專利名稱：Fbxl15蛋白及其抑制劑以及它們的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及FBXL15蛋白及其抑制劑以及它們的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)是構(gòu)成生命體內(nèi)細(xì)胞和組織的基本物質(zhì)，幾乎所有的蛋白質(zhì)都處在不斷合成與降解的動(dòng)態(tài)平衡之中。與蛋白質(zhì)的合成相比，蛋白質(zhì)的降解同樣重要，機(jī)體內(nèi)短壽命的、錯(cuò)誤折疊的以及機(jī)體自身不需要的蛋白都需要通過降解途徑來清除。其中泛素-蛋白酶體系統(tǒng)⑴biquitin-Proteasome System,UPS)就是真核生物體內(nèi)普遍存在的具有高度選擇性的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)，主要由蛋白質(zhì)泛素化和蛋白酶體降解兩個(gè)過程組成。該系統(tǒng)的生物學(xué)功能非常廣泛，參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)幾乎各個(gè)方面的生命活動(dòng)，其異常與炎癥、癌癥及神經(jīng)退行性疾病等密切相關(guān)。泛素化修飾通過由泛素激活酶(ubiquitin activating enzyme，El)、泛素結(jié)合 Sl (ubiquitin conjugating enzyme, E2)禾口泛素連接 Sl (ubi qui tin-protein ligase, E3) 參與介導(dǎo)的酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)完成，最后經(jīng)蛋白酶體降解。其中E3決定底物識(shí)別的特異性，是蛋白質(zhì)泛素化領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。E3可以分為兩大類含有RING(really interesting new gene)鋅指結(jié)構(gòu)和 HECT (homologous to E6AP C-terminus)結(jié)構(gòu)域的 E3。RING類E3中的大多數(shù)是基于Cullins蛋白的多亞基復(fù)合體，其中基于Cullinl所形成的SCF(Skpl-Cullinl-F-boX)復(fù)合體是研究最多、最深入的RING類E3復(fù)合體。它以支架蛋白Cullinl為中心，C端結(jié)合RING鋅指蛋白R(shí)ocl，N端結(jié)合接頭蛋白Skp 1，Skpl又進(jìn)一步募集不同的F-box蛋白，F(xiàn)-box蛋白擔(dān)當(dāng)?shù)孜镒R(shí)別亞基的角色，這樣SCF復(fù)合體就利用不同的F-box蛋白形成不同復(fù)合體，從而結(jié)合不同的底物，在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞生長(zhǎng)及腫瘤發(fā)生等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。F-box蛋白是一個(gè)大的蛋白家族，其家族成員數(shù)量在不同的物種中差別很大，酵母中約有20種，果蠅中有27種，而在人中則有69個(gè)成員。人中的F-box蛋白家族根據(jù)其C端所含結(jié)構(gòu)域的不同，可以分為三類含有WD40結(jié)構(gòu)域的FBXW亞家族，含有LRR區(qū)的FBXL亞家族，以及含有其它結(jié)構(gòu)域的統(tǒng)稱為FBM)亞家族， 它們分別通過WD40、LRR及其它結(jié)構(gòu)域與底物蛋白發(fā)生相互作用，介導(dǎo)SCF復(fù)合體的結(jié)合。相對(duì)于RING類E3，HECT類E3數(shù)量上約占人類E3的5 %，共有觀種，其功能與機(jī)制研究相對(duì)較少，認(rèn)識(shí)大多來自對(duì)于Nedd4(neural precursor cell-expressed developmentally downregulated gene 4)家族的研究。人中Nedd4家族共有9個(gè)成員， 根據(jù)進(jìn)化關(guān)系上的遠(yuǎn)近又可分為4個(gè)亞家族NedcMs :Nedd4-l, Nedd4_2/Nedd4L ；Smurfs Smurfl, Smurf2 ；AIPs :AIP2/WWP2, AIP4, AIP5/WWP1 ；NEDLs :NEDL1, NEDL2。各亞家族成員間的序列和結(jié)構(gòu)的相似性更高，同源性更強(qiáng)。Nedd4家族成員的結(jié)構(gòu)域組成及模式呈現(xiàn)規(guī)律性的特點(diǎn)N端均含有C2結(jié)構(gòu)域，能結(jié)合磷脂，介導(dǎo)質(zhì)膜定位；中間為2 4個(gè)Wff結(jié)構(gòu)域， 每個(gè)Wff結(jié)構(gòu)域由約40個(gè)氨基酸組成，其中因含有兩個(gè)標(biāo)志性的色氨酸殘基(Try，W)而得名，WW結(jié)構(gòu)域能與PY模序結(jié)合，介導(dǎo)蛋白與蛋白間的相互作用，決定底物的特異性；C端為 HECT催化結(jié)構(gòu)域。
Smurfl (Smad ubiquitination regulatory factor 1)白勺HMft·， 與同家族的Smurf2高度同源。Smurfl最早在線蟲中出現(xiàn)，人源Smurfl是發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)能夠降解Smads的E3，其發(fā)現(xiàn)將TGF-β /BMP通路與泛素-蛋白酶體通路聯(lián)系起來。研究發(fā)現(xiàn)，Smurfl可以通過降解經(jīng)典BMP通路的受體型Smads (如Smadl、Smad5)和BMP受體、負(fù)調(diào)控BMP通路。隨后有研究揭示Smurfl可以靶向Smad不依賴的BMP-MEKK2-JNK通路中的 MEKK2激酶，負(fù)調(diào)控骨形成。Smurfl+小鼠隨年齡增長(zhǎng)則表現(xiàn)出骨量的不斷上升，Smurfl與 Smurf2雙敲除則導(dǎo)致小鼠胚胎致死。這些研究表明，Smurfl是骨形成、胚胎發(fā)育乃至腫瘤發(fā)生的重要調(diào)控分子。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供FBXL15蛋白及其抑制劑以及它們的應(yīng)用。
本發(fā)明保護(hù)FBXL15蛋白、所述FBXL15蛋白的編碼基因或含有所述編碼基因的重組表達(dá)載體在如下①或②中的應(yīng)用①促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化；②制備促進(jìn)所述成骨細(xì)胞分化的產(chǎn)品。所述成骨細(xì)胞具體可為UMR106細(xì)胞。
FBXL15蛋白或其編碼基因還可用于促進(jìn)Smurfl蛋白的降解或制備促進(jìn)Smurfl蛋白降解的產(chǎn)品。FBXL15蛋白或其編碼基因還可用于促進(jìn)Smurfl蛋白的泛素化或制備促進(jìn) Smurfl蛋白泛素化的產(chǎn)品。FBXL15蛋白或其編碼基因還可用于增強(qiáng)BMP通路活性或制備增強(qiáng)BMP通路活性的產(chǎn)品。所述FBXL15蛋白具體可通過抑制所述Smurfl蛋白增強(qiáng)BMP通路活性。
本發(fā)明還保護(hù)一種核酸，為序列表的序列9所示核酸、序列表的序列10所示核酸或序列表的序列11所示核酸。
本發(fā)明還保護(hù)FBXL15蛋白的抑制劑在降低FBXL15蛋白的編碼基因的表達(dá)量中的應(yīng)用。
本發(fā)明還保護(hù)FBXL15蛋白的抑制劑在如下如下(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、 (VI)、(VII)或(VIII)中的應(yīng)用(I)延長(zhǎng)細(xì)胞和/或組織和/或生物體內(nèi)源Smurfl蛋白的半衰期；(II)抑制所述Smurfl蛋白的降解；(III)抑制所述Smurfl蛋白的泛素化；(IV) 抑制BMP通路活性；(V)制備延長(zhǎng)細(xì)胞和/或組織和/或生物體內(nèi)源Smurfl蛋白的半衰期的產(chǎn)品；(VI)制備抑制所述Smurfl蛋白降解的產(chǎn)品；(VII)制備抑制所述Smurf 1蛋白泛素化的產(chǎn)品；(VIII)制備抑制BMP通路活性的產(chǎn)品；
所述FBXL15蛋白的抑制劑具體可為所述核酸。
所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
所述FBXL15蛋白的編碼基因是如下(1)或⑵或(3)所述的DNA分子
(1)序列表中序列2所示的DNA分子；
(2)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白的DNA 分子；
(3)與⑴限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子。所述Smurfl蛋白是如下(C)或(d)(c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(d)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列3衍生的蛋白質(zhì)。FBXL15本身能明顯增強(qiáng)成骨細(xì)胞的分化，即促進(jìn)骨形成，可用于治療骨質(zhì)疏松等疾病。骨硬化癥，又稱石骨癥，骨密度升高伴隨骨形態(tài)變化，由于失去了中空髓腔反而使骨頭脆性增加，更容易骨折。本發(fā)明提供的FBXL15蛋白的抑制劑可以抑制成骨細(xì)胞的分化， 即抑制骨形成，可用于作為石骨癥的候選藥物。


