專利名稱：多靶標檢測用微流體平臺的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開一般性涉及微流體裝置，且更具體而言涉及多靶標檢測用微流體平臺。
背景技術(shù)：
診斷測試是可以用于檢測和鑒定病原體(例如，有害細菌、病毒和生物體等)和/ 或患病細胞的生化技術(shù)。一種已知診斷測試涉及聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)的使用，PCR使用 DNA聚合酶通過體外酶促復(fù)制來擴增DNA片段(即靶標DNA)。PCR能夠?qū)⒆畛跻詷O小濃度 存在的DNA序列快速擴增，最終產(chǎn)生上百萬的相同DNA分子并由此指數(shù)級地增加對于各DNA 序列/靶標的檢測靈敏度。某些診斷測試還包括選擇性捕獲檢測靶標(例如，擴增的DNA序列、生物標記分 子、病原體和/或其它靶標)、將靶標從大樣品中移除并將該靶標與分子探針對接。對接后 的靶標可以用各種技術(shù)進行檢測，所述技術(shù)包括基于熒光標記或發(fā)射廣譜、拉曼廣譜和紅 外廣譜或紫外廣譜的光學(xué)傳感器技術(shù)。這些診斷測試在醫(yī)學(xué)診斷實驗室中被常規(guī)用于遺傳診斷技術(shù)中。另外，商店采用 如酶聯(lián)免疫吸附測試等診斷測試來檢測新鮮制備物中的細菌(如大腸桿菌)。盡管這些技 術(shù)可用于檢測細菌或者檢測其它DNA、生物標記或其它靶標，它們常受到昂貴和沉重的實驗 室設(shè)備的阻礙、往往需要大量的手動監(jiān)管和操控，并且需要數(shù)日甚至更長時間以產(chǎn)生結(jié)果 (例如，TB細菌需要一周來培養(yǎng))。便攜式PCR試劑盒也可商購；然而，這些測試具有至少一小時長的響應(yīng)時間，這對 于便攜式臨場用裝置或高通量生物標記篩選而言通常過長。另外，常規(guī)測試試劑盒仍然使 用具有低通量的批次形式來進行單一靶標檢測，該形式具有較低的靶標計數(shù)和不可靠的靈 敏度。


圖IA IF是由四極桿電極附近的經(jīng)對接和未經(jīng)對接的示例性納米結(jié)構(gòu)體形成的 示例性圖案的圖像。圖2是一體化多重連續(xù)流動介電電泳分選裝置的示意圖。
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圖3是放大的示例性對接納米結(jié)構(gòu)體的示例性俘獲的照片。圖4是以電導(dǎo)率對尺寸不同的示例性對接納米結(jié)構(gòu)體的交叉頻率作圖而得的圖。圖5是示例性對接納米結(jié)構(gòu)體的極端(pole)的導(dǎo)電性帶電的放大圖像。圖6是顯示兩種不同示例性檢測技術(shù)的示例性快速靶標檢測裝置的示意圖。圖7顯示了示例性檢測裝置上的示例性微流體通道的一部分。圖8顯示了示例性載玻片上的圖7的示例性微通道的示例性構(gòu)建。圖9顯示了圖8的示例性載玻片上的示例性過濾器的示例性構(gòu)建。圖10展示了示例性納米結(jié)構(gòu)體上的示例性寡聚物探針的示例性功能化。圖11顯示了圖6的示例性檢測裝置的更詳細的示意圖和該示例性裝置的照片，并 帶有示例性過濾器和示例性微通道的放大圖。圖12是采用遺傳雜交的示例性多靶標檢測單元的示意圖。圖13是圖12的檢測單元的示例性檢測子單元的示意圖。圖14是圖13的示例性檢測子單元的示例性膜和示例性電極對的示意圖。圖15是圖13的示例性檢測子單元的示例性阻抗檢測器。圖16是圖15的示例性阻抗檢測器的示例性電極網(wǎng)格的放大圖。圖17是圖16的示例性電極網(wǎng)格的示例性陣列交點的放大圖。圖18是示例性成像檢測器的示意圖。圖19是來自圖18的示例性成像檢測器的示例性圖像的示意圖。圖20是采用特異性雜交的示例性多靶標檢測單元的示意圖。圖21是圖20的檢測單元的示例性檢測子單元的示意圖。
具體實施例方式所述示例性裝置和方法針對一個或多個靶標(例如，病原體和/或患病細胞)的 檢測。一種示例性方法包括將包含第一靶標的樣品置于微流體裝置內(nèi)并將該第一靶標的多 個拷貝與多個納米結(jié)構(gòu)體雜交。所述示例性方法包括對所述多個納米結(jié)構(gòu)體施加交流電流 并利用由該電流創(chuàng)建的電場來俘獲和移動納米結(jié)構(gòu)體。俘獲使得樣品能快速流經(jīng)納米結(jié)構(gòu) 體，由此使得能夠從超過例如100微升的樣品溶液中捕獲靶標。然后對納米結(jié)構(gòu)體進行分 選和評估以確定第一靶標的存在或缺失，這可以包括例如對該靶標的量的確定。此外，樣品流由在外部或內(nèi)部施加的壓力驅(qū)動，該壓力由例如機械注射泵、手動驅(qū) 動注射泵、微泵和/或其它適當(dāng)裝置提供。壓力驅(qū)動的連續(xù)流動使得可以進行大體積樣品 的采樣并且避免通道和孔隙被碎屑堵塞，因此對于高通量便攜裝置較理想。因此，本文所述 的示例性方法和系統(tǒng)的分選和俘獲以及其它方面工作于壓力下，并由此可耐受阻塞、碎屑 和/或其它障礙。換言之，增加的壓力的存在不會妨礙本文所述的示例性方法或系統(tǒng)的運 行。充當(dāng)靶標檢測器單元的示例性裝置包含微流體裝置入口和雜交室，該微流體裝置 入口內(nèi)可放置第一靶標樣品，而所述雜交室將第一靶標的多個拷貝與多個納米結(jié)構(gòu)體對 接。另外，示例性裝置包含聚焦納米結(jié)構(gòu)體的聚焦器、分選納米結(jié)構(gòu)體的分選其和收集經(jīng)分 選的納米結(jié)構(gòu)體的俘獲器。另一個示例性靶標檢測方法包括獲取包含靶標的樣品并復(fù)制樣品中的靶標以產(chǎn)生擴增混合物。該示例性方法包括將納米結(jié)構(gòu)體與小室耦聯(lián)和將分子探針功能化至該納米 結(jié)構(gòu)體。該示例性方法包括使擴增混合物流經(jīng)納米結(jié)構(gòu)體以使擴增混合物中的靶標雜交。 交流或直流電場的存在提高了雜交產(chǎn)量和速率。此外，通過任何合適的檢測裝置和/或方 法來檢測靶標的存在或缺失。另一個示例性靶標檢測器包含復(fù)制室和微流體室，在該復(fù)制室中靶標被復(fù)制而產(chǎn) 生擴增混合物，而該微流體室含有納米結(jié)構(gòu)體，所述納米結(jié)構(gòu)體具有功能化至其上的分子 探針。該示例性靶標檢測器還包含過濾器、通道和檢測器，所述過濾器將納米結(jié)構(gòu)體保持在 微流體室內(nèi)，而擴增混合物通過所述通道流經(jīng)納米結(jié)構(gòu)體以使擴增混合物中的靶標雜交， 且所述檢測器確定靶標的存在或缺失。
