本發(fā)明屬于微生物檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種金黃色葡萄球菌CRISPR位點(diǎn)檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：金黃色葡萄球菌是人類(lèi)一種重要的致病菌，隸屬于革蘭染色陽(yáng)性球菌，可以引起多種疾病，如心內(nèi)膜炎，肺炎，中毒性休克綜合征等。近些年來(lái)，隨著金黃色葡萄球菌耐藥率和耐藥程度的不斷升高，金黃色葡萄球菌感染已經(jīng)成為嚴(yán)重的健康問(wèn)題。成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR）是近年發(fā)現(xiàn)的針對(duì)噬菌體等外源基因的細(xì)菌免疫系統(tǒng)，能夠有效地抵制噬菌體和外界各種基因元件對(duì)其造成的干擾，從而抑制水平基因轉(zhuǎn)移（HorizontalGeneTransfer，HGT）。CRISPR廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中，是由一段不連續(xù)的重復(fù)序列（repeat，R），和插入其中的間隔序列（spacer，S）以及一系列cas蛋白組成。重復(fù)序列比較保守（包括長(zhǎng)度和堿基序列），大多具有回文結(jié)構(gòu)，可以形成穩(wěn)定的高度保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)。間隔序列由26-72個(gè)堿基組成，序列高度可變，有研究表明間隔序列來(lái)源于外源核酸物質(zhì)（質(zhì)粒和噬菌體等）。目前CRISPR在金黃色葡萄球菌中的研究主要集中在金黃色葡萄球菌中CRISPR的功能性研究，然而市面上并沒(méi)有特異性檢測(cè)金黃色葡萄球菌CRISPR位點(diǎn)的相關(guān)試劑盒。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的就在于克服上述不足，提供一種金黃色葡萄球菌CRISPR位點(diǎn)檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明是按照以下技術(shù)方案實(shí)施的：一種金黃色葡萄球菌CRISPR位點(diǎn)檢測(cè)試劑盒，包括針對(duì)金黃色葡萄球菌的CRISPR位點(diǎn)基因序列設(shè)計(jì)的引物，所述金黃色葡萄球菌的CRISPR位點(diǎn)基因序列有三種，分別為CRISPR-1，CRISPR-2和CRISPR-3，對(duì)應(yīng)的引物序列如下所示：CRISPR-1上游引物5’-GTAGTGATTTTTGGGAGTGG-3’,下游引物5’-GTGGTTAATGTGTAGGGACC-3’,CRISPR-2上游引物5’-CAATGACTTGGAGTGTGA-3’,下游引物5’-GGTTAATGTGTAGGAACC-3’,CRISPR-3上游引物5’-ACTCAATGGCATGGAGTGTGA-3’,下游引物5’-GGTGGTTAATGTGTAGGGACC-3’。一種金黃色葡萄球菌CRISPR位點(diǎn)檢測(cè)試劑盒還包括10×TagBuffer，0.2mMdNTP，2mMMgCl2，0.05U/μLTagDNA聚合酶，滅菌超純水和DNAMarker2000。一種金黃色葡萄球菌CRISPR位點(diǎn)檢測(cè)方法，包括以下步驟：（1）以細(xì)菌樣品的基因組DNA為模板，分別利用3種CRISPR位點(diǎn)基因序列的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如下所示，CRISPR-1上游引物5’-GTAGTGATTTTTGGGAGTGG-3’,下游引物5’-GTGGTTAATGTGTAGGGACC-3’,CRISPR-2上游引物5’-CAATGACTTGGAGTGTGA-3’,下游引物5’-GGTTAATGTGTAGGAACC-3’,CRISPR-3上游引物5’-ACTCAATGGCATGGAGTGTGA-3’,下游引物5’-GGTGGTTAATGTGTAGGGACC-3’，待PCR擴(kuò)增結(jié)束后，得擴(kuò)增產(chǎn)物；（2）將所得擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分析，CRISPR-1的預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為330bp，CRISPR-2的預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為380bp，CRISPR-3的預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為387bp，得到相應(yīng)大小的基因片段即為擴(kuò)增成功。。進(jìn)一步的，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：10μmol/L上游引物1μL，10μmol/L下游引物1μL，10×TagBuffer2.5μL，0.2mMdNTP0.5μL，2mMMgCl22μl，0.05U/μLTaqDNA聚合酶0.125μL，細(xì)菌樣品基因組DNA2μL，滅菌超純水15.875μL。