本發(fā)明涉及個體化醫(yī)學基因分型實驗質量控制領域，尤其涉及一種預測甲氨蝶呤治療類風濕關節(jié)炎療效的基因分型質控品。

背景技術：

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種臨床常見的自身免疫性疾病，其主要表現(xiàn)為慢性、對稱性、破壞性多關節(jié)炎，其中雙手、腕、膝、踝、和足關節(jié)受累最為常見。若不盡早給予合理治療，病情會逐漸發(fā)展，最終可致關節(jié)畸形和功能喪失，嚴重影響患者生活質量。

目前，甲氨蝶呤(methotrexate)是國內(nèi)外治療RA的首選藥物之一，因其物美價廉而成為RA患者使用最廣泛的基礎用藥。甲氨蝶呤主要通過抑制葉酸代謝，從而抑制細胞增殖和復制，其可作用于氨基咪唑甲酰胺酶(ATIC)，減少5-氨基咪唑-4-氨甲酰胺核苷酸(AICAR)轉化為5-甲酰氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(FAICAR)，導致AICAR在細胞內(nèi)蓄積。而AICAR同時又可通過抑制腺苷脫氨酶(ADA)和腺苷單磷酸脫氨酶(AMPD)活性，減少腺苷和腺苷酸分解，從而增加這兩種物質在細胞內(nèi)的濃度。腺苷作為抑制抗炎性介質，通過與相應的腺苷受體的結合，調節(jié)甲氨蝶呤的抗炎作用。

近年來，藥物基因組學(pharmacogenetics)的，近年來藥物基因組學(pharmacogenetics)研究揭示，編碼藥物代謝酶、藥物轉運體和藥物作用靶點的基因序列的不同是引起藥物個體化差異的一個主要原因，20％-95％藥物反應和處置的個體差異卻是由遺傳因素引起的。藥物基因組學研究則為實現(xiàn)個體化臨床用藥提供了新的途徑。

氨基咪唑甲酰胺酶(ATIC)基因位于2q35，存在數(shù)種多態(tài)性標記，其中包含rs4673993(C>T)位點。Lee YC等人對120名接受甲氨蝶呤單藥治療的類風濕關節(jié)炎患者開展的研究發(fā)現(xiàn)，ATIC rs4673993位點突變與低疾病活性相關(P＝0.01)。與基因型為TT的類風濕性關節(jié)炎患者相比，基因型為CC的患者接受甲氨蝶呤治療可獲得較好的療效。基因型為CT的患者則獲得中等療效。因此，類風濕關節(jié)炎患者的rs4673993(C>T)基因分型決定其甲氨蝶呤治療的療效。 因此，對接受甲氨蝶呤治療的類風濕關節(jié)炎患者進行ATIC rs4673993(C>T)基因分型檢測能夠預測其治療療效，從而為個體化治療提供依據(jù)。

國外開展臨床實驗室室間質量評價已有60年歷史。近十年來，我國臨床實驗室也已經(jīng)普遍開展了室間質評活動，用于評價實驗室檢測的準確性和各實驗室間結果的一致性。然而，目前已開展的室間質評項目內(nèi)容主要限于臨床檢驗，與個體化用藥監(jiān)測相關的僅有治療藥物監(jiān)測(TDM)，且種類和方法有限。隨著個體化用藥新技術的發(fā)展、國家對新藥研發(fā)的鼓勵和投入增多，越來越多的醫(yī)院、臨床實驗室陸續(xù)開展藥物基因檢測、藥物血中濃度檢測項目。由于國家相關政策尚未完善、對機構的監(jiān)督及核查不足，各個檢測機構水平參差不齊，造成了不同實驗室監(jiān)測水平差異顯著，嚴重影響了數(shù)據(jù)的準確性，數(shù)據(jù)質量的不可靠可能為藥物個體化應用埋下潛在風險。

