序列表的引用
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發(fā)明背景
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及相對于親本蛋白酶在一種或多種特性中展示出改變的新穎蛋白酶變體，所述特性包括：清洗性能、洗滌劑穩(wěn)定性和/或儲存穩(wěn)定性。本發(fā)明的變體適合用于在清潔過程和洗滌劑組合物中使用，如洗衣組合物和餐具清洗組合物，包括手洗和自動餐具清洗組合物。本發(fā)明還涉及編碼這些變體的分離的dna序列、表達載體、宿主細胞以及用于產(chǎn)生和使用本發(fā)明的蛋白酶變體的方法。
相關(guān)技術(shù)說明
酶作為清洗配制品的部分已經(jīng)在洗滌劑工業(yè)使用了數(shù)十年。從商業(yè)視角看，蛋白酶在這樣的配制品中是最相關(guān)的酶，而其他酶(包括脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶或多種酶的混合物)也是通常使用的。為了改進蛋白酶的成本和/或性能，對具有改變的特性，如在低溫下增加的活性、增加的穩(wěn)定性、在給定的ph下增加比活性、改變的ca2+依賴性、在其他洗滌劑成分(例如漂白劑、表面活性劑等)的存在下增加的穩(wěn)定性等的蛋白酶進行著持續(xù)搜尋。廣泛用于洗滌劑中的一個蛋白酶家族是枯草桿菌酶。這個家族先前已經(jīng)進一步由西埃澤恩(siezen)rj和洛因伊森(leunissen)jam，1997，蛋白質(zhì)科學(proteinscience)，6，501-523被分組為6個不同亞組。這些亞組之一是枯草桿菌蛋白酶家族，它包括枯草桿菌酶，如bpn’、枯草桿菌蛋白酶309(
發(fā)明概述
本發(fā)明進一步涉及包括一個或多個選自下組的取代的蛋白酶變體，該組由以下各項組成：q70f、q70a、q70n、s111r、s111e、s111d、s114a、s114q、s144r、a145e、k146t、k146n、k146w、k146f、k146a、i150a、i150n、i150n、i150s,a151r、n176y、i178y、i178f、i178p、g182a、l184f、l184y、l184f、l184y、l184w、l184d、r224d、r224g、r224s、以及y240r，其中這些位置對應(yīng)于seqidno:3的位置，其中該變體與seqidno:3具有至少70％序列一致性，并且其中該變體具有蛋白酶活性。
本發(fā)明還涉及編碼這些變體的分離的多核苷酸，包含這些多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細胞，以及產(chǎn)生這些變體的方法。
序列表綜述
seqidno:1＝是從芽孢桿菌屬物種分離的ty-145蛋白酶的dna序列。
seqidno:2＝是如從seqidno:1推導的氨基酸序列。
seqidno:3＝是成熟ty-145蛋白酶的氨基酸序列。
seqidno:4＝是ty-145蛋白酶+s173p+s175p的氨基酸序列。
seqidno:5＝是tyty-145蛋白酶+s173p+s175p+f180y的氨基酸序列。
定義
術(shù)語“蛋白酶”在此被定義為水解肽鍵的酶。它包括屬于ec3.4酶組的任何酶(包括其13個亞類中的每一種http://en.wikipedia.org/wiki/category:ec_3.4)。ec編號參考加利福尼亞州(california)的圣迭戈(sandiego)的nc-iubmb學術(shù)出版社(academicpress)的1992年酶命名法，分別包括出版于歐洲生物化學期刊(eur.j.biochem.)1994，223，1-5、歐洲生物化學期刊1995，232，1-6、歐洲生物化學期刊1996，237，1-5、歐洲生物化學期刊1997，250，1-6、以及歐洲生物化學期刊1999，264，610-650的增刊1-5。術(shù)語“枯草桿菌酶”是指根據(jù)斯艾森等人，蛋白質(zhì)工程學(proteinengng.)4(1991)719-737和斯艾森等人，蛋白質(zhì)科學6(1997)501-523的絲氨酸蛋白酶亞組。絲氨酸蛋白酶或絲氨酸肽酶是特征為在活性位點具有與底物形成共價加合物的絲氨酸的蛋白酶的一個亞組。另外，枯草桿菌酶(以及絲氨酸蛋白酶)的特征為除了絲氨酸以外，具有兩個活性位點氨基酸殘基，即組氨酸和天冬氨酸殘基。枯草桿菌酶可以劃分為6個亞部，即，枯草桿菌蛋白酶家族、嗜熱蛋白酶(thermitase)家族、蛋白酶k家族、羊毛硫氨酸抗生素肽酶(lantibioticpeptidase)家族、kexin家族和pyrolysin家族。術(shù)語“蛋白酶活性”意指蛋白水解活性(ec3.4)。本發(fā)明的蛋白酶是內(nèi)肽酶(ec3.4.21)。出于本發(fā)明的目的，根據(jù)以下“材料與方法”所述的程序確定蛋白酶活性。本發(fā)明的這些蛋白酶變體具有seqidno:3的多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的蛋白酶活性。
術(shù)語“親本”、“蛋白酶親本”、或“前體蛋白酶”意指蛋白酶，對其進行了改變以產(chǎn)生本發(fā)明的酶變體。因此，親本是具有與所述變體一致的氨基酸序列但是在一個或多個所述指定位置處不具有改變的一種蛋白酶。應(yīng)理解的是，在上下文中的“具有一致的氨基酸序列”的表達涉及100％序列一致性。該親本可以是天然存在的(野生型)多肽。在具體實施例中，該親本是與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少70％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％,至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性的蛋白酶。
術(shù)語“蛋白酶變體”意指具有蛋白酶活性的相比于其親本在一個或多個(或一個或若干個)位置處包括一個改變即取代、插入、和/或缺失(優(yōu)選取代)的蛋白酶，該親本是具有與所述變體一致的氨基酸序列但是在一個或多個所述指定位置不具有所述改變的蛋白酶。取代意指占據(jù)一個位置的氨基酸被一個不同的氨基酸替換；缺失意指除去占據(jù)一個位置的氨基酸；并且插入意指在與占據(jù)一個位置的氨基酸相鄰處添加氨基酸，例如1至10個氨基酸，優(yōu)選1至3個氨基酸。優(yōu)選地，變體是經(jīng)過人為修飾的。在一方面，該變體是至少1％純的，例如至少5％純的、至少10％純的、至少20％純的、至少40％純的、至少60％純的、至少80％純的、以及至少90％純的，如通過sdspage所確定的。
術(shù)語“分離的多核苷酸”意指通過人工修飾的多核苷酸。在一方面，如通過瓊脂糖電泳法確定的，該分離的多核苷酸是至少1％純的，例如至少5％純的、至少10％純的、至少20％純的、至少40％純的、至少60％純的、至少80％純的、至少90％純的、以及至少95％純的。多核苷酸可以是基因組、cdna、rna、半合成、合成來源的、或其任意組合。
術(shù)語“等位基因變體”意指占據(jù)同一染色體基因座的基因的兩種或更多種替代形式中的任一種。等位基因變異通過突變天然產(chǎn)生，并且可以導致群體內(nèi)多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽方面無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。
術(shù)語“基本上純的變體”意指包含按重量計至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％、以及至多0.5％的其他多肽材料的制劑，這些其他多肽材料是與其天然或重組地相關(guān)的。優(yōu)選地，該變體按存在于制劑中的總多肽材料的重量計是至少92％純的，例如至少94％純的、至少95％純的、至少96％純的、至少97％純的、至少98％純的、至少99％純的、至少99.5％純的、以及100％純的。本發(fā)明的這些變體優(yōu)選以基本上純的形式存在。例如，這可通過經(jīng)由眾所周知的重組方法或經(jīng)由經(jīng)典的純化方法制備變體來完成。
術(shù)語“野生型蛋白酶”意指由天然存在的有機體(如在自然界中發(fā)現(xiàn)的細菌、古生菌、酵母、真菌、植物或動物)表達的蛋白酶。野生型蛋白酶的實例是ty-145蛋白酶。
術(shù)語“成熟多肽”意指在翻譯和任何翻譯后修飾如n末端加工、c末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后處于其最終形式的多肽。在一方面，該成熟多肽對應(yīng)于具有seqidno:3的氨基酸序列。
術(shù)語“成熟多肽編碼序列”意指編碼具有蛋白酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一方面，基于預(yù)測seqidno:1的核苷酸1至81是信號肽的signalp(尼爾森(nielsen)等人，1997，蛋白質(zhì)工程學10:1-6)]，該成熟多肽編碼序列是seqidno:1的核苷酸331至1263。
術(shù)語“cdna”意指可以通過從得自原核或真核細胞的成熟的、剪接的mrna分子反轉(zhuǎn)錄來制備的dna分子。cdna缺少通常存在于對應(yīng)基因組dna中的內(nèi)含子序列。早先的初始rna轉(zhuǎn)錄本是mrna的前體，其在呈現(xiàn)為成熟的剪接的mrna之前要經(jīng)一系列的步驟進行加工，包括剪接。
術(shù)語“編碼序列”意指直接指明其多肽產(chǎn)物的氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界一般由開放閱讀框架確定，該開放閱讀框架通常以atg起始密碼子或替代性起始密碼子(如gtg和ttg)開始，并且以終止密碼子(如taa、tag、和tga)結(jié)束。編碼序列可以是dna、cdna、合成或重組的多核苷酸。
術(shù)語“核酸構(gòu)建體”意指從天然存在的基因中分離的、或以自然界中不會另外存在的方式被修飾成包含核酸片段的、或合成的單鏈或雙鏈的核酸分子。當核酸構(gòu)建體包含表達本發(fā)明編碼序列所需要的控制序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語“表達盒”含義相同。
術(shù)語“可操作地連接”意指一種配置，其中控制序列相對于多核苷酸的編碼序列放置在一個適當位置處，這樣使得控制序列指引編碼序列的表達。
術(shù)語“控制序列”意指對于表達編碼本發(fā)明變體的多核苷酸所必需的所有組分。每個控制序列對于編碼變體的多核苷酸可以是天然的或外源的，或者彼此可以是天然的或外源的。此類控制序列包括但不限于：前導子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列以及轉(zhuǎn)錄終止子。至少，控制序列包括啟動子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。出于引入有利于將這些控制序列與編碼變體的多核苷酸的編碼區(qū)域連接的特異性限制酶切位點的目的，這些控制序列可以提供有接頭。
術(shù)語“表達”包括涉及變體產(chǎn)生的任何步驟，包括但不限于：轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾、以及分泌。
術(shù)語“表達載體”意指包括編碼變體的多核苷酸并可操作地連接至提供其表達的額外核苷酸的線性或環(huán)形dna分子。
術(shù)語“轉(zhuǎn)錄啟動子”用于指為促進特定基因的轉(zhuǎn)錄的一個dna區(qū)域的啟動子。轉(zhuǎn)錄啟動子典型地位于它們所調(diào)節(jié)的基因附近，在相同鏈上并且在上游(朝向有義鏈的5'區(qū)域)。
術(shù)語“轉(zhuǎn)錄終止子”用于指標記基因結(jié)束的基因序列區(qū)段或者用于轉(zhuǎn)錄的基因組dna上的操縱子。
術(shù)語“宿主細胞”意指對于用包括本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達載體進行的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導等是易感的任何細胞類型。術(shù)語“宿主細胞”涵蓋由于復(fù)制期間發(fā)生的突變而與親本細胞不一致的親本細胞的任何后代。
兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關(guān)性由參數(shù)“序列一致性”描述。出于本發(fā)明的目的，使用如在emboss包(emboss：歐洲分子生物學開放軟件套件，賴斯(rice)等人，2000，遺傳學趨勢(trendsgenet.)16:276-277)(優(yōu)選3.0.0版或更新版本)的尼德爾(needle)程序中所實施的尼德爾曼-翁施(needleman-wunsch)算法(尼德爾曼(needleman)和翁施(wunsch)，1970，分子生物學雜志(j.mol.biol.)48:443-453)來確定兩個氨基酸序列之間的序列一致性程度。所用的任選參數(shù)是空位開放罰分10、空位延伸罰分0.5，和eblosum62(blosum62的emboss版)替代矩陣。尼德爾標注的“最長的一致性”的輸出(使用-非簡化選項獲得)被用作百分比一致性，并且如下計算：
(一致的殘基x100)/(比對長度-比對中的空位總數(shù))
術(shù)語“高嚴格條件”意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標準dna印跡程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子dna和50％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。最后在65℃下使用2xssc、0.2％sds將載體材料清洗三次，每次15分鐘。
術(shù)語“非常高嚴格條件”意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標準dna印跡程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子dna和50％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。最后在70℃下使用2xssc、0.2％sds將載體材料清洗三次，每次15分鐘。
術(shù)語“中嚴格條件”意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標準dna印跡程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子dna和35％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。最后在55℃下使用2xssc、0.2％sds將載體材料清洗三次，每次15分鐘。
術(shù)語“中-高嚴格條件”意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標準dna印跡程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并變性的鮭精子dna和或者35％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。最后在60℃下使用2xssc、0.2％sds將載體材料清洗三次，每次15分鐘。
術(shù)語“低嚴格條件”意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標準dna印跡程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子dna和25％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。最后在50℃下使用2xssc、0.2％sds將載體材料清洗三次，每次15分鐘。
術(shù)語“非常低嚴格條件”意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標準dna印跡程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子dna和25％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。最后在45℃下使用2xssc、0.2％sds將載體材料清洗三次，每次15分鐘。
術(shù)語“改進的特性”意指與變體有關(guān)的特征，該變體相比于親本、或者相比于具有seqidno:3的蛋白酶、或者相比于具有與所述變體一致的氨基酸序列但是在一個或多個所述指定位置不具有改變的蛋白酶有所改進。此類改進的特性包括但不限于：清洗性能、蛋白酶活性、熱活性曲線、熱穩(wěn)定性、ph活性曲線、ph穩(wěn)定性、底物/輔因子特異性、改進的表面特性、底物特異性、產(chǎn)物特異性、增加的穩(wěn)定性、在儲存條件下的改進的穩(wěn)定性、以及化學穩(wěn)定性。
術(shù)語“改進的蛋白酶活性”在此被定義為例如通過增加的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化而通過增加的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化，相對于(或相比于)親本蛋白酶、或相比于具有seqidno:3的蛋白酶、或者相對于具有與所述變體一致的氨基酸序列但是在一個或多個所述指定位置處不具有改變的蛋白酶的活性展示活性改變的蛋白酶變體的改變的蛋白酶活性(如上文所定義的)。
術(shù)語“穩(wěn)定性”包括儲存穩(wěn)定性和在使用過程中的穩(wěn)定性，例如在清洗過程中的穩(wěn)定性，并且反應(yīng)了作為時間函數(shù)的根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶變體的穩(wěn)定性，例如當?shù)鞍酌缸凅w置于溶液中時，尤其是在洗滌劑溶液中時，能夠保留多少活性。該穩(wěn)定性受到許多因素的影響，例如ph、溫度、洗滌劑組合物，例如助洗劑、表面活性劑的量等。術(shù)語“改進的穩(wěn)定性”和“增加的穩(wěn)定性”包括“改進的化學穩(wěn)定性”、“洗滌劑穩(wěn)定性”或“改進的洗滌劑穩(wěn)定性”。
術(shù)語“改進的化學穩(wěn)定性”在此定義為變體酶在一種或多種化學品存在下表現(xiàn)為在孵育一段時間之后仍保留酶活性，這種或這些種化學品是天然存在的或是合成的，可降低親本酶的酶活性。改進的化學穩(wěn)定性還可使得這些變體在這類化學品存在下能更好地催化反應(yīng)。術(shù)語“改進的熱活性”意指變體在特定溫度下相對于親本或相對于具有seqidno:3的蛋白酶的溫度依賴的活性曲線展示改變的溫度依賴的活性曲線。
在一個實施例中，相比于該親本酶，根據(jù)本發(fā)明的這些蛋白酶變體具有改進的抑制劑結(jié)合。在一個具體實施例中，相比于親本，例如相比于seqidno3，本發(fā)明的這些蛋白酶變體具有改進的抑制劑的抑制作用。在另一個具體實施例中，相比于如在此材料與方法的實例2中所述的相同抑制劑對ty-145蛋白酶(seqidno3)的抑制，本發(fā)明的這些蛋白酶變體具有增加的蛋白酶抑制劑的抑制。
不可逆抑制劑導致酶的共價修飾，這樣使得它的活性被永久減少。本發(fā)明的這些蛋白酶變體與適用于本發(fā)明的這些蛋白酶變體的抑制劑之間的相互作用是優(yōu)選可逆的，因此通過去除該抑制劑將該抑制劑的效果逆轉(zhuǎn)。抑制劑常數(shù)ki是抑制劑的效力的指示，并且它是獲得最大抑制的一半所需的濃度。ki是抑制特定功能的有效性的量度。在這種情況下，抑制或穩(wěn)定本發(fā)明的蛋白酶變體的有效性。相比于親本蛋白酶，通過比對應(yīng)的親本蛋白酶由合適的抑制劑更多的抑制或穩(wěn)定，本發(fā)明的這些蛋白酶變體是改進的，因此根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶變體的ki比對應(yīng)于親本的ki更低。
術(shù)語“改進的清洗性能”在此被定義為根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶變體在相關(guān)測定(如amsa)測量時，相對于親本蛋白酶的清洗性能、相對于具有seqidno:3的蛋白酶或者相對于具有與所述變體一致的氨基酸序列但是在一個或多個所述指定位置不具有改變的蛋白酶展示改進的清洗性能。術(shù)語“清洗性能”包括在洗衣并且例如在手清洗和餐具清洗方面的清洗性能。清洗性能可以被量化，如在此的“改進的清洗性能”定義下所描述的。術(shù)語“低溫性能”在此被定義為如上述在20℃或低于20℃具有清洗性能的根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶變體。