再一個示例性多靶標檢測用方法包括將包含一個或多個靶標的樣品插入微流體 裝置內(nèi)；將靶標保持在貯存器中；使靶標通過多個檢測管；并使靶標雜交。該示例性方法還 包括通過任何適當(dāng)?shù)难b置和/或方法來檢測靶標的存在或缺失。又一個示例性多靶標檢測用靶標檢測器包含注入孔、用于保持靶標的貯存器、與 貯存器互通地耦聯(lián)的多個檢測管和處于多個檢測管中的雜交室，所述注入孔用于將包含一 個或多個靶標的樣品接收至微流體裝置內(nèi)。其它替代性的示例性靶標檢測裝置類似地包含 檢測靶標存在或缺失的檢測器。本文的示例性裝置和方法的運作包括出于例如國防、國土或國家安全、醫(yī)學(xué)、研 究、環(huán)境、過程控制應(yīng)用或任何其它適當(dāng)?shù)哪康膹幕颊吆?或環(huán)境獲取樣品以進行測試。某 些樣品可能需要在進行進一步測試之前進行預(yù)處理。預(yù)處理可以包括例如過濾、用化學(xué)試 劑沉淀和/或和/或用于從樣品通過物理、化學(xué)或其它方式除去碎屑和/或化學(xué)抑制劑的 物理碎屑和/或化學(xué)抑制劑的分解。在某些實例中，預(yù)處理還可以包括多種其它不同步驟。將分子檢測靶標加入樣品。分子檢測靶標可以包括例如生物標記或基因。某些示 例性生物標記包括生物囊泡、肽和/或其它非DNA分子?；虬―NA鏈和/或RNA鏈。在 某些實例中，如果靶標包含基因，則可以使用PCR來復(fù)制/擴增樣品中的DNA和/或RNA鏈 的數(shù)量。使檢測靶標與功能化(例如，化學(xué)連接)于納米結(jié)構(gòu)體上的互補性分子探針雜交 (例如，對接)。電場(例如，由AC電流產(chǎn)生的電場)的存在可以有助于靶標在納米結(jié)構(gòu)體 上的雜交。電場的存在極大減少了雜交所需的時間量。在某些實例中，雜交可能在檢測靶標 被導(dǎo)入納米結(jié)構(gòu)體后的少于1秒中發(fā)生。減少的雜交時間對高通量便攜裝置有益。示例性 納米結(jié)構(gòu)體包括碳納米管(CNT)、納米珠、納米線、納米膠體、納米顆粒、納米棒、量子點、納 米晶體、脂質(zhì)體、二氧化硅珠、乳膠珠、膠體金和/或具有亞微米級(例如，小于1微米)維 度的任何其它幾何形狀的其它結(jié)構(gòu)?？膳c納米結(jié)構(gòu)體功能化的分子探針包括例如寡聚物、 探針、熒光團、羧基、鏈霉抗生物素蛋白/抗生物素蛋白或其它合適的可使微結(jié)構(gòu)體具有親 水性的分子探針。利用不同納米結(jié)構(gòu)體的每一個作為分子探針有著各種優(yōu)點。例如，具有 均勻尺寸的乳膠顆粒易于合成，而具有不同的化學(xué)和分子探針的二氧化硅納米珠的功能化 已經(jīng)常規(guī)化。探針和熒光團與CNT的連接也相對較為簡單。納米線使得可以進行更容易的 編碼(coding)(例如，在不同納米線上添加熒光染料和/或其它標識)，且CNT提供了更好 的特異性，因為分子不會在CNT上因靜電相互作用而差異性地吸附。CNT的導(dǎo)電性也對分子 雜交敏感，從而靶標雜交事件會產(chǎn)生較大的電阻抗信號。此外，可以將不同熒光染料依次連
9接于膠體、脂質(zhì)體或納米線上以提供本文所述的熒光條碼或其它標識。如下文更詳細所述，存在多種可將檢測靶標雜交的方式。例如，基因可以通過氫鍵 與互補分子探針雜交(例如，也是DNA的寡核苷酸)。如果將生物標記用作檢測靶標，則生 物標記與納米結(jié)構(gòu)體對接因此，雜交在生物標記的分子與納米結(jié)構(gòu)體上的互補分子之間進 行。在生物標記是分子的實例中，雜交將在生物標記自身與納米結(jié)構(gòu)體上的互補分子之間 發(fā)生。這種雜交涉及氫鍵或者任何其它適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)和/或物理成鍵機制。雜交的另一個實 例涉及如下文詳述的生物素_鏈霉抗生物素蛋白?？梢砸愿鞣N方式對檢測靶標進行檢測。例如，在某些實例中，向?qū)蛹{米結(jié)構(gòu)體施 加介電電泳(DEP)以使該納米結(jié)構(gòu)體受電場作用，從而將該納米結(jié)構(gòu)體移動成為各種圖案 和/或測定含有該納米結(jié)構(gòu)體的溶液的阻抗。在其它實例中，通過對例如含納米結(jié)構(gòu)體的 溶液的熒光性質(zhì)(例如，強度)的光學(xué)觀測來進行檢測。在另一個實例中，可以同時采用對 熒光和阻抗的測定和/或觀測。可用于檢測靶標的一個示例性診斷試劑盒或檢測裝置包含一體化的連續(xù)流動介 電電泳平臺。包括使用賦予顆粒力的AC電場的基于DEP的微結(jié)構(gòu)體/納米結(jié)構(gòu)體平臺操 控納米結(jié)構(gòu)體從而微流體平臺可檢測和鑒定靶標。具體而言，DEP是指顆粒(需要充電)在 電場梯度的影響下的遷移。當(dāng)暴露于非勻強電場中時，電場在每個納米結(jié)構(gòu)體上誘導(dǎo)顆粒 偶極。納米結(jié)構(gòu)體經(jīng)受造成受控遷移的凈力，根據(jù)遷移是朝向或離開高場區(qū)來將該凈力描 述為正DEP (p-DEP)或負DEP (n-DEP)。隨著施加頻率的增加，大多數(shù)納米結(jié)構(gòu)體會從p_DEP 轉(zhuǎn)換至n-DEP。納米結(jié)構(gòu)體轉(zhuǎn)換時的點是“交叉”點。對納米結(jié)構(gòu)體間的“交叉”頻率的差 異的利用提供了對不同納米結(jié)構(gòu)體快速賦予不同顆粒力(如方向不同的力)的方式?？梢酝ㄟ^分子對接使納米顆粒體的DEP方向反轉(zhuǎn)。例如，對接改變功能化納米結(jié) 構(gòu)體的表面導(dǎo)電性和有效尺寸，這能改變在非勻強AC電場中納米結(jié)構(gòu)體的誘導(dǎo)偶極矩。結(jié) 果，納米結(jié)構(gòu)體在非勻強AC電場中根據(jù)是否已發(fā)生對接/雜交而組裝為明顯不同的圖案。例如，圖IA IF顯示了在四極桿電極附近的納米結(jié)構(gòu)體懸浮物。納米結(jié)構(gòu)體懸浮 物在圖IA IC中未對接，而在圖ID IF中是對接的。圖IA和ID顯示了頻率為300KHz 時的納米結(jié)構(gòu)體懸浮物，圖IB和IE顯示了頻率為700KHz時的納米結(jié)構(gòu)體懸浮物，而圖IC 和IF顯示了頻率為2. IMHz時的納米結(jié)構(gòu)體懸浮物。如圖IA IF所示，具有和不具有DNA 寡聚物雜交(即對接和未對接)的納米結(jié)構(gòu)體懸浮物在不同的AC頻率展示出明顯不同的 圖案?？梢詫⒃搱D案用于快速鑒定雜交而不用標記或標簽試劑?？梢杂帽銛y式光學(xué)顯微鏡 代替共聚焦熒光顯微鏡來進行檢測。雜交(即檢測靶標與納米結(jié)構(gòu)體的結(jié)合)越顯著且雜 交越多，則原始樣品中存在的靶標越多，且因此在患者或環(huán)境中存在的靶標越多，這可以為 例如國防、國土或國家安全、醫(yī)學(xué)、研究、環(huán)境、過程應(yīng)用或任何其它適當(dāng)?shù)哪康奶峁┯杏玫?fn息ο由于納米結(jié)構(gòu)體在電場下移動，可以利用力的方向的差異來分離和分選納米 結(jié)構(gòu)體，或在如下文詳述的某些實例中將納米結(jié)構(gòu)體保持在原位。另外，與細胞計數(shù) (cytometry)不同，DEP分選不需要在分選之前鑒定納米結(jié)構(gòu)。該技術(shù)可應(yīng)用于DNA-寡聚 物雜交、蛋白-DNA、抗體-抗原(例如，生物素-鏈霉抗生物素蛋白，如下文所討論)和其它 涉及表面功能化納米結(jié)構(gòu)體的分子對接測試而無需標記試劑或其它試劑。另外，二元、三元或四元納米結(jié)構(gòu)體懸浮物能提供更加豐富的可用于多靶標檢測的圖案譜圖。具有例如不同幾何形狀和尺寸的納米結(jié)構(gòu)體的懸浮物還可有助于復(fù)雜性。最 后，利用生物特征識別整合，可以產(chǎn)生大的圖案庫。如本文所詳述，通過比較所觀測圖案與 已知圖案來確定一個或多個靶標的存在或缺失，對圖案庫的訪問將有助于靶標檢測。與電動力學(xué)流量控制組件相似，本文所述的示例性DEP平臺因其僅需微型電池和 微型變壓器而極為便攜。由于片上光學(xué)傳感器受到電子控制，于是可以以最少量的執(zhí)行器 和傳感器來實現(xiàn)用于整個裝置/芯片的完全整合電子監(jiān)控結(jié)構(gòu)體。另外，機械移動部件被 保持至最少。例如，在某些實例中，唯一的機械移動部件是數(shù)個球閥。機械移動部件的數(shù)目 的減少使芯片制造成本降低。此外，可以用監(jiān)控微電路結(jié)構(gòu)實現(xiàn)反饋控制和自動化。圖2顯示了允許進行無傳感器納米結(jié)構(gòu)體分選和鑒定的示例性一體化多重連續(xù) 流動DEP分選裝置/芯片200。