本發(fā)明屬于微生物學領域，具體涉及一種tma熔解曲線法聯(lián)合焦磷酸測序技術檢測臨床常見致病細菌的試劑盒及方法。

背景技術：

細菌感染是臨床常見的感染性疾病，其發(fā)病率和死亡率高，如果得不到早期的診斷和治療，會嚴重危及患者的生命。從臨床樣本中直接分離得到細菌表示感染嚴重需要立即進行抗菌治療。不同的致病菌對藥物種類和濃度的敏感性不同，治療成功的關鍵在于早期應用合適足量的藥物。而傳統(tǒng)的檢測致病菌的方法如顯微鏡檢查、培養(yǎng)法、生物化學檢查和免疫學方法等，由于各種因素的影響，通常需要幾種方法聯(lián)合使用，而且耗時也較長，需要1～3d，這期間用藥不當往往使得患者病情加重或增加菌株耐藥性。特別是在多種細菌聯(lián)合感染的情況下，更增加了菌種鑒定和用藥的復雜性。因此，建立一種快速且特異性強的微生物檢測方法是十分必要的。

轉錄介導的核酸擴增技術(transcriptionmediatedamplification，tma)是近年來發(fā)展起來的一種直接快速檢測rna的等溫擴增技術，它克服了以往核酸擴增的不足，更為簡便高效，尤其適用于rna病毒的檢測。高分辨率熔解曲線分析技術(highresolutionmelting，簡稱hrm)，是近年來興起的一種檢測基因突變、進行基因分型和snp檢測的新工具，可以迅速的檢測出核酸片段中單堿基的突變。hrm技術主要是基于核酸分子物理性質的不同。不同核酸分子的片段長短、gc含量、gc分布等是不同的，因此任何雙鏈dna分子在加熱變性時都會有自己熔解曲線的形狀和位置。hrm技術的基本原理就是根據熔解曲線的不同來對樣品來進行區(qū)分。焦磷酸測序(pyrosequencing)技術是新一代dna序列分析技術，被廣泛用于基因型分析領域。該技術無須進行電泳，dna片段也無須特殊的熒光標記，操作極為簡便。本試劑盒借用tma技術和焦磷酸測序技術，開發(fā)了一種tma-焦磷酸測序技術檢測臨床常見致病細菌的試劑盒及方法，可以檢測二十余種臨床常見致病細菌。本試劑盒主要用于輔助臨床醫(yī)生診斷和治療，其檢測臨床意義主要為：在進行細菌感染治療時，合理正確地使用抗生素非常重要，而每種菌都有相應適用的抗生素，如果不能快速準確地鑒定細菌種類，就可能會導致手術治療失敗、并發(fā)癥增多、感染復發(fā)、住院時間延長、昂貴抗生素及其它藥物的使用增加等。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種tma熔解曲線法聯(lián)合焦磷酸測序技術檢測臨床常見致病細菌的試劑盒，以克服現(xiàn)有技術的不足，從而細菌感染患者科學用藥提供依據和指導作用。