除非另有說明，術(shù)語“洗滌劑組合物”包括顆?；蚍勰┬问降娜Щ蛑毓盖逑磩?，尤其是清潔洗滌劑；液體、凝膠或糊形式的全效清洗劑，尤其是所謂的重垢液(hdl)類型；液體細薄織物洗滌劑；手洗餐具清洗劑或輕垢餐具清洗劑，尤其是高泡沫型的那些；機洗餐具清洗劑，包括用于居家及機構(gòu)使用的多種片劑型、顆粒型、液體型以及沖洗助劑型；液體清潔和消毒劑，包括抗菌手洗類型、清潔棒、皂棒、漱口液、義齒清潔劑、汽車或地毯清潔劑、浴室清潔劑；洗發(fā)香波和護發(fā)素；沐浴凝膠、沐浴露；金屬清洗劑；以及清潔助劑，如漂白劑添加劑和“去污棒”或預(yù)處理類型。就預(yù)期用于弄臟的物體清潔的清洗介質(zhì)中的混合物而言，使用術(shù)語“洗滌劑組合物”和“洗滌劑配制品”。在一些實施例中，就洗滌織物和/或衣服而言，使用該術(shù)語(例如，“洗衣洗滌劑”)。在替代性實施例中，該術(shù)語是指如用于清潔餐具、刀具等的那些的其他洗滌劑(例如“餐具清洗洗滌劑”)。它并不意圖使本發(fā)明限于任何特定的洗滌劑配制品或組合物。術(shù)語“洗滌劑組合物”不旨在限于包含表面活性劑的組合物。其意圖是，除了根據(jù)本發(fā)明的變體以外，該術(shù)語涵蓋了可能包含以下各項的洗滌劑：例如表面活性劑、助洗劑、螯合劑(chelator)或螯合試劑(chelatingagent)、漂白系統(tǒng)或漂白組分、聚合物、織物調(diào)理劑、增泡劑、抑泡劑、染料、香料、晦暗抑制劑、光學增亮劑、殺細菌劑、殺真菌劑、污垢懸浮劑、防腐蝕劑、酶抑制劑或穩(wěn)定劑、酶激活劑、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、氧化還原酶、上藍劑和熒光染料、抗氧化劑、以及增溶劑。
術(shù)語“織物”涵蓋任何紡織材料。因此，其意圖是，該術(shù)語涵蓋衣服，連同織物、紗線、纖維、非編織材料、天然材料、合成材料以及任何其他紡織材料。
術(shù)語“紡織品”是指編織織物，連同適于轉(zhuǎn)化為或用作紗線、編織、針織以及非編織織物的短纖維和長絲。該術(shù)語涵蓋制自天然以及合成(例如，制造的)纖維的紗線。術(shù)語“紡織材料”是纖維、紗線中間體、紗線、織物以及制自纖維的產(chǎn)品(例如，衣服以及其他物品)的通用術(shù)語。
術(shù)語“非織物洗滌劑組合物”包括非紡織品表面洗滌劑組合物，包括但不限于用于硬表面清潔的組合物，如餐具清洗洗滌劑組合物(手動餐具清洗組合物)、口服洗滌劑組合物、義齒洗滌劑組合物以及個人清潔組合物。
術(shù)語“酶的有效量”是指在特定應(yīng)用中，例如在定義的洗滌劑組合物中達到所需的酶活性所必需的酶量。此類有效量可以由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員容易地確定并且基于多種因素，如使用的具體酶、清潔應(yīng)用、洗滌劑組合物的特定組成以及是否需要液體或干燥(例如，顆粒、棒)組合物等。術(shù)語蛋白酶變體的“有效量”是指例如在定義的洗滌劑組合物中達到希望水平的酶活性的在上文描述的蛋白酶變體量。
如在此使用的術(shù)語“水硬度”或“硬度”或“dh”或“°dh”是指德國硬度。一度被定義為10毫克氧化鈣/升水。
在此使用術(shù)語“相關(guān)清洗條件”指示在洗滌劑細分市場中實際用于家用的條件，具體是清洗溫度、時間、清洗力學、洗滌劑濃度、洗滌劑類型以及水硬度。
術(shù)語“輔料”意指針對希望的具體類型的洗滌劑組合物和產(chǎn)品形式(例如，液體、顆粒、粉末、棒、糊、噴霧、片劑、凝膠或泡沫組合物)選擇的任何液體、固體或氣體材料，這些材料也優(yōu)選地與用于該組合物中的蛋白酶變體酶可相容。在一些實施例中，顆粒組合物處于“壓縮”形式，而在其他實施例中，液體組合物處于“濃縮”形式。
如在此使用的術(shù)語“污漬去除酶”描述幫助從織物或硬表面去除污漬或污垢的酶。污漬去除酶對特定底物起作用，例如蛋白酶對蛋白質(zhì)起作用、淀粉酶對淀粉起作用、脂肪酶和角質(zhì)酶對脂質(zhì)(脂肪和油)起作用、果膠酶對果膠起作用并且半纖維素酶對半纖維素起作用。污漬通常是具有不同組分的復(fù)雜混合物的沉積物，這導致材料自身局部變色或這在物體上留下粘性表面，該粘性表面可以吸引溶解于清洗液中的污垢從而導致染污的區(qū)域變色。當酶對存在于污漬中的其特定底物起作用時，該酶降解或部分降解其底物，從而幫助在清洗過程中去除與底物相關(guān)的污垢和污漬組分。例如，當?shù)鞍酌缸饔糜谘何蹪n時它會降低血液中的蛋白質(zhì)組分。
在此背景下，術(shù)語“減少的量”意指在其他方面相同的條件下，該組分的量小于將用于參照過程中的量。
術(shù)語“低洗滌劑濃度”體系包括以下洗滌劑，其中在清洗水中存在少于約800ppm的洗滌劑組分。亞洲(例如，日本)洗滌劑典型地被認為是低洗滌劑濃度系統(tǒng)。
術(shù)語“中洗滌劑濃度”系統(tǒng)包括以下洗滌劑，其中在清洗水中存在約800ppm與約2000ppm之間的洗滌劑組分。北美洲洗滌劑通常被認為是中洗滌劑濃度系統(tǒng)。
術(shù)語“高洗滌劑濃度”系統(tǒng)包括以下洗滌劑，其中在清洗水中存在大于約2000ppm的洗滌劑組分。歐洲洗滌劑通常被認為是高洗滌劑濃度系統(tǒng)。
變體命名規(guī)則
出于本發(fā)明的目的，在seqidno:3中披露的成熟多肽用于確定另一種蛋白酶中相對應(yīng)的氨基酸殘基。將另一種蛋白酶的氨基酸序列與seqidno:3中披露的成熟多肽進行比對，并且基于該比對，使用如在emboss包(emboss：歐洲分子生物學開放軟件套件，賴斯等人，2000，遺傳學趨勢16:276-277)(優(yōu)選5.0.0版或更新版本)的尼德爾程序中所實施的尼德爾曼-翁施算法(尼德爾曼和翁施，1970，分子生物學雜志48:443-453)來確定與seqidno:3中所披露的成熟多肽中的任何氨基酸殘基相對應(yīng)的氨基酸位置編號。所使用的參數(shù)是空位開放罰分10，空位延伸罰分0.5，以及eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩陣。
可以通過使用若干計算機程序，使用其對應(yīng)默認參數(shù)比對多個多肽序列來確定在另一種蛋白酶中的對應(yīng)氨基酸殘基的鑒定，所述計算機程序包括但不限于muscle(通過對數(shù)預(yù)期的多種序列比較；版本3.5或更新版本；埃德加(edgar)，2004，核酸研究(nucleicacidsresearch)32:1792-1797)、mafft(版本6.857或更新版本；加藤(katoh)和庫馬(kuma)，2002，核酸研究30:3059-3066；加藤等人，2005，核酸研究33:511-518；加藤和都(toh)，2007，生物信息學(bioinformatics)23:372-374；加藤等人，2009，分子生物學方法(methodsinmolecularbiology)537:_39-64；加藤和都，2010，生物信息學26:_1899-1900)以及采用clustalw的embossemma(1.83或更新版本；湯姆斯(thompson)等人，1994，核酸研究(nucleicacidsres.)22:4673-4680)。
當其他酶與seqidno:3的成熟多肽相背離，這樣使得傳統(tǒng)的基于序列的比較方法不能檢測其相互關(guān)系時(林達爾(lindahl)和埃洛弗松(elofsson)，2000，分子生物學雜志295:613-615)，可使用其他成對序列比較算法。在基于序列的搜索中的更大靈敏度可以使用搜索程序來獲得，這些搜索程序利用多肽家族的概率表示(特征曲線)來搜索數(shù)據(jù)庫。例如，psi-blast程序通過迭代數(shù)據(jù)庫搜索過程來產(chǎn)生多個譜，并且能夠檢測遠距離同源物(阿特休爾(atschul)等人，1997，核酸研究25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族具有在蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中的一個或多個代表，可以實現(xiàn)甚至更高的敏感度。程序如genthreader(瓊斯(jones)，1999，分子生物學雜志287:797-815；麥古芬(mcguffin)和瓊斯，2003，生物信息學19:874-881)利用來自不同來源(psi-blast、二級結(jié)構(gòu)預(yù)測、結(jié)構(gòu)比對譜以及溶劑化勢)的信息作為預(yù)測查詢序列的結(jié)構(gòu)折疊的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入。類似地，高夫(gough)等人，2000，分子生物學雜志313:903-919的方法可以用于比對未知結(jié)構(gòu)的序列與存在于scop數(shù)據(jù)庫中的超家族模型。這些比對進而可以用于產(chǎn)生多肽的同源性模型，并且使用出于該目的而開發(fā)的多種工具可以評定此類模型的準確度。
對于已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，可獲取若干工具和資源以供找回(retrieve)和生成結(jié)構(gòu)比對。例如，蛋白的scop超家族已經(jīng)在結(jié)構(gòu)上進行比對，并且那些比對是可訪問的并且可下載的?？梢允褂枚喾N算法如距離比對矩陣(奧爾姆(holm)和桑德(sander)，1998，蛋白質(zhì)(proteins)33:88-96)或組合延伸(辛迪亞洛夫(shindyalov)和伯恩(bourne)，1998，蛋白質(zhì)工程11:739-747)比對兩種或更多種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并且這些算法的實施可以另外用于查詢具有感興趣結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，以便發(fā)現(xiàn)可能的結(jié)構(gòu)同源物(例如，奧爾姆和帕克(park)，2000，生物信息學16:566-567)。
在描述本發(fā)明的變體中，以下所述的命名法適于引用方便。采用公認的iupac單字母或三字母氨基酸縮寫。氨基酸位置表示為#1、#2等。
取代：對于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。因此，在位置#1處的絲氨酸被色氨酸取代表示為“ser#1trp”或“s#1w”。多個突變通過加號(“+”)或逗號(，)分開，例如，“ser#1trp+ser#2pro”或“s#1w，s#2p”，分別代表位置#1和#2的絲氨酸(s)取代為色氨酸(w)，以及脯氨酸(p)。如果在給定位置可以取代多于一種氨基酸，那么這些氨基酸被列于括號內(nèi)，如[x]或{x}。因此，如果根據(jù)本發(fā)明trp和lys兩者都可以被取代，代替占據(jù)位置#1的氨基酸，這被表示為x#1{w，k}或x#2[w，k]，其中x表明根據(jù)本發(fā)明的不同蛋白酶的氨基酸殘基可以是親本，例如像seqidno:3的蛋白酶或與其具有至少70％一致性的蛋白酶。因此，在一些情況下，這些變體表示為#1{w,k}或x#2p，表示待取代的氨基酸取決于親本而變化。由于將seqidno:3用于為根據(jù)本申請的取代編號，可以用存在于seqidno:3中的相對應(yīng)位置的氨基酸表示。
缺失：對于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，在位置#1處的絲氨酸的缺失表示為“ser#1*”或“s#1*”。多重缺失通過加號(“+”)或逗號分開，例如，“ser#1*+ser#2*”或“s#1*，s#2*”。
插入：另外的氨基酸殘基的插入，例如像在g#1之后插入賴氨酸可表示為：gly#1glylys或g#1gk?？商娲兀~外的氨基酸殘基的插入，如在g#1后插入賴氨酸可以表示為：*#1al。當插入多于一個的氨基酸殘基，例如像在#1后插入lys和ala時，這種插入可以表示為：gly#1glylysala或g#1gka。在此類情況下，還可以通過將小寫字母添加到在插入的氨基酸殘基前的氨基酸殘基位置號處來對插入的氨基酸殘基進行編號，在這個實例中：*#1ak*#1ba。
多種改變：包括多種改變的變體由加號(“+”)或由逗號(，)分開，例如“ser#1trp+ser#2pro”或者“s#1w，s#2p”代表在位置#1和#2處的絲氨酸分別如以上所描述的被色氨酸和脯氨酸取代。
不同改變：可以在一個位置上引入不同的改變時，這些不同的改變由逗號分開，例如“ser#1trp，lys”或s#1w，k代表在位置#1上的絲氨酸被色氨酸或賴氨酸取代。因此，“ser#1trp，lys+ser#2asp”表示以下變體：“ser#1trp+ser#2pro”、“ser#1lys+ser#2pro”、或s#1w，k+s#2d。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供了從芽孢桿菌屬獲得的新穎的蛋白酶變體，特別是芽孢桿菌屬ty-145。本發(fā)明的這些蛋白酶變體與具有seqidno3的多肽具有至少60％序列一致性，并且相比于具有seqidno:3的蛋白酶，包括至少一個氨基酸位置的取代，該至少一個氨基酸位置選自下組，該組由以下位置組成：70、111、114、144、145、146、146、150、151、176、178、182、184、224、以及240。本發(fā)明的一個實施例涉及蛋白酶變體，這些蛋白酶變體與seqidno3具有至少60％一致性，具有蛋白水解活性，并且包括一個或多個選自下組的取代，該組由以下各項組成：q70f、q70a、q70n、s111r、s111e、s111d、s114a、s114q、s144r、a145e、k146t、k146n、k146w、k146f、k146a、i150a、i150n、i150n、i150s,a151r、n176y、i178y、i178f、i178p、g182a、l184f、l184y、l184f、l184y、l184w、l184d、r224d、r224g、r224s、以及y240r，其中每個位置對應(yīng)于seqidno:3的多肽的位置。在優(yōu)選的實施例中，該蛋白酶變體包括一個或多個選自下組的取代，該組由以下各項組成：q70f、q70a、q70n、s111r、s111e、s111d、s114a、s114q、s144r、a145e、k146t、k146n、k146w、k146f、k146a、i150a、i150n、i150n、i150s,a151r、n176y、i178y、i178f、i178p、g182a、l184f、l184y、l184f、l184y、l184w、l184d、r224d、r224g、r224s、以及y240r，其中每個位置對應(yīng)于seqidno:3的多肽的位置，并且其中該變體與seqidno:3具有至少60％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6，但小于100％的序列一致性。
酶已經(jīng)長期應(yīng)用于清潔組合物中。酶是有益的，因為每種酶具有特異性底物特異性，其允許去除各種污漬。蛋白酶作用于蛋白質(zhì)污漬，并添加蛋白酶有助于去除包括蛋白質(zhì)如椰子、血液、和蛋污漬的污漬。然而，在清潔組合物中特別是在液體清潔組合物中通常遇到的蛋白酶的問題是通過在該組合物的其他酶和蛋白酶本身的蛋白酶的降解。這可能導致組合物中蛋白酶和其他酶的穩(wěn)定性降低，并且在清潔組合物中酶的總體性能降低。通過添加蛋白酶抑制劑或穩(wěn)定劑，可以改進酶在清潔組合物中的儲存穩(wěn)定性，這些蛋白酶抑制劑或穩(wěn)定劑是具有蛋白酶活性(例如絲氨酸蛋白酶活性)的可逆性抑制劑。因此，通過蛋白酶抑制劑(優(yōu)選地通過可逆蛋白酶抑制劑)穩(wěn)定蛋白酶是有利的。在本領(lǐng)域中已經(jīng)描述了若干蛋白酶抑制劑，并且包括蛋白酶抑制劑，如肽醛、硼酸(boricacid)或硼酸(boronicacid)；或這些的任一者的衍生物。一些抑制劑包括但不限于：硼酸或其衍生物；優(yōu)選地，苯硼酸或其衍生物。具有以下式的苯硼酸衍生物：
其中r選自下組，該組由以下各項組成：氫、羥基、c1-c6烷基、取代的c1-c6烷基、c1-c6烯基、以及取代的c1-c6烯基。優(yōu)選地，r是氫、ch3、ch3ch2、或ch3ch2ch2。該蛋白酶抑制劑(苯基硼酸衍生物)為4-甲?；?苯基-硼酸(4-fpba)。該蛋白酶抑制劑選自下組，該組由以下各項組成：
噻吩-2硼酸、噻吩-3硼酸、乙酰胺苯基硼酸、苯并呋喃-2硼酸、萘-1硼酸、萘-2硼酸、2-fpba、3-fbpa、4-fpba、1-噻蒽硼酸、4-二苯并呋喃硼酸、5-甲基噻吩-2硼酸、硫茚硼酸(thionaphtheneboronicacid)、呋喃-2硼酸、呋喃-3硼酸、4,4聯(lián)苯-二硼酸(4,4biphenyl-diborinicacid)、6-羥基-2-萘(6-hydroxy-2-naphtalene)、4-(甲硫基)苯基硼酸、4(三甲基-甲硅烷基)苯基硼酸、3-溴代噻吩硼酸、4-甲基噻吩硼酸、2-萘基硼酸、5-溴噻吩硼酸(5-bromothipheneboronicacid)、5-氯代噻吩硼酸、二甲基噻吩硼酸、2-溴代苯基硼酸、3-氯代苯基硼酸、3-甲氧基-2-噻吩、對-甲基-苯乙基硼酸、2-噻蒽硼酸、二苯并噻吩硼酸、4-羧基苯基硼酸、9-蒽基硼酸、3,5二氯苯基硼酸、二苯基硼酸酐、鄰-氯代苯基硼酸、對-氯代苯基硼酸、間-溴代苯基硼酸、對-溴代苯基硼酸、對-氟代苯基硼酸、對-甲苯基硼酸、鄰-甲苯基硼酸、辛基硼酸、1,3,5三甲基苯基硼酸、3-氯代-4-氟代苯基硼酸、3-氨基苯基硼酸、3,5-二-(三氟甲基)苯基硼酸、2,4二氯代苯基硼酸、4-甲氧基苯基硼酸。
適于作為清潔組合物中的蛋白酶抑制劑的其他硼酸衍生物描述于us4,963,655、us5,159,060、wo95/12655、wo95/29223、wo92/19707、wo94/04653、wo94/04654、us5442100、us5488157以及us5472628中。
該蛋白酶抑制劑還可以是一種具有式x-b1-b0-h的肽醛，其中這些基團具有以下意義：
a)h是氫；
b)b0是單個氨基酸殘基，具有l(wèi)-或d-構(gòu)型并且具有式：nh-chr’-co；
c)b1是一種單個氨基酸殘基；并且
d)x由一個或多個氨基酸殘基構(gòu)成(優(yōu)選一個或兩個)，任選地包括一種n-末端保護基團。nh-chr'-co(b0)是一種l-或d-氨基酸殘基，其中r'可以是一種脂肪族或芳香族側(cè)鏈，例如芳烷基，如芐基，其中r'可以是任選取代的。更具體地，該b0殘基可以是龐大的、中性的、極性、疏水性和/或芳香性的。實例是d-或l-型的tyr(對酪氨酸)、間酪氨酸、3,4-二羥基苯丙氨酸、phe、val、met、正纈氨酸(nva)、leu、ile或正亮氨酸(nle)。在上式x-b1-b0-h中，b1殘基可以是特別小、脂肪性的、疏水性的和/或中性的。實例是丙氨酸(ala)、半胱氨酸(cys)、甘氨酸(gly)、脯氨酸(pro)、絲氨酸(ser)、蘇氨酸(thr)、纈氨酸(val)、正纈氨酸(nva)和正亮氨酸(nle)，特別是丙氨酸、甘氨酸或纈氨酸。
具體地，x可以是一個或兩個氨基酸殘基，帶有一種任選的n-末端保護基團(即該化合物是一種三-或四肽醛，具有或沒有保護基團)。因此，x可以是b2、b3-b2、z-b2或z-b3-b2，其中b3和b2各自代表一個氨基酸殘基，并且z是一種n-末端保護基團。b2殘基可以是特別小、脂肪酸和/或中性，例如ala、gly、thr、arg、leu、phe或val。具體地，b3殘基可以是龐大的、疏水性的、中性和/或芳香性的，例如phe、tyr、trp、苯基甘氨酸、leu、val、nva、nle或ile。
n-末端保護基團z(如果存在的話)可以選自甲?；?、乙?；⒈郊柞；?、三氟乙酰基、氟甲氧基羰基、甲氧基琥珀?；⒎枷阕宓暮椭咀宓哪蛲楸Ｗo基團、芐氧基羰基(cbz)、叔丁氧羰基、金剛烷基氧基羰基、對甲氧芐基羰基(moz)、芐基(bn)、對甲氧芐基(pmb)或?qū)籽醣交?pmp)、甲氧羰基(moc)；甲氧基乙酰基(mac)；氨基甲酸甲酯或甲基氨基羰基/甲基脲基團。在具有一種保護基團的三肽醛(即x＝z-b2)的情況下，z優(yōu)選是一種小的脂肪族基團，例如甲?；?、乙酰基、氟甲氧基羰基、叔丁氧羰基、甲氧羰基(moc)；甲氧基乙?；?mac)；氨基甲酸甲酯或甲基氨基羰基/甲基脲基團。在具有保護基團的三肽醛(即，x＝z-b3-b2)的情況下，z優(yōu)選是一種龐大的芳香族基團，如苯甲?；?、芐氧基羰基、對甲氧芐基羰基(moz)、芐基(bn)、對甲氧芐基(pmb)或?qū)籽醣交?pmp)。
合適的肽醛描述于wo94/04651、wo95/25791、wo98/13458、wo98/13459、wo98/13460、wo98/13461、wo98/13461、wo98/13462、wo2007/141736、2007/145963、wo2009/118375、wo2010/055052以及wo2011/036153中。更具體地，該肽醛可以是cbz-ray-h、ac-gay-h、cbz-gay-h、cbz-gal-h、cbz-val-h、cbz-gaf-h、cbz-gav-h、cbz-ggy-h、cbz-ggf-h、cbz-rvy-h、cbz-lvy-h、ac-lgay-h、ac-fgay-h、ac-ygay-h、ac-fgal-h、ac-fgaf-h、ac-fgvy-h、ac-fgam-h、ac-wlvy-h、meo-co-val-h、menco-val-h、meo-co-fgal-h、meo-co-fgaf-h、meso2-fgal-h、meso2-val-h、phch2o(oh)(o)p-val-h、etso2-fgal-h、phch2so2-val-h、phch2o(oh)(o)p-lal-h、phch2o(oh)(o)p-fal-h、或meo(oh)(o)p-lgal-h。在這里，cbz是芐氧基羰基，me是甲基，et是乙基，ac是乙?；?，h是氫，并且其他字母表示由標準的單個字母標示(例如，f＝phe，y＝tyr，l＝leu)而指代的氨基酸殘基。
