(dA)尾巴與poly(dT)引物雜交，共價(jià)結(jié)合到載玻片上，得到數(shù)十億個(gè)未經(jīng)擴(kuò)增的ssDNA模板。在第一輪測(cè)序中，引物-模板的復(fù)合體是足夠的，但是在第二輪測(cè)序中，模板鏈被復(fù)制，原始模板被除去，退火引物直接連接到表面。與第一種可逆終止子技術(shù)不同，這里的可逆終止子全部用相同的染料標(biāo)記，并按照預(yù)先設(shè)定的順序進(jìn)行單獨(dú)供應(yīng)。每次結(jié)合都會(huì)發(fā)出一個(gè)熒光信號(hào)。美國(guó)專利7，169，560介紹了使用這一可逆引物技術(shù)的方法。如果沒(méi)有使用單個(gè)分子然后調(diào)整相位，一個(gè)給定分子簇中的數(shù)千個(gè)拷貝的模板不能有效的延伸它們的引物，無(wú)法延伸將會(huì)成為問(wèn)題。該技術(shù)的局限性是讀序較短，25個(gè)堿基，且易于發(fā)生缺失錯(cuò)誤。通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)分子標(biāo)記的DNA聚合酶與磷酸末端帶有FRET分子標(biāo)記的同源dNTP結(jié)合時(shí)，釋放的FRET信號(hào)測(cè)序。當(dāng)標(biāo)記的dNTP與模板鏈互補(bǔ)時(shí)便會(huì)結(jié)合，F(xiàn)RET由于兩個(gè)FRET分子的相互作用可指示堿基延伸過(guò)程，形成測(cè)序讀序。該方法的優(yōu)勢(shì)是可實(shí)時(shí)記錄DNA聚合反應(yīng)和合成未經(jīng)任何修飾的普通DNA分子，因此在美國(guó)專利申請(qǐng)[Hardin等，美國(guó)專利7，329，492；Korlach等，美國(guó)專利7，361，466]和EidJ等人的文章(2008)[PMID=19023044]中報(bào)道了更長(zhǎng)的DNA讀序。尚未經(jīng)過(guò)證明，這些方法可用于測(cè)定一個(gè)DNA分子堿基的完整信息。為提高速度并降低費(fèi)用，科研人員研發(fā)了通過(guò)雜交、合成(3’延伸)、連接、克隆聚合(polonypolymerization)、納米孔、聚合酶結(jié)合染料標(biāo)記的dNTP和其他的DNA測(cè)序方法。DNA測(cè)序技術(shù)的高速發(fā)展(如454的高通量焦磷酸測(cè)序(454LifeSciences)(Marguliesetal.(2005)Nature437,376-380；Wheeleretal.(2008)Nature452,872-826；Ronaghi,etal.(1996)AnalBiochem242,84-89；Ronaghietal.(1998)Science281，363-365)，Illumina/Solexa的表面單克隆合成測(cè)序(Illumina)(Marguliesetal.(2005)Nature437,376-380；Wheeleretal.(2008)Nature452，872-826)，ABI的SOLiD技術(shù)("SupportedOligonucleotideLigationandDetection，，，AppliedBiosystems))(Cloonanetal.(2008)NatMethods5，613-619)，基因組學(xué)分析，生物信息學(xué)技術(shù)給研究人員獲得復(fù)雜的生物學(xué)系統(tǒng)中深度的分子圖譜帶來(lái)了可能。從技術(shù)上講，下一代測(cè)序技術(shù)通過(guò)以下幾點(diǎn)簡(jiǎn)化和加快了測(cè)序過(guò)程a)去除了傳統(tǒng)測(cè)序樣品制備中所需的單獨(dú)克??；b)平行制備數(shù)百萬(wàn)個(gè)需要分析的序列；C)同時(shí)檢測(cè)數(shù)百萬(wàn)個(gè)測(cè)序信號(hào)。然而，大規(guī)模測(cè)序技術(shù)存在著以下幾個(gè)常見(jiàn)的缺點(diǎn)，包括d)每個(gè)dNTP的增加都需要逐級(jí)(循環(huán))反應(yīng)，限制了測(cè)序方法的讀長(zhǎng)(表1和Solexa和SOLiD測(cè)序的讀長(zhǎng)都均無(wú)法超過(guò)IOObp)；e)循環(huán)反應(yīng)同時(shí)還限制了全長(zhǎng)測(cè)序的速度。Solexa測(cè)序每個(gè)步驟需要超過(guò)2小時(shí)的時(shí)間，添加35個(gè)核苷酸共需要2天或更長(zhǎng)的時(shí)間，SOLiD則需要2倍的時(shí)間；f)某些途徑需要對(duì)dNTP進(jìn)行修飾，這些修飾進(jìn)一步增加了費(fèi)用并帶來(lái)如材料在儲(chǔ)存和使用過(guò)程中的穩(wěn)定性等問(wèn)題；g)454不能處理基因組中的重復(fù)序列；h)測(cè)序讀序的質(zhì)量大約10%的序列質(zhì)量很差；i)利用短讀序的全基因組測(cè)序需要進(jìn)行深度測(cè)序，最長(zhǎng)可能20x。特別是現(xiàn)有的技術(shù)不能提供足夠長(zhǎng)的堿基讀長(zhǎng)?，F(xiàn)有的下一代測(cè)序方法的堿基讀長(zhǎng)過(guò)短而不能保證穩(wěn)定的高精確度的組裝長(zhǎng)鏈DNA用于重測(cè)序和新基因組的全基因組測(cè)序。一個(gè)長(zhǎng)度為20-30個(gè)堿基的DNA可能會(huì)在一個(gè)基因組中出現(xiàn)多次，因此它們的計(jì)數(shù)(counts)與基因組內(nèi)的豐度或重復(fù)出現(xiàn)(multiplepresences)無(wú)法區(qū)分。此外，某些基因組，例如人類，存在許多的重復(fù)序列，在這種情況下，不能確定大于30bp的堿基讀長(zhǎng)的精確基因組定位。因此當(dāng)下迫切需要提高新的超快測(cè)序技術(shù)的能力，使堿基讀長(zhǎng)至少能達(dá)到或高于Sanger測(cè)序法這樣的傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)。我們可以想象，這樣的測(cè)序技術(shù)將會(huì)在測(cè)序技術(shù)在需要更可靠的定量測(cè)定DNA或RNA拷貝的研究中大幅度的擴(kuò)大，以及會(huì)大幅度的擴(kuò)大依賴于較長(zhǎng)序列信息的測(cè)量(如新基因組測(cè)序和高度突變或反式剪接編碼序列研究)中的應(yīng)用范圍和規(guī)模。這樣的技術(shù)進(jìn)步同樣會(huì)減少數(shù)據(jù)分析所需的時(shí)間，優(yōu)勢(shì)是節(jié)省時(shí)間或全通量提高。因此，為實(shí)現(xiàn)DNA序列分析在人類醫(yī)療和基礎(chǔ)生命科學(xué)研究中的全部潛力，這些技術(shù)即使具有上述的各種改進(jìn)，也仍有幾個(gè)方面有待提高，其次，靶向測(cè)序仍需改進(jìn)。上述的幾種新測(cè)序方法隨機(jī)選取擴(kuò)增子，所以整個(gè)總體有限(如利用454焦磷酸測(cè)序檢測(cè)到25/48barcode序列(Leamon等，(2007)GeneTher.Reg.3，15-31)，表達(dá)會(huì)隨著樣本總體數(shù)量較大以及低豐度而降低，而且該方法會(huì)因特定種類序列的天然或?qū)嶒?yàn)偏好而產(chǎn)生選擇偏差)。因此，現(xiàn)有技術(shù)方法或許適用于發(fā)現(xiàn)，但是并不適用于傳統(tǒng)的靶向特異性Sanger測(cè)序法，因?yàn)樗鼈儫o(wú)法保證一條特定序列一定會(huì)被測(cè)序，并且需要運(yùn)行多次(通常10倍到20倍)測(cè)序以確保達(dá)到合理的靶序列覆蓋度和測(cè)序精確度。由于DNA有許多的重復(fù)和功能未知序列，上述的限制排除了許多應(yīng)用的可能性。除此之外，每個(gè)研究問(wèn)題感興趣的區(qū)域差異較大，例如，編碼或非編碼序列區(qū)域(smallRNA,內(nèi)含子區(qū)，基因間區(qū)域，非翻譯區(qū))，SNP，調(diào)控區(qū)(復(fù)制，轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控，其它遺傳學(xué)功能調(diào)控)，印跡或甲基化區(qū)域，反式剪接和轉(zhuǎn)座子區(qū)，或以上的結(jié)合。不同細(xì)胞器的DNA可能也需要篩選。還有許多生物醫(yī)藥基因組學(xué)應(yīng)用，如臨床分析，其需要大量樣品，但可能更關(guān)注一小部分的基因或突變位點(diǎn)。在需求很大但下一代測(cè)序技術(shù)單次運(yùn)行費(fèi)用仍然很高的情況下，急需將這些超快測(cè)序方法應(yīng)用到靶向特異性測(cè)序，使得每次反應(yīng)運(yùn)行都可以分析和系統(tǒng)研究大量不同的樣品?？朔F(xiàn)有的取樣限制將使測(cè)序技術(shù)在常規(guī)研究和臨床實(shí)驗(yàn)應(yīng)用中的潛力發(fā)揮到最大。最后，下一代測(cè)序技術(shù)的操作流程需要進(jìn)行簡(jiǎn)化。目前樣品制備和測(cè)序流程都很繁瑣，需要花費(fèi)數(shù)天時(shí)間并包含多步酶促反應(yīng)，通過(guò)合成延伸序列，每條鏈延伸需要4個(gè)堿基循環(huán)。這些復(fù)雜的操作步驟可能會(huì)帶來(lái)不穩(wěn)定的結(jié)果，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，需要專業(yè)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)。本發(fā)明提供了一個(gè)穩(wěn)定的測(cè)序系統(tǒng)，高度自動(dòng)化且常規(guī)使用可生成megabase(Mbp)到Gbp的數(shù)據(jù)量。本發(fā)明使用的方法與新一代測(cè)序的合成測(cè)序法相比更具優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明無(wú)需進(jìn)行傳統(tǒng)測(cè)序所需的單個(gè)樣品制備，并在靶向測(cè)序的速度上比下一代測(cè)序方法有顯著提高。本發(fā)明的器件與方法能生成長(zhǎng)度與傳統(tǒng)測(cè)序方法相當(dāng)?shù)鼫?zhǔn)確的讀序，提供更同步的讀序并將通量提高到傳統(tǒng)測(cè)序方法的上千倍。對(duì)于大規(guī)模實(shí)驗(yàn)，很多情況下都需要經(jīng)過(guò)篩選得到更小的子集，可通過(guò)雜交完成核酸的篩選。通常使用色譜分析法(親和分離，如沉淀析出和液體分層分離等物理方法分離)分離，通過(guò)微珠增加。小顆粒，有孔和無(wú)孔，多種形狀(片狀，球狀，棒狀，方形等)，洞狀或固體或?qū)訝罨蛴泻伺c外殼，來(lái)自于多種材料，包括但不限于玻璃，陶瓷，聚合物，金屬，金屬離子，半導(dǎo)體，以及上述材料的結(jié)合。例如，一個(gè)微珠可以包含一個(gè)被聚合物薄膜包裹或覆蓋的順磁性核心。順磁性核心便于利用磁力進(jìn)行微珠的運(yùn)送、分選和保存。另一種示范微珠則是在一個(gè)或多個(gè)部位帶有順磁性涂層，同樣也便于利用磁性控制微珠。還有另一種示范微珠包含一個(gè)固體核心，如玻璃，核心表面包裹一層聚合物基質(zhì)材料，可提高合成負(fù)荷。聚合物基質(zhì)材料材料包括但不限于低交聯(lián)聚苯乙烯，聚乙二醇和多種共聚物衍生物。微珠表面可以帶有功能基團(tuán)和分子，如核酸PCR擴(kuò)增的引物，等溫?cái)U(kuò)增，滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)和其他方法增加DNA或RNA等核酸的拷貝數(shù)。表面分子同樣可以帶有特異性的雜交探針，可作為捕獲探針或captor將所需的序列保留在表面上。帶有引物、captor或其他寡核苷酸的微珠被稱為探針微珠。雖然商業(yè)領(lǐng)域和科研實(shí)驗(yàn)室可以在微珠上常規(guī)進(jìn)行寡核苷酸的合成，但只有在皮升陣列芯片器件上才能進(jìn)行皮升規(guī)模的合成，平行合成上千個(gè)或更多不同的預(yù)先設(shè)計(jì)好的寡核苷酸，每條序列的量達(dá)到fmol(Tianetal.(2004)Nature432,1050-1054；Zhouetal.(2004)NucleicAcidsRes.32，5409-5417)。寡核苷酸和他們的化學(xué)修飾衍生物可以將性能提高到應(yīng)用所需的水平。如專利PCT/US08/82167所述，利用這些微珠的合成能力和有效性生成靶序列篩選的探針微珠是可行的。許多探針設(shè)計(jì)的方法都是基于核酸互補(bǔ)鏈作用形成堿基配對(duì)和螺旋結(jié)構(gòu)。雜交特異性和親和力是評(píng)估探針質(zhì)量的重要參數(shù)。不同的探針設(shè)計(jì)還有不同的功能。一種探針設(shè)計(jì)成對(duì)單個(gè)探針具有高度特異性，因此不會(huì)出現(xiàn)交叉雜交。另一種探針則設(shè)計(jì)成捕獲靶序列中的一個(gè)區(qū)域或幾個(gè)區(qū)域，如IOMbp癌癥易感基因區(qū)域。捕獲這些區(qū)域的探針可通過(guò)不同的策略進(jìn)行設(shè)計(jì)，例如，考慮到特異性，靶序列的長(zhǎng)度，分布密度(每堿基探針數(shù))。因此，除了高度序列特異性探針外，第二種疊瓦型探針，即探針是以重疊或依次錯(cuò)位一個(gè)或多個(gè)核苷酸。這些探針是冗余的，雜交特異性和親和性(多數(shù)用Tm，即熔點(diǎn)表達(dá))是不一致的。9這種探針的捕獲性質(zhì)基本上是隨機(jī)的，而且被捕獲序列的拷貝數(shù)差異很大。這同樣表示靶序列的拷貝數(shù)差異會(huì)很大。第三種探針被設(shè)計(jì)成覆蓋一個(gè)區(qū)域，且探針均勻的分布在感興趣的靶區(qū)域內(nèi)。樣品序列的平均長(zhǎng)度決定了探針之間的距離大小。例如，探針與探針間的距離基本與靶序列的平均長(zhǎng)度相同(假設(shè)靶序列是隨機(jī)斷裂產(chǎn)物)。在這種情況下，2-3個(gè)探針長(zhǎng)度的小范圍內(nèi)的探針篩選可以獲得更好的性能?？偟膩?lái)說(shuō)，這種探針的雜交效率和質(zhì)量更高。每個(gè)靶序列至少會(huì)與一個(gè)探針匹配。探針應(yīng)用于靶序列篩選時(shí)，可能需要減少探針的數(shù)量，并且，與靶序列雜交的探針數(shù)量被減到最少，這里，探針被有意設(shè)計(jì)成與盡可能多的靶序列共有序列(CR)區(qū)域(圖20)雜交。圖10說(shuō)明，10條直線(Si，S2…到S10)表示的10條DNA序列和3個(gè)CR探針(CR1，CR2，CR3)。通常，10條序列需要10條探針；但在圖20中，CRl探針可捕獲3條靶序列(圖21表示在錯(cuò)配點(diǎn)上，CRl探針用A、C、G的混合物結(jié)合，因此同時(shí)合成了3條靶序列的特異性探針)，CR2捕獲4條靶序列，CR3捕獲5條靶序列。靶序列S3和SlO被捕獲了2次。遵循這些工作原理，沒(méi)有必要在這些應(yīng)用中進(jìn)行高度特異性雜交，那么可以允許錯(cuò)配的出現(xiàn)并將多條不同的靶序列對(duì)應(yīng)于同一個(gè)CR探針。共有探針雜交法可以節(jié)省探針合成的費(fèi)用，而且不同靶序列的雜交拷貝數(shù)基本相同。因此，CR探針同時(shí)減少了雜交拷貝數(shù)的差異。圖22表示可將CR探針固定在磁珠上以方便使用。在本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，用鏈霉親和素包被磁珠，CR探針用生物素修飾。靶序列與磁珠上的CR探針雜交，通過(guò)沖洗磁珠洗脫沒(méi)有選定的序列。洗提收集雜交的靶序列用于下一步應(yīng)用。CR探針和特異性捕獲探針的一個(gè)常見(jiàn)應(yīng)用是用于富集miRNAs靶序列以及CR探針作為成熟體miRNAs的互補(bǔ)序列。其他的應(yīng)用包括癌癥基因，P450基因，HLA基因等。靶序列來(lái)自于序列數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)一系列規(guī)則(如允許錯(cuò)配)的比對(duì)分析可鑒定CR探針。圖22表示可將CR探針固定在微珠上以方便使用。在本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，微珠包被了鏈霉親和素，CR探針用生物素修飾。靶序列與磁珠上的CR探針雜交，通過(guò)沖洗微珠除去沒(méi)有選定的序列。洗提收集雜交的靶序列用于下一步應(yīng)用。CR探針和特異性捕獲探針常見(jiàn)應(yīng)用于富集miRNAs的靶序列，以及CR探針作為成熟體miRNA的互補(bǔ)序列。其他的應(yīng)用包括癌癥基因，P450基因，HLA基因等。靶序列來(lái)自于序列數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)一系列規(guī)則(如允許錯(cuò)配)排列的分析可鑒定CR探針。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及高通量、長(zhǎng)鏈測(cè)序、精確、快速和低成本的DNA測(cè)序器件與方法。