在該實例中，芯片200包含3個不同的順序DEP部件，并且 能將三種不同納米結(jié)構(gòu)體以例如約100納米結(jié)構(gòu)體/秒的速度分選至3個不同通道內(nèi)。芯 片200和任何周邊設(shè)備可以是手持式、一次性的，且可以以例如少于約1. 00美元的低廉價 格制造。經(jīng)過分選的納米結(jié)構(gòu)體可以被每個通道內(nèi)的DEP俘獲器捕獲而無需使用微型過濾 器。然后可以將濃縮的納米結(jié)構(gòu)體用片上(on-chip)或片下(off-chip)傳感器和檢測器 進一步分析。還可以通過例如測定一個或多個俘獲電極的阻抗來對納米結(jié)構(gòu)體進行計數(shù)。另外，可以將一個或多個示例性芯片200串聯(lián)或并聯(lián)并以模塊模式使用以便實現(xiàn) 大規(guī)模平行篩選。該模塊形式有助于提高規(guī)模以適合于采用極大數(shù)量的不同靶標的樣品分 析。這種配置還可以允許側(cè)流(sidestream)和再循環(huán)流(recycle stream)。示例性一體化DEP芯片模塊200的不同組件利用由不同納米結(jié)構(gòu)體在靠近產(chǎn)生高 電場的微電極組件的不同方向上受到的不同顆粒力。如上所述，示例性芯片200由粗DEP 碎片過濾器210 (其可如上所述用于預(yù)處理樣品)下游的三個構(gòu)件(stage)構(gòu)成。第一構(gòu) 件220是在所有顆粒的n-DEP區(qū)工作的聚焦單元。聚焦構(gòu)件220包含具有遞減的間隙寬度 且處于比大多數(shù)納米結(jié)構(gòu)體的交叉頻率高的頻率的兩個側(cè)面電極陣列222。間隙224的遞 減孔隙將連續(xù)流中的幾乎所有納米結(jié)構(gòu)體都聚焦于通道中間的小于約例如10微米的區(qū)域 內(nèi)。聚焦的納米結(jié)構(gòu)體形成線性單列隊列，然后可在下游被逐個詢查。第二單元230包含 3個DEP分選器232，每個分選器由頂部基片處的斜電極和底部處的鏡像電極(未顯示)構(gòu) 成。電極對之間的間隙維持可排斥n-DEP納米顆粒體并允許p-DEP通過的高場，由此實現(xiàn) 對這些納米結(jié)構(gòu)體的分離。n-DEP納米結(jié)構(gòu)體沿斜電極對移動，然后被從p-DEP納米結(jié)構(gòu) 體中釋放至不同的流線(streamline) 234a 234d處的下一分選器。因此，納米結(jié)構(gòu)體能 占據(jù)分選單元230之后的4個可能的流線234a 234d 原始的聚焦流線外加流經(jīng)3個分 選器233的尖端的流線。然后可將這些流線234a 234d進樣至4個不同通道236內(nèi)?？?慮到圖2的實例中所示的聚焦單元220的分辨率，在高通量工作條件下僅使用三個分選通 道236。通過在不同閘門處使用不同頻率，可以將三種不同納米結(jié)構(gòu)體分選至三個不同通道 內(nèi)。在最后的構(gòu)件中，構(gòu)造有3-D俘獲器240以捕獲每個通道中的所有納米結(jié)構(gòu)體，同時溶 液不受額外的水動阻力地流經(jīng)間隙。當(dāng)大規(guī)模并聯(lián)或串聯(lián)時，該連續(xù)流動芯片200使得可以進行高通量且無標記的分 選而不使用會引入顯著的水動阻力的分子篩或微濾器。通過使用針對特定納米結(jié)構(gòu)體的特 異性頻率，一體化分選器232和俘獲器240提供了比分子納米篩高得多的特異性。在俘獲電 極處的阻抗測定可以估算所俘獲的納米結(jié)構(gòu)體的數(shù)目。納米結(jié)構(gòu)體隊列的示例性俘獲可見
11于圖3。在該實例中，可以以約100顆粒/秒而對二元分離實現(xiàn)接近80%的分離效率。因 此，串聯(lián)的兩個或三個模塊可以實現(xiàn)約99%的純度。通過從未對接的納米結(jié)構(gòu)體中分選出具有對接抗原的納米結(jié)構(gòu)體(或雜交的遺 傳納米結(jié)構(gòu)體)，上述單元提供了采用不同納米結(jié)構(gòu)體而不用光學(xué)傳感或熒光標記(或除 此以外)的連續(xù)流動的多靶標檢測的簡單方法。對接的納米結(jié)構(gòu)體具有與未對接的納米結(jié) 構(gòu)體明顯不同的DEP移動力(mobility)和/或交叉頻率。DEP移動力對尺寸敏感，盡管更 小的納米結(jié)構(gòu)體可能對于例如DNA靶標的分子鉚接(molecular anchoring)更加敏感，但 納米結(jié)構(gòu)體不能過小否則移動力將變得無關(guān)緊要。最佳尺寸可為約50nm 500nm，這將允 許例如高達約100 μ m/s的DEP速度。由于DEP移動力對尺寸敏感，帶有相同維度的對接分 子的納米結(jié)構(gòu)體應(yīng)該具有不同的DEP移動力。此外，DNA是導(dǎo)電性分子，且其對接能顯著增 加小納米結(jié)構(gòu)體相對于緩沖溶液的顆粒導(dǎo)電性。例如，圖4顯示出隨著導(dǎo)電性的增加，尺寸 不同的納米結(jié)構(gòu)體的交叉頻率之間的差異不成比例地增加。例如，對于低于約lmS/m的導(dǎo) 電性而言，尺寸比約為6的兩個納米結(jié)構(gòu)體可能僅具有約5倍差異的交叉頻率。導(dǎo)電性更 高時，兩個納米結(jié)構(gòu)體之間的交叉頻率可能相差大約兩個數(shù)量級。圖5顯示了納米結(jié)構(gòu)體的極端的導(dǎo)電性帶電的實例。如極端處高得多的熒光強度 所證實，帶電熒光染料每半個循環(huán)在相反的極端積聚并增加其濃度(例如，約6個數(shù)量級)。 相同的正常雙層帶電、切向遷移和極端濃縮機制可以將帶負電的DNA濃縮于納米結(jié)構(gòu)體的 一極。這些對接的DNA分子反過來改變極端處的后續(xù)導(dǎo)電極化并影響納米結(jié)構(gòu)體的交叉 頻率。因此，雜交和未雜交的納米結(jié)構(gòu)體懸浮物在相同頻率處展示出不同的圖案(參見圖 IA 1F)。因此，在對接和未經(jīng)對接的納米結(jié)構(gòu)體之間因雙層效應(yīng)而存在交叉頻率的差異， 且DEP平臺200可以無需傳感器而將這兩種納米結(jié)構(gòu)體有效分選。另外，如本文所詳述，納米結(jié)構(gòu)體的幾何形狀和材料、緩沖液的介電常數(shù)、電導(dǎo)率 和離子價以及納米結(jié)構(gòu)體_納米結(jié)構(gòu)體相互作用均會影響納米結(jié)構(gòu)體的DEP行為并影響分 選。在所示實例中，探針232的長度影響交叉發(fā)生處的頻率。如CNT和細長納米線等一些 納米結(jié)構(gòu)體具有高得多的DEP移動力(因細長幾何形狀導(dǎo)致的場聚焦)、更有選擇性的分 子捕獲、可忽略的染料吸附，因此可以作為用于某些示例性DEP平臺的優(yōu)選納米結(jié)構(gòu)體。另 外，CNT和細長納米線還相對較易于條碼化(barcode)。事實上，CNT比納米球與細菌對接 更容易得多，且對接的CNT能實際上提高聚集體的DEP并成為靶標(例如，病原體)的DEP 運送體。另外，在例如兩性離子、離子液體和其它改變介質(zhì)的介電常數(shù)和電導(dǎo)率的添加劑 的情形中，可能需要進行緩沖調(diào)節(jié)。圖6顯示另一個示例性快速靶標檢測裝置600的框圖，該裝置用于檢測患者、環(huán)境 中的細菌、病毒和其它有害物種，或用于監(jiān)測超出傳統(tǒng)DNA微陣列或適時PCR的能力的流 行病、恐怖主義、生物武器等。示例性快速靶標檢測裝置600涉及基于改進的PCR法和定 制的微流體制造技術(shù)的檢測技術(shù)，所述改進PCR法利用鏈霉抗生物素蛋白/抗生物素蛋白 與生物素的特異性和較強的結(jié)合性質(zhì)。