可替代地，該肽醛可以具有wo2011/036153中所描述的式：
p-o-(ai-x')n-an+1-q
其中q是氫、ch3、cx″3、chx″2、或ch2x″，其中x″是一種鹵素原子；其中一個x'是“雙n-封端基團”co、co-co、cs、cs-cs或cs-co，最優(yōu)選是urido(co)，并且其他x’為空，其中n＝1-10，優(yōu)選是2-5，最優(yōu)選是2，其中每個ai和an+1是具有以下結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基：
對于至x'＝-co-的右側(cè)的殘基而言，是-nh-r″-co-，或
對于至x'＝-co-的左側(cè)的殘基而言，是-co-cr″-nh-
其中r″是h-或可任選地取代的烷基或烷芳基基團，該烷芳基基團能可任選地包括雜原子并且能可任選地被連接至n原子，并且其中p是氫或任何c-末端保護基團。此類肽醛的實例包括α-mapi、β-mapi、f-脲-rvy-h、f-脲-ggy-h、f-脲-gaf-h、f-脲-gay-h、f-脲-gal-h、f-脲-ga-nva-h、f-脲-ga-nle-h、y-脲-rvy-h、y-脲-gay-h、f-cs-rvf-h、f-cs-rvy-h、f-cs-gay-h、抗痛素、ge20372a、ge20372b、糜蛋白酶抑素a、糜蛋白酶抑素b、以及糜蛋白酶抑素c。肽醛的另外的實例披露于特此通過引用而結(jié)合的wo2010/055052和wo2009/118375、wo94/04651、wo98/13459、wo98/13461、wo98/13462、wo2007/145963中。
可替代地，對于肽醛，該蛋白酶抑制劑可以是具有式x-b1-nh-chr-choh-so3m的次硫酸鹽加合物，其中x、b1和r如以上定義，并且m是h或一種堿性金屬，優(yōu)選na或k。
該肽醛可以通過與重亞硫酸鈉的反應(yīng)被轉(zhuǎn)化成水溶性次硫酸鹽加合物，如在教科書，例如馬奇，j.(march,j.)高等有機化學(advancedorganicchemistry)，第四版，威利國際科學出版社(wiley-interscience)，美國1992，第895頁中所描述。
該重亞硫酸鹽加合物的水溶液可以通過將對應(yīng)的肽醛與重亞硫酸鈉(亞硫酸氫鈉，nahso3)、重亞硫酸鉀(khso3)的水溶液通過已知方法進行反應(yīng)來制備，例如在wo98/47523；us6,500,802；us5,436,229；美國化學會志(j.am.chem.soc.)(1978)100，1228；有機合成文集(org.synth.,coll.)第7卷：361中所描述。
上述肽醛(或次硫酸鹽加合物)與該蛋白酶的摩爾比可以是至少1:1或1.5:1，并且它可以小于1000:1，更優(yōu)選小于500:1，甚至更優(yōu)選從100:1至2:1或從20:1至2:1，或最優(yōu)選，摩爾比是從10:1至2:1。
甲酸鹽(例如，甲酸鈉)和甲酸也示出了作為蛋白酶活性抑制劑的良好作用。甲酸鹽可以與上述蛋白酶抑制劑協(xié)同使用，如在wo2013/004635中所示。甲酸鹽以至少0.1％w/w或0.5％w/w，例如至少1.0％、至少1.2％或至少1.5％的量存在于該洗滌劑組合物中。該鹽的量值典型地低于5％w/w、低于4％或低于3％。
wo2007/141736、wo2007/145963、和wo2007/145964披露了可逆的肽蛋白酶抑制劑穩(wěn)定液體洗滌劑組合物的用途。us2003/157088描述了包含用抑制劑穩(wěn)定的酶的組合物。
本發(fā)明提供了由蛋白酶抑制劑(如上文提及的那些)穩(wěn)定的蛋白酶變體。
因此，本發(fā)明的具體實施例涉及親本蛋白酶的變體，其中蛋白酶變體與seqidno3具有至少60％一致性，該變體具有蛋白水解活性，并且包括一個或多個選自下組的取代，該組由以下各項組成：q70f、q70a、q70n、s111r、s111e、s111d、s114a、s114q、s144r、a145e、k146t、k146n、k146w、k146f、k146a、i150a、i150n、i150n、i150s,a151r、n176y、i178y、i178f、i178p、g182a、l184f、l184y、l184f、l184y、l184w、l184d、r224d、r224g、r224s、以及y240r，其中每個位置對應(yīng)于seqidno:3的多肽的位置，并且其中相比于親本或相比于seqidno3，這些蛋白酶變體具有增強的與抑制劑的結(jié)合。如在此實例2中所述來測量抑制劑的結(jié)合。本發(fā)明的另一個具體實施例涉及親本蛋白酶的變體，其中蛋白酶變體與seqidno3具有至少60％一致性，該變體具有蛋白水解活性，并且包括一個或多個選自下組的取代，該組由以下各項組成：q70f、q70a、q70n、s111r、s111e、s111d、s114a、s114q、s144r、a145e、k146t、k146n、k146w、k146f、k146a、i150a、i150n、i150n、i150s,a151r、n176y、i178y、i178f、i178p、g182a、l184f、l184y、l184f、l184y、l184w、l184d、r224d、r224g、r224s、以及y240r，其中每個位置對應(yīng)于seqidno:3的位置，并且其中相比于親本或相比于seqidno3，這些變體具有增強的與抑制劑的結(jié)合，當如在實例2中所述測量時。
在一些另外的實施例中，本發(fā)明涉及與seqidno3具有至少60％序列一致性的蛋白酶變體，并且當如在實例2中測試這些蛋白酶變體時，這些變體具有ki低于1，如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9；如在0.1和0.5之間、或在0.2和0.7之間、或在0.3和0.9之間、或在0.4和0.9之間。
本發(fā)明的另一個具體實施例涉及親本蛋白酶的變體，其中蛋白酶變體與seqidno3具有至少60％一致性，該變體具有蛋白水解活性，并且包括一個或多個選自下組的取代，該組由以下各項組成：q70f、q70a、q70n、s111r、s111e、s111d、s114a、s114q、s144r、a145e、k146t、k146n、k146w、k146f、k146a、i150a、i150n、i150n、i150s,a151r、n176y、i178y、i178f、i178p、g182a、l184f、l184y、l184f、l184y、l184w、l184d、r224d、r224g、r224s、以及y240r，其中每個位置對應(yīng)于seqidno:3的多肽的位置，并且其中當如在實例2中所述進行測量時，相比于具有seqidno4或seqidno5的蛋白酶，這些蛋白酶變體具有增強的與抑制劑的結(jié)合。
在另一方面，根據(jù)本發(fā)明該蛋白酶變體包括在對應(yīng)于位置70、111、114、144、145、146、146、150、151、176、178、182、184、224、以及240的一個或多個(例如，若干個)位置處的取代。在另一方面，變體包括在對應(yīng)于任何位置70、111、114、144、145、146、146、150、151、176、178、182、184、224、以及240的兩個位置處的改變。在另一方面，變體包括在對應(yīng)于任何位置70、111、114、144、145、146、146、150、151、176、178、182、184、224、以及240的三個位置處的改變。在另一方面，變體包括在對應(yīng)于位置70、111、114、144、145、146、146、150、151、176、178、182、184、224、以及240的每個位置處的改變。
在另一方面，該蛋白酶變體包括在對應(yīng)于seqidno:3的位置114的位置處的取代，或由其組成。在另一方面，在對應(yīng)于位置114的位置處的氨基酸被gln取代。在一方面，該變體包括具有seqidno:3的多肽的取代s114q，或由其組成。
在另一方面，該蛋白酶變體包括在對應(yīng)于seqidno:3的位置146的位置處的取代，或由其組成。在另一方面，在對應(yīng)于位置146的位置處的氨基酸被asn、trp、phe、或ala，如被asn、如被trp、如被phe、或如被ala取代。在一方面，該變體包括具有seqidno:3的多肽的取代k146n，或由其組成。在一方面，該變體包括具有seqidno:3的多肽的取代k146w，或由其組成。在一方面，該變體包括具有seqidno:3的多肽的取代k146f，或由其組成。在一方面，該變體包括具有seqidno:3的多肽的取代k146a，或由其組成。
在另一方面，該蛋白酶變體包括在對應(yīng)于seqidno:3的位置150的位置處的取代，或由其組成。在另一方面，在對應(yīng)于位置150的位置處的氨基酸被ala、asn、或arg，如被ala，如被asn或如被arg取代。在一方面，該變體包括具有seqidno:3的多肽的取代i150a，或由其組成。在一方面，該變體包括具有seqidno:3的多肽的取代i150n，或由其組成。在一方面，該變體包括具有seqidno:3的多肽的取代i150r，或由其組成。
在另一方面，該蛋白酶變體包括在對應(yīng)于seqidno:3的位置151的位置處的取代，或由其組成。在另一方面，在對應(yīng)于位置151的位置處的氨基酸被arg取代。在一方面，該變體包括具有seqidno:3的多肽的取代s151r，或由其組成。
在另一方面，該蛋白酶變體包括在對應(yīng)于seqidno:3的位置176的位置處的取代，或由其組成。在另一方面，在對應(yīng)于位置176的位置處的氨基酸被tyr取代。在一方面，該變體包括具有seqidno:3的多肽的取代n176y或由其組成。
在另一方面，該蛋白酶變體包括在對應(yīng)于seqidno:3的位置178的位置處的取代，或由其組成。在另一方面，在對應(yīng)于位置178的位置處的氨基酸被tyr、phe、或pro，如被tyr、如被phe、或如被pro取代。在一方面，該變體包括具有seqidno:3的多肽的取代i178y，或由其組成。在一方面，該變體包括具有seqidno:3的多肽的取代i178f，或由其組成。在一方面，該變體包括具有seqidno:3的多肽的取代i178p，或由其組成。
在另一方面，該蛋白酶變體包括在對應(yīng)于seqidno:3的位置184的位置處的取代，或由其組成。在另一方面，在對應(yīng)于位置184的位置處的氨基酸被phe、tyr、trp、或asp，如被phe、如被tyr、如被trp，或如被asp取代。在一方面，該變體包括具有seqidno:3的多肽的取代l184f，或由其組成。在一方面，該變體包括具有seqidno:3的多肽的取代l184y，或由其組成。在一方面，該變體包括具有seqidno:3的多肽的取代l184w，或由其組成。在一方面，該變體包括具有seqidno:3的多肽的取代l184d，或由其組成。
在另一方面，該蛋白酶變體包括在對應(yīng)于seqidno:3的位置224的位置處的取代，或由其組成。在另一方面，在對應(yīng)于位置224的位置處的氨基酸被asp、gly、或ser，如被asp、如被gly、或如被ser取代。在一方面，該變體包括具有seqidno:3的多肽的取代r224d，或由其組成。在一方面，該變體包括具有seqidno:3的多肽的取代r224g，或由其組成。在一方面，該變體包括具有seqidno:3的多肽的取代r224s，或由其組成。
在另一方面，根據(jù)本發(fā)明的這些蛋白酶變體包括一個或多個(例如若干個)選自下組的取代，該組由以下各項組成：q70f、q70a、q70n、s111r、s111e、s111d、s114a、s114q、s144r、a145e、k146t、k146n、k146w、k146f、k146a、i150a、i150n、i150n、i150s,a151r、n176y、i178y、i178f、i178p、g182a、l184f、l184y、l184f、l184y、l184w、l184d、r224d、r224g、r224s、以及y240r，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代s114q，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代q70f，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代q70a，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代q70n，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代s111r，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代s111e，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代s111d，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代s114a，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代k146t，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代s144r，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代a145e，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代i150n，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代i150s，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代g182a，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代l184f，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代l184y，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代y240r，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代k146t，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代k146n，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代k146w，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代k146f，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代k146a，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代i150a，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代i150n，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代a151r，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代n176y，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代i178y，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代i178f，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代i178p，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代l184f，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代f184y，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:4或seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代l184w，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代l184d，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代r224d，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代r224g，或由其組成。
本發(fā)明的一方面涉及蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中親本蛋白酶是具有seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5的多肽，或與具有seqidno:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于該親本蛋白酶，該蛋白酶變體包括取代r224s，或由其組成。
本發(fā)明還涉及清潔組合物，如包括本發(fā)明的蛋白酶變體的洗滌劑組合物。在一個實施例中，該清潔組合物為液體或粉末洗衣洗滌劑，適合例如在高溫和/或高ph下的清洗，如在或高于40℃和/或在或高于ph8下。在一個實施例中，該清潔組合物為液體或粉末洗衣洗滌劑，適合例如在低溫和/或低ph下的清洗，如在或低于20℃和/或ph6下。該洗滌劑也可被配制成單位劑量洗滌劑和/或任選具有最少的水或無水的致密洗滌劑。該洗滌劑也可以是餐具清洗洗滌劑，它優(yōu)選是無磷的。該清潔組合物可以進一步包括至少一種額外的酶，如碳水化合物活性酶，像碳水化物酶、果膠酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、或蛋白酶如金屬蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、氧化酶，例如漆酶、和/或過氧化物酶。
通常，用于制造變體的蛋白酶內(nèi)的位置是如下的那些位置，其中如相比于未改變的蛋白酶，至少一個取代會導致展示出改進的特征的變體。這些變體在一個或多個(例如，若干個)其他位置上可以進一步包括一個或多個另外的改變。在特別優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明的蛋白酶變體進一步包括在對應(yīng)于seqidno:3的位置171、173、175、179或180的一個或多個位置的取代，其中該變體與seqidno:3具有至少60％序列一致性，并且該變體具有蛋白酶活性。在甚至更優(yōu)選的實施例中，在對應(yīng)于seqidno:3的位置171的位置的氨基酸選自下組，該組由以下各項組成：trp、lys、glu、asn和/或在對應(yīng)于seqidno:3的位置173的位置的氨基酸是pro，和/或在對應(yīng)于seqidno:3的位置175的位置的氨基酸是ala、val、pro，和/或在對應(yīng)于seqidno:3的位置179的位置的氨基酸選自下組，該組由以下各項組成：cys、val、gln、ser、thr、glu、his、lys、met、asn、tyr和ala和/或在對應(yīng)于seqidno:3的位置180的位置的氨基酸是tyr。在另一個優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的蛋白酶變體進一步包括在對應(yīng)于seqidno:3的位置171、173、175、179或180的兩個或更多個位置的取代，其中該變體與seqidno:3具有至少60％且小于100％序列一致性，并且該變體在對應(yīng)于位置171、173、175、179和180中任一個的兩個位置具有蛋白酶活性。在本發(fā)明優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的這些變體包括如在seqidno4中示出的突變s173p+s175p。在另一個優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的蛋白酶變體包括如在seqidno5中示出的突變s173p+s175p+f180y。
在本發(fā)明的具體實施例中，相比于seqidno3，本發(fā)明的蛋白酶變體包括以下取代：
s114q、s173p、s175p、f180y
k146t、s173p、s175p、f180y
k146n、s173p、s175p、f180y
k146w、s173p、s175p、f180y
k146f、s173p、s175p、f180y
k146a、s173p、s175p、f180y
i150a、s173p、s175p、f180y
i150n、s173p、s175p、f180y
s27k、i150n、s171n、s173p、g174r、s175p、f180y、q198e、t297p
s27k、k146p、s148r、a151r、s171n、s173p、g174r、s175p、f180y、q198e、n199k、t297p
s173p、s175p、n176y、f180y
s173p、s175p、i178y、f180y
s173p、s175p、i178f、f180y
s173p、s175p、i178f、f180y
s173p、s175p、i178p、f180y
s173p、s175p、f180y、l184f