本發(fā)明涉及下一代長(zhǎng)鏈測(cè)序長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序(NG-SS，下一代Sanger測(cè)序法)技術(shù)，該技術(shù)利用經(jīng)過(guò)時(shí)間檢驗(yàn)的Sanger測(cè)序法和毛細(xì)管電泳建立了一個(gè)基于微珠的大規(guī)模平行反應(yīng)Sanger測(cè)序反應(yīng)的新平臺(tái)，通過(guò)在一個(gè)三維(3D)高密度毛細(xì)管模塊上獨(dú)立設(shè)置上百萬(wàn)條不同序列，電泳分離測(cè)序片段，快速獲取毛細(xì)管模塊出口面的熒光圖像，利用快速記錄的時(shí)間-分辨圖像來(lái)重組序列信息。這些方法的結(jié)合為克服現(xiàn)有下一代測(cè)序方法的短讀長(zhǎng)和逐步(或循環(huán))反應(yīng)限制提供了可靠的解決方案。本發(fā)明的方法與器件將測(cè)序通量提高到傳統(tǒng)Sanger測(cè)序法的上千倍。本發(fā)明的器件提供了操作簡(jiǎn)單快速、可在數(shù)小時(shí)內(nèi)精確讀取基因組規(guī)模序列(上億個(gè)bp)、成本更低的測(cè)序儀器。除了長(zhǎng)鏈測(cè)序外，本發(fā)明的器件與方法比先前技術(shù)相比，具有的另一優(yōu)勢(shì)是高通量樣品處理無(wú)需進(jìn)行克隆。本發(fā)明的器件采用2D毛細(xì)管模塊而不是ID毛細(xì)管排列，因此將通量提高了η倍(η為二維中的列數(shù))。本發(fā)明的器件具有數(shù)百萬(wàn)個(gè)測(cè)序毛細(xì)管。本發(fā)明的方法提供了高容量，短的靶序列，可以一起連接到連續(xù)的聚合物中(即串聯(lián)體)，特別為同系物的延伸，長(zhǎng)重復(fù)和結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)提供更精確的測(cè)序。本發(fā)明的方法不涉及現(xiàn)有3種下一代測(cè)序技術(shù)所需的dNTP測(cè)序循環(huán)(454測(cè)序需要焦磷酸檢測(cè)和每次增加一種dNTP，Solexa測(cè)序的每個(gè)循環(huán)需要增加染料標(biāo)記dNTP，SOLiD測(cè)序每個(gè)反應(yīng)運(yùn)行需要5次寡核苷酸連接)，因此顯著地減少了測(cè)序時(shí)間。本發(fā)明的方法中，可以持續(xù)記錄每個(gè)毛細(xì)管道的測(cè)序數(shù)據(jù)。本發(fā)明的方法與器件可以顯著減少測(cè)序冗余要求(如對(duì)于基因組測(cè)序，Solexa和SOLiD序列需要20倍的冗余)；因此本發(fā)明的方法可節(jié)省重測(cè)序的時(shí)間和費(fèi)用。本發(fā)明的毛細(xì)管電泳陣列模塊在沖洗填充膠體之后可重復(fù)使用。毛細(xì)管表面沒(méi)有分子衍生，因此CE模塊是可再生的。本發(fā)明的CE器件可以模塊化，可用于建立同時(shí)滿足基因組規(guī)模和常規(guī)測(cè)序需求的小型實(shí)驗(yàn)室或基因組測(cè)序儀。本發(fā)明的器件與方法可通過(guò)靶向特異性捕獲分析序列應(yīng)用于同步測(cè)序和平行測(cè)核酸拷貝數(shù)。測(cè)量的范圍很寬，可以遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)現(xiàn)有的Biotrove300納升反應(yīng)平板；在序列信息方面，與現(xiàn)有的僅通過(guò)雜交識(shí)別序列的探針?lè)▽?shí)時(shí)定量PCR相比，本方法將假陽(yáng)性減至最少。超快測(cè)序和雜交微陣列將會(huì)成為DNA和RNA基因組規(guī)模或特異的小子集基因組的發(fā)現(xiàn)和全方位、深度(in-d印th)、精確、定量分析的互補(bǔ)技術(shù)。圖1所示為皮升級(jí)微流體陣列合成器件的示意圖。圖2所示為用于合成陣列的玻璃平板。圖3所示為二元微珠分揀合成系統(tǒng)的示意圖。圖4所示為微珠合成系統(tǒng)和進(jìn)程模式的示意圖。圖5所示為寡核苷酸探針微珠分子的實(shí)例示意圖。圖6所示為合成表面合成探針示意圖。圖7所示為充滿了反應(yīng)微珠的反應(yīng)小室的顯微圖像。圖8所示為探針微珠作為擴(kuò)增引物的示意圖。圖9所示為微珠在表面的圖像。圖10所示為比較在寡核苷酸混合過(guò)程中使用和未使用磁性鏈霉親和素微珠的結(jié)果的實(shí)驗(yàn)流程。圖11所示為本發(fā)明中一種樣品制備方法的示意圖。設(shè)計(jì)步驟1111到1114用于完成單個(gè)DNA分子的克隆乳液PCR(emPCR)，生成包含單個(gè)序列擴(kuò)增子的微珠。步驟1115到1118是設(shè)計(jì)用於完成Sanger反應(yīng)，在每個(gè)微珠上生成一整套來(lái)自于單個(gè)模板序列的純凈、熒光標(biāo)記的Sanger測(cè)序片段。圖12所示為在帶有Sanger產(chǎn)物捕獲序列的微珠上進(jìn)行乳液Sanger擴(kuò)增反應(yīng)的示意圖。圖13所示為由一個(gè)毛細(xì)管陣列電泳子系統(tǒng)和一個(gè)激光共聚焦掃描顯微鏡檢測(cè)子系統(tǒng)組成的集成系統(tǒng)的示意圖。圖14A所示為毛細(xì)管陣列組成的電解池的剖面示意圖。圖14B所示為毛細(xì)管陣列模塊的3D視圖。圖15所示為一個(gè)毛細(xì)管孔室部分來(lái)源_室末端的放大視圖。圖16所示為從圖像數(shù)據(jù)到序列處理過(guò)程的示意圖。圖17所示為隨著DNA膠遷移的時(shí)間進(jìn)程檢測(cè)到的圖像，圖像上方為2個(gè)放射波長(zhǎng)(FAM:510nm,Cy3:535nm)下檢測(cè)到的時(shí)間-依賴性信號(hào)強(qiáng)度。圖18所示為毛細(xì)管通道垂直面上獲得的時(shí)間_分辨圖像。圖19所示為微型毛細(xì)管芯片表面的放大視圖，表示微珠加載到填充膠體的毛細(xì)管通道內(nèi)。圖20所示為發(fā)現(xiàn)一系列DNA或RNA序列(如Si，S2···S10，但不限于10條序列)的共有區(qū)域(CR)的示意圖。圖21所示為設(shè)計(jì)一系列DNA或RNA的共有區(qū)域(CR)探針的示意圖。圖22所示為使用磁珠(但不限于磁珠)上的CR探針通過(guò)雜交捕獲DNA或RNA靶標(biāo)序列的示意圖。圖23所示為點(diǎn)擊(Click)化學(xué)反應(yīng)的一個(gè)示例。圖24所示為核酸聚合鏈中結(jié)合的dU的的化學(xué)結(jié)構(gòu)，dU的5-端是可進(jìn)行點(diǎn)擊(Click)反應(yīng)連接基團(tuán)和官能團(tuán)修飾的。圖25所示為核酸聚合鏈中結(jié)合的dU的的化學(xué)結(jié)構(gòu)，dU的5-端是可進(jìn)行點(diǎn)擊(Click)反應(yīng)連接基團(tuán)和官能團(tuán)修飾的，或是與再加的雙官能團(tuán)的連接分子(L3)進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)而可進(jìn)行點(diǎn)擊(Click)或官能團(tuán)修飾。圖26所示為一個(gè)由在互補(bǔ)鏈上的兩個(gè)修飾的殘基形成的共價(jià)鍵連接而鎖住的雙鏈。具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及高通量、長(zhǎng)鏈測(cè)序、精確、快速和低成本的DNA測(cè)序器件與方法。本發(fā)明涉及新一代長(zhǎng)鏈測(cè)序(NG-SS，新一代Sanger測(cè)序法)技術(shù)，利用經(jīng)過(guò)時(shí)間檢驗(yàn)的Sanger測(cè)序法和毛細(xì)管電泳建立一個(gè)基于微珠的大規(guī)模平行反應(yīng)Sanger測(cè)序反應(yīng)的新平臺(tái)，該方法的原理是將上萬(wàn)條不同序列分別至于一個(gè)三維(3D)高密度毛細(xì)管模塊上，電泳分離測(cè)序片段，快速獲取毛細(xì)管模塊出口平面的熒光圖像，利用快速記錄的時(shí)間-分辨圖像來(lái)重組序列信息。本發(fā)明為大規(guī)模平行制備探針和探針微珠提供了方法和器件。在本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，探針合成方法為陣列上進(jìn)行的微型化原位合成(見(jiàn)圖1與圖2)。以每個(gè)探針fmol到pmol的數(shù)量同時(shí)合成幾千到幾萬(wàn)個(gè)探針，這些探針連接到微珠原料上形成探針微珠。探針可以對(duì)但是不局限于DNA，RNA,碳水化合物，多肽，脂類，小分子和其他有用的分子嵌合體進(jìn)行生物檢測(cè)。本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施例，提供了一個(gè)二元分揀合成系統(tǒng)(圖3和圖4)和方法提供快速平行合成的探針微珠，這些微珠是數(shù)字編碼，便于可以根據(jù)設(shè)計(jì)在每個(gè)微珠上特定的合成探針。這種合成方法使用了直徑從納米到毫米的微珠，生產(chǎn)出每個(gè)的數(shù)量為fmol到nmol的探針。本實(shí)驗(yàn)提供了基因組和大規(guī)模生物相關(guān)領(lǐng)域不同應(yīng)用的通用產(chǎn)物。在本發(fā)明中，在表面可容納分子陣列的器件中完成探針合成。一個(gè)陣列的每個(gè)平方厘米面積內(nèi)至少包含400種不同的探針，最好是1000個(gè)以上的不同分子。每種探針的合成濃度都在sub-fmol到nanomol，最好是pmols濃度。圖1所示為微流體皮升陣列合成器件示意圖(Zhou,X等，2004，NucleicAcidsRes.32，5409-5417；在此以提述方式納入)。在200pL反應(yīng)小室中每個(gè)探針平行完成探針合成。合成結(jié)束后，探針衍生一個(gè)長(zhǎng)連接基團(tuán)用來(lái)支撐功能性微珠與功能性基團(tuán)形成共軛，以形成探針微珠。在本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，如圖1所示的合成器件含有近4，000個(gè)反應(yīng)小室。這種類型的反應(yīng)器件可以包含更小的(即幾百個(gè))或更大數(shù)量的反應(yīng)小室(即幾千個(gè)或更多)。這些反應(yīng)小室內(nèi)可能包含諸如IOmTantagelbeads(PolymereGmbH)數(shù)量的微珠。這些微珠的表面容量可以支持IOpmol以上的分子合成，這大約是直徑90x200m2平面反應(yīng)單元容量的10，000倍。生成探針微珠的另一種方法必需逐個(gè)添加單位序列(例如如核苷酸單體或氨基酸)到標(biāo)記好的微珠，并在每次添加之間引入一個(gè)分選步驟。分揀步驟隔離所有在下個(gè)步驟容易受到同樣影響的微珠，在此之后，微珠可以重新排序以進(jìn)入下一個(gè)步驟。例如，圖3與圖4所示為合成寡核苷酸納米微珠的一個(gè)較優(yōu)方法，該方法可將一個(gè)特定分子添加到一個(gè)特殊標(biāo)記的微珠上。微珠可通過(guò)多種方式進(jìn)行標(biāo)記，包括但不限于熒光、射頻、分子標(biāo)記、分子序列標(biāo)記、光學(xué)、磁性、光磁性或是以上的組合。在這種合成寡核苷酸納米微珠的方法中，用標(biāo)記、延伸的納米微珠(如OH官能化Tentagel(IOym)充填4個(gè)反應(yīng)室(見(jiàn)圖3，302到305)。每個(gè)反應(yīng)室相當(dāng)于4種DNA核苷酸A、T、C、G的其中一種。在向反應(yīng)室的每個(gè)微珠添加特定的核苷酸后，通過(guò)再次分選，對(duì)應(yīng)于下一個(gè)即將添加到鏈上的核苷酸的微珠進(jìn)入反應(yīng)室內(nèi)。例如圖3所示的8條序列。這些序列對(duì)應(yīng)于8個(gè)需要合成的不同分子。在3’-5’合成(本發(fā)明的方法無(wú)合成方向的限制)的第一個(gè)循環(huán)中，對(duì)應(yīng)于序列4和8的納米微珠將會(huì)在IA反應(yīng)室(見(jiàn)圖3，302)中開(kāi)始添加腺苷(A)單體。同樣，對(duì)應(yīng)于序列1的微珠將會(huì)置于IC反應(yīng)室(見(jiàn)圖3，303)中，對(duì)應(yīng)于序列2，3，5的微珠將會(huì)置于IT反應(yīng)室(見(jiàn)圖3，305)中，對(duì)應(yīng)于序列7的微珠將會(huì)置于IG反應(yīng)室(見(jiàn)圖3，304)中。各反應(yīng)室相應(yīng)的核苷酸將會(huì)添加到微珠上。本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，核苷酸單體為5’-DMT保護(hù)的保守單體。在偶聯(lián)反應(yīng)完成后，微珠進(jìn)行分選，在反應(yīng)室中按照所需序列的第二個(gè)核苷酸進(jìn)行重新分配。例如圖3中，對(duì)應(yīng)于序列1的微珠從IC反應(yīng)室(見(jiàn)圖3，303)轉(zhuǎn)移到添加鳥(niǎo)嘌呤核苷酸的IIG反應(yīng)室(見(jiàn)圖3，308)。對(duì)應(yīng)于序列2的微珠從IT反應(yīng)室(見(jiàn)圖3，305)轉(zhuǎn)移到添加鳥(niǎo)嘌呤核苷酸的IIG反應(yīng)室(見(jiàn)圖3，308)。對(duì)應(yīng)于序列3的微珠從IT反應(yīng)室(見(jiàn)圖3，305)轉(zhuǎn)移到添加腺嘌呤核苷酸的IIA反應(yīng)室(見(jiàn)圖3，306)。對(duì)應(yīng)于序列4的微珠從IA反應(yīng)室(見(jiàn)圖3，302)轉(zhuǎn)移到添加胸腺嘧啶核苷酸的IIT反應(yīng)室(見(jiàn)圖3，309)。對(duì)應(yīng)于序列5的微珠從IT反應(yīng)室(見(jiàn)圖3，305)轉(zhuǎn)移到添加胞嘧啶核苷酸的IIC反應(yīng)室(見(jiàn)圖3，307)。對(duì)應(yīng)于序列6的微珠從IT反應(yīng)室(見(jiàn)圖3，305)轉(zhuǎn)移到添加鳥(niǎo)嘌呤核苷酸的IIG反應(yīng)室(見(jiàn)圖3，308)。對(duì)應(yīng)于序列7的微珠從IG反應(yīng)室轉(zhuǎn)移到添加胸腺嘧啶核苷酸的IIT反應(yīng)室(見(jiàn)圖3，309)。對(duì)應(yīng)于序列8的微珠從IA反應(yīng)室(見(jiàn)圖3，302)轉(zhuǎn)移到添加胞嘧啶核苷酸的IIC反應(yīng)室(見(jiàn)圖3，307)。重復(fù)合成與分選循環(huán)，直到合成想要的序列。本發(fā)明的方法不局限于已經(jīng)討論過(guò)的分子類型。在本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，可在可尋址的納米微珠上可修正的原位合成DNA、RNA、多肽、碳水化合物或其他分子。同時(shí)，本發(fā)明的合成方法也不局限于可用來(lái)合成分子納米微珠的反應(yīng)小室的數(shù)目。如圖5所示，當(dāng)使用單一的反應(yīng)小室時(shí)，可以設(shè)想每個(gè)單體種類加到多重反應(yīng)小室。反應(yīng)室也可同時(shí)利用遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)一個(gè)單一步驟。其他的合成步驟還包括二聚體和三聚體或更長(zhǎng)可用元素的利用。將被添加的不同元素的數(shù)量將確定必需的反應(yīng)小室的最低數(shù)量，使得每個(gè)元素必需有一個(gè)反應(yīng)小室。例如利用天然氨基酸合成多肽序列，依照序列的長(zhǎng)度可能會(huì)需要20種不同的合成反應(yīng)小室。合成器件也可以有單獨(dú)的反應(yīng)小室，小室可以相互間物理性密封，或者器件可以在反應(yīng)小室之間進(jìn)行流體連接，其中微珠可以流經(jīng)一個(gè)分選器件，并被重新分布到用分揀器件進(jìn)行流體連接的其他反應(yīng)小室。本發(fā)明的可尋址納米微珠的分子密度可以達(dá)到1-1，000，000分子/微珠。在某些較佳實(shí)施例中是單個(gè)分子粘附于納米微珠?？梢愿牧技{米微珠和其他的納米微粒，以便可以通過(guò)利用快速(107/min)珠子分選工具流式細(xì)胞儀進(jìn)行微珠的分選，產(chǎn)生基于既定性能珠子的預(yù)分選微珠池。這樣一個(gè)預(yù)分選微珠池克服了現(xiàn)有技術(shù)中需要從分子微珠混合物中隨機(jī)組裝冗余高水平陣列的局限性。預(yù)分選微珠允許選定可尋址納米微珠中特定的微珠，和/或特殊應(yīng)用中已知序列內(nèi)容的微珠池。標(biāo)記好的微珠可制作成各種形狀，包含但不限于圓柱形、管狀、球形、空心球、橢圓形或盤(pán)狀。為了保護(hù)活性基團(tuán)與其他物質(zhì)或微珠的物理性接觸，微珠可能包含凹座形狀或面積。例如，微珠可以做成在半節(jié)處有活性表面而鈴兩端被惰性原料覆蓋的鈴形。凹座結(jié)構(gòu)可以幫助避免微珠凝聚和/或受到活性表面基團(tuán)的損害。微珠的較佳尺寸為1納米到1厘米。理想尺寸為10微米到5毫米。標(biāo)記好的微珠可以用各種不同的原料制成，包括但不限于玻璃、陶瓷、聚合物、金屬、半導(dǎo)體或以上2種材料以上的結(jié)合。例如，一個(gè)微珠可以包含一個(gè)高分子材料膠囊化的順磁性核心。順磁性核心便于利用磁力進(jìn)行運(yùn)送、分選和保存微珠。另一種示范磁珠則是在一個(gè)或多個(gè)部位帶有順磁涂層，同樣也便于利用磁性控制微珠。還有另一種示范磁珠包含一個(gè)固體核心，如玻璃，這是一個(gè)為了提高合成負(fù)荷而包裹一層聚合物基質(zhì)材料。聚合物基質(zhì)材料包括但不限于低交聯(lián)聚苯乙烯，聚乙二醇和各種共聚物衍生物。