鏈霉抗生物素蛋白是從細菌鏈霉菌(Streptomyces avidinii)純化的四聚體蛋白，而也稱作維生素H或B7的生物素(CltlH16N2O3S)是水溶性B復(fù) 合維生素。鏈霉抗生物素蛋白具有格外強的對生物素的親和力；生物素-鏈霉抗生物素蛋 白復(fù)合物的解離常數(shù)為約10_15mol/L量級，排在最強的已知非共價相互作用當(dāng)中。因此，強鏈霉抗生物素蛋白-生物素鍵能以用于將各種生物分子彼此相連或者連接于固體載體(例 如，納米結(jié)構(gòu)體)上以促進對各種生物分子的檢測，如本文所述。在PCR方案過程中，將兩個經(jīng)不同標記的引物(一個是生物素化的602，另一個是 熒光標記的604)添加至帶有樣品/靶標DNA 608的PCR室606中，并將其用于擴增感興趣 的靶標物種的DNA以便增大樣品中單鏈DNA(ssDNA)的量。因此，擴增的靶標DNA 610通過 雙鏈DNA(dsDNA)的一端與生物素基團相連且另一端與熒光標記染料相連?？梢詫㈡溍箍股锼氐鞍?抗生物素蛋白功能化于裝置/芯片通道上或芯片中所 含的納米珠/微珠、磁性納米顆粒、碳納米管、納米線、納米棒和/或其它納米結(jié)構(gòu)體(如本 文其它實例中所示)上。為實現(xiàn)對PCR產(chǎn)物的快速檢測，接著通過使擴增的DNA 610流經(jīng) 微流體芯片614中的通道612內(nèi)所俘獲的經(jīng)鏈霉抗生物素蛋白/抗生物素蛋白功能化的 納米結(jié)構(gòu)體，使擴增的sdDNA與經(jīng)鏈霉抗生物素蛋白/抗生物素蛋白功能化的納米結(jié)構(gòu)體 接觸，從而進行生物素與鏈霉抗生物素蛋白之間或生物素與抗生物素蛋白之間的強相互作 用。生物素化的擴增DNA 610流經(jīng)通道612內(nèi)所俘獲的納米結(jié)構(gòu)體使擴散長度減小并由此 允許與連接于納米結(jié)構(gòu)體表面的鏈霉抗生物素蛋白的快速相互作用。僅熒光標記的生物素 化dsDNA特異地、快速且強力地與納米結(jié)構(gòu)體表面相連。由于較強的結(jié)合，因而相互作用動力學(xué)極快且納米結(jié)構(gòu)體平臺相當(dāng)大地減少了運 送時間。而且，納米結(jié)構(gòu)體的使用還為生物素與鏈霉抗生物素蛋白/抗生物素蛋白部分的 相互作用提供了更高的表面積，且因而增強了檢測靈敏度。生物素-鏈霉抗生物素蛋白/抗 生物素蛋白結(jié)合比寡DNA雙鏈形成更具特異性并且允許對大樣品的更穩(wěn)健和準確的測試。 另外，強雜交在具有高流速的大通量芯片中(其中動水剪切力往往將較弱雜交的DNA扯下) 特別有利。此外，由于強力且特異性的結(jié)合，雜交步驟之后可以立即采用清洗緩沖液以除去 所有未連接的熒光染料分子608。最后，可以通過測定納米結(jié)構(gòu)體的熒光強度來完成檢測。另外，具有高導(dǎo)電性的功 能化碳納米結(jié)構(gòu)體的使用還有助于如本文所述在不用光學(xué)傳感器時使用阻抗測定來快速 檢測擴增產(chǎn)物。圖7 11顯示了另一個示例性的基于納米結(jié)構(gòu)體的單一靶標遺傳鑒定用雜交平 臺。圖7顯示了形成含有納米結(jié)構(gòu)體704的小室702的微流體通道700的一部分，所述納 米結(jié)構(gòu)體在所示實例中顯示為經(jīng)探針功能化的二氧化硅珠，但可以使用任何適合的納米結(jié) 構(gòu)體。探針功能化的納米結(jié)構(gòu)體(例如，二氧化硅珠)被俘獲并通過流經(jīng)緩沖溶液(可為 例如，4X標準檸檬酸鹽鹽水(SSC)雜交緩沖溶液)來正確裝填。在成功裝填納米結(jié)構(gòu)體 704后，在例如約50°C的溫度和例如約0. 5ml/h的流速，將例如100微升的體積的生物素化 ssDNA 706通過經(jīng)裝填的小室702以進行與在納米結(jié)構(gòu)體(例如，二氧化硅)表面上功能化 的互補寡聚物的雜交。DNA 706通過經(jīng)裝填的小室702減小了靶標DNA與納米結(jié)構(gòu)體704 表面上的寡聚物探針之間的分隔距離，由此減少了雜交時間。另外，該納米結(jié)構(gòu)體系統(tǒng)提供 了大得多的雜交用表面積，由此提高了檢測靈敏度?？梢蕴砑酉礈烊芤夯蚱渌后w(例如，純水或去離子水)以便洗滌未雜交的DNA 或者與納米結(jié)構(gòu)體704表面結(jié)合或與小室702的過濾器(如下所述)結(jié)合的非特異性DNA。 此外，可以通過添加結(jié)合有鏈霉抗生物素蛋白的熒光染料708來完成雜交檢測，由此利用 鏈霉抗生物素蛋白-生物素的強結(jié)合反應(yīng)。然后例如采用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)緩沖溶液將過量的染料708從通道中洗掉，并測定和/或觀測熒光710的圖案和/或強度。當(dāng)將DNA 706通過通道700認作檢測起始點時，則在該實例中檢測時間可能為約2 3小時，且檢測 靈敏度為約IOOpM nM，如下所述。本文所述的示例性的基于納米結(jié)構(gòu)體的檢測技術(shù)包含多個組件，所述組件包括例 如⑴載玻片800上的微通道700的制造(圖8)，(ii)使用甲基丙烯酸酯光聚合物來制 造微通道700內(nèi)的過濾器(圖9)，(iii)納米結(jié)構(gòu)體(例如，二氧化硅珠)上的寡聚物探針 的功能化(圖10)，(iv)不對稱PCR，和最終通過讓靶標DNA溶液經(jīng)過裝置/芯片內(nèi)的經(jīng)裝 填的納米結(jié)構(gòu)體微通道而成功實現(xiàn)雜交。如上所述，電場(例如，AC電流產(chǎn)生的電場)的 存在可以有助于納米結(jié)構(gòu)體上的靶標的雜交。電場的存在極大減少了雜交所需時間量。在 某些實例中，雜交可能隨著檢測靶標被引入納米結(jié)構(gòu)體內(nèi)而在1秒內(nèi)發(fā)生。減少的雜交時 間對于高通量便攜裝置有益。圖8顯示了載玻片800上的微通道700的制造。鉆孔以形成通道700的入口和出 口端口 802。將掩模布局圖804與載玻片800組合，并將墊片接頭(spacer tap) 806與蓋片 808結(jié)合，向其添加紫外固化膠(例如，Loctite 363膠)以結(jié)合所述元件，可以對其用紫 外能量烘烤約5秒。然后用例如丙酮和甲醇等溶劑清洗通道700，且可以進行例如2. 5分鐘 的最終紫外烘烤。過濾器900的制造(圖9)通過使用甲基丙烯酸酯光聚合物(單體)混合物以及 甲苯與異丁醇的混合物(成孔劑(porogen))來在微通道700內(nèi)進行。通過改變單體與成 孔劑的比例，可以操縱過濾器900的孔徑。在某些實例中，將孔徑為約2微米的過濾器與尺 寸為約10微米的納米結(jié)構(gòu)體一同使用。另外，還組合了掩膜并將該組合用紫外烘烤例如約 1分鐘。烘烤后，除去掩膜并用甲醇沖洗通道700例如約2小時。在微通道700制造過程和 微濾器900制造過程中均使用一體化紫外烘烤(即固化聚合過程)以使過濾器900能與微 通道700強力結(jié)合。在該實例中，可以使用上述的所有或部分實例來實現(xiàn)納米結(jié)構(gòu)體功能化、PCR設(shè)計 和雜交檢測。更具體而言，在本文所述的實例中，將胺偶聯(lián)的27聚體寡聚探針通過與水溶 性碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)偶合而與納米結(jié)構(gòu)體功能化。該組合的實 例如圖10所示。