如果有標準的室間質量評價體系，就可以確定某個實驗室進行檢測或測量的能力，并監(jiān)控實驗室的持續(xù)發(fā)展能力；識別實驗室中的問題并制定相應的補救措施；確定新的檢測和測量方法的有效性和可比性，并對這些方法進行相應的監(jiān)控；增加實驗室用戶的信心；識別實驗室間的差異，從而可保證個體化用藥的有效性和安全性。

全國開展藥物基因檢測的各家單位在標本采集和保存、DNA提取方法、基因型檢測方法、檢測結果的分析和解釋等方面存在很大差異，而這些差異將直接影響檢測結果的準確性，從而影響個體化用藥方案制定的可靠性。其中，基因檢測方法是影響最終檢測結果的關鍵因素。目前應用的基因檢測的方法主要有PCR擴增后限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析方法、Taqman探針法、DNA測序法、基因分型芯片法以及微測序法等。其中，DNA測序法是目前進行基因檢測的金標準，PCR-RFLP法應用較為廣泛，但都容易發(fā)生樣品間交叉污染。另外，探針法操作過程雖然簡單，但探針在反復凍融后容易失效?？梢?，各種基因檢測方法各有優(yōu)劣，其結果難以保證一致。所以，各實驗室檢測的結果有待一個第三方室間質評標準進行評估。

在衛(wèi)生部臨床檢驗中心印發(fā)的《醫(yī)療機構臨床藥學實驗室管理暫行辦法》中，將藥物基因檢測納入醫(yī)療機構臨床藥學實驗室管理，并指出開展檢測的實驗室每 年必須參加實驗室之間的質量評價活動。全國開展藥物基因檢測的各家單位在標本采集和保存、DNA提取方法、基因型檢測方法、檢測結果的分析和解釋等方面存在很大差異，而這些差異將直接影響檢測結果的準確性，從而影響個體化用藥方案制定的可靠性。但是，目前國內(nèi)尚缺乏一個藥物基因檢測室間質評體系。而基因檢測陽性質控品則是藥物基因檢測室間質評體系一個重要組成部分。因此，本發(fā)明提供一種基因檢測質控品以供藥物基因檢測室間質評體系使用，這對開展藥物基因檢測室間質評具有重大意義，并對提升藥物基因檢測實驗室的競爭力有重大的現(xiàn)實意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種新的用于甲氨蝶呤個體化用藥檢測實驗質量控制的標準品解決了現(xiàn)有技術中存在的問題，提供一種基因檢測質控品以供藥物基因檢測室間質評體系使用，這對開展藥物基因檢測室間質評具有重大意義，并對提升藥物基因檢測實驗室的競爭力有重大的現(xiàn)實意義。

本發(fā)明的目的在于提供一種預測甲氨蝶呤治療類風濕關節(jié)炎療效的基因分型質控品，為甲氨蝶呤治療類風濕性關節(jié)炎的療效預測提供參考依據(jù)。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術方案：

本發(fā)明所述的質控品核苷酸序列為SEQ ID NO.1：

TACACGCTGGGTACTGTCAGGCTTCAGTGGCTCTGTGGTTTTGGAGGGCAGAGAGGAGATTTCCCTCACACTGCTCCCACAACCATATTTTTAGTGTATAATTATCTGGCTAAATAGATTTCTGTTTAATTTAGCACAGGCACTAGAAAACGTGCTGCGTAGACTGGGTGTTAAGAAAACTGTCTTGATTTAGGAGTTGACAGGTAGTAACTTTAGCTTTCTTTGTTTATGATTTTACTATTTTCTAACCAGGTGCTGCTGTTGGAATTCCACTCAGTGAAGATGAGGCCAAAGTCTGCA

所述質控品模板是含有插入ATIC特異性核苷酸序列的PES質粒載體，該載體可在大腸桿菌中擴增，并采用標準的質粒提取辦法進行制備。

本發(fā)明的有益效果

提供一種基因檢測質控品以供藥物基因檢測室間質評體系使用，這對開展藥物基因檢測室間質評具有重大意義，并對提升藥物基因檢測實驗室的競爭力有重大的現(xiàn)實意義。

附圖說明

圖1是本發(fā)明陽性質控品模板的核苷酸序列和質粒載體圖。

圖2是本發(fā)明陽性質控品模板的核苷酸序列的測序結果。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。