s173p、s175p、f180y、l184f
s27k、s171n、s173p、g174r、s175p、f180y、l184f、q198e、t297p
s27k、i121v、s171n、s173p、g174r、s175p、f180y、l184f、q198e、t297p
s27k、q70n、g107n、i121v、e127q、s173p、s175p、f180y、l184f、q198e、t297p
s27k、s173p、g174k、s175p、f180y、l184f、q198e、n199k、t297p
s27k、s173p、g174k、s175p、f180y、l184f、q198e、n199r、t297p
s173p、s175p、f180y、l184y
s27k、s171n、s173p、g174r、s175p、f180y、l184y、q198e、t297p
s27k、s173p、g174k、s175p、f180y、l184y、q198e、n199k、t297p
s27k、s173p、g174k、s175p、f180y、l184y、q197k、q198e、t297p
s173p、s175p、f180y、l184w
s27k、s171n、s173p、g174r、s175p、f180y、l184w、q198e、t297p
s173p、s175p、f180y、l184d
s173p、s175p、f180y、r224d
s173p、s175p、f180y、r224g
s27k、s171n、s173p、g174r、s175p、f180y、q198e、n199k、r224g、t297p
s173p、s175p、f180y、r224s
s27k、i121v、s171n、s173p、g174r、s175p、f180y、q198e、r224s、t297p
s27k、s171d、s173p、g174r、s175p、g182a、l184f、q198e、n199k、r224g、t297p
s27k、s171d、s173p、g174r、s175p、g182a、l184f、q198e、n199k、t297p
s27k、s171n、s173p、g174r、s175p、f180y、g182a、l184f、q198e、n199k、r224g、t297p
s27k、s171n、s173p、g174r、s175p、f180y、g182a、l184f、q198e、n199k、t297p
s27k、v162t、s173p、g174k、s175p、f180y、l184f、q197k、q198e、t297p
s27k、v162t、s173p、g174k、s175p、f180y、q197k、q198e、t297p
q70f
q70a
q70n
s111r
s111e
s111d
s114a
s144r
a145e
i150n
i150s
g182a
l184f
l184y
r224g或
y240r
這些變體在一個或多個(例如，若干個)其他位置上可進一步包括一個或多個另外的改變。氨基酸改變可以具有次要性質(zhì)，即不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-5個氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端蛋氨酸殘基；位于氨基或羧基末端的至多20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或另一功能來促進純化的小延伸，如多組氨酸序列、抗原性表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
保守取代的實例在下組之內(nèi)：堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸以及甲硫氨酸)。一般不會改變比活性的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的并且例如由h.諾伊拉特(neurath)和r.l.希爾(hill)，1979，在蛋白質(zhì)(theproteins)，學術(shù)出版社(academicpress)，紐約中描述。常見的取代包括：ala/ser、val/ile、asp/glu、asn/gln、thr/ser、ala/gly、ala/thr、ser/asn、ala/val、ser/gly、tyr/phe、ala/pro、lys/arg、asp/asn、glu/gln、leu/ile、leu/val、ala/glu以及asp/gly。
可替代地，這些氨基酸改變具有這樣一種性質(zhì)：改變多肽的物理化學特性。例如，氨基酸改變可以改進多肽的熱穩(wěn)定性、改變底物特異性、改變最適ph等。
可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，如定點誘變或丙氨酸掃描誘變鑒定多肽中的必需氨基酸(康寧漢(cunningham)和韋爾斯(wells)，1989，科學(science)244:1081-1085)。在后一項技術(shù)中，在該分子中的每個殘基處引入單個丙氨酸突變，并且對所得變體分子的蛋白酶活性進行測試以鑒定對于該分子的活性至關(guān)重要的氨基酸殘基。還參見希爾頓(hilton)等人，1996，生物化學雜志(j.biol.chem.)271:4699-4708。酶或其他生物學相互作用的活性位點還可通過對結(jié)構(gòu)的物理分析來確定，如由下述技術(shù)確定：核磁共振、晶體學、電子衍射、或光親和標記，連同對推定的接觸位點氨基酸進行突變。參見，例如德沃斯(devos)等人，1992，科學255:306-312；史密斯(smith)等人，1992，分子生物學雜志224:899-904；烏樂達維爾(wlodaver)等人，1992，歐洲生物化學學會聯(lián)盟通訊(febslett.)309:59-64。還可以從與相關(guān)多肽的比對來推斷必需氨基酸的身份。對于ty-145蛋白酶(seqidno:3)，包括氨基酸d35、h72以及s251的催化三聯(lián)體對于酶的蛋白酶活性是必需的。
在實施例中，相比于親本酶，該變體具有改進的催化活性。
兩個氨基酸序列之間的同源性是在出于本發(fā)明的目的由參數(shù)“一致性”描述的背景下，兩個氨基酸序列之間的一致性程度是使用如上所述的尼德曼-翁施算法來確定的。來自程序的結(jié)果除了氨基酸比對之外還計算兩個序列之間的“百分比一致性”。
基于本描述，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，鑒別可以根據(jù)本發(fā)明來修飾的適當同源蛋白酶是相當簡單的。
基本上同源的親本蛋白酶變體可以具有一個或多個(若干個)氨基酸取代、缺失和/或插入，在此背景下，術(shù)語“一個或多個”與術(shù)語“若干個”是互換使用的。這些改變優(yōu)選地具有微小的性質(zhì)，即，不會顯著地影響蛋白或多肽的三維折疊或活性的如上所述的保守氨基酸取代以及其他取代；小的缺失，典型的是1至約30個氨基酸的缺失；以及小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端蛋氨酸殘基、包括最多約20-25個殘基的小接頭肽、或有利于純化的小延伸(親和標記物)，如聚組氨酸序列(tract)或蛋白a(尼爾遜(nilsson)等人，1985，歐洲分子生物學學會雜志(emboj.)4:1075；尼爾遜等人，1991，酶學方法(methodsenzymol.)198:3。通常還參見福特(ford)等人，1991，蛋白表達與純化(proteinexpressionandpurification)2:95-107。
盡管如上所述的這些改變優(yōu)選地具有微小的性質(zhì)，這類改變還可以是實質(zhì)性的，如均作為氨基末端或羧基末端延伸的最多達300個氨基酸或更多個氨基酸的較大的多肽的融合。
親本蛋白酶可以包括seqidno:3的氨基酸序列或其等位基因變體、或其具有蛋白酶活性的片段，或由其組成。在一方面，該親本蛋白酶包括seqidno:3的氨基酸序列或由其組成。
該親本蛋白酶可以是(a)與seqidno:3的多肽具有至少60％序列一致性的一種多肽；(b)由在中或高嚴格條件下與(i)seqidno:1的成熟多肽編碼序列、(ii)編碼seqidno:2的成熟多肽的序列、或者(iii)(i)或(ii)的全長互補體雜交的多核苷酸編碼的一種多肽；或者(c)由與seqidno:1的成熟多肽編碼序列具有至少60％序列一致性的多核苷酸編碼的一種多肽。
在一方面，該親本蛋白酶與具有seqidno:3的多肽具有至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，或至少99％序列一致性。
在一方面，該親本蛋白酶的氨基酸序列與具有seqidno:3的多肽相差不多于15個氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15個氨基酸。
在另一方面，該親本包括seqidno:3的氨基酸序列，或由其組成。在另一方面，該親本包括seqidno:2的氨基酸1至311，或由其組成。
在一方面，該親本蛋白酶的氨基酸序列與具有seqidno:4的多肽相差不多于15個氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15個氨基酸。
在另一方面，該親本包括seqidno:4的氨基酸序列，或由其組成。
在一方面，該親本蛋白酶的氨基酸序列與具有seqidno:5的多肽相差不多于15個氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15個氨基酸。
在另一方面，該親本包括seqidno:5的氨基酸序列，或由其組成。
在另一方面，該親本蛋白酶是由在非常低嚴格條件下、低嚴格條件下、中嚴格條件下、或高嚴格條件下、或非常高嚴格條件下與(i)seqidno:1的成熟多肽編碼序列、(ii)編碼seqidno:2的成熟多肽的序列、或者(iii)(i)或(ii)的全長補體雜交的多核苷酸編碼的(薩姆布魯克(sambrook)等人，1989，分子克隆，實驗室手冊(molecularcloning,alaboratorymanual)，第2版，冷泉港，紐約)。
可以使用seqidno:1的多核苷酸或其子序列、連同seqidno:3的多肽或其片段來設(shè)計核酸探針以根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法來鑒別并克隆對來自不同屬或物種的菌株的親本進行編碼的dna。具體地，可以遵循標準dna印跡程序，使用此類探針與感興趣的細胞的基因組dna或cdna雜交，以便鑒定和分離其中的對應(yīng)基因。此類探針可以明顯短于完整序列，但是長度應(yīng)為至少15，例如至少25、至少35、或至少70個核苷酸。優(yōu)選地，該核酸探針長度是至少100個核苷酸，例如長度至少200個核苷酸、至少300個核苷酸、至少400個核苷酸、至少500個核苷酸、至少600個核苷酸、至少700個核苷酸、至少800個核苷酸、或至少900個核苷酸。dna和rna探針兩者都可使用。典型地將探針進行標記(例如，用32p、3h、35s、生物素、或抗生物素蛋白)，以檢測對應(yīng)的基因。本發(fā)明涵蓋此類探針。
可以針對與上文所述的探針雜交并編碼親本的dna來篩選由這類其他菌株制備的基因組dna或cdna文庫。來自這類其他菌株的基因組dna或其他dna可以通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或其他分離技術(shù)來分離?？梢詫碜晕膸斓膁na或分離的dna轉(zhuǎn)移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其他適合的載體材料并且固定于其上。為了鑒定與seqidno:1雜交的克隆或dna或其子序列，在dna印跡中使用載體材料。
出于本發(fā)明的目的，雜交指示該多核苷酸與和(i)seqidno:1；(ii)seqidno:1的成熟多肽編碼序列；(iii)編碼seqidno:2的成熟多肽的序列；(iv)其全長補體；或者(v)其子序列相對應(yīng)的標記的核酸探針在非常低至非常高嚴格條件下雜交?？梢允褂美鐇-射線膠片或本領(lǐng)域已知的任何其他檢測手段來檢測在這些條件下核酸探針雜交的分子。
在一方面，該核酸探針是seqidno:1的成熟多肽編碼序列。在另一方面，該核苷酸探針是seqidno:1的80至1140個核苷酸長片段，例如90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或1100個核苷酸長。在另一方面，該核酸探針是編碼seqidno:2的多肽、其成熟多肽、或其片段的多核苷酸。在另一方面，該核酸探針是seqidno:1或編碼seqidno:2的成熟多肽的序列。
在另一個實施例中，該親本由多核苷酸編碼，該多核苷酸與seqidno:1的成熟多肽編碼序列或編碼seqidno:2的成熟多肽的序列具有至少60％，如至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％，至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
該多肽可以是雜合多肽，其中一種多肽的區(qū)域在另一種多肽的區(qū)域的n-末端或c-末端處融合。
該親本可以是融合多肽或可切割融合多肽，其中另一種多肽在本發(fā)明多肽的n-末端或c-末端處融合。通過將編碼另一種多肽的多核苷酸與本發(fā)明多核苷酸融合而產(chǎn)生融合多肽。用于產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且包括連接編碼多肽的編碼序列，這樣使得它們在框內(nèi)，并且融合多肽的表達處于相同的啟動子和終止子的控制之下。也可以使用內(nèi)含肽技術(shù)構(gòu)建融合多肽，其中以翻譯后方式產(chǎn)生融合多肽(庫珀(cooper)等人，1993，歐洲分子生物學學會雜志12:2575-2583；道森(dawson)等人，1994，科學266:776-779)。
融合多肽可以進一步包括兩種多肽之間的切割位點。在融合蛋白分泌之時，該位點被切割，從而釋放出這兩種多肽。切割位點的實例包括但不限于在以下文獻中披露的位點：馬丁(martin)等人，2003，工業(yè)微生物學生物技術(shù)雜志(j.ind.microbiol.biotechnol.)3:568-576；斯維特娜(svetina)等人，2000，生物技術(shù)雜志(j.biotechnol.)76:245-251；拉斯馬森-威爾遜(rasmussen-wilson)等人，1997，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(appl.environ.microbiol.)63:3488-3493；沃德(ward)等人，1995，生物技術(shù)(biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(contreras)等人，1991，生物技術(shù)9:378-381；伊頓(eaton)等人，1986，生物化學(biochemistry)25:505-512；collins-racie等人，1995，生物技術(shù)13:982-987；卡特(carter)等人，1989，蛋白質(zhì)：結(jié)構(gòu)、功能和遺傳學(proteins:structure,function,andgenetics)6:240-248；和史蒂文斯(stevens)，2003，世界藥物發(fā)現(xiàn)(drugdiscoveryworld)4:35-48。
該親本可以從任何屬的有機體中獲得。出于本發(fā)明的目的，如在此結(jié)合一種給定的來源使用的術(shù)語“從...中獲得”應(yīng)意指由多核苷酸編碼的親本是由該來源或者由已經(jīng)插入來自該來源的多核苷酸的菌株產(chǎn)生的。在一方面，該親本是胞外分泌的。
該親本可以是細菌蛋白酶。例如，該親本可以是一種革蘭氏陽性細菌多肽，如芽孢桿菌屬、梭菌屬、腸球菌屬、土芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、海洋芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、或鏈霉菌屬蛋白酶；或一種革蘭氏陰性細菌多肽，如彎曲桿菌屬、大腸桿菌、黃桿菌屬、梭桿菌屬、螺桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬、假單胞菌屬、沙門菌屬或脲原體屬蛋白酶。
在一方面，該親本是嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、或蘇云金芽孢桿菌蛋白酶。
在一方面，該親本是芽胞桿菌屬物種蛋白酶，例如具有seqidno:3的蛋白酶或seqidno:2的成熟多肽。
這些物種的菌株可以容易地在許多培養(yǎng)物保藏中心為公眾所獲得，如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc)、德國微生物菌種保藏中心(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh，dsmz)、荷蘭菌種保藏中心(centraalbureauvoorschimmelcultures，cbs)以及美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心北方地區(qū)研究中心(nrrl)。
可以使用以上提到的探針從其他來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物或直接從自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)獲得的dna樣品鑒定和獲得該親本。用于直接地從自然生活環(huán)境分離微生物和dna的技術(shù)是本領(lǐng)域中熟知的。然后可通過類似地篩選另一種微生物或混合dna樣品的基因組dna或cdna文庫來獲得編碼親本的多核苷酸。一旦已經(jīng)用探針檢測到編碼親本的多核苷酸，則可以通過利用對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說已知的技術(shù)來分離或克隆該多核苷酸(參見例如，薩姆布魯克等人，1989，見上文)。
變體的制備
本發(fā)明還涉及用于獲得相比于seqidno3具有至少一種改進的特性的蛋白酶變體的方法，該方法包括
a)向與seqidno:3具有至少60％一致性的親本蛋白酶中引入一個或多個以下取代：q70f、q70a、q70n、s111r、s111e、s111d、s114a、s114q、s144r、a145e、k146t、k146n、k146w、k146f、k146a、i150a、i150n、i150n、i150s,a151r、n176y、i178y、i178f、i178p、g182a、l184f、l184y、l184f、l184y、l184w、l184d、r224d、r224g、r224s、以及y240r，其中該變體具有與seqidno:3至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％一致的氨基酸序列；并且
b)回收該變體。
可以使用本領(lǐng)域已知的任何誘變程序來制備這些變體，如定點誘變、合成基因構(gòu)建、半合成基因構(gòu)建、隨機誘變、改組等。
本發(fā)明的這些變體還可以通過程序，如以下提到的那些來制備。
定點誘變是在編碼該親本的多核苷酸中的一個或多個限定位點處引入一個或多個(例如，若干個)突變的技術(shù)。
通過使用涉及包含所希望的突變的寡核苷酸引物的pcr可以體外實現(xiàn)定點誘變。也可以通過盒式誘變進行體外定點誘變，所述盒式誘變涉及由限制酶在包括編碼親本的多核苷酸的質(zhì)粒中的位點處切割并且隨后將包含突變的寡核苷酸連接在多核苷酸中。通常，消化該質(zhì)粒與該寡核苷酸的限制酶是相同的，以允許該質(zhì)粒的粘性端以及插入片段彼此連接。參見，例如，謝勒(scherer)和戴維斯(davis)，1979，美國國家科學院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)76:4949-4955；和巴頓(barton)等人，1990，核酸研究18:7349-4966。
還可以通過本領(lǐng)域已知的方法體內(nèi)實現(xiàn)定點誘變。參見，例如，美國專利申請公開號2004/0171154；斯托西(storici)等人，2001，自然生物技術(shù)(naturebiotechnol.)19:773-776；凱倫(kren)等人，1998，自然醫(yī)學(nat.med.)4:285-290；以及卡里薩諾(calissano)和曼奇諾(macino)，1996，真菌遺傳學通訊(fungalgenet.newslett.)43:15-16。
合成基因構(gòu)建需要體外合成設(shè)計的多核苷酸分子以編碼感興趣的多肽。基因合成可以利用多種技術(shù)來進行，如由田(tian)等人(2004，自然(nature)432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技術(shù)、以及在光可編程的微流芯片上合成并組裝寡核苷酸的類似技術(shù)。