圖1為FBXL15結(jié)構(gòu)域組成示意圖。圖2為FBXL15蛋白的細(xì)胞表達(dá)譜及亞細(xì)胞定位分析；A :FBXL15蛋白的細(xì)胞表達(dá)譜；B :FBXL15蛋白的亞細(xì)胞定位分析。圖3為FBXL15形成功能性SCF復(fù)合體促進(jìn)Smurfl蛋白的降解；A =FBXL 15與 SkpUCullinl和Rocl存在相互作用；B =FBXL 15降低Smurfl (WT/C699A)的穩(wěn)定性(1為無 FBXLl5, 2為FBXL15低劑量，3為FBXL15高劑量)；C 野生型FBXL15，而不是FBXL15截短體促進(jìn)Smurfl降解(1代表第一組，2代表第二組，3代表第三組，4代表第四組)；D :FBXL15 特異性降解Smurfl。圖4為敲低FBXL15增強(qiáng)內(nèi)源Smurfl蛋白水平；A 3條獨(dú)立的FBXL15 siRNA敲低效率檢測(cè)；B 2#、3# siRNA有效敲低內(nèi)源FBXL15蛋白水平；C 敲低FBXL15上調(diào)內(nèi)源Smurfl 水平；D和E 敲低FBXL15后增強(qiáng)Smurfl半衰期。圖5為SCFfbxu5復(fù)合體增強(qiáng)Smurfl泛素化水平；A =FBXL 15促進(jìn)Smurfl體內(nèi)泛素化水平(1代表第一組，2代表第二組，3代表第三組，4代表第四組，5代表第五組)；B 敲低 CullinU RocU FBXL15 減低 Smurfl 泛素化水平。圖6為FBXL15拮抗Smurfl對(duì)BMP通路的抑制效應(yīng)；A =Smurfl能明顯降低底物 Smadl/5的蛋白水平(1至12依次代表第一組至第十二組)。B 敲低FBXL15可以抑制BMP 通路的活化(1代表取樣時(shí)間為0小時(shí)，2代表取樣間隔時(shí)間為0. 5小時(shí)，3代表取樣間隔時(shí)間為1小時(shí)，4代表取樣間隔時(shí)間為2小時(shí)，5代表取樣間隔時(shí)間為4小時(shí)。)；C:敲低FBXL15 可以抑制BMP通路靶基因IDl和Smad6的表達(dá)(*表示P < 0. 05)。圖7為實(shí)施例5中各組細(xì)胞的堿性磷酸酶ALP染色后照片。圖8為實(shí)施例5中各組細(xì)胞的ALP活性分析結(jié)果，*表示P < 0. 05。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。Western Blot條帶通過kion Image軟件定量。BMP-2即大鼠骨成型蛋白2 購(gòu)自PEPR0TECH公司，目錄號(hào)120-02。UMR106細(xì)胞(大鼠成骨樣細(xì)胞系)購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心(ATCC)，目錄號(hào)為CRL-1661。HEK293T 細(xì)胞北京協(xié)和細(xì)胞資源中心，編號(hào)為3111C0001CCC000091 ；為人胚腎細(xì)胞(SV40T基因修飾)。pFlag-CMV-2 表達(dá)載體Sigma，目錄號(hào)為 E7398。pCMV-Myc 表達(dá)載體Clontech 公司。pCMV-HA表達(dá)載體Clontech公司。！fepG2細(xì)胞(肝癌細(xì)胞系)北京協(xié)和細(xì)胞資源中心，編號(hào)為 3111C0001CCC000035。。
限制性內(nèi)切酶、T4連接酶均購(gòu)自NEB公司。質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒均購(gòu)自Promega公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)定量熒光染料STOR Green PCR Mix購(gòu)自東洋紡公司。雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒購(gòu)自Promega公司。RNA提取試劑Trizol購(gòu)自hvitrogen 公司。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5ci購(gòu)自天根公司。細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)的胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液、雙抗及胰酶均購(gòu)自Hyclone公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自hvitrogen公司。蛋白酶體抑制劑(MG132)購(gòu)自Sigma公司。蛋白合成抑制劑cycloheximide (CHX)購(gòu)自Sigma公司。蛋白酶抑制劑(cocktail)購(gòu)自Roche公司。。Protein A/G agarose購(gòu)自 Santa Cruz ^b]。
Flag抗體購(gòu)自Sigma公司。Myc抗體購(gòu)自MBL公司。GAPDH抗體購(gòu)自ProteiniTech 公司 Smurfl 抗體(ab57573)和 Smurf2 (ab53316)抗體購(gòu)自 Abcam 公司。Cullinl 抗體、 Skpl抗體、Rocl抗體和CyclinA/Bl抗體購(gòu)自hvitrogen公司。Smadl/5抗體和磷酸化 Smadl/5 (S463/465)抗體購(gòu)自 Cell Signaling 公司。Smadl/5 抗體=CellSignaling, 97430 5111&(12/3抗體刃611 Signaling，3102。
實(shí)施例1、FBXL15蛋白的基本特征描述
一、序列的生物信息學(xué)分析
FBXL15蛋白由F_box結(jié)構(gòu)域和6個(gè)亮氨酸富含區(qū)(LRR)所組成(圖1)。LRR是一大類介導(dǎo)蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域，根據(jù)長(zhǎng)度及序列特征可以分為6類，F(xiàn)BXL15及Skp2 等F-box蛋白屬于其中的CC(cysteine-containing)亞類。FBXL15在進(jìn)化上較為保守，在果蠅、瘧蚊等無脊椎動(dòng)物及魚類、鳥類等脊椎動(dòng)物以及哺乳動(dòng)物中都存在FBXL15的同源基因，其中哺乳動(dòng)物中FBXL15高度保守，人與其它哺乳動(dòng)物的同源性高達(dá)95%以上，與魚類、 鳥類的同源性在60%左右，與無脊椎動(dòng)物的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，只有30%左右。從FBXL15與其它FBXL亞類的蛋白的進(jìn)化樹關(guān)系分析，F(xiàn)BXL15分支獨(dú)立于大多數(shù)FBXL亞類蛋白，提示 FBXL15的功能可能比較保守。
二、正常及癌細(xì)胞系中的FBXL15蛋白的編碼基因的表達(dá)水平
在獲得FBXL15抗體后，在Hela (人子宮頸癌細(xì)胞)、MCF_7 (乳腺癌細(xì)胞)、U20S (骨肉瘤細(xì)胞)、HEK293T (人胚腎細(xì)胞)、H印G2 (肝癌細(xì)胞)、K562 (粒細(xì)胞來源白血病細(xì)胞)、 STOY(神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞)、HCT-15(結(jié)腸癌細(xì)胞)中檢測(cè)FBXL15的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，F(xiàn)BXL15在各細(xì)胞系中均有表達(dá)，但在K562白血病細(xì)胞系中表達(dá)特別高(圖2A)，在 Jurkat (淋巴細(xì)胞白血病)中也檢測(cè)到高表達(dá)。
三、FBXL15蛋白的細(xì)胞定位分析
在帶有載玻片直徑為30mm的confocal專用培養(yǎng)皿中，接種MCF-7細(xì)胞，培養(yǎng)至合適匯合度后分別轉(zhuǎn)染GFP-FBXL15、Myc_FBXL15。細(xì)胞培養(yǎng)24h后，轉(zhuǎn)染GFP-FBXL15細(xì)胞直接在熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染Myc-FBXL15細(xì)胞進(jìn)行以下處理(1)4%多聚甲醛固定， 室溫 IOmin ； (2)PBS 洗滌，0. 2 % Triton-PBS 滲透，室溫 IOmin ； (3)PBS 洗滌，PBST (1%0Tween20+3 % BSA)封閉，37 °C 30min ； (4)棄封閉液，加入一抗(PBST 1 50 稀釋)， 37°C 3 4h或4°C過夜；(5) PBST洗滌三次，5min/次，靜置即可；(6)避光操作加入FITC標(biāo)記二抗，Ih以內(nèi)否則熒光易淬滅；(7)避光操作PBST洗滌三次；(S)DAPI染核，觀察。結(jié)果見圖2B，結(jié)果顯示FBXL15主要定位于胞質(zhì)中。實(shí)施例2、重組質(zhì)粒的制備一、重組質(zhì)粒Flag_FBXL15的制備1、根據(jù)NCBI (美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心)網(wǎng)站查到人FBXL15基因 (NM_024326. 3)的編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增該基因的引物對(duì)如下正向引物5，-eg gaattc aatggagccaccgatggag-3'(斜體為 EcoR I 酶切位點(diǎn))；反向弓丨物5‘-cgggatcctcagacctgcaggttgacaaa-3‘(斜體為 BamH I 酶切位點(diǎn))。2、提取HEK293T細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。