一種基于指紋圖譜的金黃色葡萄球菌鑒別方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于指紋圖譜的金黃色葡萄球菌鑒別方法，采用高效液相色譜法對34株金黃色葡萄球菌和20株非金黃色葡萄球菌建立菌體細胞萃取物色譜圖，通過比較確定了金黃色葡萄球菌的特征峰。以金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)為內標物(特征峰)，將特征峰與標準峰的相對保留時間作為數據基礎建立金黃色葡萄球菌指紋圖譜，將兩類指紋圖譜的相關系數分布進行分析比較確定限值，構建出指紋圖譜的計算方法，從而用于菌種鑒定；該方法在對金黃色葡萄球菌的識別具有一定的可行性、該方法操作簡單、耗時短、特異性好，為快速識別檢測金黃色葡萄球菌構建了一個新的穩(wěn)定的技術平臺，同時為微生物的識別檢測開拓全新的鑒定方法。
【專利說明】一種基于指紋圖譜的金黃色葡萄球菌鑒別方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及菌種鑒別領域，具體涉及一種基于指紋圖譜的金黃色葡萄球菌鑒別方 法。

【背景技術】
[0002] 金黃色葡萄球菌（StaphyloccocusaureusSA)是世界上公認的一種重要的食源 性病原菌。其廣泛存在于在自然界中，作為人和動物的常見病原菌，其主要存在于人和動物 暴露的鼻腔、咽喉、毛發(fā)上。一方面金黃葡萄球菌可引起局部化膿性炎癥，另一方面它可在 污染的食品中生長繁殖，可產生腸毒素，引起食物中毒。加強對食品中金黃色葡萄球菌的檢 測力度是解決該菌污染食品導致食品安全問題的最有效的途徑。目前，國內檢測食品中金 黃色葡萄球菌主要采用傳統(tǒng)的分離、培養(yǎng)、生化鑒定的方法，其操作繁瑣，檢測周期長，已經 不能滿足食品中致病菌快速檢測的需要。而PCR、LAPM技術等分子方法的技術含量比較高， 對人員操作、儀器條件及檢樣環(huán)境均有較高的要求，并且容易出現假陽性的檢測結果，仍不 能滿足實際檢測的需求。雖然市場上出現了商業(yè)產品化的金黃色葡萄球菌快速測試片，但 因時有出現判讀錯誤而造成誤差的情況，導致不能進行廣泛的普及。


【發(fā)明內容】

[0003] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種基于指紋圖譜的金黃色葡萄球菌鑒別方法， 以金黃色葡萄球菌標準菌株和篩選菌株中為研宄對象，建立金黃色葡萄球菌指紋圖譜，并 利用該菌指紋圖譜檢測食品中金黃色葡萄球菌的污染情況。
[0004] 為實現上述目的，本發(fā)明采取的技術方案為：
[0005] 一種基于指紋圖譜的金黃色葡萄球菌鑒別方法，包括如下步驟：
[0006]S1、未知菌培養(yǎng)：將未知菌取適量接種于200mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基搖床過夜培養(yǎng) 12h，得菌懸液；
[0007]S2、菌體富集：將步驟Sl所得的菌懸液分裝于50mL大離心管，在4°C下以離心力 為6654g，離心6min，棄去上清，得到富集的菌體；
[0008] S3、菌體清洗：將滅菌的0. 9%的生理鹽水加入步驟S2所得的菌體中，漩渦震蕩使 菌體懸浮，在4°C下以離心力為6654g，離心6min，棄去上清，達到清洗菌體的目的；
[0009] S4、菌體破碎：將IOmL的色譜甲醇加入到步驟S3所得的菌體中，漩渦震蕩使菌體 懸浮，制成菌懸液，將菌懸液于細胞破碎儀中以50%功率超聲破碎lOmin，在4°C下以離心 力為6654g，離心6min，取上清備用。
[0010] S5、樣品制備：用旋轉蒸發(fā)儀將步驟S4所得的混合液濃縮至l-2mL，經0. 45μm有 機相微孔濾膜過濾；
[0011] S6、流動相確定：將待測樣品注入高效液相色譜儀，分別以不同比例溶劑系統(tǒng)和不 同梯度洗脫進行實驗，記錄色譜圖，選擇所得色譜圖分離度較好，色譜峰數目也較多的流動 相條件，確定流動相為：流動相A:0. 05%甲酸水溶液；流動相B:乙腈；梯度程序（min/B%) 為：0-15min為 90% -80% ;15-20min為 80% -65% ;20-35min為 65% -5% ;35-40min為 5% -0% ；
[0012] S7、檢測波長確定：由于蛋白質（標準品SPA)對紫外的最大吸收波長為280nm，而 本實驗從金黃色葡萄球菌菌體細胞所提取萃取物較為復雜，所以選定分別在210nm、240nm 和280nm檢測波長下將待測樣品注入高效液相色譜儀測定色譜圖，同時進行全波長掃描， 對不同波長下圖譜進行疊加、比較分，確定紫外檢測器的檢測波長為：280nm;