可以做出單個或多個氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用已知的誘變、重組和/或改組方法進行測試，隨后進行有關(guān)篩選程序，如由里德哈爾-奧爾森(reidhaar-olson)和薩奧爾(sauer)，1988，科學241:53-57；博維(bowie)和薩奧爾，1989，美國科學院院刊86:2152-2156；wo95/17413；或wo95/22625所披露的那些。其他可以使用的方法包括易錯pcr、噬菌體展示(例如洛曼(lowman)等人，1991，生物化學30:10832-10837；us5,223,409；wo92/06204)以及區(qū)域定向誘變(德比什爾(derbyshire)等人，1986，基因(gene)46:145；內(nèi)爾(ner)等人，1988，dna7:127)。
誘變/改組方法可以與高通量自動化篩選方法組合以檢測由宿主細胞表達的克隆的誘變多肽的活性(奈斯(ness)等人，1999，自然生物技術(shù)17:893-896)。可以從宿主細胞回收編碼活性多肽的誘變的dna分子，并且使用本領(lǐng)域內(nèi)標準方法快速測序。這些方法允許迅速確定多肽中單個氨基酸殘基的重要性。
通過組合合成基因構(gòu)建、和/或定點誘變、和/或隨機誘變、和/或改組的多個方面來實現(xiàn)半合成基因構(gòu)建。半合成構(gòu)建典型地是利用合成的多核苷酸片段的過程結(jié)合pcr技術(shù)。因此，基因的限定的區(qū)域可以從頭合成，而其他區(qū)域可以使用位點特異性誘變引物來擴增，而還有其他區(qū)域可以經(jīng)受易錯pcr或非易錯pcr擴增。然后可以對多核苷酸子序列進行改組。
多核苷酸
本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的變體的分離的多核苷酸。
核酸構(gòu)建體
本發(fā)明還涉及包括編碼本發(fā)明的變體的、可操作地連接至一個或多個控制序列上的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，該一個或多個控制序列在與控制序列相容的條件下指導編碼序列在適合的宿主細胞中的表達。
可以按多種方式來操縱該多核苷酸以提供變體的表達。取決于表達載體，在多核苷酸插入載體之前對其進行操縱可以是令人希望的或必需的。用于利用重組dna方法修飾多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。
控制序列可以是啟動子，即由宿主細胞識別用于表達該多核苷酸的多核苷酸。啟動子包含介導該變體的表達的轉(zhuǎn)錄控制序列。該啟動子可以是在宿主細胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性的任何多核苷酸，包括變體、截短型及雜合型啟動子，并且可以由編碼與該宿主細胞同源或異源的細胞外或細胞內(nèi)多肽的基因獲得。
用于在細菌宿主細胞中指導本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄的適合啟動子的實例是從以下基因中獲得的啟動子：解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyq)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyl)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penp)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽糖淀粉酶基因(amym)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacb)、枯草芽孢桿菌xyla和xylb基因、蘇云金芽孢桿菌cryiiia基因(阿蓋塞(agaisse)和勒爾克呂(lereclus)，1994，分子微生物學(molecularmicrobiology)13:97-107)、大腸桿菌lac操縱子、大腸桿菌trc啟動子(埃貢(egon)等人，1988，基因(gene)69:301-315)、天藍鏈霉菌瓊脂水解酶基因(daga)、以及原核β-內(nèi)酰胺酶基因(維拉-卡馬洛夫(villa-kamaroff)等人，1978，美國國家科學院院刊75:3727-3731)以及tac啟動子(德波爾(deboer)等人，1983，美國國家科學院院刊80:21-25)。其他啟動子描述在吉爾伯特(gilbert)等人，1980，科學美國人(scientificamerican)242:74-94的“來自重組細菌的有用蛋白質(zhì)(usefulproteinsfromrecombinantbacteria)”；以及在薩姆布魯克(sambrook)等人，1989，同上。串聯(lián)啟動子的實例披露在wo99/43835中。
控制序列還可以是由宿主細胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止子。該終止子序列被可操作地連接至編碼該變體的多核苷酸的3’末端?？梢允褂迷谒拗骷毎芯哂泄δ艿娜魏谓K止子。
細菌宿主細胞的優(yōu)選終止子從以下各項的基因獲得：克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprh)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(amyl)、和大腸桿菌核糖體rna(rrnb)。
控制序列還可以是啟動子下游和基因的編碼序列上游的mrna穩(wěn)定子區(qū)域，其增加該基因的表達。
適合的mrna穩(wěn)定子區(qū)域的實例是從以下獲得的：蘇云金芽孢桿菌cryiiia基因(wo94/25612)和枯草芽孢桿菌sp82基因(化(hue)等人，1995，細菌學雜志(journalofbacteriology)177:3465-3471)。
該控制序列還可以是信號肽編碼區(qū)域，編碼與變體的n-端連接的信號肽，并且引導該變體進入細胞的分泌通路。多核苷酸的編碼序列的5’-端可以固有地包含信號肽編碼序列，該信號肽編碼序列在翻譯閱讀框中與編碼該變體的編碼序列的區(qū)段天然地連接在一起?？商娲兀幋a序列的5’-端可以包含對編碼序列是外源的信號肽編碼序列。在編碼序列不天然地包含信號肽編碼序列的情況下，可能需要外源信號肽編碼序列?？商娲?，外源信號肽編碼序列可以簡單地替換天然信號肽編碼序列，以便增強變體的分泌。然而，可以使用指導表達的變體進入宿主細胞的分泌通路的任何信號肽編碼序列。
用于細菌宿主細胞的有效信號肽編碼序列是從芽孢桿菌ncib11837生麥芽糖淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌鈣-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprt、nprs、nprm)和枯草芽孢桿菌prsa的基因獲得的信號肽編碼序列。其他信號序列由西莫寧(simonen)和帕爾瓦(palva)，1993，微生物評論(microbiologicalreviews)57:109-137描述。
該控制序列還可以是編碼位于變體的n-末端處的前肽的一個前肽編碼序列。生成的多肽被稱為前體酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情況下被稱為酶原(zymogen))。多肽原通常是無活性的并且可以通過催化切割或自身催化切割來自多肽原的前肽而轉(zhuǎn)化為活性多肽?？梢詮目莶菅挎邨U菌堿性蛋白酶(apre)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprt)、嗜熱毀絲霉漆酶(wo95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和釀酒酵母α-因子的基因獲得前肽編碼序列。
在信號肽序列和前肽序列二者都存在的情況下，該前肽序列定位成緊鄰該變體的n-末端并且該信號肽序列定位成緊鄰該前肽序列的n-末端。
還令人希望的可以是添加相對于宿主細胞的生長來調(diào)節(jié)該變體的表達的調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實例是響應(yīng)于化學或物理刺激而引起基因的表達開啟或關(guān)閉的那些，包括調(diào)控化合物的存在。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac、以及trp操縱子系統(tǒng)。
表達載體
本發(fā)明還涉及包括編碼本發(fā)明的變體的多核苷酸、啟動子、以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號的重組表達載體。不同的核苷酸和控制序列可以連接在一起以產(chǎn)生重組表達載體，這一重組表達載體可以包括一個或多個便利的限制酶切位點以允許在這些位點處插入或取代編碼該變體的多核苷酸?？商娲?，該多核苷酸可以通過將該多核苷酸或包括該多核苷酸的核酸構(gòu)建體插入用于表達的適當載體中來表達。在產(chǎn)生該表達載體時，該編碼序列位于該載體中，這樣使得該編碼序列與該用于表達的適當控制序列可操作地連接。
重組表達載體可以是可便利地經(jīng)受重組dna程序并且可引起多核苷酸表達的任何載體(例如，質(zhì)粒或病毒)。載體的選擇將典型地取決于該載體與有待引入該載體的宿主細胞的相容性。該載體可以是一種線性的或閉合的環(huán)形質(zhì)粒。
載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實體存在的載體，其復(fù)制獨立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微染色體或人工染色體。該載體可包含任何用以保證自我復(fù)制的要素?？商娲?，該載體可以是這樣載體，當它被引入該宿主細胞中時，被整合到基因組中并且與其中已整合了它的染色體一起復(fù)制。此外，可以使用單一載體或質(zhì)?；騼蓚€或更多個載體或質(zhì)粒(這些載體或質(zhì)粒共同包含待引入到宿主細胞的基因組中的總dna)或轉(zhuǎn)座子。
該載體優(yōu)選包含一個或多個允許方便地選擇轉(zhuǎn)化細胞、轉(zhuǎn)染細胞、轉(zhuǎn)導細胞等細胞的選擇性標志物。選擇性標志物是這樣一種基因，該基因的產(chǎn)物提供了殺生物劑抗性或病毒抗性、重金屬抗性、營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)型等。
細菌性選擇性標志物的實例是地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌dal基因，或賦予抗生素抗性(如氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大觀霉素或四環(huán)素抗性)的標志物。
載體優(yōu)選包含允許載體整合到宿主細胞的基因組中或載體在細胞中獨立于基因組自主復(fù)制的元件。
對于整合到該宿主細胞基因組中，該載體可以依靠編碼該變體的多核苷酸序列或用于通過同源或非同源重組整合到該基因組中的該載體的任何其他元件?？商娲?，該載體可以包含用于指導通過同源重組而整合到宿主細胞基因組中的染色體中的精確位置的另外的多核苷酸。為了增加在精確位置整合的可能性，這些整合的元件應(yīng)包含足夠數(shù)量的核酸，如100至10,000個堿基對、400至10,000個堿基對、以及800至10,000個堿基對，這些堿基對與對應(yīng)的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重組的可能性。這些整合元件可以是與宿主細胞的基因組中的靶序列同源的任何序列。此外，這些整合元件可以是非編碼多核苷酸或編碼多核苷酸。在另一方面，該載體可以通過非同源重組整合到宿主細胞的基因組中。
對于自主復(fù)制，該載體可以進一步包括使該載體能夠在所討論的宿主細胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點。復(fù)制起點可以是在細胞中起作用的介導自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子。術(shù)語“復(fù)制起點”或“質(zhì)粒復(fù)制子”意指使質(zhì)?；蜉d體能夠在體內(nèi)復(fù)制的多核苷酸。
細菌復(fù)制起點的實例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pbr322、puc19、pacyc177、以及pacyc184的復(fù)制起點，以及允許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pub110、pe194、pta1060、以及pamβ1的復(fù)制起點。
可以將本發(fā)明的多核苷酸的多于一個的拷貝插入到宿主細胞中以增加變體的產(chǎn)生。通過將序列的至少一個另外的拷貝整合到宿主細胞基因組中或通過包括一個與該多核苷酸一起的可擴增的選擇性標志物基因可以獲得多核苷酸的增加的拷貝數(shù)目，其中通過在適當?shù)倪x擇性試劑的存在下培養(yǎng)細胞可以選擇包含選擇性標志物基因的經(jīng)擴增的拷貝的細胞、以及由此該多核苷酸的另外的拷貝。
用于連接以上所述的元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達載體的程序是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知的(參見，例如，薩姆布魯克等人，1989，同上)。
宿主細胞
本發(fā)明還涉及重組宿主細胞，這些重組宿主細胞包括編碼本發(fā)明的變體的、可操作地連接至一個或多個控制序列的多核苷酸，該一個或多個控制序列指導本發(fā)明的變體的產(chǎn)生。將包括多核苷酸的構(gòu)建體或載體引入宿主細胞中，這樣使得該構(gòu)建體或載體被維持作為染色體整合體或作為自主復(fù)制的染色體外載體，如早前所述。術(shù)語“宿主細胞”涵蓋由于復(fù)制過程中發(fā)生的突變與親本細胞不同的親本細胞的任何后代。宿主細胞的選擇在很大程度上將取決于編碼該變體的基因及其來源。
宿主細胞可以是在重組產(chǎn)生變體中有用的任何細胞，例如原核細胞或真核細胞。
原核宿主細胞可以是任何革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌。革蘭氏陽性細菌包括但不限于：芽孢桿菌屬、梭菌屬、腸球菌屬、土芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、海洋芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、以及鏈霉菌屬。革蘭氏陰性細菌包括但不限于：彎曲桿菌屬、大腸桿菌、黃桿菌菌、梭桿菌菌、螺桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、以及脲原體屬。
細菌宿主細胞可以是任何芽孢桿菌屬細胞，包括但不限于：嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌以及蘇云金芽孢桿菌細胞。
細菌宿主細胞還可以是任何鏈球菌屬細胞，包括但不限于：似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌以及馬鏈球菌獸瘟亞種細胞。
細菌宿主細胞還可以是任何鏈霉菌屬細胞，包括但不限于：不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍鏈霉菌、灰色鏈霉菌、以及淺青紫鏈霉菌細胞。
將dna引入芽孢桿菌屬細胞中可通過以下來實現(xiàn)：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見例如，張(chang)和科恩(cohen)，1979，分子遺傳學與基因組學(mol.gen.genet.)168:111-115)、感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化(參見，例如，楊格(young)和斯皮宰曾(spizizen)，1961，細菌學雜志(j.bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(dubnau)以及大衛(wèi)杜夫-阿貝爾森(davidoff-abelson)，1971，分子生物學雜志56:209-221)、電穿孔(參見，例如，茂川(shigekawa)和道爾(dower)，1988，生物技術(shù)(biotechniques)6:742-751)、或者接合(參見，例如克勒(koehler)和索恩(thorne)，1987，細菌學雜志169:5271-5278)。將dna引入大腸桿菌細胞中可通過以下來實現(xiàn)：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，哈納汗(hanahan)，1983，分子生物學雜志(j.mol.biol.)166:557-580)或電穿孔(參見，例如，道爾(dower)等人，1988，核酸研究16:6127-6145)。將dna引入鏈霉菌屬細胞中可通過以下來實現(xiàn)：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔(參見例如，貢(gong)等人，2004，葉線形微生物學(foliamicrobiol.)(布拉格)49:399-405)、接合(參見例如，馬佐迪耶(mazodier)等人，1989，細菌學雜志171:3583-3585)、或轉(zhuǎn)導(參見例如，伯克(burke)等人，2001，美國國家科學院院刊98:6289-6294)。將dna引入假單孢菌屬細胞中可通過以下來實現(xiàn)：電穿孔(參見，例如，蔡(choi)等人，2006，微生物學方法雜志(j.microbiol.methods)64:391-397)或接合(參見，例如，皮內(nèi)多(pinedo)和斯梅茨(smets)，2005，應(yīng)用與環(huán)境微生物學71:51-57)。將dna引入鏈球菌屬細胞中可通過以下來實現(xiàn)：天然感受態(tài)(參見例如，佩里(perry)和藏滿(kuramitsu)，1981，感染與免疫(infect.immun.)32:1295-1297)、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，凱特(catt)和喬力克(jollick)，1991，微生物學(microbios)68:189-207)、電穿孔(參見，例如，巴克利(buckley)等人，1999，應(yīng)用與環(huán)境微生物學65:3800-3804)、或者接合(參見，例如，克萊威爾(clewell)，1981，微生物學評論(microbiol.rev.)45:409-436)。然而，可以使用本領(lǐng)域已知的用于將dna引入宿主細胞中的任何方法。
生產(chǎn)方法
本發(fā)明還涉及產(chǎn)生一種變體的方法，這些方法包括：(a)在適合于該變體的表達的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞；并且(b)回收該變體。
使用本領(lǐng)域已知的方法在適合于產(chǎn)生該變體的一種營養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)這些宿主細胞。例如，可以通過搖瓶培養(yǎng)，或者在適合的介質(zhì)中并在允許該變體表達和/或分離的條件下在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中進行小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)發(fā)酵、分批發(fā)酵、分批給料發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)該細胞。該培養(yǎng)是使用本領(lǐng)域中已知的程序，在一種適合營養(yǎng)介質(zhì)中發(fā)生，該介質(zhì)包括碳和氮來源及無機鹽。適合的介質(zhì)可從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公開的組成(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)制備。如果該變體被分泌到該營養(yǎng)介質(zhì)中，則該變體可直接從該介質(zhì)中回收。如果該變體沒有分泌，則它可從細胞裂解液中回收。
使用本領(lǐng)域已知的對具有蛋白酶活性的變體特異的方法可以檢測該變體。這些檢測方法包括但不限于：特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶測定來確定該變體的活性。
可以使用本領(lǐng)域已知的方法來回收該變體。例如，可以通過多種常規(guī)程序從該營養(yǎng)介質(zhì)中回收該變體，這些常規(guī)程序包括但不限于：收集、離心、過濾、萃取、噴霧干燥、蒸發(fā)、或沉淀。
可以通過本領(lǐng)域中已知的多種程序來純化變體以獲得基本上純的變體，這些程序包括但不限于：色譜法(例如，離子交換色譜、親和色譜、疏水作用色譜、色譜聚焦、以及尺寸排阻色譜)、電泳程序(例如，制備型等電點聚焦)、差別溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、sds-page、或萃取(參見，例如，蛋白質(zhì)純化(proteinpurification)，詹森(janson)和賴登(ryden)編輯，vch出版社(vchpublishers)，紐約，1989)。