進(jìn)一步的，針對(duì)不同的CRISPR位點(diǎn)基因序列所采用的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序分別為：CRISPR-194℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10min；CRISPR-294℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，共35個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10min；CRISPR-394℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10min。進(jìn)一步的，凝膠電泳的條件為：1.5%瓊脂糖凝膠，電壓5V/cm，時(shí)間25min。進(jìn)一步的，細(xì)菌樣品的基因組DNA采用煮沸法提取。本發(fā)明通過(guò)對(duì)CRISPRdatabase數(shù)據(jù)庫(kù)中金黃色葡萄球菌全基因組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析及對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的金黃色葡萄球菌檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其具有上述3種CRISPR位點(diǎn)存在，3種CRISPR位點(diǎn)均有2條重復(fù)序列和1條間隔序列。針對(duì)上述3種CRISPR位點(diǎn)的基因序列設(shè)計(jì)上、下游引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，合理設(shè)計(jì)出金黃色葡萄球菌CRISPR位點(diǎn)檢測(cè)試劑盒，并確定最佳的檢測(cè)方法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供的試劑盒和檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，敏感性和特異性高，檢測(cè)費(fèi)用低，具有良好的推廣應(yīng)用價(jià)值。說(shuō)明書(shū)附圖圖1為CRISPR-1的凝膠電泳圖1號(hào)泳道為DNAmarker，2號(hào)泳道為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；圖2為CRISPR-2的凝膠電泳圖1號(hào)泳道為DNAmarker，2號(hào)泳道為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；圖3為CRISPR-3的凝膠電泳圖1號(hào)泳道為DNAmarker，2號(hào)泳道為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；圖4為CRISPR-1位點(diǎn)基因序列的分析結(jié)果；圖5為CRISPR-1位點(diǎn)基因序列的分析結(jié)果；圖6為CRISPR-1位點(diǎn)基因序列的分析結(jié)果。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖以及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，在此發(fā)明的示意性實(shí)施例以及說(shuō)明用來(lái)解釋本發(fā)明，但并不作為對(duì)本發(fā)明的限定。實(shí)施例1金黃色葡萄球菌的CRISPR位點(diǎn)基因序列有三種，分別為CRISPR-1，CRISPR-2和CRISPR-3。根據(jù)Genebank中已發(fā)布的金黃色葡萄球菌CRISPR相關(guān)基因序列設(shè)計(jì)3種CRISPR位點(diǎn)引物：CRISPR-1上游引物5’-GTAGTGATTTTTGGGAGTGG-3’,下游引物5’-GTGGTTAATGTGTAGGGACC-3’,CRISPR-2上游引物5’-CAATGACTTGGAGTGTGA-3’,下游引物5’-GGTTAATGTGTAGGAACC-3’,CRISPR-3上游引物5’-ACTCAATGGCATGGAGTGTGA-3’,下游引物5’-GGTGGTTAATGTGTAGGGACC-3’。金黃色葡萄球菌CRISPR位點(diǎn)檢測(cè)試劑盒包括針對(duì)金黃色葡萄球菌的CRISPR位點(diǎn)基因序列設(shè)計(jì)的引物，10×TagBuffer，0.2mMdNTP，2mMMgCl2，0.05U/μLTagDNA聚合酶，滅菌超純水和DNAMarker2000。實(shí)施例2金黃色葡萄球菌CRISPR位點(diǎn)的檢測(cè)方法，包括以下步驟：（1）細(xì)菌樣品的基因組DNA采用煮沸法提取。（2）以細(xì)菌樣品的基因組DNA為模板，分別利用3種CRISPR位點(diǎn)基因序列的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如實(shí)施例1所示，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：10μmol/L上游引物1μL，10μmol/L下游引物1μL，10×TagBuffer2.5μL，0.2mMdNTP0.5μL，2mMMgCl22μl，0.05U/μLTaqDNA聚合酶0.125μL，細(xì)菌樣品基因組DNA2μL，滅菌超純水15.875μL。