(F.Z.D0rwald“OrganicSynthesisonSolidPhase:Supports，Linkers，Reactions，，，Wiley-VCH，2002;在此以提述方式納入)。利用微加工領(lǐng)域眾所周知的各種不同過(guò)程，可以產(chǎn)生微珠上的標(biāo)記標(biāo)簽。一種示范方法是激光標(biāo)記。激光標(biāo)記對(duì)激光加工領(lǐng)域內(nèi)的專業(yè)人員來(lái)說(shuō)是眾所周知白勺(J.C.Ion"LaserProcessingofEngineeringMaterials",ElsevierButterworth-Heinemann，2005；在此以提述方式納入)。通過(guò)電鍍或噴射可在玻璃纖維表面覆蓋一層鐵薄膜。較佳的薄膜厚度為5nm到5μπι。薄膜覆蓋技術(shù)對(duì)薄膜加工領(lǐng)域內(nèi)的專業(yè)人員來(lái)說(shuō)是眾所周知的(R.L.Comstock“IntroductiontoMagnetismandMagneticRecording”，JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork,1999；在此以提述方式納入)。光學(xué)標(biāo)記形式為同軸環(huán)標(biāo)簽，然后在纖維表面通過(guò)燒蝕鐵膜進(jìn)行激光標(biāo)記。通過(guò)保護(hù)性的薄硅膜或氣相淀積或利用溶膠凝膠法包覆纖維((M.A.Aegerter"Sol-GelTechnologiesforGlassProducersandUsers，，，KluwerAcademicPublishers,2004；在此以提述方式納入)。纖維被切割或削減形成圓筒形微珠。然后，微珠或者用適合的連接基團(tuán)衍生，或者包覆基體聚合物材料。上述方法僅是多種微珠加工過(guò)程的一個(gè)示例。例如，聚合物或金屬纖維或金屬絲可用作磁珠的核心。鐵薄膜可用順磁性鐵氧化物或鎳磷薄膜替代。深色的金屬氧化膜可沉積在磁性薄膜的上方生成通過(guò)激光打標(biāo)的高對(duì)比度標(biāo)簽。纖維可以在連接基團(tuán)衍生后或者基質(zhì)聚合物包覆后切割或削減。纖維與基體聚合物的涂層可以相似的方式完成，即把熔覆層置于玻璃纖維制造光學(xué)纖維。圖4所示為二元分揀合成系統(tǒng)示例的示意圖。該系統(tǒng)使用含有包含光學(xué)標(biāo)簽的微珠。在開(kāi)始合成之前，選擇一組帶有已知標(biāo)簽的微珠。每個(gè)微珠分配一條需要合成的序列。在開(kāi)始合成反應(yīng)時(shí)，包含微珠的溶液401通過(guò)通道入口402置于系統(tǒng)。當(dāng)微珠通過(guò)檢測(cè)入口404時(shí)，通過(guò)光學(xué)傳感器405讀取其標(biāo)簽。依靠標(biāo)簽和已設(shè)計(jì)序列，電磁發(fā)生器406L或406R活化使產(chǎn)生微珠流體，或者進(jìn)入流體通道407L或者進(jìn)入407R以完成一級(jí)分類。二級(jí)分類以相似的方式完成，通過(guò)檢測(cè)入口408和409，光學(xué)傳感器409和413，電磁發(fā)生器410L，410R，413L，和413R。微珠最終被引導(dǎo)進(jìn)入指定的反應(yīng)小室(414A,414B,414C,or414D)，在這里特定序列殘基將被添加到微珠上的分子基團(tuán)。雖然圖上沒(méi)有顯示，每個(gè)小室有可以容納微珠的機(jī)理。示范的保持機(jī)制包括但是不局限于機(jī)械塞子和磁場(chǎng)。當(dāng)所有的微珠被分揀并被放置于指定的反應(yīng)小室中，反應(yīng)試劑(例如417A)通過(guò)試劑傳送線(例如，415A)進(jìn)入反應(yīng)小室(414A，414B，414C，和414D)來(lái)進(jìn)行合成循環(huán)。反應(yīng)試劑通過(guò)排瀉線419排出。完成合成循環(huán)后，微珠從所有的反應(yīng)小室中釋放出來(lái)，并被推入循環(huán)線418。隨著排瀉線419的關(guān)閉(排氣閥未在圖中顯示)，然后微珠通過(guò)返回通道返回到一級(jí)分揀系統(tǒng)。然后開(kāi)始下一個(gè)分揀和合成循環(huán)。合成循環(huán)重復(fù)直到合成所有指定的序列。本發(fā)明可用于任何已知的固相和組合合成工藝(U.S.Pat.No.7，190，522和參考文獻(xiàn)；在此以提述方式納入)。圖4所示的流通管道可用玻璃、塑料、硅或其它合適的材料制作而成。管道直徑大小依據(jù)用途可從亞微米到毫米不等。若是在小微珠上進(jìn)行合成，較佳的流通管道直徑為大約1到200微米之間。管道可在玻璃或硅薄片上通過(guò)蝕刻制作。在同一薄片上還可生成反應(yīng)室(414A，414B，414C和414D)。若是在較大的微珠上進(jìn)行合成，如基體聚合物包被的微珠，較佳的流通管道直徑為大約100微米到1毫米之間。此時(shí)可以用玻璃、含氟聚合物或其它耐化學(xué)品材料制作的傳統(tǒng)管道。反應(yīng)室(414A，414B，414C和414D)可用含氟聚合物和聚次苯基硫醚等耐化學(xué)品聚合物、玻璃或不銹鋼制作而成。圖3與圖4所示的二元分揀合成系統(tǒng)僅是多種不同情況中的一個(gè)示例。例如，可在回收管線403和檢測(cè)區(qū)404之間設(shè)置一個(gè)緩沖室，可更好的調(diào)控微珠流動(dòng)?？稍诿總€(gè)反應(yīng)室(414A，414B,414C和414D)底部設(shè)置一個(gè)活動(dòng)玻璃料濾片，將試劑運(yùn)輸管線置于濾片之下而底物微珠置于濾片之上。在這種布置之下，反應(yīng)室中的反應(yīng)器件可以用浮床方式控制，而合成反應(yīng)過(guò)程中可以收到良好的傳質(zhì)效果。增加分選級(jí)數(shù)可以滿足更多不同殘基的需求，如多肽合成過(guò)程。在一個(gè)較佳實(shí)施模式中，光傳感器405、409和413是光電二極管。在另一個(gè)較佳實(shí)施模式中，光傳感器是CCD(charge-coupleddevice，電荷耦合傳感器)。在某些操作模式中光傳感器405只需要1個(gè)，例如微珠在分選管道中的流量穩(wěn)定或是可預(yù)見(jiàn)時(shí)，或是2個(gè)相鄰微珠間的時(shí)間間隔足夠長(zhǎng)，在第一個(gè)微珠進(jìn)入選定的反應(yīng)室之后第二個(gè)微珠再經(jīng)過(guò)檢測(cè)區(qū)404。雖然圖中未顯示，但可能需要照明燈和光傳感器配合使用。光傳感器(405、409和413)，磁場(chǎng)發(fā)生器(406L，406R，410L，410R，413L和413R)和流量控制閥門(mén)(圖4中未顯示)可與一臺(tái)或多臺(tái)計(jì)算機(jī)連接并由計(jì)算機(jī)控制它們的信號(hào)收集和/或移動(dòng)運(yùn)動(dòng)15(actuations)。也可以使用其它的磁性編碼和解碼方法。在這種情況下，可以在流動(dòng)通道的側(cè)邊設(shè)置一個(gè)磁記錄頭。二進(jìn)制編碼可以記錄或讀取或者可以像一個(gè)或多個(gè)磁帶或磁盤(pán)的數(shù)字記錄一樣的方式形成順磁性薄膜覆蓋的微珠。微珠也可通過(guò)磁力之外的力量或影響進(jìn)行操控。例如，利用壓電器件可在流動(dòng)通道內(nèi)部產(chǎn)生機(jī)械變形控制微珠的流動(dòng)方向。利用激光或電阻元件產(chǎn)生熱能可在通道孔內(nèi)產(chǎn)生流動(dòng)干擾影響微珠的流動(dòng)方向。用一個(gè)計(jì)算機(jī)控制的ID或2D的運(yùn)輸臂配合編碼解讀器件可以替代圖4所示的二元分揀機(jī)理，將標(biāo)記的微珠運(yùn)送到選定的反應(yīng)室內(nèi)。本發(fā)明通過(guò)減少總的操作步驟和使用先進(jìn)的微粒分選技術(shù)大大提高了合成速度。合成中每個(gè)反應(yīng)的循環(huán)，以每秒幾百到幾百萬(wàn)的速度進(jìn)行微珠的選擇。在本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，所有指定序列的合成結(jié)束以后，帶有標(biāo)簽的微珠可用于在微珠表面進(jìn)行檢驗(yàn)或通過(guò)從微珠上剪切合成產(chǎn)物生成原料。使用基體聚合物膠囊化的微珠尤其適用于生成脫離微珠的合成產(chǎn)物。將帶標(biāo)簽的微珠放入96孔、384孔、1536孔或其它定制格局的剪切反應(yīng)室中進(jìn)行平行的剪切反應(yīng)，得到單獨(dú)的序列產(chǎn)物?？赏ㄟ^(guò)一個(gè)計(jì)算機(jī)控制的運(yùn)輸臂配合編碼解讀器件放置帶標(biāo)簽的微珠。將所有或選定的一部分微珠放入剪切反應(yīng)室進(jìn)行剪切反應(yīng)可以得到一個(gè)混合產(chǎn)物。此合成與傳統(tǒng)的逐個(gè)寡核苷酸合成相比只消耗千分之一或更少的溶劑且生成的每條序列是fmol到nmol，更好的情況下是pmol到幾nmol的材料，如Illumina公司用于生成微珠微陣列的寡核苷酸微珠的過(guò)程(www.illumina.com)0在本發(fā)明中，用于承載探針的微珠具有多種性能。微珠的大小最好是在幾個(gè)納米至幾個(gè)毫米范圍內(nèi)，在芯片合成器件中最適宜使用1微米左右的微珠。在二元分揀合成系統(tǒng)中，微珠的最佳直徑范圍為幾個(gè)微米到毫米之間。微珠或納米和微米級(jí)顆粒的形狀可以是球形、細(xì)長(zhǎng)形、圓柱形狀及其他不規(guī)則形狀。在微珠表面可以添加有孔和/或無(wú)孔的顆粒涂層來(lái)提供需要的表面合成或附著的性能。表面官能化后可作為檢測(cè)探針的載體。制作探針微珠可以使用多種不同的微珠，包括但不限于二氧化硅微珠(如BandsLaboratories公司產(chǎn)品)，磁珠(如Invitrogen/Dynal公司產(chǎn)品)，高分子珠(如RappPolymere產(chǎn)品)。本發(fā)明中首選的四種微珠和相應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)黃金或黃金涂層球(lO-lOOnm，巰基基團(tuán))，抗生物素/鏈霉親和素涂層微珠(<10m，生物素基團(tuán))，TentaGel珠(RappPolymereGmbH,德國(guó)，1-100111，3、10、30111，朋2或0!1共軛化學(xué))，葡聚糖凝膠微珠(20-50、40_120m，羧基，NH2共軛化學(xué))。微珠可能包含用于檢測(cè)和鑒定的標(biāo)記/標(biāo)簽，如熒光分子(Fluoresbrite聚苯乙烯珠(Polysciences)，發(fā)光分子，發(fā)色團(tuán)分子，磁電子組/點(diǎn)，量子點(diǎn)，生物素等。本發(fā)明中，圖1所示的微流體芯片反應(yīng)器中使用的微珠是由穩(wěn)定的材料制作的，包括CPGkontrolledporeglasses，可控孔度玻璃)、交聯(lián)聚苯乙烯、和多種固相合成與分析中常用的樹(shù)脂。本發(fā)明涉及(圖5，501)含有如烷基、聚乙烯糖基鏈等表面連接基團(tuán)和間隔(spacer)基團(tuán)的探針?lè)肿拥墓腆w表面合成。連接基團(tuán)(圖5，501)是附著物在表面和間隔(spacer)的一個(gè)定位點(diǎn)(圖5，502)，為探針與目標(biāo)分子的相互作用提供了可及性和結(jié)構(gòu)的靈活性(圖5，505)。探針?lè)肿涌赏ㄟ^(guò)共軛作用(圖5，506)添加標(biāo)記(圖5，507)，用于檢測(cè)的熒光分子、發(fā)色團(tuán)分子，可連接到檢測(cè)分子或微珠基團(tuán)的生物素(圖5，507)。探針可在特定的剪切位點(diǎn)被剪切(圖5，504)。在本發(fā)明中的一個(gè)較佳實(shí)施例中，剪切位點(diǎn)(504)是dU(利用NewEnglandLab(NEB)的USER試劑盒剪切)，共軛位點(diǎn)(506)是一個(gè)生物素和鏈16霉親和素的連接，可連接到連有鏈霉親和素的納米微珠(507)上。本發(fā)明還涉及到加入的兩種分子，或分子與微珠，或微珠與表面的共軛反應(yīng)。具體，寡核苷酸可以附著到表面或微珠上，或溶液里的微珠附著在表面的寡核苷酸上。微珠表面反應(yīng)是利用溶液中的分子使用傳統(tǒng)方法實(shí)施的，官能化后與微珠表面反應(yīng)。一些共軛的化學(xué)連接方法是這些目的的適當(dāng)選擇(Kozlov，I.Α.等，2004，Biopolymers73,621-630；Soellner,Μ.B等，2003，J.Am.Chem.Soc.，125，11790-11791；Houseman,B.Τ.等，2002，Nat.Biotech.20，270-274；Farooqui,F.和Reddy,P.M.，2003，US2003/0092901；Wang,Q.等，2003，J.Am.Chem.Soc.，125，3192-3193；Clarke,W.等，2000，J.Chrom.A,888，13-22；Raddatz,S.^,2002,NucleicAcidsRes.30,4793-4802；Konecsni,Τ,andKilar,F.，2004，J.Chrom.A，1051，135-139；在此以提述方式納入)。在本發(fā)明中的一個(gè)較佳實(shí)施例中，在表面合成了一個(gè)超過(guò)100個(gè)寡核苷酸的陣列，末端基5’-末端最好是烷基生物素。將鏈霉親和素包被的磁珠(如DynabeadsM-270鏈霉親和素)溶液添加到表面上。生物素和鏈霉親和素是親和力很高的結(jié)合對(duì)(Kd>1013M)，溶液與表面接觸導(dǎo)致微珠寡核苷酸在表面的連接。如果當(dāng)寡核苷酸反應(yīng)位點(diǎn)的尺寸遠(yuǎn)大于微珠的尺寸時(shí)，反應(yīng)位點(diǎn)中的微珠會(huì)被同一種寡核苷酸所環(huán)繞(圖6)。在特定具體實(shí)例中，共軛到鏈霉親和素微珠上的生物素?；押塑账崾峭瑯拥男蛄幸陨梢恢橐环N寡核苷酸探針的微珠。本發(fā)明也涉及到連接兩種不同分子或分子和微珠，或微珠與表面的共軛反應(yīng)。具體來(lái)說(shuō)，寡核苷酸可以附著到表面或微珠上，或溶液里的微珠附著在表面的寡核苷酸上。共軛反應(yīng)可以發(fā)生在一對(duì)反應(yīng)物之間(來(lái)自這一對(duì)反應(yīng)物的第一和第二官能團(tuán))和多對(duì)反應(yīng)物之間(第二對(duì)反應(yīng)物的第三和第四官能團(tuán))。官能團(tuán)包含活性基團(tuán)和高親和力基團(tuán)，如炔基、烷基疊氮、氨基、羥基、巰基、醛、phosphoinothioester、馬來(lái)酰亞胺、琥珀酰亞胺、異氰酸酯、酯、胼、鏈霉親和素、親和素、neuavidin或生物素結(jié)合蛋白。在一個(gè)共軛反應(yīng)中，第一官能團(tuán)是生物素，第二官能團(tuán)是鏈霉親和素、親和素、neuavidin或其它生物素結(jié)合蛋白；在另一個(gè)共軛反應(yīng)中，第一官能團(tuán)是炔基，第二官能團(tuán)是疊氮；在另一個(gè)共軛反應(yīng)中，第一官能團(tuán)是氨基酸，第二官能團(tuán)是酯、琥珀酰亞胺或異氰酸酯；在另一共軛反應(yīng)中，第一官能團(tuán)是巰基，第二官能團(tuán)是phosphoinothioester、馬來(lái)酰亞胺；在另一共軛反應(yīng)中，第一官能團(tuán)是羥基，第二官能團(tuán)是酯、琥珀酰、琥珀酰亞胺或異氰酸酯；在另一共軛反應(yīng)中，第一官能團(tuán)是醛基，第二官能團(tuán)是胺或胼。按照附著的官能團(tuán)不同，官能團(tuán)對(duì)，如第一和第二官能團(tuán)是可以相互轉(zhuǎn)化的。在一個(gè)分子中包含的官能團(tuán)數(shù)量是沒(méi)有限制的，因此在一對(duì)分子或物質(zhì)之間可以發(fā)生一個(gè)或多個(gè)共軛反應(yīng)。兩個(gè)分子實(shí)體共軛的方法很多，具有實(shí)用價(jià)值的基本條件是(a)由此產(chǎn)生的共軛物適用于進(jìn)一步應(yīng)用，(b)共軛反應(yīng)位點(diǎn)應(yīng)該很容易制備，(c)反應(yīng)產(chǎn)生最少的副作用和/或非特異性反應(yīng)，(d)反應(yīng)時(shí)間應(yīng)適當(dāng)縮短。本發(fā)明中首選的四種微珠和相應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)金(納米，巰基基團(tuán))，鏈霉親和素涂層磁珠(<10m，生物素基團(tuán))，TentaGel珠(RappPolymereGmbH,德國(guó)，10m,NH2或OH共軛化學(xué))，葡聚糖凝膠微珠(25m，用于454測(cè)序技術(shù)，NH2共軛化學(xué))。鏈霉親和素包被磁珠廣泛應(yīng)用于利用生物素標(biāo)記篩選的不同序列分離；這種技術(shù)在純化、富集、分離和其他應(yīng)用方面使用廣泛。寡核苷酸的生物素官能化可以通過(guò)使用生物素改良試劑，利用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)(GlenResearch)修飾完成。這是一個(gè)亞磷酰胺試劑，可以在合成全長(zhǎng)序列后與一個(gè)寡核苷酸的5'-OH端偶聯(lián)。特定的生物素酰17化試劑在其偶聯(lián)到表面寡核苷酸后可以偶聯(lián)一個(gè)熒光染料。這種熒光標(biāo)記可以用于驗(yàn)證生物素基團(tuán)的結(jié)合。熒光分子可以作為合成的監(jiān)測(cè)工具，因此可以提供指導(dǎo)優(yōu)化生物素?；磻?yīng)。本發(fā)明包括制作可尋址探針納米微珠混合物的方法，其中每個(gè)納米級(jí)小球附著到一個(gè)單一類型的探針?lè)肿由?