在可替代的方面，沒有回收該變體，而是將表達該變體的本發(fā)明的宿主細胞用作該變體的來源。
組合物
除了酶，這些洗滌劑組合物可以包括其他組分。另外的組分的選擇在普通技術(shù)人員技術(shù)內(nèi)并且包括常規(guī)成分，包括以下列出的示例性、非限制性組分。對于織物護理，組分的選擇可以包括以下考慮：有待清潔的織物的類型、弄臟的類型和/或程度、進行清潔時的溫度、以及洗滌劑產(chǎn)品的配制。盡管根據(jù)具體的功能性對以下提及的組分由通用標題進行分類，但是這并不被解釋為限制，因為如將被普通技術(shù)人員所理解，一種組分可以包括另外的功能性。
本發(fā)明的洗滌劑組合物
可以將本發(fā)明的蛋白酶變體以對應(yīng)于以下各項的量添加至一種洗滌劑組合物中：每升清洗液0.001-100mg的蛋白質(zhì)，如0.01-100mg的蛋白質(zhì)，優(yōu)選是0.005-50mg的蛋白質(zhì)，更優(yōu)選是0.01-25mg的蛋白質(zhì)，甚至更優(yōu)選是0.05-10mg的蛋白質(zhì)，最優(yōu)選是0.05-5mg的蛋白質(zhì)，并且甚至最優(yōu)選是0.01-1mg的蛋白質(zhì)。
洗滌劑組合物可以包括一種或多種表面活性劑，它們可以是陰離子的和/或陽離子的和/或非離子的和/或半極性的和/或兼性離子的，或其混合物。在具體實施例中，洗滌劑組合物包括一種或多種非離子型表面活性劑和一種或多種陰離子表面活性劑的混合物。這種或這些表面活性劑典型地以按重量計從約0.1％至60％的水平存在，如約1％至約40％、或約3％至約20％、或約3％至約10％。基于所希望的清潔應(yīng)用來選擇這種或這些表面活性劑，并且包括本領(lǐng)域中已知的任何常規(guī)表面活性劑。可以利用本領(lǐng)域中已知的用于在洗滌劑中使用的任何表面活性劑。
當被包括在其中時，洗滌劑將通常包含按重量計從約1％至約40％，如從約5％至約30％(包括從約5％至約15％)、或從約20％至約25％的陰離子表面活性劑。陰離子表面活性劑的非限制性實例包括硫酸鹽和磺酸鹽，具體地，直鏈烷基苯磺酸鹽(las)、las的異構(gòu)體、支鏈烷基苯磺酸鹽(babs)、苯基鏈烷磺酸鹽、α-烯烴磺酸鹽(aos)、烯烴磺酸鹽、鏈烯烴磺酸鹽、鏈烷-2,3-二基雙(硫酸鹽)、羥基鏈烷磺酸鹽以及二磺酸鹽、烷基硫酸鹽(as)(如十二烷基硫酸鈉(sds))、脂肪醇硫酸鹽(fas)、伯醇硫酸鹽(pas)、醇醚硫酸鹽(aes或aeos或fes、也被稱為醇乙氧基硫酸鹽或脂肪醇醚硫酸鹽)、仲鏈烷磺酸鹽(sas)、石蠟烴磺酸鹽(ps)、酯磺酸鹽、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-sfme或ses)(包括甲酯磺酸鹽(mes))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(dtsa)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和單酯、及其組合。
當被包括在其中時，洗滌劑將通常包含按重量計從約1％至約40％的陽離子表面活性劑。陽離子表面活性劑的非限制性實例包括烷基二甲基乙醇季胺(admeaq)、溴化十六烷基三甲基銨(ctab)、二甲基雙十八烷基氯化銨(dsdmac)、以及烷基芐基二甲基銨、以及其組合、烷基季銨化合物、烷氧基化的季銨(aqa)。
當被包括在其中時，洗滌劑將通常包含按重量計從約0.2％至約40％的非離子型表面活性劑，例如從約0.5％至約30％，特別是從約1％至約20％、從約3％至約10％，如從約3％至約5％、或從約8％至約12％。非離子型表面活性劑的非限制性實例包括醇乙氧基化物(ae或aeo)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(pfa)，烷氧基化的脂肪酸烷基酯(如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)，烷基酚乙氧基化物(ape)，壬基酚乙氧基化物(npe)，烷基多糖苷(apg)，烷氧基化胺，脂肪酸單乙醇酰胺(fam)，脂肪酸二乙醇酰胺(fada)，乙氧基化的脂肪酸單乙醇酰胺(efam)，丙氧基化的脂肪酸單乙醇酰胺(pfam)，多羥基烷基脂肪酸酰胺，或葡萄糖胺的n-?；鵱-烷基衍生物(葡糖酰胺(ga)，或脂肪酸葡糖酰胺(faga))，連同在span和tween商品名下可獲得的產(chǎn)品及其組合。
當被包括在其中時，洗滌劑將通常包含按重量計從約1％至約40％的半極性表面活性劑。半極性表面活性劑的非限制性實例包括氧化胺(ao)(如烷基二甲基氧化胺)、n-(椰油基烷基)-n,n-二甲基氧化胺和n-(牛油-烷基)-n,n-雙(2-羥乙基)氧化胺、脂肪酸鏈烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸鏈烷醇酰胺及其組合。
當被包括在其中時，洗滌劑將通常包含按重量計從約1％至約40％的兼性離子表面活性劑。兼性離子表面活性劑的非限制性實例包括甜菜堿、烷基二甲基甜菜堿、以及磺基甜菜堿、及其組合。
本發(fā)明的這些組合物還可以包括這樣一種助水溶劑，它是將疏水化合物溶解于水溶液中(或相反地，將極性物質(zhì)溶劑于非極性環(huán)境中)的化合物。典型地，助水溶劑同時具有親水的和疏水的特征(如從表面活性劑已知的所謂兩親特性)；然而助水溶劑的分子結(jié)構(gòu)一般并不有利于自發(fā)自聚集，參見例如霍奇登(hodgdon)和卡勒(kaler)(2007)的綜述，膠體&界面科學新見(currentopinionincolloid&interfacescience)，12:121-128。助水溶劑并不顯示臨界濃度，高于該濃度就會發(fā)生如對表面活性劑而言所發(fā)現(xiàn)的自聚集以及脂質(zhì)形成膠束、薄層或其他明確定義的中間相。相反，許多助水溶劑示出連續(xù)類型的聚集過程，其中聚集物的大小隨著濃度增加而增長。然而，很多助水溶劑改變了包含極性和非極性特征的物質(zhì)的系統(tǒng)(包括水、油、表面活性劑、和聚合物的混合物)的相行為、穩(wěn)定性、和膠體特性。助水溶劑常規(guī)地在從藥學、個人護理、食品到技術(shù)應(yīng)用的各個產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用。助水溶劑在洗滌劑組合物中的使用允許例如更濃的表面活性劑配制品(如在通過去除水而壓縮液體洗滌劑的過程中)而不引起不希望的現(xiàn)象，如相分離或高粘度。
該洗滌劑可以包含按重量計0％-5％，如約0.5％至約5％，或約3％至約5％的助水溶劑?？梢岳帽绢I(lǐng)域中已知的用于在洗滌劑中使用的任何助水溶劑。助水溶劑的非限制性實例包括苯磺酸鈉、對甲苯磺酸鈉(sts)、二甲苯磺酸鈉(sxs)、枯烯磺酸鈉(scs)、傘花烴磺酸鈉、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羥基萘甲酸鈉、羥基萘磺酸鈉、乙基己基磺酸鈉及其組合。
洗滌劑組合物可以包含按重量計約0％-65％，如約5％至約50％的洗滌劑助洗劑或共助洗劑，或其混合物。在餐具清洗洗滌劑中，助洗劑的水平典型地是40％-65％，特別是50％-65％。助洗劑和/或共助洗劑可以具體是形成具有ca和mg的水溶性絡(luò)合物的螫合劑?？梢岳帽绢I(lǐng)域中已知的用于在洗衣、adw和硬表面清潔洗滌劑中使用的任何助洗劑和/或共助洗劑。助洗劑的非限制性例子包括沸石、二磷酸鹽(焦磷酸鹽)、三磷酸鹽如三磷酸鈉(stp或stpp)、碳酸鹽如碳酸鈉、可溶性硅酸鹽如偏硅酸鈉、層狀硅酸鹽(例如來自hoechst的sks-6)、乙醇胺如2-氨基乙-1-醇(mea)、亞氨基二乙醇(dea)和2,2’,2”-次氮基三乙醇(tea)、和羧甲基菊粉(cmi)、及其組合。
洗滌劑組合物還可以包含按重量計0％-65％，如約5％至約40％的洗滌劑共助洗劑或其混合物。洗滌劑組合物可以只包括共助洗劑，或結(jié)合助洗劑，例如沸石助洗劑。共助洗劑的非限制性實例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，如聚(丙烯酸)(paa)或共聚(丙烯酸/馬來酸)(paa/pma)。另外的非限制性實例包括檸檬酸鹽，螯合劑，如氨基羧酸鹽、氨基多羧酸鹽和磷酸鹽，以及烷基-或烯基琥珀酸。另外的具體實例包括2,2',2”-次氨基三乙酸(nta)、乙二胺四乙酸(edta)、二亞乙基三胺五乙酸(dtpa)、亞氨二琥珀酸(ids)、乙二胺-n,n'-二琥珀酸(edds)、甲基甘氨酸二乙酸(mgda)、谷氨酸-n,n-二乙酸(glda)、1-羥乙烷-1,1-二基雙(膦酸)(hedp)、乙二胺四(亞甲基)四(膦酸)(edtmpa)、二亞乙基三胺五(亞甲基)五(膦酸)(dtpmpa)、n-(2-羥乙基)亞氨基二乙酸(edg)、天冬氨酸-n-單乙酸(asma)、天冬氨酸-n,n-二乙酸(asda)、天冬氨酸-n-單丙酸(asmp)、亞氨二琥珀酸(ida)、n-(2-磺甲基)天冬氨酸(smas)、n-(2-磺乙基)天冬氨酸(seas)、n-(2-磺甲基)谷氨酸(smgl)、n-(2-磺乙基)谷氨酸(segl)、n-甲基亞氨基二乙酸(mida)、α-丙氨酸-n,n-二乙酸(α-alda)、絲氨酸-n,n-二乙酸(seda)、異絲氨酸-n,n-二乙酸(isda)、苯丙氨酸-n,n-二乙酸(phda)、鄰氨基苯甲酸-n,n-二乙酸(anda)、對氨基苯磺酸-n、n-二乙酸(slda)、氨基乙磺酸-n、n-二乙酸(tuda)和磺甲基-n,n-二乙酸(smda)、n-(羥乙基)-亞乙基二胺三乙酸(hedta)、二乙醇甘氨酸(deg)、二亞乙基三胺五(亞甲基膦酸)(dtpmp)、氨基三(亞甲基膦酸)(atmp)、及其組合和鹽。其他示例性助洗劑和/或共助洗劑描述于例如wo09/102854、us5977053中。
洗滌劑可以包含按重量計0％-10％，如大約1％至大約5％的漂白系統(tǒng)?？梢岳帽绢I(lǐng)域中已知的用于在洗衣、adw和硬表面清潔洗滌劑中使用的任何漂白系統(tǒng)。適合的漂白系統(tǒng)組分包括漂白催化劑、光漂白劑、漂白活化劑、過氧化氫源如過碳酸鈉和過硼酸鈉、預(yù)成型過酸及其混合物。適合的預(yù)成型過酸包括但不限于：過氧羧酸及鹽、過碳酸及鹽、過亞氨酸(perimidicacid)及鹽、過氧單硫酸及鹽(例如過硫酸氫鉀(oxone(r))，及其混合物。漂白系統(tǒng)的非限制性實例包括基于過氧化物的漂白系統(tǒng)，這些系統(tǒng)可以包括例如與過酸形成漂白活化劑組合的無機鹽，包括堿金屬鹽，如過硼酸鹽(通常是單水合物或四水合物)、過碳酸鹽、過硫酸鹽、過磷酸鹽、過硅酸鹽的鈉鹽。漂白活化劑在此意指與過氧化物漂白劑(像過氧化氫)反應(yīng)以形成過酸的化合物。以此方式形成的過酸構(gòu)成活化的漂白劑。有待在此使用的適合漂白活化劑包括屬于酯酰胺、酰亞胺或酸酐類別的那些。適合的實例是四乙酰乙二胺(taed)、3,5,5三甲基己酰氧基苯磺酸鈉、雙過氧化十二酸、4-(十二烷基氧基)苯磺酸鹽(lobs)、4-(癸?；趸?苯磺酸鹽、4-(癸?；趸?苯甲酸鹽(dobs)、4-(3,5,5-三甲基己酰氧基)苯磺酸鹽(isonobs)、四乙酰乙二胺(taed)和4-(壬酰氧基)苯磺酸鹽(nobs)，和/或wo98/17767中披露的那些。感興趣的漂白活化劑的具體家族披露于ep624154中并且該家族中特別優(yōu)選的是乙酰檸檬酸三乙酯(atc)。atc或短鏈甘油三酸酯(像特雷森(triacin))具有以下優(yōu)點，它是環(huán)境友好的，因為它最終降解為檸檬酸和醇。此外，乙酰檸檬酸三乙酯和三乙酸甘油酯在儲存時在產(chǎn)品中具有良好的水解穩(wěn)定性，并且它是有效的漂白活化劑。最后，atc為洗衣添加劑提供一種良好的助洗能力?？商娲兀紫到y(tǒng)可以包括例如酰胺、酰亞胺、或砜型的過氧酸。漂白系統(tǒng)還可以包括過酸，如6-(酞?；被?過己酸(pap)。漂白系統(tǒng)還可以包括漂白催化劑。在一些實施例中，漂白組分可以是選自下組的有機催化劑，該組由以下各項組成：具有下式的有機催化劑：
(iii)及其混合物；其中每個r1獨立地是包含從9至24個碳的支鏈烷基基團或包含從11至24個碳的直鏈烷基基團，優(yōu)選地，每個r1獨立地是包含從9至18個碳的支鏈烷基基團或包含從11至18個碳的直鏈烷基基團，更優(yōu)選地，每個r1獨立地選自下組，該組由以下各項組成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正-十二烷基、正-十四烷基、正-十六烷基、正-十八烷基、異-壬基、異-癸基、異-十三烷基和異-十五烷基。其他示例性漂白系統(tǒng)描述于例如wo2007/087258、wo2007/087244、wo2007/087259、wo2007/087242中。合適的光漂白劑可以例如是磺化的酞菁鋅。
該清潔組合物可以包含按重量計0％-10％，如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％、或0.2％-1％的聚合物?？梢岳帽绢I(lǐng)域中已知的用于在洗滌劑中使用的任何聚合物。該聚合物可以作為如以上提到的共助洗劑起作用，或可以提供抗再沉積、纖維保護、污垢釋放、染料轉(zhuǎn)移抑制、油污清潔和/或防沫特性。一些聚合物可以具有多于一種的以上提到的特性和/或多于一種的以下提到的基序。示例性聚合物包括(羧甲基)纖維素(cmc)、聚(乙烯醇)(pva)、聚(乙烯吡咯烷酮)(pvp)、聚(乙二醇)或聚(環(huán)氧乙烷)(peg)、乙氧基化的聚(乙烯亞胺)、羧甲基菊糖(cmi)、和聚羧化物，如paa、paa/pma、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水修飾的cmc(hm-cmc)和硅酮、對苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚對苯二甲酸乙二酯和聚氧乙烯對苯二甲酸乙二酯的共聚物(pet-poet)、pvp、聚(乙烯基咪唑)(pvi)、聚(乙烯吡啶-n-氧化物)(pvpo或pvpno)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(pvpvi)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚環(huán)氧乙烷和聚環(huán)氧丙烷(peo-ppo)以及乙氧基硫酸二季銨鹽。其他示例性聚合物披露于例如wo2006/130575中。也考慮了以上提到的聚合物的鹽。
這些清潔組合物還可以包括織物調(diào)色劑，如當配制在洗滌劑組合物中時，可以在織物與包括所述洗滌劑組合物的清洗液體接觸時沉積在所述織物上從而通過可見光吸收/反射來改變所述織物色彩的染料或色素。熒光增白劑發(fā)射至少一些可見光。相比之下，因為它們吸收至少一部分可見光光譜，所以織物調(diào)色劑改變表面的色彩。適合的織物調(diào)色劑包括染料和染料-粘土軛合物，并且還可以包括色素。適合的染料包括小分子染料和聚合物染料。適合的小分子染料包括選自下組的小分子染料，該組由落入顏色索引(colourindex)(c.i.)分類的以下染料組成：直接藍、直接紅、直接紫、酸性藍、酸性紅、酸性紫、堿性藍、堿性紫和堿性紅、或其混合物，例如描述于wo2005/03274、wo2005/03275、wo2005/03276和ep1876226中(將其通過引用而特此結(jié)合)。洗滌劑組合物優(yōu)選包括從約0.00003wt％至約0.2wt％、從約0.00008wt％至約0.05wt％、或甚至從約0.0001wt％至約0.04wt％的織物調(diào)色劑。該組合物可以包括從0.0001wt％至0.2wt％的織物調(diào)色劑，當該組合物處于單位劑量袋的形式時，這可以是尤其優(yōu)選的。合適的著色劑還披露于例如wo2007/087257、wo2007/087243中。
在一個實施例中，將根據(jù)本發(fā)明的變體與一種或多種酶，如至少兩種酶，更優(yōu)選是至少三種、四種或五種酶組合。優(yōu)選地，這些酶具有不同的底物特異性，例如蛋白質(zhì)分解活性、淀粉分解活性、脂質(zhì)分解活性、溶半纖維活性或溶果膠活性。
洗滌劑添加劑以及洗滌劑組合物可以包括一種或多種額外的酶，如碳水化合物活性酶，像碳水化物酶、果膠酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、或蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、氧化酶，例如漆酶、和/或過氧化物酶。
一般而言，所選酶的特性應(yīng)與選定的洗滌劑相容(即，最適ph，與其他酶和非酶成分的相容性，等)，并且該酶應(yīng)以有效量存在。
纖維素酶：
適合的纖維素酶包括細菌或真菌來源的那些。包括經(jīng)化學修飾的或蛋白質(zhì)工程化的變體。適合的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、鐮孢屬、梭孢殼菌屬、支頂孢屬的纖維素酶，例如披露于us4,435,307、us5,648,263、us5,691,178、us5,776,757以及wo89/09259中的由特異腐質(zhì)霉、嗜熱毀絲霉和尖孢鐮孢屬產(chǎn)生的真菌纖維素酶。
特別適合的纖維素酶是具有顏色護理益處的堿性或中性纖維素酶。此類纖維素酶的實例是描述于ep0495257、ep0531372、wo96/11262、wo96/29397、wo98/08940中的纖維素酶。其他實例是如描述于wo94/07998、ep0531315、us5,457,046、us5,686,593、us5,763,254、wo95/24471、wo98/12307以及wo99/001544中的那些纖維素酶變體。
其他纖維素酶是具有以下序列的內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶，該序列與wo2002/099091的seqidno:2的位置1至位置773的氨基酸序列具有至少97％一致性，或家族44木葡聚糖酶，該木葡聚糖酶具有以下序列，該序列與wo2001/062903的seqidno:2的位置40-559具有至少60％一致性。
可商購的纖維素酶包括celluzymetm和carezymetm(諾維信公司)、carezymepremiumtm(諾維信公司)、cellucleantm(諾維信公司)、cellucleanclassictm(諾維信公司)、cellusofttm(諾維信公司)、whitezymetm(諾維信公司)、clazinasetm和puradaxhatm(杰能科國際公司(genencorinternationalinc.))以及kac-500(b)tm(花王株式會社(kaocorporation))。
甘露聚糖酶：
適合的甘露聚糖酶包括細菌或真菌來源的那些。包括化學修飾或遺傳修飾的變體。該甘露聚糖酶可以是家族5或26的堿性甘露聚糖酶。它可以是一種來自芽孢桿菌屬或腐質(zhì)霉屬的野生型，特別是粘瓊脂芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌或特異腐質(zhì)霉。合適的甘露聚糖酶在wo1999/064619中進行了描述。一種可商購的甘露聚糖酶是mannaway(諾維信公司)。
蛋白酶：
適合的另外的蛋白酶包括細菌、真菌、植物、病毒或動物來源的那些，例如植物或微生物來源。優(yōu)選微生物來源。包括經(jīng)化學修飾的或蛋白質(zhì)工程化的變體。它可以是堿性蛋白酶，如絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶。絲氨酸蛋白酶可以例如是s1家族(如胰蛋白酶)或s8家族(如枯草桿菌蛋白酶)。金屬蛋白酶可以例如是來自例如家族m4的嗜熱菌蛋白酶或其他金屬蛋白酶，如來自m5、m7或m8家族的那些。
術(shù)語“枯草桿菌酶”是指根據(jù)斯艾森等人，蛋白質(zhì)工程4(1991)719-737和斯艾森等人，蛋白質(zhì)科學6(1997)501-523的絲氨酸蛋白酶亞組。絲氨酸蛋白酶是特征為在活性位點具有與底物形成共價加合物的絲氨酸的蛋白酶的一個亞組?？莶輻U菌酶可以劃分為6個亞部，即，枯草桿菌蛋白酶家族、嗜熱蛋白酶家族、蛋白酶k家族、羊毛硫氨酸抗生素肽酶家族、kexin家族和pyrolysin家族。
枯草桿菌酶的實例是來源于芽孢桿菌屬的那些，如描述于us7262042和wo09/021867中的遲緩芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和吉氏芽孢桿菌；和描述于wo89/06279中的枯草桿菌蛋白酶遲緩(lentus)、枯草桿菌蛋白酶諾和(novo)、枯草桿菌蛋白酶嘉士伯(carlsberg)、地衣芽孢桿菌、枯草桿菌蛋白酶bpn’、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168以及描述于(wo93/18140)中的蛋白酶pd138。其他有用的蛋白酶可以是描述于wo92/175177、wo01/016285、wo02/026024以及wo02/016547中的那些。胰蛋白酶樣蛋白酶的實例是胰蛋白酶(例如豬或牛來源的)和鐮孢屬蛋白酶(描述于wo89/06270、wo94/25583和wo05/040372中)，以及來源于纖維單胞菌屬(cellumonas)的糜蛋白酶(描述于wo05/052161和wo05/052146中)。
進一步優(yōu)選的蛋白酶是來自遲緩芽孢桿菌dsm5483的堿性蛋白酶(如在例如wo95/23221中所述)、及其變體(在wo92/21760、wo95/23221、ep1921147以及ep1921148中描述的)。