針對(duì)不同的CRISPR位點(diǎn)基因序列所采用的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序分別為：CRISPR-194℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10min；CRISPR-294℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，共35個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10min；CRISPR-394℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10min。待PCR擴(kuò)增結(jié)束后，得擴(kuò)增產(chǎn)物；（3）將所得擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分析，凝膠電泳的條件為：1.5%瓊脂糖凝膠，電壓5V/cm，時(shí)間25min。CRISPR-1的預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為330bp，CRISPR-2的預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為380bp，CRISPR-3的預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為387bp，得到相應(yīng)大小的基因片段即為擴(kuò)增成功。實(shí)驗(yàn)例一、樣品采集試驗(yàn)中使用的細(xì)菌樣品為金黃色葡萄球菌，2014年分離于河南鄭州某醫(yī)院。二、實(shí)驗(yàn)方法采用本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒對(duì)細(xì)菌樣品的CRISPR位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)步驟如下：（1）DNA模板的制備采用煮沸法從細(xì)菌樣品中提取全基因組DNA。從-80℃冰箱內(nèi)取出細(xì)菌樣品凍存管，放于4℃冰箱復(fù)溫5小時(shí)，在超凈臺(tái)中采用無(wú)菌接種環(huán)快速蘸取菌液，以分段劃線法接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)板上，37℃恒溫箱孵育20小時(shí)，挑取血平板上單個(gè)菌落，接種于腦心浸液液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)16小時(shí)，取1mL菌液于1.5mL的Eppdorf管中，轉(zhuǎn)速為12000r/min條件下離心1分鐘，將上清棄去，加入超純水100μL，震蕩混勻，煮沸10min，轉(zhuǎn)速為12000r/min條件下離心10分鐘，取上清，即可以得到細(xì)菌樣品的基因組DNA，置于-20℃貯存?zhèn)溆?。?）PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系：10μmol/L上游引物1μL，10μmol/L下游引物1μL，10×TagBuffer2.5μL，0.2mMdNTP0.5μL，2mMMgCL22μL，TaqDNA聚合酶0.125μL，金黃色葡萄球菌基因組DNA模板2μL，滅菌超純水加至25μL。所述TagBuffer為(NH4)2SO4溶液，引物序列分別為：CRISPR-1330bp上游引物:GTAGTGATTTTTGGGAGTGG下游引物:GTGGTTAATGTGTAGGGACCCRISPR-2380bp上游引物:CAATGACTTGGAGTGTGA下游引物:GGTTAATGTGTAGGAACCCRISPR-3387bp上游引物:ACTCAATGGCATGGAGTGTGA下游引物:GGTGGTTAATGTGTAGGGACCPCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序如下表所示：CRISPR位點(diǎn)循環(huán)參數(shù)循環(huán)次數(shù)CRISPR-194℃30s，51℃30s，72℃30s35CRISPR-294℃30s，50℃30s，72℃45s35CRISPR-394℃30s，55℃30s，72℃45s35（3）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析取5μLPCR產(chǎn)物與1μL6×loadingbuffer混勻，進(jìn)行電泳，采用1×TAE電泳緩沖液，濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠，電壓5V/cm，電泳時(shí)間為25min，電泳結(jié)束后，取出凝膠并采用使用凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照保存。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果（1）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增3種CRISPR位點(diǎn)產(chǎn)物的電泳結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2、圖3。