為解決上述技術問題，本發(fā)明提供如下技術方案：

tma熔解曲線法聯(lián)合焦磷酸測序技術檢測臨床常見致病細菌的引物和探針，包括如下序列：

(1)tma反應引物：其核苷酸序列如seqidno.1～4所示；

(2)分子信標探針：其核苷酸序列如seqidno.5～7所示；

(3)測序引物：其核苷酸序列如seqidno.8所示。

具體tma反應引物包括正向引物f1、f2和反向引物r1、r2；

所述正向引物f1和反向引物r1的堿基序列表示如下：

正向引物f1：5’-gaagagtttgatcatggctcag-3’；

反向引物r1：5’-aattctaatacgactcactatagggagaaggttactcacccgtccgccact-3’；

所述正向引物f2和反向引物r2的堿基序列表示如下：

正向引物f2：5’-gcaacgcgaagaaccttacc-3’；

反向引物r2：5’-aattctaatacgactcactatagggagaaggacgacagccatgcagcacct-3’；

所述正向引物f1、f2的5’端標記生物素；

所述反向引物r1、r2的5’端的31個堿基是增加的t7噬菌體啟動子序列，而3’端20個堿基是與細菌16srrna互補的特異性序列；

所述分子信標探針的堿基序列表示如下：

分子信標探針p1：5’-gcgcggcctaatacatgcaagtcgagcgaacggacggggagcttgcccgcgc-3’；

分子信標探針p2：5’-gcccgttagagatagaggcttcaccttcggaggacaatgtgaacgggc-3’；

分子信標探針p3：5’-cgcgcgggccgaacacaaaaagttaagcttcttagcgccgattgtagccgcgcg-3’；

所述分子信標探針p1在其寡核苷酸dna分子的5’端標記熒光報告基團cy5，3’端標記熒光淬滅基團dabcyl；p1的5’端和3’端的6個堿基是形成探針特征性發(fā)夾結構莖端區(qū)的反向互補序列，探針分子中間的40個堿基是與細菌16srrna反義鏈互補的特異性序列；

所述分子信標探針p2在其寡核苷酸dna分子的5’端標記熒光報告基團hex，3’端標記熒光淬滅基團dabcyl；p2的5’端和3’端的7個堿基是形成探針特征性發(fā)夾結構莖端區(qū)的反向互補序列，探針分子中間的34個堿基是與細菌16srrna反義鏈互補的特異性序列；

所述分子信標探針p3在其寡核苷酸dna分子的5’端標記熒光報告基團fam，3’端標記熒光淬滅基團dabcyl；p3的5’端和3’端的7個堿基是形成探針特征性發(fā)夾結構莖端區(qū)的反向互補序列，探針分子中間的40個堿基是與細菌16srrna反義鏈互補的特異性序列；

tma熔解曲線法聯(lián)合焦磷酸測序法檢測臨床常見致病細菌試劑盒，該試劑盒包括rna提取試劑、2×tma反應液、5×酶混合液、單鏈純化試劑、測序試劑。

其中，所述rna提取試劑包括：裂解液、洗滌液i、洗滌液ⅱ、洗脫液te；

所述裂解液包括如下組分：2～8m胍鹽、50～200mmtris、0.5％～10％體積百分數(shù)的表面活性劑，所述胍鹽為異硫氰酸胍或鹽酸胍，所述的表面活性劑為tween20、np40或者tritonx-100；

所述洗滌液i包括如下組分：2～6m胍鹽、50～200mmtris、0.5％～10％體積百分數(shù)的表面活性劑，所述胍鹽為異硫氰酸胍或鹽酸胍，所述的表面活性劑為tween20、np40或者tritonx-100；

所述洗滌液ⅱ包括如下組分：10～100mmtris、20～100mmedta、65～80％體積百分數(shù)的乙醇；

所述洗脫液te包括如下組分：10mmtris、1mmedta，ph8.0。

其中，所述2×tma反應液包括：0.4～1μmseqidno.1～4所示的寡核苷酸、0.05～0.5μm3種分子信標探針、80mmtris-hcl(ph8.0)、24mmmgcl2、140mmkcl、2mmdntps、4mmntps和30％(v/v)二甲基亞砜。

其中，所述5×酶混合液包括：200um-mlv、1000ut7rnapol和105μgbsa；

所述單鏈純化試劑包含：75％(v/v)乙醇溶液，0.2mnaoh，10mmph7.6三(羥甲基)氨基甲烷醋酸鹽溶液，結合緩沖液，退火緩沖液，鏈親和素包被的磁珠；

所述測序試劑包含：dna聚合酶、atp硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶、底物aps、熒光素和dntp。

上述tma熔解曲線法聯(lián)合焦磷酸測序法檢測臨床常見致病細菌試劑盒在檢測致病細菌中的應用。

使用上述tma熔解曲線法聯(lián)合焦磷酸測序法檢測臨床常見致病細菌試劑盒檢測臨床常見致病細菌的方法，包括步驟：

(1)待測樣品或細菌rna的提?。?/p>

(2)tma擴增：取步驟(1)提取好的rna溶液5ul，加入10ul2×tma反應液中，混勻，65℃，5min，41℃，2min；然后加入5ul5×酶混合液，混勻，置于41℃恒溫擴增30min(可直接放置roche熒光定量pcr儀上)；