3、以步驟2的cDNA為模板，用步驟1設(shè)計(jì)的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。4、用限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I雙酶切步驟3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。5、用限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I雙酶切pFlag-CMV_2表達(dá)載體，回收載體骨架(約 4. 7kb)。6、將步驟4的酶切產(chǎn)物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒Flag_FBXL15。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒Flag-FBXL15進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下在pFlag-CMV-2表達(dá)載體的EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列2所示的人FBXL15基因(序列表的序列2 所示的人FBXL15基因編碼序列表的序列1所示的人FBXL15蛋白)。重組質(zhì)粒Flag_FBXL15 可以表達(dá)Flag-FBXL15融合蛋白(蛋白分子量約為38kDa)。二、重組質(zhì)粒 Flag-FBXL15_ Δ F 的制備1、設(shè)計(jì)引物對(duì)如下正向引物5’-eg gaa ttc, aggtccgcagatcccg-3‘(斜體為 EcoR I 酶切位點(diǎn))；反向弓丨物5 ‘ -cggga tcc tcagacctgcaggttgacaaa-3 ‘(斜體為 BamH I 酶切位點(diǎn))。2、以重組質(zhì)粒Flag_FBXL15為模板，用步驟1設(shè)計(jì)的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。3、用限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。4、用限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I雙酶切pFlag-CMV_2表達(dá)載體，回收載體骨架(約 4. 7kb)。5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒 Flag-FBXL15-AF。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒Flag-FBXL15_ Δ F進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下在 pFlag-CMV-2表達(dá)載體的EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列2自5’末端第211至903位核苷酸所示的人FBXL15-AF基因。重組質(zhì)粒Flag-FBXL15_ Δ F可以表達(dá) Flag-FBXL15-AF融合蛋白(蛋白分子量約為^kDa)。三、重組質(zhì)粒Flag-FBXL15-F_box的制備1、設(shè)計(jì)引物對(duì)如下
正向弓I物5，_cg 貧 aat tea atg gag cca ccg atg gag(斜體為 EcoR I Bl切位占).
反向弓I物5，-eg 從a tcc tea cac ctg cgc ggc ate gaa(斜體為 BamH I 酶切位點(diǎn))O
2、以重組質(zhì)粒Flag_FBXL15為模板，用步驟1設(shè)計(jì)的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
3、用限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
4、用限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I雙酶切pFlag-CMV_2表達(dá)載體，回收載體骨架(約 4. 7kb)。
5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒 Flag-FBXL15-F-boX。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒Flag-FBXL15-F-boX進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下 在pFlag-CMV-2表達(dá)載體的EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列2自5’ 末端第1至210位核苷酸所示的人FBXL15-F-box基因。重組質(zhì)粒Flag-FBXL15-F-boX可以表達(dá)Flag-FBXL15-F-boX融合蛋白(蛋白分子量約為IlkDa)。
四、重組質(zhì)粒Myc_FBXL15的制備
1、設(shè)計(jì)引物對(duì)如下
正向引物5，-cg卵a(bǔ) cggatggagccaccgatggag-3，(斜體為EcoR I 酶切位點(diǎn))；
反向弓丨物5，-ccgctcgag atcagacctgcaggttgacaaa-3，(斜體為 Xho I 酶切位點(diǎn))ο
2、以重組質(zhì)粒Flag_FBXL15為模板，用步驟1設(shè)計(jì)的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
3、用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Bio I雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
4、用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Bio I雙酶切pCMV_Myc表達(dá)載體，回收載體骨架(約 3. 8kb)。
5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒Myc_FBXL15。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒Myc-FBXL15進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下在pCMV_Myc表達(dá)載體的EcoR I和 Xho I酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列2所示的人FBXL15基因。重組質(zhì)粒Myc_FBXL15 可以表達(dá)Myc-FBXL15融合蛋白(蛋白分子量約為38kDa)。
五、重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (WT)的制備
1、根據(jù)NCBI (美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心)網(wǎng)站查到人Smurfl基因 (NM_181349. 2)的編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增該基因的引物對(duì)如下
正向引物5，-ccaa^rii;atgtcgaaccccgggaca-3，(斜體為Hind III 酶切位點(diǎn))；
反向弓I物5‘-cggaattctcactccacagcaaacccgca-3‘(斜體為 EcoR I 酶切位點(diǎn))。
2、提取HEK293T細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
3、以步驟2的cDNA為模板，用步驟1設(shè)計(jì)的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
4、用限制性內(nèi)切酶Hind III和EcoR I雙酶切步驟3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
5、用限制性內(nèi)切酶Hind III和EcoR I雙酶切pFlag-CMV-2表達(dá)載體，回收載體骨架(約4. 7kb)。6、將步驟4的酶切產(chǎn)物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒 Flag-Smurfl (WT)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (WT)進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下在 pFlag-CMV-2表達(dá)載體的Hind III和EcoR I酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列4所示的人 Smurfl基因(序列表的序列4所示的人Smurfl基因編碼序列表的序列3所示的人Smurfl 蛋白)。重組質(zhì)粒Flag-Smurf 1 (WT)可以表達(dá)Flag-Smurf 1 (WT)融合蛋白(蛋白分子量約為 ^kDa)。六、重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (C699A)的制備1、設(shè)計(jì)引物如下正向弓I 物 1 :5，-co aagctt atgtcgaaccccgggaca-3'(斜體為 Hind III 醇切位