[0013]S8、流動相流速和色譜柱溫度確定：改變流動相的流速，分別為0. 5ml/min、 0.8ml/min、l.Oml/min，記錄色譜圖，觀察色譜方法中流速對色譜峰保留時間和峰形的影 響，確定流速為：〇.8mL/min;改變色譜柱的溫度，由于柱溫過低容易造成色譜柱堵塞，故 不可設定過低溫度，遂將柱溫分別為25°0、30°0、35°0,40°0，并記錄色譜圖，確定柱溫為 ： 300C；
[0014]S9、進樣量確定：改變進樣量大小，分別為10μ1、20μ1，并記錄色譜圖，觀察進樣 量過小時會導致色譜圖峰響應值過小或者沒有響應值，進樣量過大是否會則導致峰形變 化，有沒有峰面積誤差以及潛在柱過載現象出現，柱分離能力在何種進樣量下更高，依據以 上標準選擇適宜的進樣量，確定進樣量為：20μL;
[0015]S10、在上述確定的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)方法、前處理方法和液相色譜條件下，分 別調節(jié)34株金黃色葡萄球菌數量級10 3cfu/mL(與接種的金黃色葡萄球菌保持一致的OD 值），按2%的接種量接種于200mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基搖床過夜培養(yǎng)12h，經離心、洗滌獲得富 集菌體，將菌體破碎并提取出細胞萃取物，0. 45μm微孔濾膜過濾，并分別精密吸取各待測 樣品溶液20μ1，分別進樣，記錄色譜圖，保留時間，初步建立金黃色葡萄球菌指紋圖譜色譜 圖；
[0016]S11、在以上確定的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)方法、前處理方法和液相色譜條件下，分 別提取出菌株RS05,RS08,RS30三株屎腸球菌，同樣以103cfu/mL數量級，按2%的接種量 接種于200mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基搖床過夜培養(yǎng)12h，經離心、洗滌獲得富集菌體，將菌體破碎 并提取出細胞萃取物，〇. 45μm微孔濾膜過濾，加入標準品SPA，并分別精密吸取各供試品 溶液20μ1，分別進樣，記錄色譜圖，保留時間，與金黃色葡萄球菌細胞萃取物色譜圖進行對 比；
[0017]S12、在以上確定的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)方法、前處理方法和液相色譜條件下，分 別提取出17株非金黃色葡萄球菌的細胞萃取物，經0.45μπι微孔濾膜過濾，加入標準品 SPA，并分別精密吸取各供試品溶液20μ1，分別進樣，記錄色譜圖，與金黃色葡萄球菌細胞 萃取物色譜圖進行比對，找出金黃色葡萄球菌特有的色譜峰；
[0018]S13、指紋圖譜匹配和相似度計算：
[0019] 首先，在確定共有色譜峰和SPA內標物標準峰的前提下，對34株金黃色葡萄球菌 的共有峰的保留時間計算平均值，計算出每個峰的可信度Φ;其次，在確定每個所選出的 共有峰及標準峰具有可用性的條件下，計算34株金黃色葡萄球菌色譜圖的相似度r;最后， 對19株非金黃色葡萄球菌菌株色譜圖計算相似度。
[0020] 其中，所述每個峰的可信度Φ的計算公式為：
[0021]

【權利要求】
1. 一種基于指紋圖譜的金黃色葡萄球菌鑒別方法，其特征在于，包括如下步驟： 51、 未知菌培養(yǎng)：將未知菌取適量接種于200mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基搖床過夜培養(yǎng)12h，得 菌懸液； 52、 菌體富集：將步驟S1所得的菌懸液分裝于50mL大離心管，在4°C下以離心力為 6654g，離心6min，棄去上清，得到富集的菌體； 53、 菌體清洗：將滅菌的0. 9%的生理鹽水加入步驟S2所得的菌體中，漩渦震蕩使菌體 懸浮，在4°C下以離心力為6654g，離心6min，棄去上清，達到清洗菌體的目的； 54、 菌體破碎：將10mL的色譜甲醇加入到步驟S3所得的菌體中，漩渦震蕩使菌體懸浮， 制成菌懸液，將菌懸液于細胞破碎儀中以50 %功率超聲破碎lOmin，在4°C下以離心力為 6654g，離心6min，取上清備用。 55、 樣品制備：用旋轉蒸發(fā)儀將步驟S4所得的混合液濃縮至l-2mL，經0. 45ym有機相 微孔濾膜過濾； 56、 流動相確定：將待測樣品注入高效液相色譜儀，分別以不同比例溶劑系統(tǒng)和不同 梯度洗脫進行實驗，記錄色譜圖，選擇所得色譜圖分離度較好，色譜峰數目也較多的流動 相條件，流動相為：流動相A:0. 