，包括a)在表面合成一個(gè)探針?lè)肿雨嚵?，這里分子具有第一個(gè)末端和第二個(gè)末端，這里第一個(gè)末端粘附于鏈接到表面的間隔(spacer)上，第二個(gè)末端可以偶聯(lián)到第一個(gè)官能化基團(tuán)；b)將一個(gè)官能化基團(tuán)共軛到第二個(gè)末端；c)將第二官能團(tuán)衍生的標(biāo)記納米微珠與探針?lè)肿由系牡诙┒说墓倌軋F(tuán)偶聯(lián)；d)從表面移除未偶聯(lián)的標(biāo)記納米微珠；e)給未偶聯(lián)的探針?lè)肿拥墓倌芑鶊F(tuán)加帽；f)從陣列上切下標(biāo)記探針納米微珠，以形成可尋址探針納米微珠混合物，其中每一個(gè)微珠都粘附有單一類型的探針?lè)肿印１景l(fā)明的陣列可以包含超過(guò)1000種不同的探針?lè)肿?。在較佳實(shí)例中，間隔(spacer)具有6_30個(gè)化學(xué)鍵，可以偶聯(lián)到剪切位點(diǎn)，這樣可尋址探針微珠可以從表面切除。功能性基團(tuán)可以是但是不局限于生物素，氨，炔，疊氮物，氨基，羥基，巰基，醛，phosphoinothioester,馬來(lái)酰亞胺，琥珀酰，琥珀，異氰酸鹽，酯，鏈，抗生物素蛋白，neuavidin和生物素結(jié)合蛋白。納米微珠可以和蛋白質(zhì)以及表面封閉溶液一起處理(例如，0.5%BSAinPBSbuffer)以防止跟探針共軛前發(fā)生非特異性結(jié)合。阻遏蛋白或無(wú)離子的表面活性劑可以用來(lái)降低背景的非特異性反應(yīng)。使用稀釋后的反應(yīng)溶液或者提高了離解能力的溶液進(jìn)行嚴(yán)格的洗滌。這進(jìn)一步消除了由于非特異性反應(yīng)而殘留在表面的微珠，提高了正確共軛微珠與非特異性結(jié)合微珠的比例。不同的反應(yīng)條件(例如，緩沖液，溶劑，溫度，PH和時(shí)間)可能對(duì)共軛反應(yīng)有顯著影響。本發(fā)明的一個(gè)首選方法，探針最好是10-200殘基的DNA寡核苷酸，和/或10-200殘基的RNA寡核苷酸，和/或10-200殘基的DNA和RNA嵌合體(DNA和RNA混合組成)。官能化可以通過(guò)化學(xué)共軛的方法實(shí)現(xiàn)。一個(gè)廣泛使用的方法是產(chǎn)生一個(gè)氨基基團(tuán)，比如在寡核苷酸序列中結(jié)合一個(gè)氨基修飾基團(tuán)或一個(gè)5-(3-amin0allyl)-dU或使用亞磷酰胺(GlenResearch)在5'-OH基團(tuán)上偶聯(lián)一個(gè)氨基酸連接基團(tuán)(圖5)。寡核苷酸的5'_端氨基基團(tuán)能與一個(gè)活化酯發(fā)生反應(yīng)，例如微珠表面的NHS酯涂層形成酰胺鍵。共軛寡核苷酸-微珠在絕大部分化學(xué)和生物測(cè)定條件下是穩(wěn)定的。官能化并不一定需要寡核苷酸的5'_末端氨基基團(tuán)；在其他寡核苷酸鏈中，該功能基團(tuán)并不一定需要寡核苷酸，其它的寡核苷酸鏈，可以去結(jié)合本發(fā)明所述的共軛化學(xué)討論到的適當(dāng)?shù)男揎?。在修飾基團(tuán)之間可形成分子內(nèi)部共軛連接。在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，官能化可通過(guò)吸附法完成。寡核苷酸可以用5'-巰基修飾(GlenResearch)，形成一巰基，那種包含硫醇的結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸。硫醇與金的表面具有高親和性。含有固定寡核苷酸的金球載體已成功地應(yīng)用于DNA檢測(cè)和納米結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。較好的官能化化學(xué)可與寡核苷酸合成或去保護(hù)化學(xué)作用兼容，且官能團(tuán)通常作為寡核苷酸固定到固體表面的修飾物。優(yōu)化適用于合成的表面連接化學(xué)和表面微珠-標(biāo)記寡核苷酸的切除可提高探針微珠混合物的生成效率。本發(fā)明還涉及到表面和溶液中的微珠的共軛反應(yīng)方法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，微珠表面用寡甘醇氨基基團(tuán)簇衍生。間隔(spacer)的總鏈長(zhǎng)如果用鍵的數(shù)量來(lái)衡量，其總長(zhǎng)度超過(guò)6，較好是18以上，最好是大于30。偶聯(lián)反應(yīng)溶液(DIC/DMAP(1，3-1，3-diisopropylcarbodiimide/dimethylaminopyridine)在DMF/CH2C12)中的微珠含有表面琥珀酰，可與表面連接基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，多次清洗表面，微珠會(huì)保留在表面上。相比之下，不含有表面琥珀酰的微珠因?yàn)榕c表面之間沒(méi)有形成共價(jià)鍵而被沖洗掉。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，微珠附著的表面是由圖1與圖7所示的三維反應(yīng)室組成的。微珠通過(guò)與孔室表面的共軛反應(yīng)固定于反應(yīng)室，使它們?cè)诙嗖交瘜W(xué)合成反應(yīng)中(圖7，702)不會(huì)因?yàn)橐后w流過(guò)通道(圖7，701)進(jìn)入孔室而脫離。微珠同時(shí)也被孔室兩側(cè)與流通管道垂直的2面分隔墻固定于孔室(圖7，703)。本發(fā)明的方法也提供了微珠表面官能化的優(yōu)化方法，因此可得到更高質(zhì)量的合成結(jié)果。反應(yīng)室尺寸為10到500微米，這比微珠尺寸(IOnrn至幾百m)大，使得單個(gè)反應(yīng)室內(nèi)可以固定大量的微珠，保證每次陣列合成可以合成足夠數(shù)量的分子。這樣在每個(gè)芯片中可合成足夠大數(shù)量的分子(如fmol到nmol，最好pmol至nmol之間)。在本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，圖1繪制了一個(gè)由三維反應(yīng)小室構(gòu)成的三維微流體PiCO-陣列的結(jié)構(gòu)，其中，每個(gè)反應(yīng)小室的表面積約為90X180mm2，高度為16_30m。圖1所示的陣列含有3，968個(gè)反應(yīng)室，可以容納3，968個(gè)獨(dú)立的合成反應(yīng)?；谏鲜龇磻?yīng)室的尺寸和反應(yīng)室中填充20%Im微珠的容量，每個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)可以容納將近8，100個(gè)或是更多的微珠。這一水平下，一次芯片合成生成的微珠可提供至少數(shù)百到一千個(gè)pmol水平的樣本檢測(cè)。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，在玻璃平板合成器件中(圖2)，探針合成并不局限于具有微珠附著表面的孔室(圖6)，或作為切下的分子混合物的探針，或是將切下的分子附著到放到探針溶液的微珠的探針微珠。根據(jù)微珠的尺寸和應(yīng)用，具有該尺寸反應(yīng)小室的陣列可以容納數(shù)百萬(wàn)個(gè)微珠。微粒體器件同時(shí)還可以根據(jù)應(yīng)用要求的不同增加或減小反應(yīng)室的大小。在本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，附著微珠上的分子合成是利用數(shù)控的投影光和光照射下形成的反應(yīng)試劑(PGR)進(jìn)行的。(GaoX等，US6,426,184,GaoX等，US7，235，670；在此以提述方式納入)。在光照射下光照引發(fā)反應(yīng)室內(nèi)微珠上的化學(xué)反應(yīng)。生物大分子可以通過(guò)重復(fù)光照、去保護(hù)和偶聯(lián)反應(yīng)步驟進(jìn)行合成。圖7所示為共軛到陣列芯片合成器件的微珠，這里IOm的TentaGel微珠以分散的形式裝載于微流體芯片上，通過(guò)與芯片表面的琥珀?；鶊F(tuán)發(fā)生反應(yīng)，微珠被固定于芯片表面上。為了適應(yīng)陣列合成，需要調(diào)整發(fā)出適宜光強(qiáng)度的光能量單位功率以及充滿了納米微珠的反應(yīng)小室內(nèi)的流體傳送器件。通常，合成表面位點(diǎn)需要數(shù)十mW到數(shù)百mW的光照能量；形成去保護(hù)反應(yīng)所需的足量光生成試劑。本發(fā)明中，陣列內(nèi)微珠上的分子合成方法的應(yīng)用之一是增加分子的合成產(chǎn)量?，F(xiàn)有陣列的每個(gè)反應(yīng)室大約只能合成Ifmol的寡聚物。而利用本發(fā)明的微珠合成方法，每個(gè)反應(yīng)室可以合成大約Ipmol到20pmol的產(chǎn)物。此外，基于陣列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，每個(gè)陣列可以合成4，000到100，000條不同的DNA寡核苷酸。增加的容積可以使得科研人員利用部分探針微珠寡核苷酸將測(cè)序重點(diǎn)集中在特別感興趣的區(qū)域。本發(fā)明中，陣列中微珠上的分子合成方法的應(yīng)用之一是增加分子的合成產(chǎn)量。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，一個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)使用偽密碼子(Gao，X.etal.,W02008/003100.)(偽密碼子是一個(gè)標(biāo)記，諸如Z，可以在合成中代表一個(gè)以上的單體構(gòu)造單元，例如，Z=A和G，合成人員可以利用這些信息進(jìn)行合成)。根據(jù)偽密碼子包含的單體數(shù)目，往合成中添加單體混合物會(huì)合成兩個(gè)以上的化合物。使用多個(gè)偽密碼子會(huì)形成組合庫(kù)。例如，對(duì)于低聚物合19成，如果第一個(gè)偽密碼子代表3個(gè)單體，第二個(gè)偽密碼子代表3個(gè)單體，低聚物的合成結(jié)果為形成9個(gè)不同化合物的庫(kù))。這樣，單個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)上可以得到多個(gè)不同分子。這種合成形式大大受益于本發(fā)明的方法和器件。合成庫(kù)中每個(gè)分子的數(shù)量遠(yuǎn)大于從傳統(tǒng)合成中所得的量。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了連接微珠到已在表面合成的分子上(圖7)的方法和器件。微珠可能連接的分子包括但不限于DNA、RNA、PNA、脂類、多肽、蛋白質(zhì)和碳水化合物。微珠的附著過(guò)程是分子末端或內(nèi)部的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的官能化，生成可與獨(dú)立分子或微珠發(fā)生親和結(jié)合或共價(jià)結(jié)合的活性位點(diǎn)。本發(fā)明的首選方法是將寡核苷酸的末端官能化，如5’末端，但是官能化可能選擇要合成的分子的任何位置。低聚物5’-官能化的一個(gè)好處是，合成失敗的序列在最后一步偶聯(lián)以后被加帽，這樣就不再參與官能化。這樣收集到的5’-官能化序列的質(zhì)量得到了提高。微珠切割以后可以收集探針并配制為混合物。例如，寡核苷酸分子將要從合成表面切除，這種情況下，寡核苷酸可以包含幾個(gè)功能位點(diǎn)(圖5，每一個(gè)寡核苷酸包含至少一個(gè)剪切位點(diǎn)[特定X，圖5]，一個(gè)5’-官能化位點(diǎn)[特定()圖5]，和一個(gè)微珠共軛位點(diǎn)[特定(0)，圖5])。但官能團(tuán)并不局限于末端位置，并且可在探針?lè)肿拥牟煌稽c(diǎn)合成。釋放表面分子到溶液中的剪切位點(diǎn)是特別設(shè)計(jì)的，因此可以得到進(jìn)一步應(yīng)用所需的分子。但是也有可能使用普通的堿性或酸性條件從表面分離探針?lè)肿?。也可能使用酶催化從表面分離探針?lè)肿?。探針?lè)肿忧懈钗稽c(diǎn)在合成條件下應(yīng)當(dāng)是穩(wěn)定的。探針微珠切割位點(diǎn)應(yīng)該在合成寡核苷酸后切割。通常，剪切固體支持物(如可控毛細(xì)玻璃(CPG))上的合成寡核苷酸的可以通過(guò)酯鍵的液體氨水解完成。然而，在陣列寡核苷酸合成過(guò)程中，寡核苷酸應(yīng)當(dāng)保留在表面用于檢測(cè)應(yīng)用，因此不可以使用跟CPG寡核苷酸合成相同的表面連接化學(xué)。美國(guó)專利7,211,654(GaoX.,etal.，在此以提述方式納入)介紹了一種從合成表面剪切寡核苷酸的方法；在此以提述方式納入。剪切的寡核苷酸具有3’-OH基團(tuán)，這樣合成的OligoMixTM可在多種應(yīng)用總使用，例如引物、誘變的克隆插入和siRNA序列庫(kù)。rU化學(xué)修飾既可以用于切割的核酸酶反應(yīng)，也可以用于堿性水解反應(yīng)。這些反應(yīng)可以與共軛鍵和化合物兼容，例如生物素-鏈霉親和素或共價(jià)氨基連接。本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，探針微珠寡核苷酸包含一個(gè)rU連接。表面的寡核苷酸合成中可以結(jié)合rU單體亞磷酰胺。切割反應(yīng)條件可以在特殊類型的探針微珠混合物的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化。通常，如果表面的寡核苷酸更加“易溶”，反應(yīng)效率越高。因此，在本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，利用連接基團(tuán)和(或)間隔(spacer)來(lái)實(shí)現(xiàn)效率更高的反應(yīng)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，連接基團(tuán)單元是丙胺。間隔(spacer)單元基于鏈的長(zhǎng)度是靈活的。六聚乙二醇可作為間隔(spacer)的建構(gòu)基礎(chǔ)。通過(guò)比較同一芯片不同反應(yīng)位點(diǎn)上包含不同間隔(spacer)長(zhǎng)度的序列，可以實(shí)現(xiàn)間隔(spacer)的長(zhǎng)度優(yōu)化。熒光信號(hào)強(qiáng)度的檢測(cè)可以提供產(chǎn)生有效合成的間隔(spacer)信息(它們具有更強(qiáng)的熒光信號(hào))。微珠探針混合物的制備過(guò)程包括寡核苷酸合成(圖6，901和902)、寡核苷酸官能化(圖6，903)、寡核苷酸微珠共軛(圖6，904)和微珠探針移除(圖6，905)。包含大量不同序列的探針微珠混合物可以應(yīng)用在各種方面，包括特殊靶標(biāo)測(cè)序和特殊靶標(biāo)擴(kuò)增。寡核苷酸可以作為捕獲探針(即雜交后隨后把雙鏈從樣本或模板探針(即PCR或其他擴(kuò)增方法的引物)中移除)用于擴(kuò)增特定的基因組區(qū)域，以及擴(kuò)增諸如癌相關(guān)基因的基因。本發(fā)明的探針微珠也可以通過(guò)如圖6(901和902)所示的分子陣列合成(平行以及大量不同的序列)獲得，接著從合成表面剪切下來(lái)后混合并通過(guò)共軛作用附著到微珠上。生成的探針微珠可以用于微珠，最好是納米微珠的標(biāo)記，標(biāo)簽和分類，納米微珠裝配和其他微珠或獨(dú)立或者作為一組混合物的應(yīng)用。本發(fā)明的微珠追蹤和分選方法提供了多種納米微珠靈活和不同的應(yīng)用。使用分選的納米微珠或通過(guò)微珠標(biāo)記和標(biāo)記檢測(cè)可以得到可尋址納米微珠陣列。納米微珠的標(biāo)記方法包括每個(gè)微珠的寡核苷酸編碼，測(cè)序解碼和多重?zé)晒鈽?biāo)記或使用組合方式(現(xiàn)在可以通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行操控)的內(nèi)置光學(xué)編碼微珠。根據(jù)使用者設(shè)計(jì)的可尋址納米微珠，這種標(biāo)記微珠的方法更容易裝配。通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的納米微珠比現(xiàn)有微陣列更具多樣性。本發(fā)明中的納米微珠陣列或探針微珠混合物可以包含混合分子微珠。例如，一系列廣泛的細(xì)胞蛋白表達(dá)譜或檢測(cè)可以為很多生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)提供關(guān)鍵信息。但在目前這是無(wú)法實(shí)現(xiàn)的，因?yàn)檫€沒(méi)有一個(gè)工具可以同時(shí)檢測(cè)不同的蛋白質(zhì)。然而，本發(fā)明的納米微珠或探針微珠混合物提供了具有不同分子探針的陣列，從而提供了一種可以同時(shí)會(huì)檢測(cè)樣本中多種不同類型分子的方法，例如核酸和蛋白質(zhì)。例如，蛋白質(zhì)的全方位檢測(cè)可以通過(guò)包含DNA和RNA分子探針的納米陣列完成，可以檢測(cè)核酸結(jié)合蛋白，多肽作為底物的同源蛋白和酶(如激酶和蛋白酶)。本發(fā)明的方法和成分提供了芯片上的高品質(zhì)合成寡核苷酸，也提供了監(jiān)測(cè)合成過(guò)程的方法。對(duì)合成過(guò)程的監(jiān)測(cè)可以進(jìn)行寡核苷酸質(zhì)量的控制和持續(xù)改進(jìn)。幾種方法在評(píng)價(jià)合成質(zhì)量上是有效的。將熒光殘留與不同長(zhǎng)度的寡核苷酸偶聯(lián)。