在某些實例中，為使基于納米結(jié)構(gòu)體的雜交平臺更簡單并且為避免靶標DNA的變 性(因變性的ssDNA會在其到達并與微通道內(nèi)所俘獲的探針功能化納米結(jié)構(gòu)體相互作用之 前重組到一起)，進行不對稱PCR以產(chǎn)生單鏈DNA。在該方法中，使用不等濃度的引物(與 之相反的是例如正常的對稱PCR)。起初，擴增以指數(shù)級開始，但隨著較低濃度的引物的消 耗，更高濃度的引物繼續(xù)擴增而產(chǎn)生單鏈DNA。在該實例中，在將納米結(jié)構(gòu)體704添加至通道702之前，可以將例如2%牛血清白 蛋白(BSA)溶液等溶液通過微通道700以避免靶標DNA706和熒光染料708與過濾器900 和通道700的表面的非特異性結(jié)合。圖11是一體化便攜式PCR檢測芯片800的更詳細示意圖。過濾器900顯示于芯 片800頂部的通道700中。圖7 11中所述實例能在例如30分鐘內(nèi)進行單靶標檢測，且 大多數(shù)時間用于PCR循環(huán)。如圖11中可見，可以用便攜式數(shù)碼相機輕易獲取來自俘獲的納 米結(jié)構(gòu)體706的熒光信號而不用采用共聚焦設(shè)備。該一次性芯片800含有片上泵和閥以及二極管傳感器。因此，芯片800是配套齊全的便攜式遺傳鑒定裝置/試劑盒。就檢測而言，由于每單位體積的寡聚功能化納米結(jié)構(gòu)體的較大表面積，毫米維度 的微型貯存器能以皮摩爾靈敏度捕獲立方厘米體積樣品中的所有靶標DNA。然而，由于所有 熒光分子被濃縮在微升級體積內(nèi)，故熒光強度極高。作為參照，DNA微陣列(例如，圖15 17)上的單個像素的面積為10_2cm2，而在1微升微珠(50體積％ )中要高出4個數(shù)量級并具 有成比例的更高的熒光強度。利用這種增強，可以消除激光激發(fā)和共聚焦檢測。簡單光學(xué) 濾光片和數(shù)碼相機、二極管傳感器或CCD相機可以適用于本文所示的陽性_陰性鑒定?？?速且便攜的陽性_陰性診斷具有許多重要的作為初步篩選步驟的臨場用應(yīng)用港口/機場 的流行病控制、禽類進口的禽流感監(jiān)測、環(huán)境監(jiān)測等。圖12 19顯示了可以用作帶有一體化PCR/檢測單元的多靶標DNA檢測單元的 其他示例性實施方式。圖12 19所示的實例可以擴展至具有更高通量的連續(xù)流動形式。所示實例使用阻抗檢測或成像來檢測和測定納米結(jié)構(gòu)體上的雜交。如上所述，納 米結(jié)構(gòu)體包括在雜交之前和之后具有極為靈敏的阻抗信號的CNT。兩種檢測方法均利用納 米結(jié)構(gòu)體技術(shù)的雜交快速性和靈敏性，以及因如上所述的雜交而引起的納米結(jié)構(gòu)體的電導(dǎo) 率、尺寸、誘導(dǎo)偶極和介電電泳移動力的變化。在圖12 19所示實例中，雜交是遺傳性的，使用了經(jīng)鏈霉抗生物素蛋白功能化的 納米結(jié)構(gòu)體和用如上所述的不同引物分別PCR的生物素化ssDNA。在該實例中，復(fù)制或PCR 模塊1200包含可拆卸地聯(lián)接的管陣列盒1202，其包含多個檢測瓶或檢測管1204，其中之一 如圖13所詳細顯示?？梢允褂米⑸淦骰虮?206將含有檢測靶標的樣品經(jīng)由注入孔1208輸 送至PCR模塊1200。將樣品注入PCR模塊1200并進入貯存器1210。另外，PCR模塊1200 包含加熱元件(未顯示)以提供維持例如約50°C 90°C的溫度的熱源。如圖13和14所示，貯存器1210中的檢測靶標遇到與至少第一電極或第一電極對 1214聯(lián)接的第一膜1212。第一膜1212是納米多孔的或為水凝膠且為透水性的，但不允許 其它分子通過，即檢測靶標無法通過膜1212。特別地，當(dāng)檢測瓶過小而無法允許氣泡逃逸 時，膜1212應(yīng)為透水性的。用于膜1212的一個示例性材料是Nafion。然而，對于半徑大 于Imm的管1204而言，所述膜無須允許水通過?？缭降谝浑姌O1214的電場和/或電壓會 溶解、崩解破壞第一膜1212或者破壞其完整性，從而開出至少一個孔以用于檢測靶標1212 的分子傳送。在檢測靶標1212通過第一膜1214之后，針對特定的檢測管1204采用特定的引物 /酶來對檢查靶標1212進行PCR。由于每個PCR瓶(即檢測管1204)的擴增子受特定靶標 ssDNA的控制，并且由于每個擴增子被輸送至不同的檢測單元，當(dāng)其存在時，沒有必要在鑒 定階段是特異性的。擴增的檢測靶標遇到與至少第二電極或第二電極組1220聯(lián)接的第二膜1218，其 起著與第一膜1214和第一電極1216相似的作用。在對第二電極1220施加電壓后，第二膜被破壞且檢測靶標1212通過PCR層而來 到雜交和檢測層。此處，使用如上文詳述的鏈霉抗生物素蛋白功能化的納米結(jié)構(gòu)體將檢測 靶標雜交，以形成對接的分子探針或?qū)拥募{米結(jié)構(gòu)體1222。該反應(yīng)在例如室溫附近發(fā)生。雜交后，對接的分子探針1222遇到阻抗檢測器1224(圖13和15)。阻抗檢測器 1224處測定的阻抗值提供了對如本文所詳述的檢測靶標1212的存在或缺失的指示。圖16
15是圖13和15所示阻抗檢測器1224的一部分的放大圖。微電極網(wǎng)格1228包含多個像素 1230，其中之一在圖17中放大顯示。像素1230是可尋址的，且在某些實例中時可同時尋址 的，而在其它實例中像素1230不是能同時尋址的。每個像素1230包含處于兩個線性陣列 1234的交匯處的介電墊片1232。介電墊片1232使得能在兩個線性陣列1234的交匯處產(chǎn) 生高場。電可以操控如上所述的對接納米結(jié)構(gòu)體1226的移動。對接納米結(jié)構(gòu)體1226被移 動來使對接納米結(jié)構(gòu)體濃縮以進行成像或阻抗讀數(shù)。圖18顯示了示例性成像檢測單元1800。在該示例性成像檢測單元1800中，相機 1802透過一個或多個電極網(wǎng)格1228的光學(xué)透明覆蓋透鏡或蓋片1804來獲取圖像。圖19 顯示了示例性圖像1900。示例性圖像1900顯示出其中對接的納米結(jié)構(gòu)體1226聚集的擁堵 區(qū)域1902和其中對接納米結(jié)構(gòu)體1226未聚集的空曠區(qū)域1904。替代性地，在圖20 21中所示實例中，雜交可以在靶標ssDNA與納米結(jié)構(gòu)體上功 能化的互補寡聚物之間是靶標特異性的。在該替代性實例中，在替代性的示例性復(fù)制或PCR 單元2000中進行PCR以產(chǎn)生擴增的檢測靶標2002，所述復(fù)制或PCR單元2000包含具有針 對所有可能的靶標ssDNA的所有引物的貯存器。因此，該貯存器含有針對樣品中所包含的 所有靶標類型的所有增強子類型的集合。微泵/微閥2004將帶有擴增檢測靶標2002的樣 品轉(zhuǎn)移至雜交/檢測單元2006中，該雜交/檢測單元2006含有多個單獨檢測管或檢測瓶 2008，其中之一如圖21所放大顯示。在某些實例中，微閥僅需開啟一次。集合性PCR擴增 子被送至所有的單瓶2008，且單瓶2008中的每一個都含有與特定寡聚物功能化的納米結(jié) 構(gòu)體。在某些實例中，在膜因如上詳述的跨電極的電場或電壓的存在而開啟時，檢測靶標與 雜交層中的納米結(jié)構(gòu)體分離。一旦檢測靶標2002進入雜交層，發(fā)生如上詳述的雜交。在該 實例中，雜交在約70°C發(fā)生。在檢測靶標2002與納米結(jié)構(gòu)體雜交而形成對接探針或?qū)蛹{米結(jié)構(gòu)體2010之 后，對接納米結(jié)構(gòu)體2010可能遇到阻抗檢測器2012。阻抗檢測器2012以類似于如上詳述 的阻抗檢測器1124的方式來檢測檢測靶標2002的存在或缺失。另外，在本實例中還可將 圖像檢測器1800用于檢測檢測靶標2002的存在或缺失。