一種抗甲氧西林耐藥的金黃色葡萄球菌的藥物組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及協(xié)同抗甲氧西林耐藥的金黃色葡萄球菌（MRSA)感染的藥物組合物， 該藥物組合物包括抗菌肽Cbf-K 16和選自頭孢他啶或氨芐青霉素在內(nèi)的抗生素。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗生素自用于細(xì)菌性感染的治療以來(lái)，大大延長(zhǎng)了人的壽命。然而，隨著抗生素的 大量使用，抗生素耐藥性問(wèn)題也日益嚴(yán)重，細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了新抗生素的 開(kāi)發(fā)速度。金黃色葡萄球菌是臨床感染的主要病原菌之一，可以引起如皮膚軟組織感染、 肺炎、菌血癥、手術(shù)部位及導(dǎo)管相關(guān)性感染等，嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康。過(guò)去的20年里，MRSA 已成為醫(yī)院感染的重要病原菌，受到世界范圍的廣泛關(guān)注。MRSA具有多重耐藥性，對(duì)包括 0-內(nèi)酰胺類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、林可霉素等多種抗菌藥物 耐藥。萬(wàn)古霉素是治療MRSA感染的首選藥物，有較強(qiáng)的抗MRSA活性，能夠降低其致病力。 然而，近年來(lái)在日本和美國(guó)等地先后出現(xiàn)了對(duì)萬(wàn)古霉素中度耐藥（VISA)或耐藥（VRSA)的 MRSA，給萬(wàn)古霉素對(duì)MRSA的治療帶來(lái)了挑戰(zhàn)。因此，單一抗生素針對(duì)MRSA感染的治療已經(jīng) 無(wú)法滿(mǎn)足臨床的需要。
[0003] 頭孢他啶、氨芐青霉素為半合成的廣譜0-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，主要作用于青霉素 結(jié)合蛋白（PBPs)。PBPs是細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖生物合成的重要酶，具有催化肽聚糖聚合（轉(zhuǎn) 糖基）和交聯(lián)（轉(zhuǎn)肽）的作用，在細(xì)菌細(xì)胞壁的生物合成、細(xì)胞分裂和形態(tài)維持中發(fā)揮重要 作用。這兩種抗生素通過(guò)抑制PBPs在細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的合成、細(xì)胞生長(zhǎng)以及維持細(xì)胞 形態(tài)過(guò)程中的作用，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁的完整性被破壞，原生質(zhì)流失，從而達(dá)到殺滅細(xì)菌的目 的。但是，MRSA對(duì)頭孢他啶和氨芐青霉素具有一定的耐藥性；其耐藥機(jī)制主要有兩種，一是 產(chǎn)生0 -內(nèi)酰胺酶以降解藥物，另一種是產(chǎn)生特異的青霉素結(jié)合蛋白PBP2a，取代對(duì)0 -內(nèi) 酰胺抗生素具有高親和力的PBP2和PBP3的功能。
[0004] 抗菌肽作為一類(lèi)天然的小分子多肽，因其獨(dú)特的作用機(jī)制及廣譜殺菌性，近年來(lái) 備受人們的關(guān)注。抗菌肽的活性高，對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲(chóng)等均有抑制作用；而其獨(dú) 特的作用機(jī)制，使得病原體不易對(duì)其產(chǎn)生耐藥性。因此，抗菌肽有望成為新一代的抗菌藥 物。Cbf-K 1^發(fā)明人在前期研宄中，將抗菌肽Cathelicidin-BF部分活性氨基酸位點(diǎn)進(jìn) 行突變，采用固相化學(xué)合成法獲得的對(duì)耐藥性病原菌具有高抑制活性的抗菌肽，其具有SEQ ID No : 1所示的氨基酸序列，其分子量為3637. 63Da，全序列為：賴(lài)氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨 酸-精氨酸-賴(lài)氨酸_亮氨酸_賴(lài)氨酸_賴(lài)氨酸_絲氨酸_纈氨酸_賴(lài)氨酸-賴(lài)氨酸-精 氨酸-丙氨酸-賴(lài)氨酸-賴(lài)氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-賴(lài)氨酸-賴(lài)氨酸-脯氨酸-精氨 酸-纈氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-纈氨酸-絲氨酸-異亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸。體外 抗菌活性研宄表明，Cbf-K 16具有一定的殺滅耐藥性細(xì)菌的作用。該技術(shù)記載于本專(zhuān)利發(fā)明 人周長(zhǎng)林等已申請(qǐng)的中國(guó)專(zhuān)利ZL201210171901. 8中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對(duì)MRSA對(duì)傳統(tǒng)抗生素敏感性下降，提出一種抗MRSA的藥物組合物，能有 效地預(yù)防和治療MRSA引起的感染。
[0006] 本發(fā)明公開(kāi)了一種抗菌肽Cbf-K16與抗生素的復(fù)方藥物組合物，由藥物活性組分 和藥學(xué)上可接受的載體組成，其中藥物活性組分含序列為SEQ ID No :1的多肽（即多肽 Cbf-K16)及選自頭孢他啶、氨芐青霉素在內(nèi)的任一組分，構(gòu)成復(fù)方藥物。