占). /、、、 / 反向弓丨物 1 :5，-atccggttaaatgcggtatgggcc-3，；正向弓丨物 2 :5，-ggcccataccgcatttaaccggat-3，；反向弓I物 2 :5，-eg gaattc tcactccacagcaaacccgca-3，(斜體為 EcoR I 酶切位點(diǎn))ο2、提取HEK293T細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。3、以重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (WT)為模板，分別用步驟1設(shè)計(jì)的引物對(duì)1 (由正向引物1和反向引物1組成)和引物對(duì)2 (由正向引物2和反向引物2組成)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。4.將步驟3回收得到的PCR產(chǎn)物混合，以混合物為模板，以引物對(duì)3 (由正向引物 1和反向引物2組成)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。5、用限制性內(nèi)切酶Hind I和EcoR I雙酶切步驟4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。6、用限制性內(nèi)切酶Hind III和EcoR I雙酶切pFlag-CMV-2表達(dá)載體，回收載體骨架(約4. 7kb)。7、將步驟5的酶切產(chǎn)物和步驟6的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒 Flag-Smurfl (C699A)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (C699A)進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下與重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (WT)相比，重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (C699A)的差異僅在于將序列表的序列4所示的DNA自5，末端第2095-2097位核苷酸由“tgc”突變?yōu)榱?“gca”；引起序列表的序列3所示蛋白質(zhì)自N末端第699位氨基酸殘基由半胱氨酸突變?yōu)榱吮彼?，從而失去活性。重組質(zhì)粒Flag-Smurf 1 (C699A)可以表達(dá)Flag-Smurf 1 (C699A)融合蛋白(蛋白分子量約為85kDa)。七、重組質(zhì)粒HAIb的制備1、根據(jù)NCBI (美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心)網(wǎng)站查到人證基因 (NM_001135592. 2)的編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增該基因片段的引物對(duì)如下正向引物:5，-CCgtcgac catgcagattttcgtgaaa-3，(斜體為 Sal I 酶切位點(diǎn))；反向弓丨物5‘-ccggcggccgc ttaccaccacgaagtctc-3‘(斜體為 Not I 酶切位點(diǎn))。2、提取HEK293T細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
11
3、以步驟2的cDNA為模板，用步驟1設(shè)計(jì)的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
4、用限制性內(nèi)切酶Ml I和Not I雙酶切步驟3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
5、用限制性內(nèi)切酶Ml I和Not I雙酶切pCMV-HA表達(dá)載體，回收載體骨架(約 3. 8kb)。
6、將步驟4的酶切產(chǎn)物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒HA-Ub。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒HA-Ub進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下在pCMV-HA表達(dá)載體的Ml I和Not I酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列5所示的人證基因片段。
八、重組質(zhì)粒Myc-Smadl的構(gòu)建
1、根據(jù)NCBI (美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心)網(wǎng)站查到人Smadl基因 (NM_001003688. 1)的編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增該基因的引物對(duì)如下
正向引物5，-CCCtCgagi gtatgaatgtgacaagttta-3，(斜體為 Xho I 酶切位點(diǎn))；
反向引物5，-ccg^r^grc^rttaagatacagatgaaat-3，(斜體為 Not I 酶切位點(diǎn))。
2、提取HEK293T細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
3、以步驟2的cDNA為模板，用步驟1設(shè)計(jì)的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
4、用限制性內(nèi)切酶Bio I和Not I雙酶切步驟3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
5、用限制性內(nèi)切酶Bio I和Not I雙酶切pCMV-Myc表達(dá)載體，回收載體骨架(約 3. 8kb)。
6、將步驟4的酶切產(chǎn)物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒Myc-Smadl。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒Myc-Smadl進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下在pCMV_Myc表達(dá)載體的Β ο I和 Not I酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列6所示的Smadl基因。重組質(zhì)粒Myc-Smadl可以表達(dá)Myc-Smadl融合蛋白(蛋白分子量約為55kDa)。
九、重組質(zhì)粒Myc_Smad3的構(gòu)建
1、根據(jù)NCBI (美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心)網(wǎng)站查到人Smad3基因 (NM_001145102. 1)的編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增該基因的引物對(duì)如下
正向引物5，-cg卵a(bǔ) cggatggagctgtgtgagttc-3，(斜體為EcoRI 酶切位點(diǎn))；
反向弓丨物5，-ccgcic^,actaagacacactggaaca-3，(斜體為 Xho I 酶切位點(diǎn))。
2、提取HEK293T細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
3、以步驟2的cDNA為模板，用步驟1設(shè)計(jì)的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
4、用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Bio I雙酶切步驟3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
5、用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Bio I雙酶切pCMV_Myc表達(dá)載體，回收載體骨架(約 3. 8kb)。
6、將步驟4的酶切產(chǎn)物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒Myc-Smad3。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒Myc-Smad3進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下在pCMV_Myc表達(dá)載體的EcoRI和 Xho I酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列7所示的Smad3基因。重組質(zhì)粒Myc-Smad3可以表達(dá)Myc-Smad3融合蛋白(蛋白分子量約為40kDa)。
十、重組質(zhì)粒Myc_Smad5的構(gòu)建
1、根據(jù)NCBI (美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心)網(wǎng)站查到人Smad5基因 (NM_001001419. 1)的編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增該基因的引物對(duì)如下正向引物5，-coctcgag\ gtatgacgtcaatggccagc-3，(斜體為 Xho I 酶切位點(diǎn))；反向引物-.W-觀 gcggccgc ttatgaaacagaagatat-3，(斜體為 Not I 酶切位點(diǎn))。2、提取HEK293T細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。3、以步驟2的cDNA為模板，用步驟1設(shè)計(jì)的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。4、用限制性內(nèi)切酶Bio I和Not I雙酶切步驟3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。5、用限制性內(nèi)切酶Bio I和Not I雙酶切pCMV_Myc表達(dá)載體，回收載體骨架(約