利用本文所述的示例性診斷裝置/檢測單元實現(xiàn)了許多優(yōu)點和益處。例如，本文 所述的實例使得病原體診斷能夠更為快速、特異、靈敏和可臨場應(yīng)用。優(yōu)點眾多，包括例如 早期和快速的癌癥檢測或者對如膿毒癥等急性感染的迅捷且病原體特異的診斷，這將顯著 增加患者存活率。除速度和特異性以外，本文所述的示例性裝置和方法還具有允許臨場使 用的高便攜性，這對于諸如流行病控制等臨場應(yīng)用以及對多種可能危及全世界健康的感染 性病原體的病原體鑒定特別有用，所述病原體包括例如禽流感、SARS、溶血性尿毒綜合征和 血性腹瀉(大腸桿菌0157:H7)、結(jié)核(結(jié)核分支桿菌)、炭疽(炭疽芽孢桿菌)、肺炎(肺炎 鏈球菌)、瘧疾(瘧原蟲屬)、肝炎(甲肝、乙肝、丙肝、丁肝和戊肝病毒)和出血熱(埃博拉 病毒)。本文所述的示例性裝置和方法還可以用于檢測食物產(chǎn)品和水源中的大腸桿菌，并鑒 定具有抗生素耐藥性的病原體(例如，肺炎雙球菌、腸球菌、葡萄球菌、惡性瘧原蟲和結(jié)合 分支桿菌或瘧疾細菌)在第三世界國家的重新出現(xiàn)。對于消費者導(dǎo)向的診斷裝置/試劑盒 而言，示例性便攜裝置的樣品接觸組件可以是一次性的。另外，示例性裝置具有高靈敏度， 這可用于涉及較少量靶標的病原體檢測，例如，生物恐怖主義和環(huán)境應(yīng)用中所經(jīng)歷的情形。本文所述實例是芯片實驗室(lab-on-a-chip)式的微流體平臺，其可通過將離散的樣品或連續(xù)流在單個芯片內(nèi)從一個站點移動至另一站點而無須人的干預(yù)以使得能夠?qū)?現(xiàn)大通量連續(xù)流動的形式。另外，由于通過本文所述的微流體方式和DEP將所需靶標(例 如，特定DNA片段)濃縮于探針附近，因而裝置特異性得到提高。另外，上述AC電動力學(xué)平臺極為便攜，因為它們可以由如手機內(nèi)的那些手持電源 驅(qū)動。高頻(例如，大于約100kHz) AC場通常比對應(yīng)電壓的法拉第反應(yīng)時間更短的周期，因 而在電極處不會產(chǎn)生氣泡和離子產(chǎn)物的凈生成。如此，可以將電極嵌入示例性裝置內(nèi)以允 許更精確的流體管理。此外，本文所述的實例的主要優(yōu)點之一在于使用示例性裝置進行多靶標診斷的能 力。即使僅一個靶標(例如，一個病原體)待檢測，但也常常需要來自其基因組的多個DNA 靶標以進行準確的鑒定。另外，具有小維度、大數(shù)量和大的面積-體積比的次微米級納米結(jié)構(gòu)體表面上的 分子探針的功能化增加了檢測靈敏度。例如，100微升的的納米結(jié)構(gòu)體(例如，微米尺 寸的膠體)懸浮物樣品含有總表面積為Icm2的百萬個納米結(jié)構(gòu)體。與傳統(tǒng)DNA微陣列的 Imm2的像素面積相比，這些納米結(jié)構(gòu)體提供了高8個數(shù)量級的捕獲面積和相當(dāng)大的靈敏度 的增加。此外，在同一樣品中，納米結(jié)構(gòu)體之間的平均間隔比樣品的線性維度小3個數(shù)量 級。對于存在少數(shù)檢測靶標分子的情況而言，這可轉(zhuǎn)換為最大6個數(shù)量級的擴散時間的減 少，這比任何增強對流的物質(zhì)轉(zhuǎn)移速率都高得多。該納米結(jié)構(gòu)體平臺具有其他潛在的益處。如果可以將這些納米結(jié)構(gòu)體組裝 并分散于微通道內(nèi)，則納米結(jié)構(gòu)體能形成微型CSTR、微型色譜和微型塞流式反應(yīng)器 (microplugflow reactor)，并因此引起了這些反應(yīng)器涉及的優(yōu)點比開放流式CSTR的熱 力學(xué)產(chǎn)率更好的產(chǎn)率，可提高平行對接反應(yīng)的選擇性的分離，和可提高不可逆反應(yīng)的產(chǎn)率 的低分散性。另外，在那些其中將PCR技術(shù)與鏈霉抗生物素蛋白/抗生物素蛋白與生物素的強 相互作用相結(jié)合的實例中，對檢測靶標物種的遺傳鑒定更簡單、更快速、穩(wěn)健和靈敏。本文 所述的實例顯著減少了響應(yīng)時間而同時增加了靈敏度。因此，本文所述的便攜式PCR芯片 或其它裝置提供了臨場應(yīng)用。本文所述的實例還消除了對需要經(jīng)實驗室培訓(xùn)的技術(shù)人員和 實驗室設(shè)備的用于熒光檢測的多步方案(攪拌、洗滌和清洗)的需求。另外，本文所述的實 例和方法移除了對固定在實驗室的共聚焦設(shè)備的需求從而有助于檢測和長達小時的雜交 時間。此外，可以使用聯(lián)接有光學(xué)濾光片和硅光二極管的發(fā)光二極管(LED)來進一步發(fā)展 光學(xué)檢測平臺和使其小型化。此外，本文所述的示例性微通道和納米結(jié)構(gòu)體的幾何形狀放寬了傳統(tǒng)微流體設(shè)計 所體驗的靈敏度和便攜性限制。微通道內(nèi)的較大表面積與體積之比使得更多的表面探針能 與通道壁功能化，這顯著增加了捕獲微小濃度中存在的靶標的可能性，并由此提高了對應(yīng) 的診斷測試的靈敏度。示例性裝置檢測傳染性病原體的能力使得能夠?qū)τ刹≡w造成的疾病的爆發(fā)采 取快速和有效的響應(yīng)。操作員(例如，臨床微生物學(xué)家、護士或其它技術(shù)人員)能確定樣 品(其可為臨床樣品、食物樣品、環(huán)境樣品等)中是否存在病原體，且如果存在則鑒定出該 病原體的類型和量。鑒定出的病原體可以是僅數(shù)種(例如，少于約5種)乃至上百種，且每 種類型的數(shù)目可以幾個數(shù)量級上變化，例如，數(shù)個至數(shù)百萬個集落形成單元(CFU)/毫升樣品。 盡管本文已經(jīng)對某些示例性方法、設(shè)備和制造品進行了描述，但本發(fā)明的覆蓋范 圍并不限于此。相反，本發(fā)明涵蓋在字面上或根據(jù)等同原則落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)的 所有方法、設(shè)備和制造品。此外，本文所述的任何示例性裝置和/或方法可以以整體或部分 進行組合。
權(quán)利要求
一種檢測一個或多個靶標的檢測方法，所述方法包括將包含第一靶標的樣品置于微流體裝置內(nèi)；將該第一靶標的多個拷貝與多個納米結(jié)構(gòu)體雜交；對所述多個納米結(jié)構(gòu)體施加電流；利用該電流創(chuàng)建的電場來移動所述多個納米結(jié)構(gòu)體；對所述多個納米結(jié)構(gòu)體進行分選；和評估經(jīng)分選的納米結(jié)構(gòu)體以確定所述第一靶標的存在、缺失或含量中的至少一項。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中通過介電電泳施加電流。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中存在增大的壓力不會阻礙所述方法。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一靶標的多個拷貝通過聚合酶鏈式反應(yīng)產(chǎn)生。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述電場在第一電流下具有第一頻率且在第二電流 下具有第二頻率，并且其中所述多個納米結(jié)構(gòu)體中的至少一個在第一頻率下向第一方向移 動而在第二頻率下向第二方向移動。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多個納米結(jié)構(gòu)體根據(jù)電場的頻率形成圖案。