實施例1質粒標準品的制備方法

1、通過PCR方法獲得目的基因

根據(jù)基因序列設計一對引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點，本實驗中為Smal 1和EcoRV)，通過高保真DNA聚合酶PCR循環(huán)擴增獲得目的基因片段。

PCR反應體系為：

PCR反應條件為：94℃變性5min、94℃變性30s、55℃復性40s、68℃延伸1min(根據(jù)片段大小設置，1kb/min)，30個循環(huán)；68℃延伸10min；16℃ forever。

2、目的基因片段回收純化

將擴增后的PCR產(chǎn)品通過新鮮的TAE緩沖液進行瓊脂糖凝膠電泳跑膠，同時通過MarKerV進行比較，確定片段大小正確后在紫外燈下切膠回收，接著通過膠回收純化目的基因片段。

3.雙酶切反應

將目的基因和質粒載體按照一定的體系分別進行雙酶切反應，雙酶切體系如下：

雙酶切反應2.5-3h左右，進行跑膠回收純化

4、目的DNA片段和載體的體外連接

分別取1μl左右的目的DNA片段與載體DNA測量他們的濃度，利用T4DNA連接酶將目的基因與載體DNA摩爾比為3:1-8:1左右連接，放置16℃的恒溫水浴鍋過夜連接。

5、連接產(chǎn)物的轉化

感受態(tài)細胞的制備

⑴保存于-70℃的DH5α(或其他菌種)用接種環(huán)劃菌于1.5％瓊脂平板上，37℃恒溫倒置培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)(約14-16hr)。

⑵挑取單菌落，接種于2.0ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫，250g振蕩培養(yǎng)過夜(約12hr)。

⑶取0.5ml過夜培養(yǎng)液，接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2-2.5hr，至OD₆₀₀為0.4-0.5時，放置于4℃冰箱冷卻1-2hr。

(注：以下操作均應在冰浴中進行。)

⑷將培養(yǎng)液分入兩個50ml離心管中，4℃離心，4000g×10min，棄去上清，用冰浴的0.1M MgCl₂ 25ml懸浮30min。

⑸4℃離心,4000g×10min，棄去上清，加入冰浴的0.1M CaCl₂-甘油溶液1ml懸浮。

⑹以100μl/管分裝入1.5ml離心管中，-70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

連接產(chǎn)物的轉化

⑴取100μl貯存于-70℃鈣化菌，冰浴化開；

⑵加入適量連接產(chǎn)物(一般不超過10μl，輕輕混勻，冰浴20min；

⑶于42℃熱休克90s，迅速轉移至冰浴中，繼續(xù)冰浴2-3min；

⑷加入LB液體培養(yǎng)基500μl，于37℃緩搖孵育45min；

⑸將培養(yǎng)物適量涂于1.5％瓊脂LB平板(根據(jù)質粒性質添加抗生素AMP即氨芐50μg/ml)，待膠表面沒有液體流動時，37℃溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr。

6、重組質粒的鑒定

將過夜培養(yǎng)的長出的菌斑進行菌落PCR鑒定，接著接種于5ml的LB液體培養(yǎng)基過夜振蕩培養(yǎng)利用質粒提取試劑盒提質粒，并進行質粒PCR和雙酶切驗證，確定目的基因大小正確送公司測序進一步的分析驗證。

實施例2基于DNA測序法的陽性質控品測試

1.引物設計與合成：

以人ATIC基因序列為模板，使用Primer Premier 5.0設計引物。

所述質控品模板是含有插入ATIC特異性核苷酸序列的PES質粒載體，該載體可在大腸桿菌中擴增，并采用標準的質粒提取辦法進行制備。

所述PES質粒載體具有氨芐青霉素抗性片段，在插入目的核苷酸序列后，可產(chǎn)生氨芐青霉素抗性，從而使轉化了該質粒載體的大腸桿菌具有耐氨芐青霉素的性質，能夠在加入一定氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基中生長。