3.8kb)。6、將步驟4的酶切產(chǎn)物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒Myc-Smad5。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒Myc-Smad5進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下在pCMV_Myc表達(dá)載體的Β ο I和 Not I酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列8所示的Smad5基因。重組質(zhì)粒Myc-Smad5可以表達(dá)Myc-Smad5融合蛋白(蛋白分子量約為55kDa)。實(shí)施例3、FBXL15形成SCF復(fù)合體并反式調(diào)控Smurfl蛋白穩(wěn)定性一、FBXL15 形成 SCF 復(fù)合體絕大多數(shù)F-box均可與Skpl、Cullinl、R0cl等形成SCF復(fù)合體參與對(duì)底物的識(shí)別和降解，但其中也有例外，如FBX045則不能形成經(jīng)典的SCF復(fù)合體，而是與PAM等蛋白形成其它類型的復(fù)合體，有的F-box蛋白甚至不能形成復(fù)合體。設(shè)置三組處理如下第一組(空載體組)在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pFlag-CMV-2表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染劑量為
4.Oug質(zhì)粒/IX IO6細(xì)胞；第二組(Flag-FBXL15組)在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Flag_FBXL15，轉(zhuǎn)染劑量為4. Oug質(zhì)粒/IX IO6細(xì)胞；第三組(Flag-FBXL15_AF組)在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒 Flag-FBXL15- Δ F，轉(zhuǎn)染劑量為4. Oug質(zhì)粒/1 X IO6細(xì)胞。轉(zhuǎn)染3 后加入蛋白酶體抑制劑(20 μ Μ)處理他，然后收集細(xì)胞。向細(xì)胞中補(bǔ)加450μ1 HEPES裂解液，并補(bǔ)加蛋白酶抑制劑(20 μ 1)和磷酸酶抑制劑(IOmM NaF和 ImMNa3VO4),冰上裂解并短暫超聲至裂解液清亮。4°C 12000rpm離心lOmin，取上清。50 μ 1 上清(Iys樣本)進(jìn)行western blot分析。剩余的上清加入Flag抗體約2 μ g，4°C旋轉(zhuǎn)混合3_4h后加入protein A/G agarose 40 μ 1孵育過夜，離心收集agarose，經(jīng)裂解液洗滌3 次后煮樣(IP樣本)進(jìn)行western blot分析。western blot分析的一抗分別采用Cullinl 抗體、Skpl抗體、Rocl抗體和Flag抗體。結(jié)果見圖3A。各組細(xì)胞的上清中，均可檢測(cè)到Cullinl、Skpl和Rocl。第二組和第三組的上清中都可以檢測(cè)到Flag。第二組的IP樣本中可以檢測(cè)到Cullinl、Skpl和 Rocl，第三組的IP樣本中沒有檢測(cè)到Cullinl、Skpl和Rocl。結(jié)果表明，F(xiàn)BXL15在體內(nèi)確實(shí)能與Cullinl、Skpl和Rocl形成經(jīng)典的SCF復(fù)合體，為其發(fā)揮E3功能奠定基礎(chǔ)，而 Flag-FBXL15 Δ F因缺失募集Skpl的關(guān)鍵F_box模序無法與Cullinl、Skpl和Rocl形成SCF 復(fù)合體。
13
二、FBXL15下調(diào)外源Smurfl蛋白穩(wěn)定性1、實(shí)驗(yàn) 1設(shè)置六組處理如下第一組(無FBXL15)在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (WT)，轉(zhuǎn)染劑量為0. 5ug質(zhì)粒/IX IO6細(xì)胞；第二組(FBXL15低劑量)在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Flag-Smurf 1 (WT)和重組質(zhì)粒Flag-FBXL15，重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (WT)的轉(zhuǎn)染劑量為0. 5ug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞， 重組質(zhì)粒Flag-FBXL15的轉(zhuǎn)染劑量為1. Oug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞；第三組(FBXL15高劑量)在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Flag-Smurf 1 (WT)和重組質(zhì)粒Flag-FBXL15，重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (WT)的轉(zhuǎn)染劑量為0. 5ug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞， 重組質(zhì)粒Flag-FBXL15的轉(zhuǎn)染劑量為2. Oug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞；第四組(無FBXL15)在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Flag-Smurf 1 (C699A)，轉(zhuǎn)染劑量為0. 5ug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞；第五組(FBXL15低劑量)在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (C699A) 和重組質(zhì)粒Flag-FBXL15，重組質(zhì)粒Flag-Smurf 1 (C699A)的轉(zhuǎn)染劑量為0. 5ug質(zhì)粒/1 X IO5 細(xì)胞，重組質(zhì)粒Flag-FBXL15的轉(zhuǎn)染劑量為1. Oug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞；第六組(FBXL15高劑量)在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (C699A) 和重組質(zhì)粒Flag-FBXL15，重組質(zhì)粒Flag-Smurf 1 (C699A)的轉(zhuǎn)染劑量為0. 5ug質(zhì)粒/1 X IO5 細(xì)胞，重組質(zhì)粒Flag-FBXL15的轉(zhuǎn)染劑量為2. Oug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞。轉(zhuǎn)染M小時(shí)后，每組細(xì)胞分成兩組(其中一組加入蛋白酶體抑制劑)，繼續(xù)培養(yǎng) 12小時(shí)，然后將各組細(xì)胞進(jìn)行western blot分析。western blot分析的一抗采用Flag抗體。以GAPDH抗體檢測(cè)的結(jié)果作為對(duì)照。結(jié)果見圖;3B。隨著Flag-FBXL15轉(zhuǎn)染劑量的增加，外轉(zhuǎn)Smurfl (WT)蛋白(野生型)水平逐步減低，這說明FBXL15可降低Smurfl(WT)蛋白的穩(wěn)定性，而該效應(yīng)可被蛋白酶體抑制劑MG132所阻斷，說明FBXL15對(duì)Smurfl (WT)蛋白的降解依賴蛋白酶體。隨著 Flag-FBXL15轉(zhuǎn)染劑量的增加，外轉(zhuǎn)Smurfl (C699A)蛋白(失活型突變體)水平逐步減低， 說明FBXL15對(duì)Smurfl蛋白的降解不依賴Smurfl自身的E3活性(cis activity)，而很有可能為反式降解(trans activity)。2、實(shí)驗(yàn) 2設(shè)置四組處理如下第一組在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (WT)，轉(zhuǎn)染劑量為0. 5ug質(zhì)粒/IX IO5細(xì)胞；第二組在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (WT)和重組質(zhì)粒 Flag-FBXL15,重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (WT)的轉(zhuǎn)染劑量為0. 5ug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞，重組質(zhì)粒Flag-FBXL15的轉(zhuǎn)染劑量為2. Oug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞；第三組在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (WT)和重組質(zhì)粒 Flag-FBXL15- Δ F，重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (WT)的轉(zhuǎn)染劑量為0. 5ug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞，重組質(zhì)粒Flag-FBXL15- Δ F的轉(zhuǎn)染劑量為2. Oug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞；第四組在ΗΕΚ293Τ細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (WT)和重組質(zhì)粒