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一靶標的存在或缺失表明病原體、癌細胞、生 物囊泡、肽、DNA、RNA或非DNA分子的存在或缺失。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括在微流體裝置的不同點施加多個電流。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述多個電流創(chuàng)建了跨越所述微流體裝置的非勻強 電場。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多個納米結(jié)構(gòu)體是碳納米管、納米珠、納米線、 納米膠體、納米顆粒、納米棒、量子點、納米晶體、脂質(zhì)體、二氧化硅珠、乳膠珠、膠體金或其 它維度小于1微米的結(jié)構(gòu)中的一個或多個。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括將一個或多個分子探針功能化于所述 多個納米結(jié)構(gòu)上。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述一個或多個分子探針包括寡聚物、熒光團、羧 基或鏈霉抗生物素蛋白中的一個或多個。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括對樣品進行預(yù)處理。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述預(yù)處理包括抑制劑的過濾或除去中的至少一項。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其中對經(jīng)分選的多個納米結(jié)構(gòu)體的評估包括確定阻抗 值、觀察圖案或檢測熒光中的一項或多項。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法包括在分選之前將所述多個納米結(jié)構(gòu)體聚焦。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法包括 檢測所述樣品中所包含的第二靶標；將該第二靶標的多個拷貝與多個納米結(jié)構(gòu)體雜交；評估經(jīng)分選的納米結(jié)構(gòu)體以確定所述第二靶標的存在、缺失或含量中的至少一項， 其中，對所述多個納米結(jié)構(gòu)體施加電流導(dǎo)致與第一靶標雜交的多個納米結(jié)構(gòu)體向第一 方向移動，并導(dǎo)致與第二靶標雜交的多個納米結(jié)構(gòu)體向第二方向移動，并且其中根據(jù)第一方向或第二方向來對第一靶標和第二靶標進行分選。
18.一種靶標檢測器單元，所述靶標檢測器單元包含 向其內(nèi)放入第一靶標的樣品的微流體裝置的入口； 將第一靶標的多個拷貝與多個納米結(jié)構(gòu)體對接的雜交室； 聚焦所述多個納米結(jié)構(gòu)體的聚焦器；對所述多個納米結(jié)構(gòu)體進行分選的分選器；和 收集所述多個納米結(jié)構(gòu)體的俘獲器。
19.如權(quán)利要求18所述的靶標檢測器，其中所述聚焦器包含對所述多個納米結(jié)構(gòu)體施 加電場以使第一靶標的拷貝對齊的一個或多個電極。
20.如權(quán)利要求18所述的靶標檢測器，其中所述分選器包含對所述多個納米結(jié)構(gòu)體施 加電場以使第一靶標的拷貝向第一方向移動的一個或多個電極。
21.如權(quán)利要求18所述的靶標檢測器，其中聚焦器或分選器中的至少一者采用介電電泳。
22.如權(quán)利要求18所述的靶標檢測器，所述靶標檢測器還包含產(chǎn)生第一靶標的多個拷 貝的復(fù)制室。
23.如權(quán)利要求22所述的靶標檢測器，其中所述復(fù)制室采用聚合酶鏈式反應(yīng)。
24.如權(quán)利要求18所述的靶標檢測器，其中聚焦器或分選器中的至少一者施加電流以 產(chǎn)生電場，其中所述電場在第一電流下具有第一頻率且在第二電流下具有第二頻率，并且 其中所述多個納米結(jié)構(gòu)體中的至少一個在第一頻率下向第一方向移動而在第二頻率下向 第二方向移動。
25.如權(quán)利要求24所述的靶標檢測器，其中所述多個納米結(jié)構(gòu)體根據(jù)電場的頻率形成圖案。
26.如權(quán)利要求18所述的靶標檢測器，所述靶標檢測器還包含在所述微流體裝置的不 同點處施加多個電流的一個或多個電極。
27.如權(quán)利要求26所述的靶標檢測器，其中所述多個電流創(chuàng)建了跨越所述微流體裝置 的非勻強電場。
28.如權(quán)利要求18所述的靶標檢測器，其中所述多個納米結(jié)構(gòu)體是碳納米管、納米珠、 納米線、納米膠體、納米顆粒、納米棒、量子點、納米晶體、脂質(zhì)體、二氧化硅珠、乳膠珠、膠體 金或其它維度小于1微米的結(jié)構(gòu)中的一個或多個。
29.如權(quán)利要求18所述的靶標檢測器，其中將一個或多個分子探針功能化于所述多個 納米結(jié)構(gòu)上。
30.如權(quán)利要求29所述的靶標檢測器，其中所述一個或多個分子探針包括寡聚物、熒 光團、羧基或鏈霉抗生物素蛋白中的一個或多個。
31.如權(quán)利要求18所述的靶標檢測器，所述靶標檢測器還包含對樣品進行預(yù)處理的過
32.如權(quán)利要求18所述的靶標檢測器，其中所述俘獲器包含通過確定阻抗值、觀察圖 案或檢測熒光中的至少一項來評估經(jīng)分選的多個納米結(jié)構(gòu)的檢測器。
33.如權(quán)利要求32所述的靶標檢測器，其中所述阻抗值、圖案或熒光表明第一靶標的 存在或缺失。
34.如權(quán)利要求33所述的靶標檢測器，其中第一靶標的存在或缺失表明病原體、癌細 胞、生物囊泡、肽、DNA、RNA或非DNA分子的存在、缺失或含量中的至少一項。
35.如權(quán)利要求18所述的靶標檢測器，其中所述樣品中包含第二靶標，其中所述雜交 室將第二靶標的多個拷貝與多個納米結(jié)構(gòu)體對接，并且其中所述分選器對處于不同于第一 靶標的方向的第二靶標進行分選。
36.如權(quán)利要求35所述的靶標檢測器，其中所述分選器包含一個或多個電極，所述電 極對所述多個納米結(jié)構(gòu)體施加電場以使第一靶標的拷貝向第一方向移動并使第二靶標的 拷貝向第二方向移動。
37.一種檢測靶標的方法，所述方法包括 獲取包含所述靶標的樣品；復(fù)制樣品中的靶標以產(chǎn)生擴增混合物； 將納米結(jié)構(gòu)體與小室耦聯(lián)； 將分子探針功能化至該納米結(jié)構(gòu)體；使擴增混合物流經(jīng)所述納米結(jié)構(gòu)體以使擴增混合物中的靶標雜交；和 檢測靶標的存在、缺失或含量中的至少一項。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中通過聚合酶鏈式反應(yīng)來復(fù)制所述靶標。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述聚合酶鏈式反應(yīng)使用兩種經(jīng)不同標記的引物。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其中一個引物是生物素化的，而另一個引物是熒光標 記的。
41.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述納米結(jié)構(gòu)體經(jīng)由化學(xué)鍵、物理鍵、來自電場的 力或放置于過濾器的兩側(cè)之間來與所述小室耦聯(lián)。
