一種快速檢測肉中金黃色葡萄球菌的試劑盒及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種快速檢測肉中金黃色葡萄球菌的試劑盒及應(yīng)用，屬于食品安全技 術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，應(yīng)用分子生物學(xué)原理，基于核酸擴增檢測食源性致病菌的方法以得到了飛 速的發(fā)展。針對于金黃色葡萄球菌的檢測方法，主要圍繞著傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和生化鑒定相 結(jié)合的方法、PCR法以及熒光定量PCR法。近幾年已有應(yīng)用Bst大片段DNA聚合酶進(jìn)行LAMP 擴增檢測金黃色葡萄球菌，但都未從食用肉基質(zhì)中進(jìn)行檢測。
[0003] Biolab公司最新研發(fā)出Bst 2. 0 WarmStart DNA聚合酶，可以用于LAMP擴增反 應(yīng)。該酶相比于傳統(tǒng)的Bst大片段DNA聚合酶的優(yōu)點在于，該酶是熱啟動酶，無需低溫條 件下配制反應(yīng)體系，即可保證酶催化反應(yīng)的特異性。從而使反應(yīng)更適合于現(xiàn)場的食源性致 病菌檢測，為該方法的實際應(yīng)用創(chuàng)造了更大的可能。PCR及熒光定量PCR法需要3-4小時， LAMP方法只需1小時即可擴增109倍從而達(dá)到檢測目的。同時，也有報道稱LAMP反應(yīng)不易 受食品基質(zhì)中成分的抑制作用，對DNA模板純度要求不高。因此可知LAMP檢測方法具有快 速、特異、靈敏等的優(yōu)點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種快速檢測肉中金黃色葡萄球菌的試劑 盒及應(yīng)用，采用的技術(shù)方案如下：
[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測肉中金黃色葡萄球菌的試劑盒，該試劑盒由 LAMP擴增反應(yīng)體系、陰性對照液和陽性對照液組成，所述LAMP擴增反應(yīng)體系含有Bst 2. 0 WarmStart DNA聚合酶和如下引物組：
[0006] 上游外引物 nuc-F3 :CGATTGATGGTGATACGGTTA
[0007] 下游外引物 nuc-B3 :CCACGTCCATATTTATCAGTTC
[0008] 上游內(nèi)引物 nuc-FIP :GGATGCTTTGTTTCAGGTGTATCATGTACAAAGGTCAACCAATG
[0009] 下游內(nèi)引物 nuc-BIP :AGAGAAATATGGTCCTGAAGCAAGCCTTTGTCAAACTCGACTTC
[0010] 按照體積份數(shù)組成如下：25份LAMP擴增反應(yīng)體系，1份陰性對照液和1份陽性對 照液。
[0011] 所述LAMP引物組，外引物與內(nèi)引物濃度比為1:6。
[0012] 所述LAMP擴增反應(yīng)體系由LAMP引物組、Bst 2. 0 WarmStart DNA聚合酶和擴增 反應(yīng)液組成，其中每25 μ L LAMP擴增反應(yīng)體系由0. 4 μ M的F3及B3, 2. 4 μ M的FIP和BIP， 0.9yL 8U Bst 2.0 WarmStart DNA 聚合酶，4mM MgC12,2mM dNTPs，0.4M甜菜堿，2.5yL IOXBufTer及2 μ L模板DNA組成，其余部分由滅菌雙蒸水補足。
[0013] 所述陽性對照液為金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)液中提取的基因組DNA溶液，陰 性對照液為滅菌雙蒸水。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種上述試劑盒在快速檢測食品級鮮肉或肉制品中金黃色葡萄 球菌的應(yīng)用。
[0015] 所述應(yīng)用步驟如下：
[0016] 1)提取待測物DNA :取25g待檢肉樣置于無菌均質(zhì)袋中，加入225mL生理鹽水，拍 打勻漿，提取肉中金黃色葡萄球菌的DNA ;
[0017] 2)環(huán)介導(dǎo)等溫擴增：以DNA提取物為模板進(jìn)行LAMP擴增，將LAMP擴增反應(yīng)體系 各成分進(jìn)行混合，然后將混合物在64°C下擴增60min，再將體系加熱到80°C持續(xù)5min終止 反應(yīng)，獲得擴增產(chǎn)物；
[0018] 3)電泳檢測：取5yL步驟2)所得擴增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成 像系統(tǒng)觀察結(jié)果。
[0019] 本發(fā)明有益效果：
[0020] 1.本發(fā)明采用新研發(fā)的Bst 2. 0 WarmStart DNA聚合酶進(jìn)行LAMP擴增反應(yīng)，該酶 是熱啟動酶，低溫或常溫條件下不擴增，能夠有效保證酶催化反應(yīng)的特異性，更好的抑制非 特異性擴增，同時無需創(chuàng)造低溫條件配制反應(yīng)體系的特點更適合用于現(xiàn)場檢測。
[0021] 2.本發(fā)明方法直接將反應(yīng)體系各組分全部混合后進(jìn)行擴增反應(yīng)即可，無需預(yù)變性 過程。
[0022] 3.本文所建立的LAMP法能夠特異性的檢測金黃色葡萄球菌，并且檢測金黃色葡 萄球菌純菌的靈敏度為9.8 X 10°CFU/mL，是普通PCR檢測靈敏度的100倍。在檢測肉中金 黃色葡萄球菌時，檢測限為9. 8X lOtFU/mL。因此，本實驗所建立的LAMP法檢測食品級肉 及肉制品中金黃色葡萄球菌的方法，具有靈敏、快速以及簡便等的優(yōu)點，是一種具有很好的 發(fā)展前景的檢測手段。