14Flag-FBXL15-F-box,重組質(zhì)粒 Flag-Smurfl (WT)的轉(zhuǎn)染劑量為 0. 5ug 質(zhì)粒 /IX IO5 細(xì)胞， 重組質(zhì)粒Flag-FBXL15-F-box的轉(zhuǎn)染劑量為2. Oug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞。
轉(zhuǎn)染M小時(shí)后，每組細(xì)胞分成兩組(其中一組加入蛋白酶體抑制劑)，繼續(xù)培養(yǎng) 12小時(shí)，然后將各組細(xì)胞進(jìn)行western blot分析。western blot分析的一抗采用Flag抗體。以GAPDH抗體檢測(cè)的結(jié)果作為對(duì)照。
結(jié)果見圖3C。FBXL15的突變體FBXL15-Δ F、FBXL15_F_box因不能形成功能性的 SCF復(fù)合體而無法降低Smurfl的穩(wěn)定性，初步說明FBXL15發(fā)揮降解功能依賴其SCF復(fù)合體的完整性。
3、實(shí)驗(yàn) 3
另外，又考察了其它的F-box蛋白，如FBXL亞類的Skp2、FBXL3、FBXL5及FBXL21， FBXff 類的 β -Trcpl，F(xiàn)BXO 類的 FBX042 對(duì) Smurfl 的影響。ΗΕΙ^93Τ 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 Flag-Smurfl 和不同的F-box蛋白真核表達(dá)載體(BXL、FBXff, FBXO亞類的幾個(gè)蛋白真核表達(dá)載體均購(gòu)自 Origene公司)，細(xì)胞收獲后檢測(cè)Smurfl水平。發(fā)現(xiàn)除FBXL15外，其它F_box蛋白均不能降解Smurf 1，說明FBXL15對(duì)Smurfl的調(diào)控是特異的(圖3D)。
三、通過抑制FBXL15上調(diào)內(nèi)源Smurfl蛋白水平
為了在內(nèi)源條件下更真實(shí)的反映FBXL15及其復(fù)合體對(duì)內(nèi)源Smurfl蛋白水平的影響，擬考察FBXL15及復(fù)合體其它組分敲低后Smurfl內(nèi)源水平的變化。
1、設(shè)計(jì)合成如下siRNA
靴向人中FBXL15蛋白的編碼基因的siRNA(FBXL15 siRNA)
1#(序列表的序列 9) :5，-CACCCUGGAGCUUCAAAUATT-3，；
2#(序列表的序列 10) :5，-GGAACUGCCCAGAACUCCATT-3，；
3#(序列表的序列 11) :5，-GCCUGAGCCGCUUGCGGAATT-3，；
陰性對(duì)照 s iRNA 5，-UUCUCCGAAC⑶⑶CAC⑶TT-3，。
siRNA均由上海吉瑪公司負(fù)責(zé)合成。
2、實(shí)驗(yàn) 1
借助Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別將步驟1合成的l#siRNA(1#組)、姊 siRNA(2#組)、3# siRNA(3#組)和陰性對(duì)照siRNA(NC組)分別與重組質(zhì)粒Flag_FBXL15 共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，觀察siRNA對(duì)外源表達(dá)的FBXL15蛋白的敲低效率。siRNA的轉(zhuǎn)染劑量為ΙΟΟηΜ/1 X IO5細(xì)胞，重組質(zhì)粒Flag_FBXL15轉(zhuǎn)染量為0. 5ug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞。
轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收取細(xì)胞。將各組細(xì)胞進(jìn)行western blot分析。western blot 分析的一抗采用Flag抗體，以GAPDH抗體檢測(cè)的結(jié)果作為對(duì)照。western blot分析結(jié)果見圖4A，結(jié)果表明，2#、3# siRNA均可有效敲低內(nèi)源的FBXL15。
3、實(shí)驗(yàn) 2
借助Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別將步驟1合成的^siRNA (2#組)、 3#siRNA (3#組)和陰性對(duì)照siRNA (NC組)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，siRNA的轉(zhuǎn)染劑量為 ΙΟΟηΜ/ΙΧ IO5細(xì)胞，觀察2#、3# siRNA對(duì)內(nèi)源FBXL15蛋白的敲低效率。
轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收取細(xì)胞。將各組細(xì)胞進(jìn)行western blot分析。western blot 分析的一抗采用FBXL15多克隆抗體(人FBXL15多克隆抗體由北京博爾邁生物技術(shù)公司負(fù)責(zé)制備；抗原表位為序列表的序列1所示的FBXL15蛋白自N末端第1-17位氨基酸殘基組成的多肽“MEPPMEPSGGEQEPGAVC”;將抗原表位與KLH載體蛋白偶聯(lián)后免疫新西蘭大耳兔獲得抗血清，親和純化后得到多克隆抗體)，以GAPDH抗體檢測(cè)的結(jié)果作為對(duì)照。western blot 分析結(jié)果見圖4B。結(jié)果表明，2#、3#siRNA均可有效敲低內(nèi)源FBXL15的表達(dá)，其中姊siRNA 敲低效果更好。4、實(shí)驗(yàn) 3借助Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別將步驟1合成的邶siRNA (2#組)、 3# siRNA (3#組)和陰性對(duì)照siRNA (NC組)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，siRNA的轉(zhuǎn)染劑量為 ΙΟΟηΜ/ΙΧΙΟ5細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收取細(xì)胞。將各組細(xì)胞進(jìn)行western blot分析。 western blot分析的一抗分別為Smurfl抗體和FBXL15多克隆抗體。以GAPDH抗體檢測(cè)的結(jié)果作為對(duì)照。western blot分析結(jié)果見圖4C。結(jié)果表明，結(jié)果顯示敲低FBXL15后內(nèi)源 Smurfl蛋白水平呈現(xiàn)2-3倍不同程度的上調(diào)。5、實(shí)驗(yàn) 4借助Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別將步驟1合成的邶siRNA (2#組)、 3# siRNA (3#組)和陰性對(duì)照siRNA (NC組)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，siRNA的轉(zhuǎn)染劑量為 ΙΟΟηΜ/1 X IO5細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，在細(xì)胞中加入放線菌酮(cyclohemixde ；CHX)，使其終濃度為50 μ g/ml (放線菌酮的作用為終止細(xì)胞合成新的Smurfl蛋白)，分別于加入CHX后 0、4、8和12小時(shí)取細(xì)胞進(jìn)行western blot分析。western blot分析的一抗分別為Smurfl 抗體和FBXL15多克隆抗體。以GAPDH抗體檢測(cè)的結(jié)果作為對(duì)照。結(jié)果見圖4D。從加入放線菌酮開始，細(xì)胞內(nèi)的Smurfl蛋白量變化見圖4E，蛋白量下降至初始時(shí)刻蛋白量的50%的時(shí)間即為Smurfl蛋白的半衰期。結(jié)果表明，加入siRNA后內(nèi)源Smurfl的半衰期從Mi延長(zhǎng)至9h左右。綜合以上實(shí)驗(yàn)說明，F(xiàn)BXL15確實(shí)影響Smurfl的內(nèi)源蛋白穩(wěn)定性，并且該功能的發(fā)揮依賴其形成的SCF復(fù)合體。四、SCFfbxu5復(fù)合體促進(jìn)Smurfl的泛素化1、實(shí)驗(yàn) 1設(shè)置五組處理如下第一組在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒HA-Ub，轉(zhuǎn)染劑量為2. Oug質(zhì)粒/1 X IO6 細(xì)胞；第二組在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒HA-Ub和重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (WT)，重組質(zhì)粒HA-Ub的轉(zhuǎn)染劑量為2. Oug質(zhì)粒/1 X IO6細(xì)胞，重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (WT)的轉(zhuǎn)染劑量為3. Oug質(zhì)粒/1 X IO6細(xì)胞；第三組在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒HA_Ub、重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (WT)和重組質(zhì)粒Myc-FBXL15，重組質(zhì)粒HA-Ub的轉(zhuǎn)染劑量為2. Oug質(zhì)粒/1 X IO6細(xì)胞，重組質(zhì)粒 Flag-Smurfl (WT)的轉(zhuǎn)染劑量為3. Oug質(zhì)粒/1 X IO6細(xì)胞，重組質(zhì)粒Myc_FBXL15的轉(zhuǎn)染劑量為2. Oug質(zhì)粒/IX IO6細(xì)胞；第四組在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒HAIb和重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (C699A)， 重組質(zhì)粒HA-Ub的轉(zhuǎn)染劑量為2. Oug質(zhì)粒/1 X IO6細(xì)胞，重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (C699A)的轉(zhuǎn)染劑量為3. Oug質(zhì)粒/1 X IO6細(xì)胞；第五組在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒HA_Ub、重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (C699A)重組質(zhì)粒HA-Ub的轉(zhuǎn)染劑量為2. Oug質(zhì)粒/1 X IO6細(xì)胞，重組質(zhì)粒 Flag-Smurfl (C699A)的轉(zhuǎn)染劑量為3. Oug質(zhì)粒/1 X IO6細(xì)胞，重組質(zhì)粒Myc_FBXL15的轉(zhuǎn)染劑量為2. Oug質(zhì)粒/1 X IO6細(xì)胞；