05%甲酸水溶液；流動相B:乙腈；梯度程序（min/B% ) 為：0-15min為 90% -80% ;15-20min為 80% -65% ;20-35min為 65% -5% ;35-40min為 5% -0% ； 57、 檢測波長確定：分別在210nm、240nm和280nm檢測波長下將待測樣品注入高效液相 色譜儀測定色譜圖，同時進行全波長掃描，對不同波長下圖譜進行疊加、比較分，確定紫外 檢測器的檢測波長為：280nm; 58、 流動相流速和色譜柱溫度確定：改變流動相的流速，分別為0. 5ml/min、0. 8ml/ min、1.Omi/min，記錄色譜圖，觀察色譜方法中流速對色譜峰保留時間和峰形的影響，確定 流速為：〇. 8mL/min;改變色譜柱的溫度，分別為25 °C、30°C、35 °C，40 °C，并記錄色譜圖，確 定柱溫為：30°C; 59、 進樣量確定：改變進樣量大小，分別為10yl、2〇yl，并記錄色譜圖，觀察進樣量過 小時會導致色譜圖峰響應值過小或者沒有響應值，進樣量過大是否會則導致峰形變化，有 沒有峰面積誤差以及潛在柱過載現象出現，柱分離能力在何種進樣量下更高，依據以上標 準選擇適宜的進樣量，確定進樣量為：20yL; 510、 在上述確定的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)方法、前處理方法和液相色譜條件下，分別調 節(jié)34株金黃色葡萄球菌數量級103cfu/mL，按2 %的接種量接種于200mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基搖 床過夜培養(yǎng)12h，經離心、洗滌獲得富集菌體，將菌體破碎并提取出細胞萃取物，0. 45ym微 孔濾膜過濾，并分別精密吸取各待測樣品溶液20y1，分別進樣，記錄色譜圖，保留時間，初 步建立金黃色葡萄球菌指紋圖譜色譜圖； 511、 在以上確定的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)方法、前處理方法和液相色譜條件下，分別提 取出菌株RS05,RS08,RS30三株屎腸球菌，同樣以103cfu/mL數量級，按2%的接種量接種 于200mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基搖床過夜培養(yǎng)12h，經離心、洗滌獲得富集菌體，將菌體破碎并提 取出細胞萃取物，〇. 45ym微孔濾膜過濾，加入標準品SPA，并分別精密吸取各供試品溶液 20yl，分別進樣，記錄色譜圖，保留時間，與金黃色葡萄球菌細胞萃取物色譜圖進行對比； 512、 在以上確定的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)方法、前處理方法和液相色譜條件下，分別提 取出17株非金黃色葡萄球菌的細胞萃取物，經0. 45ym微孔濾膜過濾，加入標準品SPA，并 分別精密吸取各供試品溶液20y1，分別進樣，記錄色譜圖，與金黃色葡萄球菌細胞萃取物 色譜圖進行比對，找出金黃色葡萄球菌特有的色譜峰； S13、指紋圖譜匹配和相似度計算： 首先，在確定共有色譜峰和SPA內標物標準峰的前提下，對34株金黃色葡萄球菌的共 有峰的保留時間計算平均值，計算出每個峰的可信度巾；其次，在確定每個所選出的共有 峰及標準峰具有可用性的條件下，計算34株金黃色葡萄球菌色譜圖的相似度r;最后，對19 株非金黃色葡萄球菌菌株色譜圖計算相似度。
2. 根據權利要求1所述的一種基于指紋圖譜的金黃色葡萄球菌鑒別方法，其特征在 于，所述每個峰的可信度巾的計算公式為：
式中，Xi代表第i個峰對于標準峰SPA峰的相對保留時間；則代表34個金黃色葡萄 球菌指紋圖譜樣本中第i個峰對于標準峰SPA峰的相對保留時間的平均值；n為樣本數。
3. 根據權利要求1所述的一種基于指紋圖譜的金黃色葡萄球菌鑒別方法，其特征在 于，所述金黃色葡萄球菌色譜圖的相似度r的計算公式為：
式中，\依依舊代表第j個峰對于標準峰SPA峰的相對保留時間；s則代表34個金黃 色葡萄球菌指紋圖譜樣本中第j個峰對于標準峰SPA峰的相對保留時間的平均值；n為一 個樣本中峰的個數。
【文檔編號】G01N30/02GK104483409SQ201410803044
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月12日 優(yōu)先權日:2014年12月12日
【發(fā)明者】田益玲, 張偉, 馬曉燕, 趙元煜, 于志彬 申請人:河北農業(yè)大學