【附圖說明】
[0023] 圖1為金黃色葡萄球菌LAMP檢測結(jié)果；
[0024] (M，DNA Marker ; 1，金黃色葡萄球菌ATCC13565 ;2,空白對照/陰性對照）。
[0025] 圖2為LAMP檢測金黃色葡萄球菌靈敏度電泳圖；
[0026] (M，DNA Marker ;1-11 分別對應(yīng)菌濃度（CFU/mL)為 2. OlX 109、2· OlX 108、 2. 01 X IO7,2. 01 X IO6,2. 01 X IO5,2. OlXlO4,2. 01Xl〇\2. 01 X IO2,2. 01Χ1〇\2. 01X10°, 2· 01X10^12 :陰性對照）。
[0027] 圖3 PCR檢測金黃色葡萄球菌純菌的靈敏度電泳圖；
[0028] (M，DNA Marker ;1-11 分別對應(yīng)菌濃度（CFU/mL)為 2. OlX 109、2· OlX 108、 2. 01 X IO7,2. 01 X IO6,2. 01 X IO5,2. OlXlO4,2. 01Xl〇\2. 01 X IO2,2. 01Χ1〇\2. 01X10°, 2· 01X10^12 :陰性對照）。
[0029] 圖4 LAMP檢測人工污染肉中金黃色葡萄球菌的靈敏度電泳圖；
[0030] (M，DNA Marker ; 1-10 分別對應(yīng)菌濃度（CFU/mL)為 2. OlX 108、2· OlX 107、 2. 01 X IO6,2. 01 X IO5,2. 01Xl〇\2. 01 XlO3,2. 01 X IO2,2. 01Xl〇\2. 01 X 10°,2. 01Χ10-1； 11 :陰性對照）。
【具體實施方式】
[0031] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不受實施例的限制。
[0032] 實施例1
[0033] 1.實驗方法
[0034] I. 1不同菌種的培養(yǎng)以及DNA模板的提取
[0035] 取金黃色葡萄球菌ATCC13565作為標(biāo)準(zhǔn)菌株，3株金黃色葡萄球菌（ATCC25923， CMCC26074，CMCC26075)作為參考菌株以及其他26株非金黃色葡萄球菌菌株進(jìn)行特異性實 驗。金黃色葡萄球菌及其他菌種，分別活化培養(yǎng)于NB以及復(fù)合增菌培養(yǎng)基BPW中，37°C培 養(yǎng)過夜。分別吸取對數(shù)生長期的菌懸液lmL，采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌DNAJf 所得到的DNA模板于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0036] I. 2 LAMP引物的設(shè)計與合成
[0037] 在GenBank中尋找到金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶基因（nuc)，該基因具有特異性 好的特點，并且具有高度的保守性。因此，本文應(yīng)用此特異性基因 nuc序列進(jìn)行引物的設(shè) 計。采用在線的Primer EXpl〇rer4.0引物設(shè)計軟件，針對特異性的目的片段設(shè)計得到了一 套特異性引物（SEQ ID NO. 1~4)。如表1所示。
[0038] 表1金黃色葡萄球菌nuc基因 LAMP引物序列
[0040] I. 3 LAMP反應(yīng)體系的建立及反應(yīng)條件的優(yōu)化
[0041] LAMP反應(yīng)體系（25yL)包括：內(nèi)引物FIP和BIP、外引物F3和B3、Mgcl2、脫氧核 糖核苷酸（dNTPs)、甜菜喊、DNA模板、10 XBuffer、Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶，滅菌水 補足體系。
[0042] 將混合物在65°C恒溫60min進(jìn)行擴增，之后將體系加熱到80°C持續(xù)5min以終止 反應(yīng)。
[0043] 選擇對LAMP體系中的關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，包括鎂離子濃度（2mM，4mM，6mM，8mM， 10禮)、(1階1 3濃度（0.41111，0.81111，1.21111，1.61111，21111)、外引物與內(nèi)引物濃度比（1:2，1:4， 1:6,1:8,1:10)、甜菜堿濃度（0Μ，0·4Μ，0· 8Μ，1·2Μ，1·6Μ)、Bst 2.0 WarmStart DNA 聚合酶 (0. 5 μ L、0. 6 μ L、0. 7 μ L、0. 8 μ L、0. 9 μ L、1 μ L)，根據(jù)LAMP擴增后電泳圖條帶的有無和亮 度選擇最適條件，建立LAMP反應(yīng)體系。
[0044] 建立LAMP反應(yīng)體系后，將反應(yīng)體系分別在61 °C、62°C、63°C、64°C及65°C條件下進(jìn) 行擴增反應(yīng)，確定最適反應(yīng)溫度。并在確認(rèn)的最適反應(yīng)溫度下，進(jìn)行LAMP反應(yīng)，分別擴增 15min、30min、45min、60min及75min，擴增后進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，確定LAMP反應(yīng)的最 適反應(yīng)條件。
[0045] I. 4 LAMP檢測金黃色葡萄球菌的特異性
[0046] 按照I. 1的方法，提取4株金黃色葡萄球菌以及其他26株非金黃色葡萄球菌的 DNA，分別作為LAMP反應(yīng)的模板，進(jìn)行擴增反應(yīng)，取擴增后的產(chǎn)物5 μ L進(jìn)行2 %瓊脂糖凝膠 電泳，觀察實驗結(jié)果。
[0047] I. 5 LAMP及PCR方法檢測金黃色葡萄球菌靈敏度的比較