42.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述納米結(jié)構(gòu)體與鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素 蛋白中的至少一個耦聯(lián)，且復(fù)制的靶標與該鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白結(jié)合。
43.如權(quán)利要求37所述的方法，所述方法還包括施加電場，其中電場的存在有助于靶 標的雜交。
44.如權(quán)利要求37所述的方法，其中通過確定阻抗、觀察圖案或檢測熒光中的一項或 多項來檢測靶標。
45.一種靶標檢測器，所述靶標檢測器包含 復(fù)制室，于其中復(fù)制靶標以產(chǎn)生擴增混合物； 含有經(jīng)分子探針功能化的納米結(jié)構(gòu)體的微流體室； 將所述納米結(jié)構(gòu)體保持在微流體室中的過濾器；通道，所述擴增混合物通過該通道流經(jīng)納米結(jié)構(gòu)體以使擴增混合物中的靶標雜交；和 確定靶標的存在、缺失或含量中的至少一項的檢測器。
46.如權(quán)利要求45所述的靶標檢測器，其中通過聚合酶鏈式反應(yīng)來復(fù)制靶標。
47.如權(quán)利要求46所述的靶標檢測器，其中所述聚合酶鏈式反應(yīng)使用兩種經(jīng)不同標記 的引物。
48.如權(quán)利要求47所述的靶標檢測器，其中一個引物是生物素化的，而另一個引物是 熒光標記的。
49.如權(quán)利要求45所述的靶標檢測器，其中所述納米結(jié)構(gòu)體經(jīng)由化學(xué)鍵、物理鍵、來自 電場的力或放置于過濾器的兩側(cè)之間來與所述小室耦聯(lián)。
50.如權(quán)利要求45所述的靶標檢測器，其中所述納米結(jié)構(gòu)體與鏈霉抗生物素蛋白或 抗生物素蛋白中的至少一個耦聯(lián)，且復(fù)制的靶標與該鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白結(jié)I=I ο
51.如權(quán)利要求45所述的靶標檢測器，其中所述檢測器通過阻抗、圖案或熒光來檢測 靶標。
52.一種檢測一個或多個靶標的方法，所述方法包括 將包含一個或多個靶標的樣品插入微流體裝置內(nèi)； 將靶標保持在貯存器中；使靶標通過多個檢測管； 使靶標雜交；和檢測靶標的存在、缺失或含量中的至少一項。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其中將膜崩解以使靶標能通過所述多個檢測管。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其中通過施加電壓來使所述膜崩解。
55.如權(quán)利要求52所述的方法，其中將所述靶標在所述多個檢測管中復(fù)制。
56.如權(quán)利要求55所述的方法，其中使用特定引物來復(fù)制靶標以在所述多個檢測管中 的每一個中產(chǎn)生靶標特異性擴增子。
57.如權(quán)利要求52所述的方法，其中將所述靶標與經(jīng)鏈霉抗生物素蛋白功能化的納米 結(jié)構(gòu)體雜交。
58.如權(quán)利要求52所述的方法，其中將所述靶標在貯存器內(nèi)復(fù)制。
59.如權(quán)利要求58所述的方法，其中用非特異性引物復(fù)制靶標以產(chǎn)生用于貯存器中的 多個靶標的多種類型擴增子的集合。
60.如權(quán)利要求59所述的方法，其中使靶標通過多個檢測管包括通過讓所述多種類型 擴增子的集合通過所述多個檢測管中的每一個。
61.如權(quán)利要求60所述的方法，其中使用單一類型的寡聚物來將所述多個檢測管中的 每一個功能化，從而在所述多個檢測管中的每一個中僅有對應(yīng)于單一靶標的多種類型擴增 子的集合中的一類被雜交。
62.如權(quán)利要求52所述的方法，所述方法還包括施加電場以使靶標朝微電極網(wǎng)格移 動；和測定跨越該網(wǎng)格的阻抗或觀察該網(wǎng)格的圖像中的至少一項，以便檢測靶標的存在、缺 失或含量中的至少一項。
63.一種用于檢測多個靶標的靶標檢測器，所述靶標檢測器包含 用于將包含一個或多個靶標的樣品接收至微流體裝置內(nèi)的注入孔； 用于保持靶標的貯存器；與貯存器互通地耦聯(lián)的多個檢測管；所述多個檢測管中的雜交室；和檢測靶標的存在、缺失或含量中的至少一項的檢測器。
64.如權(quán)利要求63所述的靶標檢測器，所述靶標檢測器還包含耦聯(lián)于貯存器和多個檢 測管中的每一個之間的多個膜，其中所述多個膜中的至少一個被崩解以使靶標能夠通過所述多個檢測管中的一個。
65.如權(quán)利要求61所述的靶標檢測器，所述靶標檢測器還包含一個或多個電極，其中 通過跨越所述一個或多個電極施加電壓來使膜崩解。
66.如權(quán)利要求63所述的靶標檢測器，其中將靶標在所述多個檢測管內(nèi)復(fù)制。
67.如權(quán)利要求66所述的靶標檢測器，其中使用特定引物來復(fù)制靶標以在所述多個檢 測管中的每一個中產(chǎn)生靶標特異性擴增子。
68.如權(quán)利要求63所述的靶標檢測器，其中將靶標與經(jīng)鏈霉抗生物素蛋白功能化的納 米結(jié)構(gòu)體雜交。
69.如權(quán)利要求63所述的靶標檢測器，其中將靶標在貯存器內(nèi)復(fù)制。
70.如權(quán)利要求69所述的靶標檢測器，其中用非特異性引物復(fù)制靶標以產(chǎn)生用于貯存 器中的多個靶標的多種類型擴增子的集合。
71.如權(quán)利要求70所述的靶標檢測器，其中使靶標通過多個檢測管包括通過讓所述多 種類型擴增子的集合通過所述多個檢測管中的每一個。
72.如權(quán)利要求71所述的靶標檢測器，其中使用單一類型的寡聚物來將所述多個檢測 管中的每一個功能化，從而在所述多個檢測管中的每一個中僅有對應(yīng)于單一靶標的多種類 型擴增子的集合中的一類被雜交。
73.如權(quán)利要求63所述的靶標檢測器，其中所述貯存器和所述多個檢測管通過微泵耦聯(lián)。
74.如權(quán)利要求63所述的靶標檢測器，所述靶標檢測器還包括施加電場以使靶標朝微 電極網(wǎng)格移動；和測定跨越該網(wǎng)格的阻抗或觀察該網(wǎng)格的圖像中的至少一項，以便檢測靶 標的存在、缺失或含量中的至少一項。
75.如權(quán)利要求74所述的靶標檢測器，所述靶標檢測器還包含捕獲網(wǎng)格的圖像的照相機。
76.如權(quán)利要求63所述的靶標檢測器，其中所述靶標檢測器是便攜式的。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于檢測一個或多個靶標的示例性方法和裝置。一種示例性方法包括將包含第一靶標的樣品置于微流體裝置內(nèi)并將該第一靶標的多個拷貝與多個納米結(jié)構(gòu)體雜交。所述示例性方法包括對所述多個納米結(jié)構(gòu)體施加電流并利用該電流創(chuàng)建的電場來移動所述多個納米結(jié)構(gòu)體。另外，對所述多個納米結(jié)構(gòu)體進行分選和評估以確定所述第一靶標的存在、缺失或含量中的至少一者。
文檔編號C12M1/34GK101896599SQ200880119892
公開日2010年11月24日 申請日期2008年10月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月9日
發(fā)明者休-奇亞·常, 扎卡里·加格農(nóng), 薩特亞約蒂·賽內(nèi)帕蒂, 賈森·戈登 申請人:圣母大學(xué)