轉(zhuǎn)染3 后加入蛋白酶體抑制劑(20 μ M)處理他，然后收集細(xì)胞。向細(xì)胞中補(bǔ)加 450 μ 1 RIPA 裂解液(IOmM ρΗ 7.5 Tris-HCl,5mM EDTA, 150mM NaCl, 1% Nonidet P-40， 1% sodium deoxycholate,0. 025% SDS)，并補(bǔ)加蛋白酶抑制劑(20 μ 1)和磷酸酶抑制劑 (IOmM NaF和ImM Na3VO4)，冰上裂解并短暫超聲至裂解液清亮。4°C 12000rpm離心lOmin， 取上清。50 μ 1上清(Iys樣本)進(jìn)行western blot分析。剩余的上清加入Flag抗體約 2μ g，4°C旋轉(zhuǎn)混合3-4h后加入protein A/G agarose 40 μ 1孵育過夜，離心收集agarose， 經(jīng)裂解液洗滌3次后煮樣(IP樣本)進(jìn)行western blot分析。western blot分析的一抗分別采用Flag抗體和Myc抗體。
結(jié)果見圖5A。彌散狀泳道顯示泛素化。在沒有外源FB)(L15條件下，Smurfl (WT)存在自身泛素化，Smurfl (C699A)也能檢測(cè)到微弱的泛素鏈，說明存在內(nèi)源FBXL15對(duì)Smurfl 的泛素化。當(dāng)引入外源表達(dá)的FBXL15時(shí)，Smurfl (包括野生型和C699A突變型)的泛素化水平均得到明顯的增強(qiáng)。
2、實(shí)驗(yàn) 2
靶向人中Cullinl蛋白編碼基因的siRNA(Cullinl siRNA)
1# :5，-G⑶UAUAUCA⑶UGUCUAA-3，；
2# 5，-CAACGAAGAGUUCAG⑶UU-3，。
靴向人中Rocl蛋白編碼基因的siRNA(Rocl siRNA)
1# 5，-GAAGCGCUUUGAA⑶GAAA-3，；
2# 5，-GCAUAGAAU⑶CAAGCUAA-3，。
借助Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑分別將 Cullinls iRNA(l# 和 2#)、Rocl 8士1 離(1#和姊)、步驟三的1制備的FBXL15 SiRNA ( 和3#)和步驟三的1制備的陰性對(duì)照 siRNA (NC組)和重組質(zhì)粒HA-Ub共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，siRNA的轉(zhuǎn)染劑量均為luM/1 X IO6 細(xì)胞，重組質(zhì)粒HA-Ub的轉(zhuǎn)染劑量為2. Oug質(zhì)粒/1 X IO6細(xì)胞。
轉(zhuǎn)染3 后加入蛋白酶體抑制劑(20μΜ)處理他，然后收集細(xì)胞。向細(xì)胞中補(bǔ)加450μ1 RIPA裂解液，并補(bǔ)加蛋白酶抑制劑(20μ 1)和磷酸酶抑制劑(IOmM NaF和 ImMNa3VO4)，冰上裂解并短暫超聲至裂解液清亮。4°C 12000rpm離心lOmin，取上清，加入 Smurfl抗體約4 μ g，4°C旋轉(zhuǎn)混合3_4h后加入protein A/G agarose 40 μ 1孵育過夜，離心收集agarose，經(jīng)裂解液洗滌3次后煮樣進(jìn)行western blot分析。western blot分析的一抗采用Smurfl抗體。
結(jié)果見圖5B。轉(zhuǎn)染siRNA后，SCFfbxu5復(fù)合體各組分Cullinl、Rocl及FBXL15蛋白水平均敲低，內(nèi)源Smurfl的泛素化水平削弱，這就證明FBXL15確實(shí)能夠增強(qiáng)Smurfl的泛素化水平。
實(shí)施例4、FBXL15反式調(diào)控Smurfl的功能研究(FBXL15拮抗Smurfl對(duì)BMP通路的抑制效應(yīng))
一、實(shí)驗(yàn) 1
設(shè)置十二組處理如下17
第一組在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Myc-Smadl，轉(zhuǎn)染劑量為0. 2ug質(zhì)粒 /IX IO5 細(xì)胞；第二組在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Myc-Smadl和重組質(zhì)粒 Flag-Smurfl (WT)，重組質(zhì)粒Myc-Smadl的轉(zhuǎn)染劑量為0. 2ug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞，重組質(zhì)粒 Flag-Smurfl (WT)的轉(zhuǎn)染劑量為0. 4ug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞；第三組在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Myc-Smadl、重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (WT) 和重組質(zhì)粒Flag-FBXL15，重組質(zhì)粒Myc-Smadl的轉(zhuǎn)染劑量為0. 2ug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞，重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (WT)的轉(zhuǎn)染劑量為0. 4ug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞，重組質(zhì)粒Flag_FBXL15的轉(zhuǎn)染劑量為0. Sug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞；第四組在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Myc-Smadl、重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (WT) 和重組質(zhì)粒Flag-FBXL15，重組質(zhì)粒Myc-Smadl的轉(zhuǎn)染劑量為0. 2ug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞，重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (WT)的轉(zhuǎn)染劑量為0. 4ug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞，重組質(zhì)粒Flag_FBXL15的轉(zhuǎn)染劑量為1. 2ug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞；第五組在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Myc_Smad3，轉(zhuǎn)染劑量為0. 2ug質(zhì)粒 /IX IO5 細(xì)胞；第六組在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Myc_Smad3和重組質(zhì)粒 Flag-Smurfl (WT)，重組質(zhì)粒Myc_Smad3的轉(zhuǎn)染劑量為0. 2ug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞，重組質(zhì)粒 Flag-Smurfl (WT)的轉(zhuǎn)染劑量為0. 4ug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞；第七組在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Myc_Smad3、重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (WT) 和重組質(zhì)粒Flag-FBXL15，重組質(zhì)粒Myc_Smad3的轉(zhuǎn)染劑量為0. 2ug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞，重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (WT)的轉(zhuǎn)染劑量為0. 