這些反應(yīng)可以在較低熒光濃度下進(jìn)行，以避免表面染料分子的飽和。利用很好的描述的(特征鑒定明了的)控制序列雜交以獲取理想匹配(PM)與錯(cuò)位匹配(MM)比率。長(zhǎng)片段寡核苷酸的剪切和測(cè)序在表面完成的。最后，陣列合成的單個(gè)序列進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析。本發(fā)明制備納米微珠陣列和探針微珠混合物的首選方法是使用光生試劑(PGR)化學(xué)和微流體陣列技術(shù)(Paraflo:)來(lái)獲得，本發(fā)明的方法與器件適用于當(dāng)前的多種DNA微陣列，包括微流體picoarray平臺(tái)(單個(gè)陣列上有4，000-30,000個(gè)特征點(diǎn))，其他的從低到高密度的微陣列，(單個(gè)陣列上有40，000到大于1百萬(wàn)個(gè)特征點(diǎn))，Agilent陣列(40，000-200,000個(gè)特征點(diǎn))，Affymetrix/Nimblegen陣列(250，000到大于1百萬(wàn)個(gè)特征點(diǎn))，Nimblegen-typetechnology的Febit陣列(8，000-40,000)，或使用PGA化學(xué)合成的生物學(xué)發(fā)現(xiàn)(BioDiscovery)的玻璃平板陣列(>40，000個(gè)特征點(diǎn))?，F(xiàn)有的所有技術(shù)都適用于適當(dāng)?shù)奈⒅?共軛(隨著化學(xué)修飾的發(fā)展)以產(chǎn)生全面的探針微珠混合產(chǎn)物。本發(fā)明方法和器件使用的微珠具體不同的尺寸(亞微米到30m)以及使用不同的材料，包括但不限于金、聚苯乙烯、葡聚糖凝膠、和graftedpolyethyleneglycolandpolystyrene。通過(guò)系統(tǒng)優(yōu)化微珠加樣、表面相互作用、特殊親和結(jié)合或共價(jià)結(jié)合可以使微珠與寡核苷酸的共軛作用最大化，副作用的產(chǎn)生最小化。通過(guò)以上討論的方法獲得的探針微珠量較少，大約為0.Ifmolo在本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，芯片中的微珠呈現(xiàn)出單分散性。為了達(dá)到單分散性，需要考慮到幾個(gè)因素。溶劑(如偶極、密度、粘度、溫度等)、溶劑PH值和微珠的處理(濃度、混合方法、表面的開(kāi)啟或關(guān)閉等)會(huì)影響表面上微珠的均勻分布。21在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，需要在每個(gè)單位面積內(nèi)布滿盡量多的序列。對(duì)于雜交微陣列和探針微珠寡核苷酸，當(dāng)不必增加序列的密度時(shí)，一個(gè)積極的因素是增加合成寡核苷酸的拷貝數(shù)，可以在給定的區(qū)域獲得更多的序列。狀高聚物亞磷酰胺如trebleHGlenResearch,TreblerPhosphoramidte)就是這樣的例子，它可以偶聯(lián)芯片表面的羥基，然后進(jìn)行去保護(hù)形成3個(gè)羥基基團(tuán)，隨后在下一反應(yīng)中和3個(gè)亞磷酰胺分子偶聯(lián)。寡核苷酸產(chǎn)量的測(cè)定(由偶聯(lián)到序列的5’-末端熒光素決定)作為三倍偶聯(lián)的功能之一，得到原始OH數(shù)目的3X3，即9倍。Dentrimer法的局限性在于，只能在表面分子飽和表面之前或表面未太擁擠之前加入dentrimer。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，用探針和探針微珠來(lái)產(chǎn)生小滴形式的寡核苷酸庫(kù)。液體的濃度控制在大約nM(nanomolar)以便每個(gè)液滴都包含一種類型的探針或探針微珠。利用RainDance(http//www.raindancetechnologies.com/applications/next-generation-sequencing-technology.asp)的器件，樣品的液滴與特定寡核苷酸液滴混合，選擇用于富集特殊區(qū)域的探針作為PCR引物，能夠進(jìn)行對(duì)序列特異性測(cè)序和其它遺傳學(xué)分析?；谖⒅榈腟anger法樣品準(zhǔn)備在所有的下一代循環(huán)測(cè)序方法中一個(gè)基本的、普遍的方法就是利用體外單DNA分子擴(kuò)增法，他們通過(guò)在在管子中進(jìn)行的乳液PClUemulsionPCR)擴(kuò)增或是在玻璃表面上進(jìn)行的橋式PCR擴(kuò)增獲得足夠的分子進(jìn)行熒光檢測(cè)。在本發(fā)明中，乳液PCR擴(kuò)增的使用延伸到了基于微珠的Sanger擴(kuò)增反應(yīng)。傳統(tǒng)的低通量Sanger測(cè)序法依賴克隆或者PCR，一個(gè)管子(或者一個(gè)微量滴定孔)只進(jìn)行一個(gè)Sanger反應(yīng)，而本發(fā)明的方法采用了在一個(gè)PCR管子中進(jìn)行上萬(wàn)個(gè)甚至是更多的獨(dú)立反應(yīng)。這顯著縮短了樣本準(zhǔn)備的時(shí)間，試劑消耗也減少了上萬(wàn)或更多倍，因此降低了自動(dòng)化設(shè)備以及用品的費(fèi)用。在本發(fā)明中的一個(gè)實(shí)施例中，由于測(cè)序擴(kuò)增反應(yīng)采用雙脫氧的NTPs(ddNTPs)，其擴(kuò)增系數(shù)小于100，因此利用一個(gè)兩步法乳液PCR來(lái)確保生成足夠量的靶分子用于檢測(cè)。在本發(fā)明的較佳實(shí)施例中采用了一步法乳液PCR。圖11所示為本發(fā)明中樣品準(zhǔn)備方法的一個(gè)實(shí)施例的工藝流程圖。該實(shí)施例中的步驟包括但不限于模板擴(kuò)增(步驟1111-1114)和Sanger擴(kuò)增(步驟1115-1118)的乳液PCR擴(kuò)增。對(duì)基因組DNA測(cè)序而言，首先基因組DNA被剪切成片段化，之后通過(guò)連接反應(yīng)把通用接頭連接到片段上，從而形成PCR的模板(未在圖中顯示)。將模板加入到含有聚合酶1104、dNTPs1104以及反向引物1106的PCR反應(yīng)混合液中。對(duì)模板的濃度進(jìn)行優(yōu)化，使得形成乳液時(shí)平均每個(gè)包含水相微珠液滴內(nèi)均包含一個(gè)模板分子1102。在一個(gè)實(shí)施例中，每個(gè)微珠1103都與正向引物1101的多個(gè)拷貝共價(jià)結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施例中，每個(gè)微珠1103都與正向引物和反向引物的多個(gè)拷貝共價(jià)結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施例中，每個(gè)微珠1103都與PCR引物多個(gè)拷貝，還有設(shè)計(jì)用于通過(guò)雜交捕獲特異性或所有PCR產(chǎn)物的捕獲共價(jià)結(jié)合。在本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，連接的PCR引物有一個(gè)3’-0H基團(tuán)和與微珠表面相連的5’末端。在PCR反應(yīng)混合液中加入含有微珠1103的引物/捕獲序列。在礦物油中加入表面活性劑(如SunSoftNo.818SK)和助表面活性劑(如交酯化蓖麻酸聚甘油酯)可制得油溶液。在另一個(gè)實(shí)施例中，在磁力攪拌下將水相PCR反應(yīng)混合液加入到油溶液中(>70%油)可形成一個(gè)油包水乳狀溶液。在另一個(gè)實(shí)施例中，使用機(jī)械振蕩或使用鋼珠等攪拌可形成一個(gè)油包水乳狀溶液。多篇文獻(xiàn)報(bào)道中詳盡介紹了乳液PCR的各種不同的方法，例如22Margulies2005和Kojima2005，這些都將作為本發(fā)明的參考。圖11步驟1111示意圖表示一個(gè)最佳液滴的內(nèi)容，其包含一個(gè)模板DNA分子1102和一個(gè)微珠1103。乳液PCR擴(kuò)增(圖11的步驟11122和1113)被設(shè)計(jì)用于單分子DNA分子的克隆擴(kuò)增，生成的每一個(gè)微珠都含有單個(gè)序列的擴(kuò)增子。利用常規(guī)PCR儀在PCR管中進(jìn)行擴(kuò)增。每管中可能包含約1.0萬(wàn)至100萬(wàn)的微珠，微珠尺寸為Ιμπι至100μπι，溶于20μL至100μL溶液中。在另一個(gè)實(shí)施例中，采用96或384孔板進(jìn)行PCR。PCR循環(huán)程序的設(shè)計(jì)將包括盡可能的考慮增加表面結(jié)合第一鏈DNAl107的全長(zhǎng)序列的長(zhǎng)度和產(chǎn)量，并將它們作為合成Sanger測(cè)序片段的模板。這可以在40個(gè)循環(huán)的常規(guī)PCR(94°C，30秒，58°C60秒，680C90秒)之后通過(guò)增加10至15個(gè)循環(huán)反應(yīng)(例如，在94°C30秒，58°C360秒)進(jìn)行雜交延伸。PCR反應(yīng)后，可以加入異丙醇或其他溶劑，如乙醇，從而破壞乳液。在退火緩沖液之后微珠會(huì)用異丙醇或其他溶劑如乙醇進(jìn)行沖洗。微珠上的第二鏈DNA通過(guò)在一個(gè)基礎(chǔ)溶液中孵化后將被移除。在一個(gè)實(shí)施例中，約30%的微珠含有擴(kuò)增子，而其余微珠將沒(méi)有序列連接。在另一個(gè)實(shí)施例中，約50%微珠含有擴(kuò)增子。在另一個(gè)實(shí)施例中，約70%微珠含有擴(kuò)增子。30%的產(chǎn)率雖然感覺(jué)很低，但實(shí)際上是合理和可以接受的，因?yàn)槲覀円３肿銐虻偷某跏寄０鍧舛?，以避免在每滴油珠中含有多個(gè)DNA模板分子。在一個(gè)較佳實(shí)施例中，包含的一個(gè)步驟可以富集擴(kuò)增子包含微珠。在一個(gè)富集步驟的實(shí)施例中，擴(kuò)增子包含微珠通過(guò)其5’_生物素化寡核苷酸retrieved，寡核苷酸與擴(kuò)增子的3’-末端通用序列部分互補(bǔ)。利用鏈霉親和素包被的磁珠進(jìn)行提取。在另一個(gè)實(shí)施列中，擴(kuò)增子包含微珠通過(guò)與熒光標(biāo)記的寡核苷酸雜交，寡核苷酸與擴(kuò)增子的3’-末端通用序列部分互補(bǔ)。然后通過(guò)流式細(xì)胞儀富集熒光標(biāo)記的寡核苷酸結(jié)合微珠?；谖⒅榈姆磻?yīng)第二部分(圖11的1115和1118步驟)是Sanger擴(kuò)增反應(yīng)。這些步驟的目的是在每個(gè)珠子上產(chǎn)生一個(gè)完整的一套干凈的、熒光標(biāo)記的Sanger序列片段，這些序列片段來(lái)自于同一個(gè)序列模板。在包含有來(lái)自于第一個(gè)emPCR(圖11的1114)的微珠和礦物油的Sanger混合溶液中形成乳液。Sanger混合溶液包含聚合酶1104、dNTP1104和熒光標(biāo)記的ddNTP終止子1109，以及引物1108(圖11的1115步驟)。Sanger擴(kuò)增反應(yīng)是在PCR儀上的PCR管內(nèi)進(jìn)行的。商業(yè)化試劑盒(例如ABI的0igDyeTerminatorv3.ICycleSequencingKits或GEHealthCare的DYEnamicETmix)與方法可以用于這些步驟。在熱循環(huán)程序末端的退火步驟可用于將擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合到固定模板上(圖Dll的1116步驟)。破乳和微珠洗滌條件，如利用低溫和高鹽緩沖液，可以被用來(lái)確保將Sanger擴(kuò)增產(chǎn)物保留在微珠上(圖11的1117)。在破乳中使用的異丙醇或其他溶劑，如乙醇會(huì)使DNA分子的結(jié)合更強(qiáng)，因此該進(jìn)程沒(méi)有關(guān)系。在微珠上直接純化以去除未使用的標(biāo)記終止子1109和其他影響信號(hào)檢測(cè)和電泳分離的擴(kuò)增試劑的能力，這是這一方法的一個(gè)顯著優(yōu)勢(shì)。圖12所示為與圖11相比的另一種可選微珠的表面組成。在這個(gè)方法中，捕獲序列1202附著在連接有正向引物的微珠表面1203。捕獲序列1202與Sanger片段的5’端通用部分互補(bǔ)(圖121207)，被設(shè)計(jì)用于捕獲與Sanger片段。在一個(gè)較佳實(shí)施列中，序列位于與前面所提的5’-生物素化寡核甘酸互補(bǔ)的部分之外，因此不會(huì)對(duì)富集PCR微珠造成任何問(wèn)題。在一個(gè)較佳實(shí)施列中，這些捕獲序列含有自由5’末端，避免任何聚合酶引伸以及減少與Sanger片段1207雜交的位阻效應(yīng)?；旌险蛞锱c捕獲序列1203的一個(gè)潛在優(yōu)勢(shì)是減少了正向引物的表面密度，將改進(jìn)在PCR反應(yīng)中形成全長(zhǎng)第一鏈DNA1201以及在Sanger反應(yīng)中的引物延伸條件。本發(fā)明的方法可能會(huì)使用各種大小、形狀、材料和多孔性的微珠。在微珠的選擇過(guò)程中，將考慮寡核苷酸序列的共價(jià)結(jié)合力，乳液PCR與Sanger反應(yīng)的穩(wěn)定性，表面負(fù)載密度，尺寸分布以及凝膠電泳分離的能力。材料包括但不限于Sepharose(GEHealthcare，前AmershamBiosciences)，即交聯(lián)瓊脂糖，交聯(lián)聚丙烯酰胺(來(lái)自ThermoScientificPierce或其他公司)，TentaGel(RappPolymereGmbH)，即聚乙二醇接枝的低交聯(lián)聚苯乙烯，和其它任何合適的材料。多數(shù)微珠具有官能團(tuán)，例如N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS)和胺，已存在在微珠表面上以用于附著寡核苷酸。在一個(gè)實(shí)施例中，含有3’或者5’末端胺基團(tuán)的寡核苷酸通過(guò)形成穩(wěn)定的胺鍵附著在NHS官能化微珠上。在一個(gè)較佳實(shí)施例中，具有54個(gè)骨架原子或者更長(zhǎng)的聚乙二醇鏈被加到寡核苷酸的表面附著末端，達(dá)到減少在聚和反應(yīng)和雜交反應(yīng)的位阻效應(yīng)。在一個(gè)較佳實(shí)施例中，通過(guò)確定所需的微珠表面負(fù)載容量和毛細(xì)管電泳測(cè)序的檢測(cè)極限來(lái)達(dá)到微珠尺寸的優(yōu)化。根據(jù)入射光強(qiáng)度、熒光分子和光學(xué)檢測(cè)，毛細(xì)管電泳中激光誘導(dǎo)熒光的檢測(cè)極限為102-106個(gè)熒光團(tuán)分子。對(duì)于毛細(xì)管電泳測(cè)序，應(yīng)該很容易每條帶檢測(cè)105熒光分子，也有可能降低10倍(Blazej2006)。因此，例如，為了讀600條帶，需要600X105=6X107=IOOattomoles標(biāo)記Sanger的片段，可能可以減少到IOattomoles。電泳陣列本發(fā)明器件與方法的第二個(gè)元件是高密度毛細(xì)管陣列電泳單元。與當(dāng)前的分離毛細(xì)管不同，高密度毛細(xì)管陣列可用于形成3D電泳法分離系統(tǒng)，從而顯著提高通量。毛細(xì)管陣列可以具有各種形狀、大小和密度。材料可以通過(guò)玻璃加工技術(shù)制成，這一技術(shù)最初被發(fā)展用于光纖成像應(yīng)用。Scott的陣列是用透明或者高對(duì)比度的黑色玻璃材料制作的。毛細(xì)管的內(nèi)徑(或孔徑)大約為5ym-lmm。陣列的長(zhǎng)度大約為lmm-2m。首選的陣列應(yīng)該包含有密集包被、均一分布的毛細(xì)孔，其孔內(nèi)構(gòu)造光滑，并且前末端與后末端表面都是經(jīng)過(guò)拋光工藝達(dá)到光學(xué)光潔度的。在一個(gè)實(shí)施例中，選用了來(lái)自Schott的一個(gè)線性高密度毛細(xì)管陣列，其孔徑為50μm,毛細(xì)管長(zhǎng)為80cm，并且在20x20mm2的橫截面面積上可裝載20萬(wàn)個(gè)。其他孔徑，可以選擇例如5μm，10μm，20μm，或者100μm。其他包裝量，例如100，1，000，10，000,1，000,000,甚至更高以滿足特定應(yīng)用。圖14A所示為包含毛細(xì)管陣列模塊的電泳池的示意圖。毛細(xì)管陣列模塊1412被置于電解池1406的正中間。圖14B所示為毛細(xì)管陣列塊的3D視圖。雖然圖中沒(méi)有顯示，電解池中還有冷卻與加熱元件、溫度傳感器和溫度控制機(jī)制，既可以去除焦耳加熱產(chǎn)生的熱量也可以對(duì)電泳池進(jìn)行加熱以保持進(jìn)行優(yōu)化和可重復(fù)電泳分離所需的溫度。圖14所示的一個(gè)熱交換區(qū)1404利用了毛細(xì)管陣列模塊的部分毛細(xì)管。以水或空氣等作為熱交換流體通過(guò)入口1416進(jìn)入電解池，達(dá)到強(qiáng)化傳熱的效果。在電解質(zhì)池中合適的位置放置陰極電極1402以及陽(yáng)極電極1409，產(chǎn)生一個(gè)橫跨所有毛細(xì)管的電壓降。在一個(gè)較佳實(shí)施列中，電極由鉬制成。電極材料也可以采用例如多孔炭等其他材料。值得一提的是所有的毛細(xì)血管電泳條件沒(méi)有必要完全一致，也沒(méi)有必要使所有毛細(xì)管中特定大小的片段經(jīng)過(guò)時(shí)間完全同步，因?yàn)槊總€(gè)泳道中所跑的膠是獨(dú)立進(jìn)行分析的，因此，可以根據(jù)本說(shuō)明書(shū)后文提到的實(shí)時(shí)熒光圖像在每個(gè)毛細(xì)管建立一個(gè)獨(dú)立的色譜。還應(yīng)該考慮到探針以及電解池的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)以便于釋放電極表面產(chǎn)生的氣體。