(3)熔解曲線檢測：在熒光定量pcr儀上設置：95℃，2min；按照0.14℃/step升溫速率，從35℃到75℃逐漸升高溫度，熔解曲線分析程序記錄每一次升溫分子信標產生的熒光值，meltinganalysis程序在熒光定量pcr儀(lightcycler480型，roche公司)上進行；

(4)結果分析：根據步驟(3)中檢測樣本的熔解曲線峰值(tm)來判斷結果。首先是質控系統(tǒng)判斷，即陰性對照和空白對照均無熔解峰，否則系統(tǒng)檢測無效。當系統(tǒng)檢測有效時，判斷待測樣本結果，不同菌對應不同熔解tm值；

(5)焦磷酸測序：當按照步驟(4)無法判定出細菌種屬時，將步驟(3)產物取出與鏈親和素包被的磁珠結合進行單鏈純化；然后將單鏈純化產物進行焦磷酸測序；將測序結果與ncbi數(shù)據進行比對確定所測樣本菌屬。

有益效果：

本發(fā)明的試劑盒根據目前已有的細菌16srrna基因序列的保守區(qū)設計引物和探針，保證檢測方法的特異性。本發(fā)明采用改進的轉錄介導的核酸擴增技術(tma)-熔解曲線技術-焦磷酸測序技術，特異性強，具有與pcr檢測方法相似的靈敏度，低污染(擴增產物rna在自然環(huán)境下易于降解)、快速(tma-熔解曲線檢測只需要1小時左右，單鏈純化+焦磷酸測序也僅需1小時即可完成)，能在1小時左右完成臨床常見致病細菌80％菌屬的鑒定，而2小時內可完成所有臨床感染細菌種屬的鑒定。將在臨床微生物的快速鑒定和檢測分析中發(fā)揮重要作用，應用前景廣闊。

附圖說明

圖1：異變形桿菌、陰溝腸桿菌、洋蔥克雷伯菌檢測結果圖，其中1為奇異變形桿菌、2為陰溝腸桿菌、3為洋蔥克雷伯菌、4為陰性對照、5為空白對照。

圖2：越南伯克霍爾德氏菌焦磷酸測序結果。

圖3：紐氏放線菌焦磷酸測序結果。

具體實施方式

根據下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。

實施例1：一種tma熔解曲線法聯(lián)合焦磷酸測序法檢測臨床常見致病細菌的方法

1.提取臨床標本rna(利用試劑盒中的rna提取試劑)

儀器：天隆np968核酸提取儀

步驟：

a.取5個臨床標本，離心收集沉淀，加入300μl生理鹽水，混勻后轉移至96深孔板裂解孔中，加入300μl試劑盒中的裂解液，150μl異丙醇(自備)和20μl試劑盒中的磁珠；

b.核酸提取儀上提取rna，大約15～30min。

2.tma熔解曲線檢測

儀器：roche羅氏480ii實時熒光定量pcr

a.以步驟1所得rna為模板，利用細菌16srrna保守區(qū)的特異性引物(seqidno.1～4)和分子信標探針(seqidno.5～7)進行tma-熔解曲線檢測；

其中，所述的tma擴增體系為：2×tma反應液10μl(包含引物f1、f2、r1、r2和分子信標探針p1、p2、p3)，5×酶混合液4μl，提取好的rna6μl；反應條件為：65℃5min；41℃，30min；然后95℃，2min；35～75℃，升溫速率為0.14℃/step，收集每一次升溫分子信標探針產生的熒光值。

b.根據步驟a所得熔解曲線tm位置的不同，完成常規(guī)細菌的鑒定，如圖1所示。

3.焦磷酸測序

儀器：qiagenpyromarkq96id測序儀

3.1單鏈純化：

對于一些不常見的或者步驟2不能完全區(qū)分的樣本，利用試劑盒中的單鏈純化試劑對步驟2的tma擴增產物進行單鏈純化,具體操作步驟如下：

1)在使用前，確保所有溶液都達到室溫；打開烘箱電源開關，使溫度達到80℃；

2)在psq96板中加入45μlannealingbuffer(退火緩沖液)和1-2μl10um的測序引物(seqidno：8)；

3)在振蕩器上充分混勻sepharosebeads(鏈親和素標記的磁珠)；

4)將所需sepharosebeads量(按每樣本3μl計算)轉移到一個1.5mleppendorf管中；

5)在sepharosebeads中加入bindingbuffer(結合緩沖液)，使得平均每個樣品約有50μl的體積，在振蕩器上將混合物充分混勻；

6)將以上混合物加入tma擴增產物(約50μl反應體積)中，每樣本加50μl；

7)常溫下、在振蕩器上將pcr板混勻10分鐘，使得sepharosebeads與生物素標記產物充分結合；

8)在vacuumprepworkstation中，四個液體槽中依次加入180ml純水、120ml70％乙醇、washingbuffer和denaturationbuffer；