[0007] 多肽0^_1(16與選自頭孢他啶或氨芐青霉素中的任一組分的重量比可選 8 : 1-1 : 8。優(yōu)選 4 : 1-1 : 4。更優(yōu)選 1 : 1-1 : 2。最優(yōu)選 1 : 1。
[0008] 可通過(guò)常規(guī)的操作手段，向藥物活性組分中直接或間接加入藥學(xué)上可接受的輔料 制成膠囊劑、顆粒劑、丸劑、散劑、片劑、口服液、糖漿、口崩片、含漱液、細(xì)粒劑、粉末、或者注 射劑等劑型供臨床應(yīng)用。
[0009] 下面是本發(fā)明的部分抗菌試驗(yàn)及結(jié)果：
[0010] 一、抗菌肽Cbf-K16、頭孢他啶和氨芐青霉素的藥效、優(yōu)選配比研宄以及協(xié)同作用評(píng) 價(jià)
[0011] ⑴接種物的制備
[0012] 將實(shí)驗(yàn)所需菌株從保藏的甘油管中接至營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，37°C培養(yǎng)16h，接種環(huán)挑取 少許接種至2ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)8h，用MH肉湯培養(yǎng)基稀釋成I X 105CFU/ml左右 的細(xì)菌懸液。
[0013] (2)藥物的配置
[0014] 稱(chēng)取一定量的Cbf-K16、頭孢他啶、氨芐青霉素，溶于無(wú)菌的生理鹽水中，配制成濃 度為1024 y g/ml的母液，經(jīng)0. 22 y m濾膜過(guò)濾除菌，分裝。置于-20°C備用。
[0015] (3)最小抑菌濃度（MIC)的測(cè)定
[0016] 將IX IO5CFUAiI左右的細(xì)菌懸液接種至96孔板中，每孔100 y 1。然后等體積加 入經(jīng)MH倍比稀釋的藥物。使最終藥物濃度為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0. 5、0. 25yg/ ml。同時(shí)設(shè)不含藥物的空白對(duì)照組。37°C培養(yǎng)16-20h。觀(guān)察結(jié)果，記錄最低不長(zhǎng)菌的藥物 濃度，即為最低抑菌濃度。結(jié)果見(jiàn)表1。
[0017] 表1抗菌肽Cbf-K16與抗生素對(duì)細(xì)菌的MIC
[0018]
[0019] 由表1可看出，本發(fā)明所選的耐藥性細(xì)菌臨床株對(duì)頭孢他啶、氨芐青霉素都表現(xiàn) 出較強(qiáng)的耐藥性，MIC值均大于64 y g/ml ;而對(duì)抗菌肽Cbf-K16相對(duì)敏感，MIC值均小于 32 y g/ml〇
[0020] (4) 0^-1(16與抗生素優(yōu)選配比研宄
[0021] 用無(wú)菌MH肉湯培養(yǎng)基將藥物原液倍比稀釋成含藥濃度為1024、512、256、128、64、 32、16、8、4、2μg/ml的藥液。根據(jù)MIC值，由低到高依次將2種抗菌藥物按棋盤(pán)法設(shè)計(jì)， 兩兩組合加入96孔板中，每種抗菌藥物加50 y 1，再取100 y 1菌液加入孔中，置37°C培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)16-20h。另設(shè)不含藥組作為對(duì)照。觀(guān)察抗菌效果，并記錄聯(lián)合的MIC值。通過(guò) 計(jì)算部分抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC)判斷相互作用。
同、相加、無(wú)關(guān)、拮抗作用。結(jié)果見(jiàn)表2。
[0022] 表2 0^_1(16與抗生素優(yōu)選配比研宄
[0023]
[0025] 由表2可知，Cbf-^與抗生素聯(lián)用時(shí)，不同的配比對(duì)MRSA的活性不同。在 Cbf-K 16與抗生素重量比為8 : 1-1 : 8范圍內(nèi)有協(xié)同效果，在Cbf-K16與抗生素重量比為 4 : 1-1 : 4范圍內(nèi)協(xié)同效果明顯，2 : 1-1 : 2時(shí)效果更好，Cbf-K16與抗生素以I : 1配 比時(shí)協(xié)同效果最高。
[0026] (5)棋盤(pán)法測(cè)定Cbf-K16與抗生素聯(lián)用的效果
[0027] 用無(wú)菌MH肉湯培養(yǎng)基將藥物原液倍比稀釋成含藥濃度為1024、512、256、128、64、 32、16、8、4、2 y g/ml的藥液。根據(jù)MIC值，由低到高依次將2種抗菌藥物按棋盤(pán)法設(shè)計(jì)，兩 兩組合（Cbf-K16 :抗生素重量比=I : 1)加入96孔板中，每種抗菌藥物加50 yl，再取 100 y 1菌液加入孔中，置37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-20h。另設(shè)不含藥組作為對(duì)照。觀(guān)察抗菌效 果，計(jì)算FIC。結(jié)果見(jiàn)表3。
[0028] 表3 Cbf-K16與頭孢他啶或氨芐青霉素聯(lián)用對(duì)耐藥株的MIC值以及部分抑菌濃度 指數(shù)（FIC)
[0029]
[0030] 由表3可以看出，Cbf-K16與抗生素聯(lián)合用藥對(duì)MRSA顯示出較強(qiáng)的協(xié)同抗菌活性， FIC指數(shù)均< 0. 5。但藥物組合物對(duì)耐藥性革蘭陰性細(xì)菌大腸埃希菌沒(méi)有顯示出聯(lián)用活性， FIC指數(shù)均> 0. 5。
[0031] 二、抗菌肽Cbf-Klf^抗生素聯(lián)用的藥物組合物對(duì)MRSA的殺菌活性
[0032] (1)抗菌肽Cbf-K16與抗生素聯(lián)用后對(duì)MRSA的殺菌曲線(xiàn)的繪制
[0033] 將1/2 XMIC濃度的抗菌肽C