在一個(gè)較佳實(shí)施例中，電解池支架1406是用玻璃制作的，24也可采用其它耐熱、非導(dǎo)電材料，例如耐熱塑料和陶瓷。為使在進(jìn)行膠填裝時(shí)易于使用毛細(xì)管陣列，上層的套頭1415以及底部窗口1407是可拆卸的。在一個(gè)較佳實(shí)施例中，套頭是由耐熱以及非導(dǎo)電材料制成的，如聚砜、聚苯硫醚或陶瓷。在一個(gè)較佳實(shí)施例中，底部窗口1407是由ΙΟΟμπι-δΟΟμπι的超薄玻璃制成。在玻璃窗口1407與底部毛細(xì)管模塊表面1412之間的套頭1417應(yīng)相對(duì)較短，從50μm到200μm。這使得共聚焦激光掃描顯微鏡(在本說(shuō)明書(shū)之后的章節(jié)中詳細(xì)介紹)能夠聚焦到毛細(xì)管1411。在一個(gè)較佳實(shí)施例中，電解質(zhì)穩(wěn)定流過(guò)目標(biāo)孔室，沖走染色標(biāo)記廢料，從而降低光子檢測(cè)信號(hào)的背景值。除電解池外，一個(gè)電泳子系統(tǒng)可能還包括一個(gè)用于電泳的高壓電源和一個(gè)PID溫度控制器。在一個(gè)較佳實(shí)施列中，毛細(xì)管表面首先經(jīng)由化合物處理，然后用膠填滿。表面處理以及凝膠形成方法根據(jù)應(yīng)用的不同而不同，并且在文獻(xiàn)中有詳細(xì)介紹，如Zhang1999，Blazej2006等，在此已以提述方式納入。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，毛細(xì)管陣列填膠的方式是注射法。用于注射的工具包括密封墊片和注射器。有多種技術(shù)可將微珠加載到毛細(xì)管中。在一個(gè)實(shí)施例中，將微珠分散在凝膠墊上，通過(guò)輕壓毛細(xì)管陣列塊表面和凝膠墊將其推進(jìn)毛細(xì)管陣列塊內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施例中，首次制造出如圖15所示的毛細(xì)管進(jìn)口上的淺井1502，表面流動(dòng)著含有緩沖溶液的微珠，通過(guò)輕輕攪拌使微珠由于重力(所有交聯(lián)膠材料的密度都必須比水的高)進(jìn)入孔中。在一個(gè)較佳實(shí)施例中，微珠的尺寸應(yīng)該是略微小于毛細(xì)管孔徑，保證一個(gè)孔里面將不會(huì)填充2個(gè)微珠。在一個(gè)實(shí)施列中，孔1501是在填膠的過(guò)程中產(chǎn)生的。從毛細(xì)管陣列塊的底部開(kāi)始填充膠，并且略微溢出，通過(guò)擠壓抹去表面被擠出來(lái)的過(guò)多的凝膠，然后從底部抽出少量、固定的量以生成孔。在一個(gè)較佳實(shí)施例中，在抽出之前先在陣列塊上注入緩沖液，避免在孔內(nèi)產(chǎn)生氣泡。填充過(guò)后，用洗脫緩沖液沖走表面多余的微珠。洗脫序列的快速樣品進(jìn)樣對(duì)獲得高分辨率的毛細(xì)管電泳分離至關(guān)重要。一方面，應(yīng)該采取謹(jǐn)慎措施，防止Sanger片段在裝載過(guò)程中與微珠分離。這可以通過(guò)將微珠保存在較低溫度(如4°C)下和在裝載過(guò)程中使用非變性緩沖液達(dá)到上述目的。盡管圖14上未顯示，電解池套頭至少有兩個(gè)用于流體流動(dòng)、緩沖液交換、微珠攪動(dòng)及從小室中移除多余微珠的液體口。微珠裝載完畢后，打開(kāi)電泳的電場(chǎng)，用電泳緩沖液替代非變性緩沖液，打開(kāi)電解池套頭上的快速加熱器急驟加熱微珠(未在圖14上顯示)，即開(kāi)始進(jìn)樣。急驟加熱將導(dǎo)致Sanger片斷與微珠分離。信號(hào)檢測(cè)推薦方法的第三個(gè)關(guān)鍵元件是快速共焦成像儀?，F(xiàn)有的CE測(cè)序儀使用的信號(hào)檢測(cè)方法是從一維組裝毛細(xì)管的一側(cè)激發(fā)和收集熒光信號(hào)。該方法顯然不能用于二維毛細(xì)管陣列中。我們必須使用一個(gè)可收集二維平面上所有毛細(xì)管信號(hào)的方法。我們選擇共聚焦激光掃描成像儀，因?yàn)樗梢詮脑仙戏浅１〉谋韺由蠙z出信號(hào)，同時(shí)限制了信號(hào)收集板(或焦平面)上方和下方材料的干擾。圖13所示為一個(gè)快速共焦激光掃描顯微鏡子系統(tǒng)與集成系統(tǒng)連接的示意圖。這種設(shè)計(jì)是對(duì)一個(gè)最初由UCIrvine的Parker實(shí)驗(yàn)室(Callamaras1999)制造的videorate共聚焦顯微鏡的改良。用一個(gè)雙行氬離子激光器1331作為激發(fā)光源，激發(fā)標(biāo)記ddNTP(來(lái)自ABI公司和GEHearlthCare)中使用的4種能量轉(zhuǎn)換染料。在操作過(guò)程中，激光束通過(guò)平凹鏡1333被放大，經(jīng)由二向色濾光鏡1334，Y檢流計(jì)1335和X檢流計(jì)1336完成一系列25反射，由反射鏡1338經(jīng)過(guò)顯微鏡目鏡1337，然后通過(guò)顯微鏡物鏡1339，集中于毛細(xì)管陣列塊1312下表面之上的焦平面1319。激發(fā)的共聚焦平面深度可通過(guò)改變平凹鏡1333的焦距或顯微鏡物鏡1339和平凹鏡1333之間的距離進(jìn)行調(diào)整。X-Y激光掃描由X和Y檢流計(jì)1335及1336進(jìn)行。用一個(gè)工作于8kHz的諧振振蕩器(可向GeneralScarming購(gòu)買(mǎi))替代其中一個(gè)檢流計(jì)可以實(shí)現(xiàn)視頻頻率高速掃描。熒光發(fā)射光由物鏡1339收集，沿激光束相反的方向返回直到到達(dá)二向色濾光鏡1334，一個(gè)長(zhǎng)通濾光鏡。該發(fā)射光穿過(guò)二向色濾光鏡1334，由反射鏡1352反射，穿過(guò)光圈1340，由一組二向色濾光鏡(1341，1342和1343)和帶通過(guò)濾器(1345，1346，1347和1344)選擇，由匹配波長(zhǎng)的光電倍增管(1348，1349，1350和1351)檢測(cè)。通過(guò)改變虹膜光圈1340的孔徑可以調(diào)整熒光探測(cè)共聚焦平面的深度。作為推薦的毛細(xì)管陣列電泳的高通量信號(hào)檢測(cè)器，成像儀必須滿足幾個(gè)要求。首先，它必須以足夠快的速度以及足夠高的分辨率捕獲預(yù)定掃描范圍內(nèi)所有毛細(xì)管的色譜。通常毛細(xì)管電泳兩個(gè)相鄰測(cè)序峰之間的時(shí)間間隔為5到8秒。若在兩個(gè)相鄰峰之間需要10個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，成像儀掃描速度必須達(dá)到至少每秒2幀。其次，由于推薦的毛細(xì)管陣列實(shí)際上是一個(gè)X-Y方向上分布不同測(cè)序模板及Z方向(毛細(xì)管軸向方向)上分布不同尺寸測(cè)序碎片的3D電泳系統(tǒng)，該成像儀必須在三維空間上都具有足夠的空間分辨率。在項(xiàng)目的第一階段，我們將使用毛細(xì)管直徑50μm、毛細(xì)管中心到中心距離60μm的毛細(xì)管陣列。假設(shè)每個(gè)毛細(xì)管捕捉的最低要求為5x5像素，該成像器在X和Y方向?qū)⑿枰?0/5=12μm的分辨率。在Z方向上，毛細(xì)管陽(yáng)極末端兩相鄰峰之間的距離大約是在1500μπι。為真正分辨兩峰之間的10個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，聚焦深度不得超過(guò)1，500/10=150μm?；诖饲邦愃频娘@微鏡設(shè)計(jì)結(jié)果，均可達(dá)到上述要求。至于圖像分辨率，第一階段計(jì)劃顯示為512X5122.6X105像素。在每秒2幀的情況下，每個(gè)光電倍增管需要能夠收集到2.6X105X2=5.2X105Hz速度的數(shù)據(jù)。一個(gè)光電倍增管的典型響應(yīng)時(shí)間大約為2納秒，這意味著最大數(shù)據(jù)收集頻率為1/(2X10-9)=5X108Hz，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了我們的第一階段的速度要求，并為我們?cè)陧?xiàng)目的第二階段提高數(shù)據(jù)通量提供了充足空間。例如，我們計(jì)劃在第二階段在100萬(wàn)毛細(xì)管中進(jìn)行測(cè)序。假設(shè)同樣要求每個(gè)毛細(xì)管5X5像素及每秒2巾貞，我們需要一個(gè)5X5X106X2=5X107Hz的數(shù)據(jù)收集率，仍然低于光電倍增管的極限。在系統(tǒng)層面，我們認(rèn)識(shí)到了來(lái)自于制造以及在幾十平方厘米區(qū)域內(nèi)快速和高分辨率共焦成像的大范圍潛在應(yīng)用的挑戰(zhàn)。系統(tǒng)集成和操作除圖13所示的元件外，還需添加一個(gè)流體支管、多區(qū)溫度控制元件、檢流計(jì)的電子驅(qū)動(dòng)、光電倍增管的電子放大器和一個(gè)具有高速數(shù)據(jù)采集板和高速數(shù)據(jù)存儲(chǔ)的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。利用軟件程序進(jìn)行數(shù)據(jù)收集和儀器控制。該程序可以在圖像上定位毛細(xì)管的位置，提取信號(hào)強(qiáng)度，并通過(guò)連接所有數(shù)據(jù)點(diǎn)的強(qiáng)度數(shù)據(jù)制成電泳圖(圖16)。此處介紹的方法同時(shí)還可以用于形成已被形成雙鏈固定(即沒(méi)有分離)的核酸的雙鏈。穩(wěn)定的雙鏈一旦發(fā)現(xiàn)特異性的互補(bǔ)位點(diǎn)就會(huì)保留溶液分子，防止表面分子返回到溶液表面。有一個(gè)方法揭示了用Huisgen環(huán)加成反應(yīng)(click化學(xué))進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)(圖23)。改性后的dU位點(diǎn)含有末端炔基(圖24與圖25)，連接基團(tuán)的長(zhǎng)度適合在Click反應(yīng)或其他偶聯(lián)反應(yīng)條件中形成跨鏈連接。在一個(gè)實(shí)施例中，在乙醇與水的混合物反應(yīng)中，有CuS04和Ph3P的存在和有如圖26所示的序列存在的條件下進(jìn)行2小時(shí)。具體實(shí)施例實(shí)施例1洗提毛細(xì)管束中的序列測(cè)序CE塊由拉制玻璃制成，用內(nèi)徑為IOOm的毛細(xì)管形成通道橫截面積為2x3mm2、長(zhǎng)5cm的凹陷通道束。在測(cè)序通道中通過(guò)毛細(xì)效應(yīng)填充10%的PAGE膠，使溶液流過(guò)底部面積(與通道垂直)的一半?yún)^(qū)域來(lái)加載樣品(見(jiàn)下文介紹)。使用的樣品中含有4種熒光染料標(biāo)記的長(zhǎng)度不同的寡核苷酸。這4種寡核苷酸為FAM-18mer，Cy3-6mer,Cy3-38mer和FAM-46mer0之后將測(cè)序CE塊在水平的電泳裝置中放置一定時(shí)間(分鐘)，取出后用熒光顯微鏡(OlympusBX41EPI熒光研究顯微鏡)獲取外端表面的圖像，再將其放回到電泳裝置中繼續(xù)。將這個(gè)過(guò)程重復(fù)幾次，所得的記錄圖像如圖5所示。A、B(頂部那一行，圖Cl)中圖像較窄的一側(cè)為沒(méi)有加載樣品的質(zhì)控區(qū)。時(shí)間進(jìn)程見(jiàn)圖像上方。75-80min，檢測(cè)到FAM-18mer，隨后在85min檢測(cè)到Cy3_6mer，在97min檢測(cè)到Cy3_38mer，最后檢測(cè)到的FAM_46mer為中心102min附近的一條寬條帶。值得注意的是Cy3_6寡核苷酸，GGTTGG，是一個(gè)G-四鏈體基序；四鏈的6mer在凝膠圖像在表現(xiàn)的像是24-mer。我們的實(shí)驗(yàn)室對(duì)Cy3_GGTTGG在多種條件下的G-四鏈體形成進(jìn)行了研究，驗(yàn)證了我們?cè)跍y(cè)序芯片中觀察到的現(xiàn)象。通過(guò)利用2種檢測(cè)波長(zhǎng)，俯視圖反映的是從毛細(xì)管通道洗提的物質(zhì)以及一小時(shí)電泳中分解(圖像A、B，圖Cl)的四種寡核苷酸(FAM-18mer，Cy3-6mer,Cy3-38mer,andFAM_46mer)。數(shù)據(jù)低分辨率較低(主要是由于樣品溶液加載過(guò)程中在多個(gè)被照亮的通道之間發(fā)生交叉污染)。美國(guó)專利文件Gao,X.,Zhou,X.,andGulari,Ε."Methodandapparatusforchemicalandbiochemicalreactionsusingphoto-generatedreagents，，·US6,426，184Gao,X.,Zhang,H.,Yu,P.,LeProust,Ε.,Pellois,J.P.Xiang,Q.,Zhou,X.."Linkersandco-couplingagentsforoptimizationofoligonucleotidesynthesisandpurificationonsolidsupports”·US7,211，654，AU2002305061.Gao,X.,Zhou,X.,Cai,S.-Y,You,Q.,Zhang,X."Arrayο1igomersynthesisanduse"W02004/039953.Farooqui,F.andReddy,P.M.(2OO3)Efficieηtsynthesisofprotein-oligonucleotideconjugates.US2003/0092901.Roullard,J.M.，Gulari,Ε.，Gao,X.，Zhou,Χ.(2007)Methodforformingmolecularsequencesonsurfaces.其他國(guó)家專利文件Gao,Χ.，Zhou，Χ.，andGulari,Ε."Methodandapparatusforparallelsynthesisofmolecularsequencearraysusingphoto-generatedreagents”.EP1054726B1，AU772531，CA2319587Gaoetal.PCT/US08/82167Probebeadsynthesisanduse其他參考文獻(xiàn)Akeson,M.,Branton,D.,Kasianowicz,J.J.，Brandin，E.andDeamer,D.W.(1999)Microsecondtime-scalediscriminationamongpolycytidylicacid，polyadenylicacid，andpolyuridylicacidashomopolymersorassegmentswithinsingleRNAmolecules.BiophysJ77,3227-33.27Albert，Τ.J.，Molla，Μ.N.，Muzny,D.Μ.，Nazareth,L.，Wheeler,D.，Song，X.，Richmond，Τ.Α.，Middle，C.Μ.，Rodesch，Μ.J.，Packard，C.J.，Weinstock,G.Μ.andGibbs，R.A.(2007)Directselectionofhumangenomiclocibymicroarrayhybridization.NatMethods4，903-905·Backer,S.C.etal.(2005)"TheExternalRNAControlsConsortium:aprogressreport"NatureMethods2,731-734.Barski，A.，Cuddapah,S.，Cui，K.，Roh,Τ.Y.，Schones，D.Ε.，Wang,Ζ.，Wei，G.，Chepelev，I.andZhao，K.(2007)High-resolutionprofilingofhistonemethylationsinthehumangenome.Cell129,823-837.Bennett，S.T.，Barnes，C.，Cox,A.，Davies，LandBrown,C.(2005)Towardthe1，OOOdollarshumangenome.Pharmacogenomics6，373-382.Bentley，D.R.(2006)Whole-genomere-sequencing.CurrOpinGenetDev16，545-552.Bentley，D.R.etal.(2008)Accuratewholehumangenomesequencingusingreversibleterminatorchemistry.Nature456，53—59.Blazej，R.G.，Kumaresan，P.andMathies，R.A.(2006)MicrofabricatedbioprocessorforintegratednanoliterscaleSangerDNAsequencing.ProcNatlAcadSciUSA103,7240-7245.Blazej，R.G.，Kumaresan，P.，Cronier,S.A.andMathies，R.A.(2007)Inlineinjectionmicrodeviceforattomole—scaleSangerDNAsequencing.AnalChem79，4499-4506.Branton,D.etal.(2008)Thepotentialandchallengesofnanoporesequencing.NatBiotechnol26,1146-1153.Buratti,E.，BaralIe,Μ.，andBaralle，F(xiàn).Ε.，(2006)Defectivesplicing，diseaseandtherapysearchingformastercheckpointsinexondefinition.NAR34,3494-510.Callamaras,N.&Parker,I.