9)打開vacuumprepworkstation的泵，將vacuumpreptool在純水中清洗30秒；

10)將vacuumpreptool移到pcr板孔中，抓取結合了生物素標記核酸的sepharosebeads；

11)拿起pcr板，檢查beads是否都被吸附在了vacuumpreptool上；

12)將vacuumpreptool放入70％乙醇中15秒，然后移到denatureationbuffer中15秒，再移到washingbuffer中清洗30秒；

13)把tool懸放在含有測序引物的psq板孔的上方，不要接觸液面，關掉泵，將vacuumpreptool放入含有測序引物的psq板中，旋轉搖動，以釋放sepharosebeads；

14)將放有純化樣本的psq96板放在thermoplate上，置于80℃烘箱中加熱2分鐘，取出后冷卻到室溫，然后放入測序儀，進行下游pyrosequencing反應。

3.2純化完畢后清洗：

1)不開真空泵和閥門，使用少量純水清洗vacuumpreptool，使少量未脫落的beads洗脫下來；

2)更換純水后再打開真空泵和閥門，用約300ml純水清洗tool；

3)關掉真空泵和閥門，將vacuumpreptool側放，室溫晾干；

4)清洗所有盛裝試劑溶液的塑料槽，自然晾干；

5)用濕布擦拭純化設備表面。

3.3焦磷酸測序

1)調出設定好的運行程序文件，點擊“view”的下拉鍵，選擇“run”，按照軟件自動計算本次實驗的各試劑使用量，添加各試劑成分至試劑加樣倉；

2)把準備好的樣本和試劑艙放入儀器相應的位置，點擊屏幕右下端的“run”開始焦磷酸測序；

3)檢測完成后，首先點擊軟件進程狀態(tài)窗口的“close”鍵以保存測序結果；

3.4焦磷酸測序結果分析

1)在“sqaruns”文件夾中雙擊鼠標，打開上述運行文件，選擇“sqamode”，點擊“analyzeall”鍵，對所有檢測標本進行分析；

2)讀取每個檢測樣本的堿基序列，在網上genebank中進行比對分析，確定所檢測樣本菌屬類型，如圖2、圖3所示。

綜上，本發(fā)明所選取的靶序列，以及應用本發(fā)明的試劑盒能夠實現(xiàn)快速、簡便、準確、高效、實用、經濟的檢測臨床常見致病細菌及疑難細菌，能夠滿足臨床檢驗實際工作的要求，利于臨床細菌感染患者準備合理地進行抗菌藥物治療提供指導，進而避免抗生素的濫用，為患者節(jié)省寶貴的治療時間，提高患者生活質量。

sequencelisting

<110>杭州迪安醫(yī)學檢驗中心有限公司

<120>一種tma熔解曲線法聯(lián)合焦磷酸測序技術檢測臨床常見致病細菌的試劑盒及其應用

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<212>dna

<213>引物f1

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gaagagtttgatcatggctcag22

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<213>引物f2

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<212>dna

<213>引物r2

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aattctaatacgactcactatagggagaaggacgacagccatgcagcacct51

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<212>dna

<213>分子信標探針p1

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gcgcggcctaatacatgcaagtcgagcgaacggacggggagcttgcccgcgc52

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<212>dna

<213>分子信標探針p2

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gcccgttagagatagaggcttcaccttcggaggacaatgtgaacgggc48

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<211>54

<212>dna

<213>分子信標探針p3

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cgcgcgggccgaacacaaaaagttaagcttcttagcgccgattgtagccgcgcg54

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<211>20

<212>dna

<213>測序引物

<400>8

ttactcacccgtccgccact20