金屬蛋白酶的實例是如描述于wo07/044993(杰能科國際公司(genencorint.))中的中性金屬蛋白酶，如來源于解淀粉芽孢桿菌的那些。
有用的蛋白酶的實例是描述于wo92/19729、wo96/034946、wo98/20115、wo98/20116、wo99/011768、wo01/44452、wo03/006602、wo04/03186、wo04/041979、wo07/006305、wo11/036263、wo11/036264中的變體，尤其是在以下位置的一個或多個中具有取代的變體：3、4、9、15、27、36、57、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252以及274，使用bpn’編號。更優(yōu)選的蛋白酶變體可以包括以下突變：s3t、v4i、s9r、a15t、k27r、*36d、v68a、n76d、n87s,r、*97e、a98s、s99g,d,a、s99ad、s101g,m,rs103a、v104i,y,n、s106a、g118v,r、h120d,n、n123s、s128l、p129q、s130a、g160d、y167a、r170s、a194p、g195e、v199m、v205i、l217d、n218d、m222s、a232v、k235l、q236h、q245r、n252k、t274a(使用bpn'編號)。
適合的可商購蛋白酶包括以下列商品名出售的那些：
脂肪酶和角質(zhì)酶：
適合的脂肪酶和角質(zhì)酶包括細菌來源或真菌來源的那些。包括化學修飾的或蛋白質(zhì)工程化的變體酶。實例包括來自嗜熱真菌屬的脂肪酶，例如如描述于ep258068和ep305216中的來自疏綿狀嗜熱絲孢菌(早先命名為疏棉狀腐質(zhì)霉)；來自腐質(zhì)霉屬的角質(zhì)酶，例如特異腐質(zhì)霉(wo96/13580)；來自假單胞菌屬的菌株的脂肪酶(這些中的一些現(xiàn)在改名為伯克霍爾氏菌屬)，例如產(chǎn)堿假單胞菌或類產(chǎn)堿假單胞菌(ep218272)、洋蔥假單胞菌(ep331376)、假單胞菌屬菌株sd705(wo95/06720&wo96/27002)、威斯康星假單胞菌(p.wisconsinensis)(wo96/12012)；gdsl-型鏈霉菌屬脂肪酶(wo10/065455)；來自稻瘟病菌的角質(zhì)酶(wo10/107560)；來自門多薩假單胞菌的角質(zhì)酶(us5,389,536)；來自褐色嗜熱裂孢菌(thermobifidafusca)的脂肪酶(wo11/084412)；嗜熱脂肪土芽孢桿菌脂肪酶(wo11/084417)；來自枯草芽孢桿菌的脂肪酶(wo11/084599)；以及來自灰色鏈霉菌(wo11/150157)和始旋鏈霉菌(s.pristinaespiralis)的脂肪酶(wo12/137147)。
其他實例是脂肪酶變體，如描述于ep407225、wo92/05249、wo94/01541、wo94/25578、wo95/14783、wo95/30744、wo95/35381、wo95/22615、wo96/00292、wo97/04079、wo97/07202、wo00/34450、wo00/60063、wo01/92502、wo07/87508以及wo09/109500中的那些。
優(yōu)選的商業(yè)化脂肪酶產(chǎn)品包括lipolasetm、lipextm；lipolextm和lipocleantm(諾維信公司)，lumafast(最初來自杰能科公司(genencor))以及l(fā)ipomax(最初來自吉斯特-博克德斯公司(gist-brocades))。
再其他實例是有時稱為?；D(zhuǎn)移酶或過水解酶的脂肪酶，例如與南極假絲酵母(candidaantarctica)脂肪酶a具有同源性的?；D(zhuǎn)移酶(wo10/111143)、來自恥垢分枝桿菌(mycobacteriumsmegmatis)的?；D(zhuǎn)移酶(wo05/56782)、來自ce7家族的過水解酶(wo09/67279)以及恥垢分枝桿菌過水解酶的變體(特別是來自亨斯邁紡織品染化有限公司(huntsmantextileeffectspteltd)的商業(yè)產(chǎn)品gentlepowerbleach中所用的s54v變體)(wo10/100028)。
淀粉酶：
可以與本發(fā)明的蛋白酶變體一起使用的適合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以具有細菌或真菌起源。包括經(jīng)化學修飾的或蛋白質(zhì)工程化的變體。淀粉酶包括例如獲得自芽孢桿菌屬的α-淀粉酶，例如gb1,296,839中更詳細描述的地衣芽孢桿菌具體株系的α-淀粉酶。
合適的淀粉酶包括具有在wo95/10603中的seqidno:2的淀粉酶或與seqidno:3具有90％序列一致性的其變體。優(yōu)選的變體描述于wo94/02597、wo94/18314、wo97/43424以及wo99/019467的seqidno:4中，如在一個或多個以下位置處具有取代的變體：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408以及444。
不同的適合的淀粉酶包括具有wo02/010355中的seqidno:6的淀粉酶或與seqidno:6具有90％序列一致性的其變體。seqidno:6的優(yōu)選變體是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。
其他適合的淀粉酶是包括示于wo2006/066594的seqidno:6中的來源于解淀粉芽孢桿菌的α-淀粉酶的殘基1-33和示于wo2006/066594的seqidno:4中的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的殘基36-483的雜合α-淀粉酶或其具有90％序列一致性的變體。這一雜合α-淀粉酶的優(yōu)選變體是在以下位置中的一個或多個中具有取代、缺失或插入的那些：g48、t49、g107、h156、a181、n190、m197、i201、a209以及q264。包括示于wo2006/066594的seqidno:6中的來源于解淀粉芽孢桿菌的α-淀粉酶的殘基1-33和seqidno:4的殘基36-483的雜合α-淀粉酶的最優(yōu)選變體是具有以下取代的那些：
m197t；
h156y+a181t+n190f+a209v+q264s；或
g48a+t49i+g107a+h156y+a181t+n190f+i201f+a209v+q264s。
另外的合適的淀粉酶是具有在wo99/019467中的seqidno:6的淀粉酶或與seqidno:6具有90％序列一致性的其變體。seqidno:6的優(yōu)選變體是在一個或多個以下位置中具有取代、缺失或插入的那些：r181、g182、h183、g184、n195、i206、e212、e216以及k269。特別優(yōu)選的淀粉酶是在位置r181和g182或位置h183和g184中具有缺失的那些。
能被使用的另外的淀粉酶是具有wo96/023873的seqidno:1、seqidno:3、seqidno:2或seqidno:7的那些或與seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3或seqidno:7具有90％序列一致性的其變體。seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3或seqidno:7的優(yōu)選變體是在以下位置的一個或多個中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304、以及476，使用wo96/023873的seqid2用于編號。更優(yōu)選的變體是在選自181、182、183和184的兩個位置上具有缺失的那些，如181和182、182和183、或位置183和184。seqidno:1、seqidno:2或seqidno:7的最優(yōu)選淀粉酶變體是在位置183和184具有缺失并在位置140、195、206、243、260、304和476中的一個或多個具有取代的那些。
其他能被使用的淀粉酶是具有wo08/153815的seqidno:2、wo01/66712的seqidno:10的淀粉酶或與wo08/153815的seqidno:2或wo01/66712的seqidno:10具有90％序列一致性的其變體。wo01/66712中的seqidno:10的優(yōu)選變體是在以下位置中的一個或多個中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211以及264。
另外的適合的淀粉酶是具有wo09/061380的seqidno:2的淀粉酶或與seqidno:2具有90％序列一致性的其變體。seqidno:2的優(yōu)選變體是具有c末端截短和/或在以下一個或多個位置具有取代、缺失或插入的那些：q87、q98、s125、n128、t131、t165、k178、r180、s181、t182、g183、m201、f202、n225、s243、n272、n282、y305、r309、d319、q320、q359、k444和g475。seqidno:2的更優(yōu)選變體是在以下位置：q87e,r、q98r、s125a、n128c、t131i、t165i、k178l、t182g、m201l、f202y、n225e,r、n272e,r、s243q,a,e,d、y305r、r309a、q320r、q359e、k444e以及g475k的一個或多個中具有取代，和/或在位置r180和/或s181或t182和/或g183中具有缺失的那些。seqidno:2的最優(yōu)選的淀粉酶變體是具有以下取代的那些：
n128c+k178l+t182g+y305r+g475k；
n128c+k178l+t182g+f202y+y305r+d319t+g475k；
s125a+n128c+k178l+t182g+y305r+g475k；或
s125a+n128c+t131i+t165i+k178l+t182g+y305r+g475k，其中這些變體是c末端截短的并且任選地進一步包括在位置243的取代和/或在位置180和/或位置181的缺失。
另外的適合的淀粉酶是具有wo13184577的seqidno:1的淀粉酶或與seqidno:1具有90％序列一致性的其變體。seqidno:1的優(yōu)選變體是在以下位置中的一個或多個中具有取代、缺失或插入的那些：k176、r178、g179、t180、g181、e187、n192、m199、i203、s241、r458、t459、d460、g476和g477。seqidno:1的更優(yōu)選變體是在以下位置：k176l、e187p、n192fyh、m199l、i203yf、s241qadn、r458n、t459s、d460t、g476k和g477k中的一個或多個中具有取代和/或在位置r178和/或s179或t180和/或g181處具有缺失的那些。seqidno:1的最優(yōu)選的淀粉酶變體是具有以下取代的那些：
e187p+i203y+g476k
e187p+i203y+r458n+t459s+d460t+g476k、
其中這些變體任選地進一步在位置241處包括取代和/或在位置178和/或位置179處包括缺失。
另外的適合的淀粉酶是具有wo10104675的seqidno:1的淀粉酶或與seqidno:1具有90％序列一致性的其變體。seqidno:1的優(yōu)選變體是在以下位置中的一個或多個中具有取代、缺失或插入的那些：n21、d97、v128、k177、r179、s180、i181、g182、m200、l204、e242、g477和g478。seqidno:1的更優(yōu)選變體是在以下位置：n21d、d97n、v128i、k177l、m200l、l204yf、e242qa、g477k和g478k中的一個或多個中具有取代和/或在位置r179和/或s180或i181和/或g182處具有缺失的那些。seqidno:1的最優(yōu)選的淀粉酶變體是具有以下取代的那些：
n21d+d97n+v128i
其中這些變體任選地進一步在位置200處包括取代和/或在位置180和/或位置181處包括缺失。
其他適合的淀粉酶是具有wo01/66712中的seqidno:12的α-淀粉酶或與seqidno:12具有至少90％序列一致性的變體。優(yōu)選的淀粉酶變體是在wo01/66712中的seqidno:12的一個或多個以下位置中具有取代、缺失或插入的那些：r28、r118、n174、r181、g182、d183、g184、g186、w189、n195、m202、y298、n299、k302、s303、n306、r310、n314、r320、h324、e345、y396、r400、w439、r444、n445、k446、q449、r458、n471、n484。特別優(yōu)選的淀粉酶包括具有d183和g184的缺失并且具有取代r118k、n195f、r320k和r458k的變體，并且另外在一個或多個選自下組的位置處具有取代的變體：m9、g149、g182、g186、m202、t257、y295、n299、m323、e345以及a339，最優(yōu)選的是另外在所有這些位置處具有取代的變體。
其他的實例是淀粉酶變體，如在wo2011/098531、wo2013/001078、和wo2013/001087中描述的那些。
可商購的淀粉酶是duramyltm、特妙淀粉酶tm、fungamyltm、stainzymetm、stainzymeplustm、natalasetm、liquozymex及bantm(來自諾維信公司)，以及rapidasetm、purastartm/effectenztm、powerase、preferenzs1000、preferenzs100及preferenzs110(來自杰能科國際有限公司/杜邦公司(genencorinternationalinc./dupont))。
過氧化物酶/氧化酶：
適合的過氧化物酶/氧化酶包括植物、細菌或真菌來源的那些。包括經(jīng)化學修飾的或蛋白質(zhì)工程化的變體。有用的過氧化物酶的實例包括來自鬼傘屬，例如來自灰蓋鬼傘的過氧化物酶，及其變體，如在wo93/24618、wo95/10602、以及wo98/15257中描述的那些。
可商購的過氧化物酶包括guardzymetm(諾維信公司)。
其他酶：
根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶變體還可以與另外的酶如果膠裂解酶(例如pectawashtm)、葉綠素酶等組合。本發(fā)明的蛋白酶變體可以與任何另外的酶混合。
該洗滌劑酶可以通過添加包含一種或多種酶的獨立添加劑，或通過添加包括所有這些酶的組合添加劑而被包括于洗滌劑組合物中。洗滌劑添加劑，即單獨的或組合的添加劑，可以配制成例如顆粒、液體、漿液等。優(yōu)選的洗滌劑添加劑配制品為顆粒，特別是無粉塵顆粒；液體，特別是穩(wěn)定化液體；或者漿液。
非塵顆?？梢岳缛缭趗s4,106,991和4,661,452中所披露而產(chǎn)生，并且可以任選地通過本領(lǐng)域已知的方法進行包衣。蠟質(zhì)包衣材料的實例為具有1000至20000的平均摩爾重量的聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)物(聚乙二醇，peg)；具有從16至50個環(huán)氧乙烷單元的乙氧化壬基苯酚；乙氧化脂肪醇，其中該醇包含從12至20個碳原子，并且其中具有15至80個環(huán)氧乙烷單元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油單酯和甘油二酯以及甘油三酯。適用于通過流化床技術(shù)應(yīng)用的成膜包衣材料的實例在gb1483591中給出。液體酶制劑可以例如通過根據(jù)已確立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而穩(wěn)定化。受保護的酶可以根據(jù)ep238,216中披露的方法來制備。
輔料
還可以利用本領(lǐng)域中已知的用于在洗衣洗滌劑中使用的任何洗滌劑組分。其他任選的洗滌劑組分包括防腐蝕劑、防縮劑、抗污垢再沉積劑、抗皺劑、殺細菌劑、粘合劑、腐蝕抑制劑、崩解劑(disintegrant)/崩解試劑(disintegrationagent)、染料、酶穩(wěn)定劑(包括硼酸、硼酸鹽、cmc和/或多元醇如丙二醇)、織物調(diào)理劑(包括粘土)、填充劑/加工助劑、熒光增白劑/光學增亮劑、增泡劑、泡沫(泡)調(diào)節(jié)劑、香料、污垢懸浮劑、軟化劑、抑泡劑、晦暗抑制劑以及芯吸劑，單獨或組合使用?？梢岳帽绢I(lǐng)域中已知的用于在洗衣洗滌劑中使用的任何成分。此類成分的選擇完全在普通技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)。
分散劑這些洗滌劑組合物還可以包含分散劑。具體地說，粉狀洗滌劑可以包括分散劑。適合的水溶性有機材料包括均聚合或共聚合的酸或其鹽，其中聚羧酸包括至少兩個羧基，這兩個羧基被不超過兩個碳原子彼此分開。適合的分散劑例如描述于粉狀洗滌劑(powdereddetergents)，表面活性劑科學系列(surfactantscienceseries)，第71卷中，馬塞爾·德克爾公司(marceldekker,inc.)。
染料轉(zhuǎn)移抑制劑-這些洗滌劑組合物還可以包括一種或多種染料轉(zhuǎn)移抑制劑。適合的聚合物染料轉(zhuǎn)移抑制劑包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺n-氧化物聚合物、n-乙烯吡咯烷酮和n-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮和聚乙烯咪唑或其混合物。當在受試組合物中存在時，染料轉(zhuǎn)移抑制劑可以按該組合物的重量計以從約0.0001％至約10％、從約0.01％至約5％或甚至從約0.1％至約3％的水平存在。
熒光增白劑-洗滌劑組合物還將優(yōu)選地包含另外的組分，這些組分可以給正清潔的物品著色，如熒光增白劑或光學增亮劑。其中增亮劑優(yōu)選以約0.01％至約0.5％的水平存在。在該組合物中可以使用適合在洗衣洗滌劑組合物中使用的任何熒光增白劑。最常用的熒光增白劑是屬于以下類別的那些：二氨芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-聯(lián)苯乙烯基衍生物。熒光增白劑的二氨芪-磺酸衍生物型的實例包括以下各項的鈉鹽：4,4'-雙-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸鹽；4,4'-雙-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸鹽；4,4'-雙-(2-苯胺基-4(n-甲基-n-2-羥基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸鹽、4,4'-雙-(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸鹽；4,4'-雙-(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羥基-乙胺基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸鹽以及2-(芪基(stilbyl)-4"-萘-1.,2':4,5)-1,2,3-三唑-2"-磺酸鹽。優(yōu)選的熒光增白劑是可從汽巴-嘉基股份有限公司(ciba-geigyag)(巴塞爾，瑞士)獲得的天來寶(tinopal)dms和天來寶cbs。天來寶dms是4,4'-雙-(2-嗎啉基-4苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪二磺酸鹽的二鈉鹽。天來寶cbs是2,2'-雙-(苯基-苯乙烯基)二磺酸鹽的二鈉鹽。還優(yōu)選熒光增白劑，是可商購的parawhitekx，由派拉蒙礦物與化學品(paramountmineralsandchemicals)，孟買，印度供應(yīng)。適合使用的其他熒光劑包括1-3-二芳基吡唑啉和7-烷氨基香豆素。
適合的熒光增白劑水平包括從約0.01wt％、從0.05wt％、從約0.1wt％或甚至從約0.2wt％的較低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的較高水平。
污垢釋放聚合物-該洗滌劑組合物還可以包括一種或多種污垢釋放聚合物，這些污垢釋放聚合物幫助從織物，如棉或聚酯基織物上除去污垢，特別是從聚酯基織物上除去疏水污垢。污垢釋放聚合物可以例如是基于非離子型或陰離子型對苯二甲酸的聚合物、聚乙烯基己內(nèi)酰胺和相關(guān)共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，參見例如粉狀洗滌劑，表面活性劑科學系列第71卷第7章，馬塞爾·德克爾公司。另一種類型的污垢釋放聚合物是包括核心結(jié)構(gòu)和連接至該核心結(jié)構(gòu)的多個烷氧基化基團的兩親性烷氧基化油污清潔聚合物。核心結(jié)構(gòu)可以包括聚烷基亞胺結(jié)構(gòu)或聚烷醇胺結(jié)構(gòu)，如wo2009/087523中詳細描述的(將其通過引用而特此結(jié)合)。此外，任意接枝共聚物是適合的污垢釋放聚合物。適合的接枝共聚物更詳細地描述于wo2007/138054、wo2006/108856以及wo2006/113314中(將其通過引用而特此結(jié)合)。其他污垢釋放聚合物是取代的多糖結(jié)構(gòu)，尤其是取代的纖維素結(jié)構(gòu)，如修飾的纖維素衍生物，如ep1867808或wo2003/040279中描述的那些(將二者都通過引用結(jié)合在此)。適合的纖維素聚合物包括纖維素、纖維素醚、纖維素酯、纖維素酰胺及其混合物。適合的纖維素聚合物包括陰離子修飾的纖維素、非離子修飾的纖維素、陽離子修飾的纖維素、兼性離子修飾的纖維素及其混合物。適合的纖維素聚合物包括甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、酯羧甲基纖維素及其混合物。