(1999)Constructionofaconfocalmicroscopeforreal-timeχ-yandχ-ζimaging.CellCalcium26:271-280.Carrilho，E.，Ruiz-Martinez,M.C.，Berka，J.，Smimov,I.，Goetzinger,W.，Miller，A.W.，Brady,D.andKarger,B.L.(1996)RapidDNAsequencingofmorethanIOOObasesperrunbycapillaryelectrophoresisusingreplaceabIelinearpolyacrylamidesolutions.AnalChem68，3305—3313.Cloonan，N.，F(xiàn)orrest，A.R.，Kolle，G.，Gardiner，B.B.，F(xiàn)aulkner，G.J.，Brown,M.K.，Taylor,D.F.，Steptoe，A.L，Wani，S.，Bethel，G.，Robertson，A.J.，Perkins，A.C.，Bruce，S.J.，Lee,C.C.，Ranade,S.S.，Peckham,H.Ε.Manning，J.M.，McKeman,K.J.andGrimmond，S.M.(2008)Stemeelltranscriptomeprofilingviamassive-scalemRNAsequencing.NatMethods5，613—619.Connel1,C.R.etal.(1987)AutomatedDNASequenceAnalysis.BioTechniques5，342-348.28Dah1,F.etal.(2007)Multigeneamplificationandmassivelyparallelsequencingforcancermutationdiscovery.Proc.Natl.Acad.Sci.USA104，9387-9392.Dillmore,W.S.,Yousaf,M.N.andMrksich，M.(2004)Aphotochemicalmethodforpatterningtheimmobilizationofligandsandcellstoself—assembledmonolayers.Langmuir20,7223-7231.Dolnik，V.，Liu,S.andJovanovich,S.(2000)Capillaryelectrophoresisonmicrochip.Electrophoresis21，41—54·DrmanacS，KitaD，LabatI，HauserB，SchmidtC，BurczakJD,DrmanacR(1998)AccuratesequencingbyhybridizationforDNAdiagnosticsandindividualgenomics.NatBiotechnol16，54—58.Duke,T.，Monne1Iy,G.，Austin，R.H.，Cox,Ε.C.(1997)Sequencinginnanofabricatedarrays:afeasibilitystudy.Electrophoresis18,17-22.Eid，J.eta1.(2008)Real-TimeDNAsequencingfromsinglepolymerasemolecules.Science.DOI10.1126/science.1162986.Eriksson，J.，Karamohamed，S.andNyren,P.(2001)Methodforreal-timedetectionofinorganicpyrophosphataseactivity.AnalBiochem293，67—70·Ewing，B.，andGreen，P.(1998)Base-callingofautomatedsequencertracesusingphred.II.Errorprobabilities.GenomeRes.8,186-194.Ewing,B.，Hillier,L.，Wendl,Μ.C.，andGreen,P.(1998)Base-callingofautomatedsequencertracesusingphred.I.Accuracyassessment.GenomeRes.8,175-185.Gao,X.，LeProust,Ε.，Zhang，H.，Srivannavit,0.，Gulari,Ε.，Yu,P.，Nishiguchi，C.，Xiang，Q.，Zhou，X.(2001)FlexibleDNAchipsynthesisgatedbydeprotectionusingsolutionphotogeneratedacids.NucleicAcidsRes.29，4744-4750.Greenleaf,W.J.andBlock,S.M.(2006)Single-molecule,motion-basedDNAsequencingusingRNApolymerase.Science313,801.http://cgap.nci.nih.gov/；http://cancergenome.nih.gov/http://marketing,appliedbiosystems.com/images/Product/SolidKnowledge/ABI-5845_S0LID_Product_Spec_Sheet_loresfinal.pdfhttp/Vwww.bindingdb.org/bind/index,jsphttp/Vwww.biotrove.com/what_we_do/openarray.htmlhttp/Vwww.illumina.com/downloads/GenomeAnalyzerSpecSheet.pdfhttp/Vwww.lcsciences.com/products/genomics/oligomix/oligomix.htmlhttp://www.lcsciences.com/products/genomics/specialty_genomicsarrays/specialty—genomics—microarrays.htmlhttps://products,appliedbiosystems.com443/ab/en/US/adirect/ab？cmd=catNavigate2&catID=601642&tab=TechSpecHuse,S.M.，Huber,J.A.，Morrison,H.G.，Sogin,M.L.，andWelch,D.Μ.(2007)Accuracyandqualityofmassively-parallelDNApyro-sequencing.GenomeBiol.8,R143.InternationalHumanGenomeSequencingConsortium(2004)Finishingtheeuchromaticsequenceofthehumangenome.Nature431,931-945.Johnsonetal.(2003)Genome-widesurveyofhumanaltemativepre-mRNAsplicingwithexonjunctionmicroarraysarraysdetectalternativesplicingindrugtargets.Science302，2141-2144.JuJ，RuanC，F(xiàn)ullerCW,GlazerAN，MathiesRA(1995)Fluorescenceenergytransferdye-labeledprimersforDNAsequencingandanalysis.ProcNatlAcadSciUSA92:4347-4351.Ju,J.，Kim,D.H.,Bi,L.,Meng,Q.，Bai,X.,Li,Ζ.,Li,Χ.,Marma,Μ.S.，Shi,S.，Wu,J.，Edwards,J.R.，Romu,A.andTurro,N.J.(2006)Four-colorDNAsequencingbysynthesisusingcleavablefluorescentnucleotidereversibIeterminators.ProcNatlAcadSciUSA103，19635-19640.KanCW,DohertyEA,BarronAE(2003)AnovelthermogellingmatrixformicrochannelDNAsequencingbasedonpoly-N-alkoxyalkylacrylamidecopolymers.Electrophoresis24,4161-4169.KasianowiczJ.J.，Brandin，E.，Branton，D.，andDeamer,D.W.(1996)Characterizatonofindividualpolynucleotidemoleculesusingamembranechannel.ProcNatlAcadSciUSA93，13770-13773.Kaushansky,K.(2007)ThechronicmyeloproliferativedisordersandmutationofJAK2IDameshekrs54yearoldspeculationcomesofage.BestPractResClinHaematol20,5-12.Kozlov,I.A.，Melnyk，P.C.，Stromsborg，K.E.，Chee,Μ.S.，Barker，D.L.andZhao,C.(2004)Efficientstrategiesfortheconjugationofoligonucleotidestoantibodiesenablinghighlysensitiveproteindetection.Biopolymers73，621—630·Kumaresan,P.,Yang,C.J.,Cronier,S.A.,Blazej,R.G.andMathies,R.A.(2008)High-throughputsinglecopyDNAamplificationandcellanalysisinengineerednanoliterdroplets.AnalChem80，3522-3529·Lander,E.S..(2001)Initialsequencingandanalysisofthehumangenome.Nature409，860-921.Leamon,J.H.，Braverman,Μ.S.，andRothberg，J.M.(2007)High-Throughput，massivelyparalIelDNAsequencingtechnologyfortheeraofpersonalizedmedicine.GeneTher.Reg.3,15-31.Leproust，E.，Zhang，H.，Yu,P.，Zhou，X.，andGao,X.(2001)Characterizationofoligodeoxyribonucleotidesynthesisonglassplates.NucleicAcidsRes.29，2171-2180.Levy,S.，Sutton，G.，Ng,P.C.，F(xiàn)euk,L，Halpem，A.L，Walenz,B.P.，Axelrod,N.，Huang，J.，Kirkness，Ε.F.，Denisov,G.，Lin,Y.，Macdonald，J.R.，Pang，Α.W.，Shago,Μ.，Stockwel1，Τ.B.，Tsiamouri，Α.，Bafna，V.，BansalV.，Kravitz,S.Α.，Busam，D.Α.，Beeson,K.Y.,Mcintosh,Τ.C.，Remington，K.Α.,Abril,J.F.，Gill，J.,Borman,J.，Rogers，Y.H.,Frazier,M.Ε.,Scherer,S.W.，Strausberg，R.LandVenter,J.C.(2007)Thediploidgenomesequenceofanindividualhuman.PLoSBiol5,e254.Liu,C.N.，Toriello,N.Μ.andMathies,R.A.(2006)MultichannelPCR-CEmicrodeviceforgeneticanalysis.AnalChem78，5474—5479.Liu,P.，Seo，T.S.，Beyor,N.，Shin，K.J.，Scherer,J.R.andMathies，R.A.(2007)Integratedportablepolymerasechainreaction-capillaryelectrophoresismicrosystemforrapidforensicshorttandemrepeattyPing.AnalChem79，1881-1889.Liu,S.，Ren,H.，Gao,Q.，Roach，D.J.，Loder,R.Τ.，Jr.，Armstrong，Τ.Μ.，Mao,Q.，Blaga,I.,Barker,D.L.andJovanovich,S.B.(2000)AutomatedparallelDNAsequencingonmultiplechannelmicrochips.ProcNatlAcadSciUSA97，5369—5374.Makhijani，V.，Roth,G.T.，Gomes，X.，Tartaro,K.，Niazi，F(xiàn).，Turcotte，C.L，Irzyk,G.P.，Lupski，J.R.，Chinault，C.，Song，Χ.Ζ.，Liu,Y.，Yuan，Y.，Nazareth,L，Qin,X.，Muzny,D.M.，Margulies,M.，Weinstock,G.M.，Gibbs,R.A.andRothberg,J.Μ.(2008)ThecompletegenomeofanindividualbymassivelyparallelDNAsequencing.Nature452,872-826.Marguliesetal.(2005)Genomesequencinginmicrofabricatedhigh-densitypicolitrereactors.Nature437，376—380·Maxam,A.M.，andGilbert，W.(1977)AnewmethodforsequencingDNA.Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，560-564.Metzker,M.L.(2005)EmergingtechnologiesinDNAsequencing.GenomeRes15,1767-1776.MitraR.D.，ShendureJ.，OlejnikJ.，Edyta-Krzymanska0.，andChurchGM(2003)Fluorescentinsitusequencingonpolymerasecolonies.AnalBiochem320，55-65.Morozova,0.andMarra,M.A.(2008)Applicationsofnext-generationsequencingtechnologiesinfunctionalgenomics.Genomics92，255-264.Mughal,Τ.I.andGoldman,J.M.(2007)EmergingstrategiesforthetreatmentofmutantBcr-AblT315Imyeloidleukemia.ClinLymphomaMyeloma7Suppl2,S81-84.Okou,D.T.etal.(2007)Microarray-basedgenomicselectionforhigh-throughputresequencing.Nat.Methods，advanceonlinepublication140ctober2007(doi:10.1038/nmethll09).Parameswran,P.，Jalili,R.，Tao,L，Shokralla,S.，Gharizadeh，B.，Ronaghi,Μ.，andFire，A.Z.(2007)Apyrosequecing-tailorednucleotidebarcodedesignunveilsopportunitiesforlarge-scalesamplemultiplexing.NucleicAcidsRes.31Octoberll，2007doi:10·1093.Porreca，G.J.，Zhang，K.，Li，J.B.，Xie，B.，Austin，D.，Vassallo,S.L.，LeProust，Ε.Μ.，Peck，B.J.，Emig，C.J.，Dahl，F(xiàn).，Gao,Y.，Church，G.Μ.andShendure，J.(2007)Multiplexamplificationoflargesetsofhumanexons.NatMethods4，931-936.ProberJ.M.，TrainorG.L，DamR.J.，HobbsF.W.，RobertsonC.W.,ZagurskyR.J.，CocuzzaA.J.，JensenM.A.，andBaumeister,K.(1987)AsystemforrapidDNAsequencingwithfluorescentchain-terminatingdideoxynucIeotides.Science238，36-341.Raddatz,S.，Mueller-Ibeler,J.，Kluge，J.，Wass,L，Burdinski,G.，Havens,J.R.，Onofrey,Τ.J.，Wang,D.，andSchweitzer,Μ.(2002)Hydrazideoligonucleotidesnewchemicalmodificationforchiparrayattachmentandconjugation.NucleicAcidsRes.，30，4793-4802.ReviewedinGao,X.，Gulari,Ε.，andZhou，X.(2004)Insitusynthesisofoligonucleotidemicroarrays.Biopolymers73，579-596.ReviewedinGao,X.，Gulari,Ε.，andZhou，X.(2004)Insitusynthesisofoligonucleotidemicroarrays.Biopolymers73，579-596.ReviewedinGao,X.，Pellois，J.P.，Kim,K.，Na，Y.，Gulari,Ε.，andZhou，X.(2004)Highdensitypeptidemicroarrays.Insitusynthesisandapplications.MolecularDiversity8,177-187.Ronaghi，M.