所述質控品模板在大腸桿菌中擴增及質粒提取步驟如下：

1.活化：取凍存的甘油菌涂布平板或平板劃線，37℃培養(yǎng)過夜。

2.挑取單菌落，接種于5ml LB(含Amp)培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。

3.將菌液1.8ml分裝至2ml離心管，12000rpm離心1min，棄去上清。

4.向離心管中加入100μl預冷的溶液Ⅰ，懸浮、混勻菌體沉淀。

5.加入200μl溶液Ⅱ，輕柔顛倒數(shù)次，靜置1min。

6.加入150μl預冷溶液Ⅲ，輕柔顛倒，靜置1-2min，12000rpm離心10min。

7.吸取上清至新2ml離心管，加入與上清等體積的酚-氯仿，振蕩混勻，冰上靜置10min，12000rpm離心2min。

8.上清移至新離心管，加入2倍體積的無水乙醇，振蕩混勻，室溫靜置2-3min，12000g離心5min。

9.棄上清，用75％乙醇洗滌沉淀一次，室溫靜置干燥10min。

10.用100μl TE(含RNase 20μg/ml)溶解沉淀，37℃水浴30min

11.紫外分光光度計測定OD260(按照在260nm波長產(chǎn)生1個OD值的DNA濃度是50ng/ml換算)；瓊脂糖凝膠電泳檢驗結果。

12.溶解后質粒置于-20℃保存。

上述步驟中所述溶液I的成分為：50mM葡萄糖、25mM Tris-HCl(pH8.0)和10mM EDTA(pH8.0)。

上述步驟中所述溶液II的成分為：0.2M NaOH和1％SDS。

上述步驟中所述溶液III的成分為：5M乙酸鉀60ml、冰乙酸11.5ml調pH至4.8，加入蒸餾水定容至100ml。

實施例3類風濕關節(jié)炎臨床治療藥物基因檢測室間質評體系的建立

藥物基因檢測質控品的制備

組織者完成血漿中基因提取和序列測定方法學的建立及驗證。

血漿中基因序列標準品：用金標準DNA測序法檢測本發(fā)明公開的含SNP片斷的質粒,作為標準品。

血漿中基因檢測質控品：基因標準品→定量→取標準品溶液加入空白血漿→得到目標基因的質控品。

方法學建立：建立血液樣本DNA提取、目的基因片段PCR擴增、擴增產(chǎn)物，提純以及DNA序列測定的方法。

含SNP片斷的質粒標準品

方法學驗證：考察藥物基因檢測的特異性、準確度和精密度和穩(wěn)定性。

作業(yè)指導書(SOP)撰寫：評價項目和時限要求(發(fā)放、回收、評價)、樣品保存條件、樣本處理方法、檢測方法描述、方法學驗證的內(nèi)容、報告格式以及其他注意事項。

藥物基因檢測質控品的發(fā)放和結果回收

面向藥物基因檢測實驗室，發(fā)放質控品及相關作業(yè)指導書。質控品的發(fā)放將 通過嚴格監(jiān)控的冷鏈運輸體系，以確保質控品的穩(wěn)定性。

室間質評參加者須在規(guī)定時間內(nèi)按照作業(yè)指導書要求完成測定，結果以標準格式通過網(wǎng)絡形式上報至中心，并留存原始記錄及結果報告。

結果評價

制定評分標準：對于每一個測定結果，進行評分。

對每一次EQA調查，針對某一項目的得分計算公式為：

該項目的可接受結果數(shù)/該項目的總的測定樣本數(shù)×100％

而對評價的所有項目，其得分計算公式為：

全部項目可接受結果總數(shù)/全部項目總的測定樣本數(shù)×100％

室間質評計劃的成績要求

每次活動每一分析項目未能達到至少100％可接受成績則稱為本次活動該分析項目不滿意的EQA成績。

未參加室間質評活動定為不滿意的EQA成績，該次得分為0。

在規(guī)定的回報時間內(nèi)實驗室未能將能室間質評的結果回報給組織者，將定為不滿意的EQA成績，該次活動的得分為0。