抗再沉積劑-這些洗滌劑組合物還可以包括一種或多種抗再沉積劑，如羧甲基纖維素(cmc)、聚乙烯醇(pva)、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、聚環(huán)氧乙烷和/或聚乙二醇(peg)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸與馬來酸的共聚物以及乙氧基化聚乙亞胺。以上在污垢釋放聚合物下描述的基于纖維素的聚合物還可以用作抗再沉積劑。
其他適合的輔料包括但不限于：防縮劑、防皺劑、殺菌劑、粘合劑、載體、染料、酶穩(wěn)定劑、織物柔軟劑、填充劑、泡沫調(diào)節(jié)劑、助水溶劑、香料、色素、抑泡劑(sodsuppressor)、溶劑、用于液體洗滌劑的結(jié)構(gòu)化劑(structurants)和/或結(jié)構(gòu)彈性劑(elasticizingagent)。
洗滌劑產(chǎn)品的配制品
該洗滌劑組合物可以處于任何常規(guī)形式，例如棒，均勻的片劑，具有兩層或更多層的片劑，規(guī)則的或壓縮的粉末，顆粒，糊，凝膠，或規(guī)則的、壓縮或濃縮的液體。
洗滌劑配制品形式：層(相同或不同的相)、袋、對比用于機器給藥單位的形式。
可以將小袋配置為單室或多室。它可以具有適合容持該組合物的任何形式、形狀和材料，例如在與水接觸之前，不允許該組合物從袋中釋放出來。該袋由水溶性薄膜制成，它包含了一個內(nèi)部體積。所述內(nèi)部體積可以分成袋的室。優(yōu)選的薄膜是高分子材料，優(yōu)選被制成薄膜或薄片的形式的聚合物。優(yōu)選的聚合物、共聚物或其衍生物選自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纖維素、羧甲基纖維素、糊精鈉、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、麥芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最優(yōu)選的是聚乙烯醇共聚物以及羥丙基甲基纖維素(hpmc)。優(yōu)選地，聚合物在膜例如pva中的水平是至少約60％。優(yōu)選的平均分子量將典型地是約20,000至約150,000。膜還可以是共混物組合物，該共混物組合物包括可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在貿(mào)易參照m8630下，如由美國印第安納州蓋里(gary,ind.,us)的克里斯克拉夫特工業(yè)產(chǎn)品公司(chriscraftin.prod.)銷售)加增塑劑，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。這些袋可以包括固體洗衣清潔組合物或部分組分和/或液體清潔組合物或由水溶性膜分開的部分組分。用于液體組分的室在構(gòu)成上可以與包含固體的室不同。參考：(us2009/0011970a1)
可以由水可溶袋中的或片劑的不同層中的室來將洗滌劑成分彼此物理分離因此，可以避免組分間的不良的儲存相互作用。在清洗溶液中，每個室的不同溶解曲線還可以引起選擇的組分的延遲溶解。
這些形式的定義/特征：
非單位給藥的液體或凝膠洗滌劑可以是水性的，典型地包含按重量計至少20％并且高達95％的水，如高達約70％的水、高達約65％的水、高達約55％的水、高達約45％的水、高達約35％的水。包括但不限于鏈烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他類型的液體可以被包括在水性液體或凝膠中。水性液體或凝膠洗滌劑可以包含從0％-30％的有機溶劑。
液體或凝膠洗滌劑可以是非水性的。
方法和用途
可以將本發(fā)明的這些蛋白酶變體添加到洗滌劑組合物中，并且因此成為洗滌劑組合物的組分，其中所述的變體包括seqidno:3的一個或多個以下的取代：q70f、q70a、q70n、s111r、s111e、s111d、s114a、s114q、s144r、a145e、k146t、k146n、k146w、k146f、k146a、i150a、i150n、i150n、i150s,a151r、n176y、i178y、i178f、i178p、g182a、l184f、l184y、l184f、l184y、l184w、l184d、r224d、r224g、r224s、以及y240r，其中該變體與seqidno:3具有至少60％，如至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％,至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
洗滌劑組合物通常用于清潔過程中，如洗衣和/或硬表面清潔，例如餐具清洗。
本發(fā)明的一個實施例涉及洗滌劑組合物，如洗衣或餐具清洗組合物，這些組合物包括與seqidno3具有至少60％一致性的蛋白酶親本的蛋白酶變體，其中所述變體包括至少一個選自下組的取代，該組由以下各項組成：q70f、q70a、q70n、s111r、s111e、s111d、s114a、s114q、s144r、a145e、k146t、k146n、k146w、k146f、k146a、i150a、i150n、i150n、i150s,a151r、n176y、i178y、i178f、i178p、g182a、l184f、l184y、l184f、l184y、l184w、l184d、r224d、r224g、r224s、以及y240r。
洗滌劑組合物可以包括至少一個蛋白酶變體，其中所述變體包括seqidno:3的一個或多個以下的取代：q70f、q70a、q70n、s111r、s111e、s111d、s114a、s114q、s144r、a145e、k146t、k146n、k146w、k146f、k146a、i150a、i150n、i150n、i150s,a151r、n176y、i178y、i178f、i178p、g182a、l184f、l184y、l184f、l184y、l184w、l184d、r224d、r224g、r224s、以及y240r，其中該蛋白酶變體與seqidno:3具有至少60％的序列一致性，如與seqidno:3具有至少61％、至少62％、至少63％、至少64％,至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％,至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性，并且該變體具有蛋白酶活性。該至少一種蛋白酶變體優(yōu)選地具有如在“材料和方法”下所述的增加的抑制劑的抑制作用。
洗滌劑組合物可以配制為例如手洗或機洗洗衣洗滌劑組合物，包括適用于預(yù)處理有染污的織物的洗衣添加劑組合物，和漂洗添加的織物軟化劑組合物，或配制為用于一般家用硬表面清潔操作的洗滌劑組合物，或配制用于手洗或機洗餐具清洗操作。
清潔過程或紡織品護理過程可以例如是洗衣過程、餐具清洗過程或清潔硬質(zhì)表面如浴室瓷磚、地板、桌面、下水道、洗滌槽和洗臉盆。洗衣過程可以例如是家用洗衣，但是它也可以是工業(yè)洗衣。用于洗滌織物和/或衣服的過程可以是如下的一個過程，該過程包括用包含洗滌劑組合物和至少一種蛋白酶變體的清洗溶液處理織物。例如，可以在機器清洗過程中或者在手動清洗過程中進行清潔過程或紡織品保養(yǎng)過程。清洗溶液可以例如是包含洗滌劑組合物的水洗溶液。
經(jīng)過清洗、清潔或者紡織品保養(yǎng)過程的織物和/或衣服可以是常規(guī)的可清洗衣服，例如家庭洗衣。優(yōu)選地，洗衣的主要部分是衣服和織物，包括針織品、編織物、斜紋粗棉布、非編織物、毛氈、紗線、以及毛布巾。這些織物可以是纖維素基的，如天然纖維素，包括棉布、亞麻、亞麻布、黃麻、苧麻、劍麻或椰殼纖維；或者人造纖維素(例如，來源于木漿)，包括纖維膠/人造絲、苧麻、醋酸纖維素纖維(三胞)、萊賽爾纖維(lyocell)或其共混物。這些織物還可以是非纖維素基的，如天然聚酰胺，包括羊毛、駱駝毛、羊絨、馬海毛、兔毛或絲；或者合成聚合物，如尼龍、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯以及斯潘德克斯彈性纖維(spandex)/彈性纖維；或其共混物以及纖維素基和非纖維素基纖維的共混物。共混物的例子是棉和/或人造絲/纖維膠與一種或幾種伴隨材料的共混物，該伴隨材料如羊毛、合成纖維(例如聚酰胺纖維、丙烯酸纖維、聚酯纖維、聚乙烯醇纖維、聚氯乙烯纖維、聚亞胺酯纖維、聚脲纖維、芳族聚酰胺纖維)以及含纖維素的纖維(例如人造絲/纖維膠、苧麻、亞麻/亞麻布、黃麻、醋酸纖維素纖維、萊賽爾纖維)。
最近幾年，人們對替換洗滌劑中的組分的興趣逐漸增加，這源于用可再生生物組分如酶和多肽替換石油化學品而不損害清洗性能。當洗滌劑組合物的組分改變新酶活性或者相比于常用洗滌劑酶(如蛋白酶)具有替代和/或改進的特性的新酶時，需要脂肪酶和淀粉酶來實現(xiàn)與傳統(tǒng)洗滌劑組合物比較時類似或改進的清洗性能。
蛋白酶及其變體可用于蛋白質(zhì)性質(zhì)污漬去除過程。蛋白質(zhì)污漬可能是如食品污漬等污漬，如嬰兒食品、皮脂、可可、蛋、血液、牛奶、墨水、草、或其組合。
典型的洗滌劑組合物包括除酶之外的各種組分，這些組分具有不同的作用，一些組分像表面活性劑降低洗滌劑的表面張力，這允許正清潔的污漬被提起和分散并隨后被清洗出來，其他組分像漂白系統(tǒng)通常通過氧化除去顏色并且很多漂白劑還具有強殺菌特性，并且用于消毒和滅菌。再其他組分像助洗劑和螯合劑例如通過從液體中除去金屬離子來軟化清洗水。
這些酶組合物可以進一步包括以下中至少一種或多種：表面活性劑、助洗劑、螯合劑或螯合試劑、洗衣或餐具清洗中的漂白系統(tǒng)或漂白組分。
表面活性劑、助洗劑、螯合劑或螯合試劑、漂白系統(tǒng)和/或漂白組分的量相比于在未添加本發(fā)明的蛋白酶變體情況下使用的表面活性劑、助洗劑、螯合劑或螯合試劑、漂白系統(tǒng)和/或漂白組分的量可以有所減小。優(yōu)選地，作為表面活性劑、增效劑、螯合劑或螯合試劑、漂白系統(tǒng)和/或漂白組分的該至少一種組分以以下量存在：比在不添加本發(fā)明的蛋白酶變體的情況下組分在系統(tǒng)中的量(如，此組分的常規(guī)的量)少1％，如少2％、如少3％、如少4％、如少5％、如少6％、如少7％、如少8％、如少9％、如少10％、如少15％、如少20％、如少25％、如少30％、如少35％、如少40％、如少45％、如少50％。洗滌劑組合物還可以是如下的組合物，該組合物不含至少一種組分，該組分是表面活性劑、助洗劑、螯合劑或螯合試劑、漂白系統(tǒng)或漂白組分和/或聚合物。
清洗方法
洗滌劑組合物理想地適用于在洗衣應(yīng)用中使用。這些方法包括用于洗滌織物的方法。該方法包括將有待洗滌的織物與包括一種洗滌劑組合物的清潔洗衣溶液接觸的步驟?？椢锟梢园軌蛟诔Ｒ?guī)消費者使用條件下被洗滌的任何織物。該溶液優(yōu)選具有從約5.5至約11.5的ph?？稍谌芤褐邪匆韵聺舛仁褂媒M合物：從約100ppm，優(yōu)選500ppm至約15,000ppm。水溫的范圍典型地是從約5℃至約95℃，包括約10℃、約15℃、約20℃、約25℃、約30℃、約35℃、約40℃、約45℃、約50℃、約55℃、約60℃、約65℃、約70℃、約75℃、約80℃、約85℃以及約90℃。水與織物之比典型地是從約1:1至約30:1。
在具體實施例中，在以下ph下執(zhí)行該清洗方法：從約5.0至約11.5、或者從約6至約10.5、約5至約11、約5至約10、約5至約9、約5至約8、約5至約7、約5.5至約11、約5.5至約10、約5.5至約9、約5.5至約8、約5.5.至約7、約6至約11、約6至約10、約6至約9、約6至約8、約6至約7、約6.5至約11、約6.5至約10、約6.5至約9、約6.5至約8、約6.5至約7、約7至約11、約7至約10、約7至約9、或者約7至約8、約8至約11、約8至約10、約8至約9、約9至約11、約9至約10、約10至約11，優(yōu)選約5.5至約11.5。
在具體實施例中，在以下硬度下執(zhí)行該清洗方法：從約0°dh至約30°dh，如約1°dh、約2°dh、約3°dh、約4°dh、約5°dh、約6°dh、約7°dh、約8°dh、約9°dh、約10°dh、約11°dh、約12°dh、約13°dh、約14°dh、約15°dh、約16°dh、約17°dh、約18°dh、約19°dh、約20°dh、約21°dh、約22°dh、約23°dh、約24°dh、約25°dh、約26°dh、約27°dh、約28°dh、約29°dh、約30°dh。在典型歐洲清洗條件下，硬度是約16°dh，在典型美國清洗條件下，是約6°dh，并且在典型亞洲清洗條件下，是約3°dh。
用于在上述方法中使用的組合物可進一步包括至少一種如以上“其他酶”部分列出的額外的酶，如選自下組的酶，該組由以下各項組成：水解酶(如蛋白酶)、脂肪酶和角質(zhì)酶、碳水化物酶(如淀粉酶)、纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、以及果膠酶或其組合。
通過以下實例進一步描述本發(fā)明，這些實例不應(yīng)當解釋為限制本發(fā)明的范圍。
實例
材料與方法
蛋白酶活性測定
1)suc-aapf-pna活性測定：
蛋白水解活性可以通過采用suc-aapf-pna底物的方法來確定。suc-aapf-pna是n-琥珀?；?丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-對硝基苯胺的縮寫，并且它是可以通過內(nèi)切蛋白酶切割的一種封閉肽。在切割后，一個游離pna分子被釋放出來，并且它具有黃色顏色并且因此可以通過可見光分光光度法在波長405nm下進行測量。該suc-aapf-pna底物由巴亨公司(bachem)(目錄號l1400，溶解于dmso中)來制造。
待分析的蛋白酶樣品被稀釋在殘余活性緩沖液中(100mmtrisph8.6)。通過轉(zhuǎn)移30μl的稀釋的酶樣品至96孔微量滴定板并添加70μl底物工作溶液(0.72mg/ml于100mmtrisph8.6中)進行該測定。將該溶液在室溫下混合并且在od405nm下經(jīng)5分鐘每20秒測量吸收。在一組給定條件下，時間相關(guān)吸收曲線的斜率(每分鐘的吸光度)與所討論的蛋白酶的活性成正比例。應(yīng)該將蛋白酶樣品稀釋至其中斜率為線性的水平。
實例1：通過定點誘變構(gòu)建ty145變體
定點變體是構(gòu)建自包括根據(jù)本發(fā)明的具體的取代的ty145蛋白酶(seqidno:3)。這些變體是通過傳統(tǒng)的克隆dna片段制得(薩姆布魯克等人，分子克?。簩嶒炇沂謨裕?版，冷泉港，1989)，使用pcr連同正確地設(shè)計的誘變寡核苷酸，這些寡核苷酸在所得序列中引入了所希望的突變。
對應(yīng)于希望的突變位點側(cè)翼的dna序列設(shè)計的誘變的寡核苷酸，其由限定插入/缺失/取代的dna堿基對分離，并且購自寡核苷酸供應(yīng)商，如生命技術(shù)公司(lifetechnologies)。以此方式，構(gòu)建并產(chǎn)生下表1中所列的變體。
為了測試本發(fā)明的ty145蛋白酶變體，將包括本發(fā)明的變體的突變dna轉(zhuǎn)化到一個感受態(tài)枯草芽孢桿菌菌株并使用標準方案發(fā)酵(液體介質(zhì)，3-4天，30℃)。將培養(yǎng)液離心(26000xg，20min)并且將上清液小心地與沉淀物潷析分開。上清液通過耐潔(nalgene)0.2μm過濾裝置過濾以便除去剩余的芽孢桿菌宿主細胞。將0.2μm濾液以1:1與3.0m(nh4)2so4混合，并且將該混合物施加到苯基-瓊脂糖ff(高載量(highsub))柱(來自ge醫(yī)療公司(gehealthcare))，該柱以100mmh3bo3、10mmmes/naoh、2mmcacl2、1.5m(nh4)2so4(ph6.0)平衡。在用平衡緩沖液清洗該柱之后，將蛋白酶用100mmh3bo3、10mmmes、2mmcacl2(ph6.0)進行逐步洗脫。收集洗脫峰(包含蛋白酶活性)，并且施加至在100mmh3bo3、10mmmes、2mmcacl2(ph6.0)中平衡的桿菌肽瓊脂糖柱(來自upfront層析公司(upfrontchromatography))上。在用平衡緩沖液充分地清洗該柱之后，將蛋白酶用具有25％(v/v)2-丙醇的100mmh3bo3，10mmmes，2mmcacl2，1mnacl(ph6)洗脫。將該洗脫峰(包含蛋白酶活性)轉(zhuǎn)移至在g25葡聚糖凝膠柱(來自ge醫(yī)療公司)上的20mmmes、2mmcacl2(ph6.0)。經(jīng)g25轉(zhuǎn)移的峰是純化的制劑，并且將其用于進一步實驗。
實例2：抑制劑的結(jié)合常數(shù)的確定
將經(jīng)純化的蛋白酶變體預(yù)稀釋在稀釋緩沖液中至大約0.2mg/ml。然后將40μl經(jīng)稀釋的蛋白酶與40μl抑制劑溶液(z-gly-ala-nhch(ch2c6h4poh)c(oh)(so3na)-h，其中z是芐氧基羰基)或40μl4-fpba溶液在96孔微量滴定板(nuncf96-mtp)的孔中混合。針對每個蛋白酶變體，測試8種濃度的抑制劑溶(600μm、200μm、67μm、22μm、7.4μm、2.47μm、0.82μm、以及0μm)液和8種濃度的4-fpba(120mm、40mm、13.3mm、4.44mm、1.48mm、0.494mm、0.164mm、以及0mm)。在室溫下將蛋白酶和抑制劑混合10min后，將30μl的混合物轉(zhuǎn)移至在孔中具有270μl標準b洗滌劑的微量滴定板(nuncu96pp0.5ml)中，導致0-30μm的抑制劑濃度和0-6000μm的4-fpba濃度。使用磁棒將蛋白酶、抑制劑、和洗滌劑混合1小時，在室溫下保持1小時以達到平衡。然后將20μl轉(zhuǎn)移至微量滴定板(nuncf96-mtp)中。添加100μl底物溶液，并且5sec混合后，在spectramaxplus讀取器上每20sec持續(xù)5min測量405nm處的吸收值。使用來自在405nm處的吸光值的初始增加的線性回歸的斜率來計算表觀結(jié)合常數(shù)。
ki的計算
假設(shè)蛋白酶和抑制劑根據(jù)以下方程反應(yīng)：
其中e是蛋白酶，i是抑制劑，并且ei是蛋白酶-抑制劑復(fù)合物。進一步假設(shè)，在標準b中的1小時孵育期間，達到了蛋白酶、抑制劑、以及蛋白酶-抑制劑復(fù)合物之間的平衡，并且在用于線性回歸的測量時間期間，底物溶液的添加不會導致該平衡的顯著改變。然后將在洗滌劑溶液中的酶-抑制劑的濃度由如下給出：
[ei]＝(([etot]+[itot]+ki-sqrt(([etot]+[itot]+ki)^2-4*[etot]*[itot]))/2
其中etot是總蛋白濃度([etot]＝[e]+[ei])，itot是總抑制劑濃度([itot]＝[i]+[ei])，并且ki是針對該反應(yīng)的平衡結(jié)合常數(shù)。所測量的斜率v由如下給出：
v＝v0＊(1-[ei]/[etot])＝v0＊(1-(([etot]+[itot]+ki-sqrt(([etot]+[itot]+ki)^2-4＊[etot]＊[itot]))/2/[etot])
其中v0是沒有添加抑制劑的斜率。為了計算表觀結(jié)合常數(shù)ki，以ki和v0作為變量來進行所測量斜率在各種抑制劑濃度下對該方程的最小二乘方擬合。
如上所述，計算針對該親本蛋白酶和針對每個變量的ki。
針對每個變體具有ki，如果數(shù)據(jù)對于至少兩個區(qū)別僅在于突變的變體是可用時，則計算單突變的效果是有可能的。在這種情況下，將針對突變的相對ki計算為：
較低的ki是所期望的，因為在較低抑制劑濃度下可以獲得令人滿意的抑制作用，因此有益突變具有相對ki<1.0
以下表顯示這種相對ki突變。每行顯示：
·突變(柱1：“突變”)
·一種包括來自柱1(柱2：“具有突變的變體”)的突變的蛋白酶變體(相對于seqidno:2)
·另一種蛋白酶變體(相對于seqidno:2)，其與柱2中的蛋白酶變體不同之處僅在于不具有在柱1(柱3：“不具有突變的變體”)中的突變
·在柱3中的變體的上下文中，標準b洗滌劑中所測量的柱1中突變的相對ki突變(柱4：“標準b中的抑制劑結(jié)合”)
·在柱3中的變體的上下文中，在ph8的tris緩沖液中所測量的柱1中突變的相對ki突變(柱5：“tris緩沖液(ph8)中的抑制劑結(jié)合”)
實例4：在標準b洗滌劑中結(jié)合常數(shù)的確定
如在實例3中所述計算ki。實驗條件示出在表5中。針對抑制劑nnic和4-fpba的改進因子(if)或相對
序列表
<110>諾維信公司
<120>蛋白酶變體以及對其進行編碼的多核苷酸
<130>13008-wo-pct
<160>5
<170>patentin版本3.5
<210>1
<211>1263
<212>dna
<213>芽孢桿菌屬物種
<220>
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<220>
<221>信號肽
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<220>
<221>成熟肽
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