，Karamohamed,S.，Pettersson，B.，Uhlen，Μ.andNyren,P.(1996)Real-timeDNAsequencingusingdetectionofpyrophosphaterelease.AnalBiochem242，84-89.Ronaghi,M.，Uhlen,M.andNyren,P.(1998)Asequencingmethodbasedonreal-timepyrophosphate.Science281,363-365.Sanger，F(xiàn).，Air，G.M.，Barrell，B.G.Brown,N.L.，Coulson，A.R.，F(xiàn)iddes，C.A.，Hutchison，C.A.，Slocombe，P.M.，Smith，M.(1977)NucleotidesequenceofbacteriophagephiX174DNA.Nature265，687-695.Sanger，F(xiàn).，Coulson,A.R.(1975)ArapidmethodfordeterminingsequencesinDNAbyprimedsynthesiswithDNApolymerase.J.Mol.Biol.94,441-448；(b)Sanger，F(xiàn)；，Nicklen，S.，Coulson,A.R.(1977)DNAsequencingwithchain-terminatinginhibitors,Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，5463-5467.Shendure，J.，Mitra，R.D.，Varma,C.，andChurch，G.M.(2004)Advancedsequencingtechnologies:methodsandgoals.NatRevGenet5，335—344.Shendure,J.，PorrecaG.J.，ReppasN.B.，LinX.，McCutcheonJ.P.，RosenbaumΑ.Μ.，WangΜ.D.，ZhangK.，MitraR.D.，andChurchG.Μ.(2005)Accuratemultiplexpolonysequencingofanevolvedbacterialgenome.Science309，1728—1732·SmithL.M.，SandersJ.Z.，KaiserR.J.，HughesP.，DoddC.，ConnellC.R.，HeinerC.，KentS.B.，andHoodLE(1986)FluorescencedetectioninautomatedDNA32sequenceanalysis.Nature321,674-679.Soellner,Μ.B.，Dickson,K.Α.，Nilsson,B.L.，andRaines,R.Τ.(2003)Site-specificproteinimmobilizationbyStaudingerligation.J.Am.Chem.Soc.125,11790-11791.Soni,G.V.andMeller，A.(2007)ProgresstowardUltrafastDNASequencingUsingSolid-StateNanopores.ClinChem53，1996—2001.Srivannavit,0.，Gulari,Μ.，Gulari,Ε.，LeProust,Ε.，Pellois，J.P.，Gao,X.，andZhou，X.(2004)DesignandfabricationofmicrowellarraychipsforasoIution-based,photogeneratedacid-catalyzedparalleloligonuclotideDNAsynthesis.SensorsandActuatorsA.116,150-160.Sundquist，A.，Ronaghi，Μ.，Tang,H.，Pevzner,P.andBatzoglou,S.(2007)Whole-genomesequencingandassemblywithhigh—throughput，short-readtechnologies.PLoSONE2，e484.SzekelyiM.(1977)SequencingDNA.Nature267,104.TheGeneOntology(GO)project(http://www.geneontology,org/)；AlternativeExonDatabase(http://www.ebi.ac.uk/asd/aedb/)Thesearelistedatwww.lcsciences.com.Tian,J.,Gong,H.，Sheng，N·,Zhou,X.，Gulari，E·，Gao，X·，andChurch,G.(2004)AccuratemultiplexgenesynthesisfromprogrammableDNAchips.Nature432，1050-1054.VenterJC,etal.(2001)Thesequenceofthehumangenome.Science291,1304-1351.Wang,Q.，Chan,T.R.，Hilgraf,R.，F(xiàn)okin,V.V.，Sharpless,K.B.，andFinn，Μ.G.(2003)Bioconjugationbycopper(I)-catalyzedazide-alkyne[3+2]Cycloaddition.J.Am.Chem.Soc.，125，3192-3193.Wamecke,F.andHugenholtz,P.(2007)Buildingonbasicmetagenomicswithcomplementarytechnologies.GenomeBiol8,231.Weisberg,E.，Manley,P.W.，Cowan-Jacob,S.W.，Hochhaus，A.andGriffin,J.D.(2007)SecondgenerationinhibitorsofBCR-ABLforthetreatmentofimatinib—resistantchronicmyeloidleukaemia.NatRevCancer7，345—356.Wheeler,D.A.，Srinivasan，M.，Egholm，M.，Shen,Y.，Chen，L，McGuire,Α.，He，W.,Chen,Y.J.,Wold,B.andMyers,R.M.(2008)Sequencecensusmethodsforfunctionalgenomics.NatMethods5，19—21.Zhang，J.，Voss，K.0.，Shaw,D.F.，Roos,K.P.，Lewis,D.F.，Yan,J.，Jiang，R.，Ren,H.，Hou,J.Y.，F(xiàn)ang，Y.，Puyang，X.，Ahmadzadeh,H.，andDovichi，N.J.(1999)Amultiple-capillaryelectrophoresissysttmforsmall-scaleDNAsequencingandanalysis.NucleicAcidsRes.27,e36.Zhou，H.，Miller，A.W.，Sosic，Z.，Buchholz,B.，Barron，A.E.，Kotler,LandKarger,B.L.(2000)DNAsequencingupto1300basesintwohoursbycapillaryelectrophoresiswithmixedreplaceablelinearpolyacrylamidesoIutions.AnalChem72,1045-1052.Zhou，X.，Cai,S.，Hong,Α.，Yu,P.，Sheng，N.，Srivannavit,0.，Yong，Q.，Muranjan,S.，Rouilard，J.M.，Xia，Y.，Zhang，X.，Xiang，Q.，Ganesh，R.，Zhu,Q.，Makejko，A.，Gulari,Ε.，andGao,Χ.(2004)MicrofluidicPicoArraysynthesisofoligodeoxynucleotidesandsimultaneouslyassemblingofmultipleDNAsequences.NucleicAcidsRes.32，5409-5417.Perez-Balderas.F.，etc.(2003)Multivalentneoglycoconjugatesbyregiospecificcycloadditionofalkynesandazidesusingorganic-soIublecoppercatalysts.Org.Lett.5，1951—1954.權(quán)利要求一種測(cè)定DNA分子的核酸堿基序列的方法包括a)提供多個(gè)核酸模板和附著有聚合物分子的微珠，其中所述聚合物分子可將所述核酸模板結(jié)合到所述微珠上；b)在包含擴(kuò)增核酸模板序列所需試劑的第一反應(yīng)溶液中混合所述核酸模板和微珠；c)形成第一乳液來(lái)生成多個(gè)包含所述核酸模板、微珠和第一反應(yīng)溶液的微反應(yīng)器，其中至少一個(gè)所述微反應(yīng)器包括單個(gè)的核酸模板和包被在第一反應(yīng)溶液中的單個(gè)微珠，其中所述微反應(yīng)器包含在同一容器中；d)在所述微反應(yīng)器中擴(kuò)增核酸，形成核酸的擴(kuò)增拷貝；e)破第一乳液并沖洗微珠；f)混合由4種不同三磷酸脫氧核苷、一種續(xù)進(jìn)性DNA聚合酶和4種不同標(biāo)記的、可在特定核酸堿基終止DNA合成的DNA合成終止劑組成的第二反應(yīng)溶液和附著在微珠上的核酸模板；g)形成第二乳液來(lái)生成多個(gè)包含核酸模板、微珠和第二反應(yīng)溶液的微反應(yīng)器，其中至少一個(gè)微反應(yīng)器包括單個(gè)的核酸模板和包裹在第二反應(yīng)溶液中的單個(gè)微珠，其中微反應(yīng)器包含在同一容器中，其中每個(gè)終止劑在不同的核酸堿基終止DNA合成，所以形成終止序列；h)破第二乳液并沖洗微珠；i)將微珠加載到多個(gè)毛細(xì)管中，使得一個(gè)微珠加載到一個(gè)毛細(xì)管中；j)使所述終止序列從微珠上分離；k)根據(jù)序列大小分離第二乳液反應(yīng)中的終止序列；l)利用標(biāo)記合成終止劑檢測(cè)所述終止序列，這樣至少可以確定上述DNA分子的一部分核酸堿基序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核酸模板的長(zhǎng)度為25-1500堿基。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核酸模板的長(zhǎng)度為50-1200堿基。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核酸模板的長(zhǎng)度為100-1000堿基。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中附著在微珠上的所述聚合物分子是引物分子。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中附著在微珠上的所述聚合物分子是捕獲分子。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中進(jìn)一步包含所述微珠的孵化，使得在第二反應(yīng)溶液中混合附著在微珠上的核酸模板之前和破乳液和沖洗微珠之后，該核酸模板為單鏈存在。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述DNA合成終止劑是熒光染料標(biāo)記的雙脫氧核苷酸。9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述雙脫氧核苷酸是ddT、ddA、ddG和ddC。10.根據(jù)權(quán)利要求1、6或7所述的方法，其中通過(guò)共聚焦顯微鏡來(lái)檢測(cè)終止序列。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中加熱將所述終止序列從微珠上分離。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中毛細(xì)管個(gè)數(shù)超過(guò)1000個(gè)毛細(xì)管。13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中毛細(xì)管個(gè)數(shù)是大約10000到大約100000個(gè)毛細(xì)管。14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述毛細(xì)管為整體式結(jié)構(gòu)。15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中第一反應(yīng)溶液包含一種或多種引物。16.一種制備標(biāo)記終止的DNA序列的方法包括a)通過(guò)多個(gè)含有單條DNA模板序列的微珠提供多個(gè)DNA模板；b)混合由4種不同三磷酸脫氧核苷、一種續(xù)進(jìn)性DNA聚合酶和4種不同標(biāo)記的、可在特定核酸堿基終止DNA合成的DNA合成終止劑組成的第二反應(yīng)溶液和附著在微珠上的核酸模板；c)形成第二乳液來(lái)生成多個(gè)包含核酸模板、微珠和第二反應(yīng)溶液的微反應(yīng)器，其中至少一個(gè)微反應(yīng)器包括一個(gè)單個(gè)的核酸模板和包裹在第二反應(yīng)溶液中的單個(gè)微珠，其中微反應(yīng)器包含在同一容器中，其中每個(gè)所述終止劑在不同的核酸堿基終止DNA合成，所以形成終止序列。17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中多個(gè)微珠是超過(guò)1000000個(gè)。18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中多個(gè)微珠是大約100000到大約10000000之間。19.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中多個(gè)DNA模板是在大約100到大約1000000之間。20.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中多個(gè)DNA模板是在大約1000到大約100，000之間。21.一種檢測(cè)熒光標(biāo)記終止DNA序列的器件包括a)多個(gè)填充了凝膠高聚物的毛細(xì)管；b)將微珠送入毛細(xì)管的辦法；和c)共聚焦激光掃描儀。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的器件，其中多個(gè)毛細(xì)管組成毛細(xì)管模塊。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的器件，其中所述毛細(xì)管模塊包含大約1000到大約200000個(gè)毛細(xì)管。24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的器件，其中所述毛細(xì)管模塊包含大約10000到大約50000個(gè)毛細(xì)管。25.根據(jù)權(quán)利要求21所述的器件，其中所述毛細(xì)管直徑為大約1微米到大約500微米。26.根據(jù)權(quán)利要求21所述的器件，其中所述毛細(xì)管直徑為大約10微米到大約100微米。27.根據(jù)權(quán)利要求21所述的器件，其中所述毛細(xì)管長(zhǎng)度為大約1厘米到大約500厘米。28.根據(jù)權(quán)利要求21所述的器件，其中所述毛細(xì)管長(zhǎng)度為大約10厘米到大約100厘米。29.根據(jù)權(quán)利要求21所述的器件，其中所述毛細(xì)管長(zhǎng)度為大約40厘米到大約80厘米。30.根據(jù)權(quán)利要求21所述的器件，其中進(jìn)一步包括電解池架。31.根據(jù)權(quán)利要求21所述的器件，其中進(jìn)一步包括換熱器件。32.根據(jù)權(quán)利要求21所述的器件，其中進(jìn)一步包括蓋子。33.根據(jù)權(quán)利要求21所述的器件，其中所述共聚焦掃描儀包括激光器件。34.根據(jù)權(quán)利要求21所述的器件，其中所述共聚焦掃描儀進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)帶通過(guò)濾器ο35.根據(jù)權(quán)利要求21所述的器件，其所述中共聚焦掃描儀進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)選色過(guò)濾器ο336.根據(jù)權(quán)利要求21所述的器件，其中所述共聚焦掃描儀進(jìn)一步包括顯微鏡目鏡。37.根據(jù)權(quán)利要求21所述的器件，其中所述共聚焦掃描儀進(jìn)一步包括顯微鏡物鏡。38.根據(jù)權(quán)利要求21所述的器件，其中所述共聚焦掃描儀以100000赫茲到10000000赫茲的速率收集陣列圖像數(shù)據(jù)。39.根據(jù)權(quán)利要求21所述的器件，其中所述共聚焦掃描儀收集時(shí)間_分辨圖像來(lái)獲得多個(gè)序列信息。40.根據(jù)權(quán)利要求21所述的器件，其中毛細(xì)管有一個(gè)末端凹陷以容納微珠。全文摘要本發(fā)明涉及核酸序列分析領(lǐng)域。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及到高通量平行DNA測(cè)序的方法與設(shè)備。本發(fā)明同時(shí)提供一種篩選分析樣品序列的方法，用于富集靶序列或去除特定分子，尤其是測(cè)序樣品中不需要的序列模板。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101918590SQ200880120084公開(kāi)日2010年12月15日申請(qǐng)日期2008年12月10日優(yōu)先權(quán)日2007年12月10日發(fā)明者周小川,高曉蓮申請(qǐng)人:高曉蓮;周小川