根據(jù)引物設(shè)計(jì)推斷，CRISPR-1的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為330bp，CRISPR-2的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為380bp，CRISPR-3的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為387bp。從圖1-3中可以看出，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度與預(yù)期長(zhǎng)度基本符合，證實(shí)PCR擴(kuò)增3種CRISPR位點(diǎn)成功。（2）PCR擴(kuò)增結(jié)果測(cè)序鑒定將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如下所示：CRISPR-1的序列為CACGGTGATAGAGCACGGTCTTTTATTCTTTGTCATTAGCCACAGCTATTGTGTACTTAAAAATAGGAATGCATGAGTGCAACTCATGCATAAGAAATACTAATTTCTAAAGAAAAAGTATTTCTTTATGTTGGGGCCCACCCCAACTTGCATTGTTTGTAGAATTTCTTTTCGAAATTCTCTGTGTTGGGGCCCCGCCAACTTGCATTGCCTGTAGAATTTCTTTTCGAAATTCTTTATGTTGGGGCCCCGCCAACTAATTACAATATATCATTGTAGAGCTTAGGTCATTGATTTTTGGCTCGGACTTTTATGACRISPR-2的序列為ATAACCTAAGATTTATTATGTAGTGATTCTTAAGAGTGGGATAGAAATGATATTTTCATAAAATTTTATTTCGTTGTTCCCCAACTTGCATTGTCTGTAGAATTTCTTTTTGAAATTCTCTATGTTGGGGCCCCGTTCCCCAACTTGCACATTATTGTATGCTGACTTTTGTCAGCTTCTGTGTTGGGGCCCCGCCAACTTGCACATTATTGTAAGCTGACTTTCTGTCAGCTTCTATGTTGGGGCCCCGCCGATTTGTAAAAACATTAAAAACGATCATTTCTATTAAATCTGGCATAGATATGACCGTTTTTACTTTAATAAATAATATTGTATTTTAGGGAGTAAGACAGAAATATTAAAGAATCTCTAATGATTTAATATGTAGTGGTTCCTAAACATTAACCCAACRISPR-3的序列為CCATACGTTAGAGATTCTTTATATTTCTGTCTTACTCCCTAAAATACAATATTATTTATTAAAGTAAAAACGGTCATATCTATGCCAGATTTAATAGAAATGATCGTTTTTAATGTTTTTACAAATCGGCGGGGCCCCAACATAGAAGCTGACAGAAAGTCAGCTTACAATAATGTGCAAGTTGGCGGGGCCCCAACACAGAAGCTGACAAAAGTCAGCATACAATAATGTGCAAGTTGGGGAACGGGGCCCCAACATAGAGAATTTCAAAAAGAAATTCTACAGACAATGCAAGTTGGGGAACAACGAAATAAAATTTTATGAAAATATCATTTCTATCCCACTCTTAAGAATCACTACATAATAAATCTTTAGTGGTTCTTTAACATTGATGTCACACTCCATGCCCATTGAGTAA將測(cè)序得到的基因序列與Genebank上基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示CRISPR-1與Staphylococcusaureussubsp.aureusNCTC8325chromosome98%相同，CRISPR-2和CRISPR-3與Staphylococcusaureussubsp.aureusDSM2023193%相同。（3）PCR擴(kuò)增結(jié)果測(cè)序分析對(duì)測(cè)序結(jié)果中3個(gè)CRISPR位點(diǎn)基因序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示3個(gè)CRISPR位點(diǎn)均有2個(gè)重復(fù)序列和一個(gè)間隔序列組成，如圖4、圖5、圖6所示。將3種CRISPR位點(diǎn)的間隔序列依次在Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)CRISPR-1的間隔序列與Staphylococcusaureussubsp.aureusNCTC8325chromosome完全匹配，CRISPR-2和CRISPR-3的間隔序列與Staphylococcusaureussubsp.aureusDSM20231完全匹配，證實(shí)細(xì)菌樣品CRISPR位點(diǎn)序列擴(kuò)增成功。本發(fā)明的技術(shù)方案不限于上述具體實(shí)施例的限制，凡是根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案做出的技術(shù)變形，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3