4ug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞，重組質(zhì)粒Flag_FBXL15的轉(zhuǎn)染劑量為0. Sug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞；第八組在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Myc_Smad3、重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (WT) 和重組質(zhì)粒Flag-FBXL15，重組質(zhì)粒Myc_Smad3的轉(zhuǎn)染劑量為0. 2ug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞，重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (WT)的轉(zhuǎn)染劑量為0. 4ug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞，重組質(zhì)粒Flag_FBXL15的轉(zhuǎn)染劑量為1. 2ug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞；第九組在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Myc_Smad5，轉(zhuǎn)染劑量為0. 2ug質(zhì)粒 /IX IO5 細(xì)胞；第十組在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Myc_Smad5和重組質(zhì)粒 Flag-Smurfl (WT)，重組質(zhì)粒Myc_Smad5的轉(zhuǎn)染劑量為0. 2ug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞，重組質(zhì)粒 Flag-Smurfl (WT)的轉(zhuǎn)染劑量為0. 4ug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞；第十一組在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Myc_Smad5、重組質(zhì)粒 Flag-Smurfl (WT)和重組質(zhì)粒Flag_FBXL15，重組質(zhì)粒Myc_Smad5的轉(zhuǎn)染劑量為0. 2ug質(zhì)粒 /1 X IO5細(xì)胞，重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (WT)的轉(zhuǎn)染劑量為0. 4ug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞，重組質(zhì)粒Flag-FBXL15的轉(zhuǎn)染劑量為0. 8ug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞；第十二組在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Myc_Smad5、重組質(zhì)粒 Flag-Smurfl (WT)和重組質(zhì)粒Flag_FBXL15，重組質(zhì)粒Myc_Smad5的轉(zhuǎn)染劑量為0. 2ug質(zhì)粒 /1 X IO5細(xì)胞，重組質(zhì)粒Flag-Smurfl (WT)的轉(zhuǎn)染劑量為0. 4ug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞，重組質(zhì)粒Flag-FBXL15的轉(zhuǎn)染劑量為1. 2ug質(zhì)粒/1 X IO5細(xì)胞；
轉(zhuǎn)染36小時(shí)后，收取細(xì)胞。將各組細(xì)胞進(jìn)行western blot分析。western blot 分析的一抗分別為Myc抗體和Flag抗體。以GAPDH抗體檢測(cè)的結(jié)果作為對(duì)照。western blot分析結(jié)果見圖6A。結(jié)果顯示，Smurfl能明顯降低底物Smadl/5的蛋白水平，對(duì)非底物 Smad3沒有影響。隨著FBXL15的梯度增強(qiáng)，Smurfl蛋白水平下調(diào)，Smadl/5蛋白水平則明顯回升，說明FBXL15的表達(dá)可拮抗Smurfl對(duì)底物的降解效應(yīng)。
二、實(shí)驗(yàn) 2
設(shè)置兩組處理如下
第一組在H印G2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染實(shí)施例3的步驟三的1制備的陰性對(duì)照siRNA，siRNA 轉(zhuǎn)染劑量為80ηΜ/1Χ105細(xì)胞。
第二組在H印G2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染實(shí)施例3的步驟三的1制備的^siRNA，siRNA轉(zhuǎn)染劑量為80ηΜ/1Χ105細(xì)胞。
轉(zhuǎn)染4 后，加入BMP-2(50ng/ml)刺激H印G2細(xì)胞lh，然后更換新的細(xì)胞培養(yǎng)基， 并在不同時(shí)間點(diǎn)取樣檢測(cè)Smadl/5的磷酸化水平，來說明BMP通路被激活的程度。將各時(shí)間點(diǎn)(從更換培養(yǎng)基開始計(jì)時(shí))取樣的細(xì)胞進(jìn)行western blot分析。western blot分析的一抗分別為磷酸化Smadl/5抗體、Smadl/5抗體、Smurfl抗體和FBXL15多克隆抗體。以 GAPDH抗體檢測(cè)的結(jié)果作為對(duì)照。
western blot分析結(jié)果見圖6B。當(dāng)敲低FBXL15后，Smurfl蛋白水平在刺激后期有較明顯的上升，而磷酸化Smadl/5的水平則明顯減弱，說明BMP通路的活化程度被明顯削弱。
三、實(shí)驗(yàn)3
設(shè)置三組處理如下
第一組在H印G2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染實(shí)施例3的步驟三的1制備的陰性對(duì)照siRNA(NC 組)，siRNA的轉(zhuǎn)染劑量為50nM/5X IO4細(xì)胞。
第二組在H印G2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染實(shí)施例3的步驟三的1制備的^isiRNA( 組)， siRNA的轉(zhuǎn)染劑量為50nM/5X IO4細(xì)胞。
第三組在H印G2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染實(shí)施例3的步驟三的1制備的3# siRNA(3#組)， siRNA的轉(zhuǎn)染劑量為50nM/5X IO4細(xì)胞。
轉(zhuǎn)染3 后，每組分成兩個(gè)小組，其中一組加入BMP-2 (50ng/ml)刺激!fepG2細(xì)胞 Ih (第1組)，另一組不加入BMP-2 (第2組)。刺激結(jié)束后，!fepG2細(xì)胞經(jīng)Trizol裂解后提取RNA，后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)BMP通路靶基因IDl和 Smad6的相對(duì)變化(借助GAPDH基因調(diào)整各組細(xì)胞至相同濃度)。qRCR在Bio-Rad IQ5系統(tǒng)上進(jìn)行，結(jié)果通過Pfaffl法進(jìn)行分析。
檢測(cè)GAPDH基因的引物對(duì)如下
5，-GGGAAGGTGAAGGTCGGAGT-3，；5，-TTGAGGTCAATGAAGGGGTCA-3，。
檢測(cè)IDl基因的引物對(duì)如下
5’ -AGGCTGGATGCAGTTAAGGG-3，；5，-GACGATCGCATCTTGTGTCG-3，。
檢測(cè)Smad6基因的引物對(duì)如下
5，-TGCAACCCCTACCACTTCA-3，；5，-CGAGGAGACAGCCGAGAGT-3，。
以NC組不加入BMP-2的小組中目的基因的表達(dá)量作為100%，計(jì)算各個(gè)處理組的19相對(duì)表達(dá)量，見圖6C。結(jié)果顯示，在BMP刺激條件下，敲低FBXL15后BMP通路靶基因(如 IDl、Smad6)的表達(dá)水平受到明顯抑制。以上這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)，F(xiàn)BXL15確實(shí)可通過抑制Smurfl 來增強(qiáng)BMP通路的活性，是BMP通路的一個(gè)正向調(diào)控因子。
實(shí)施例5、FBXL15增強(qiáng)成骨細(xì)胞的分化
1、在24孔板中加入含10%胎牛血清(GIBCO)的α -MEM培養(yǎng)基(Hyclone)，每孔 500微升，然后每孔接種0. 5 X IO5個(gè)UMR106細(xì)胞。
2、待細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度約70%時(shí)，設(shè)置以下三組處理(每組設(shè)置三個(gè)復(fù)孔)
第一組(Flag-FBXL15-Δ F 組；第 1 組)利用 Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑 (Invitrogen)將重組質(zhì)粒Flag_FBXL15_ Δ F轉(zhuǎn)染細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)與質(zhì)粒比例為1 X IO5個(gè)細(xì)胞Iyg質(zhì)粒；
第二組(Flag_FBXL15組；第2組)利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒Flag-FBXL15轉(zhuǎn)染細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)與質(zhì)粒比例為1 X IO5個(gè)細(xì)胞= Iyg質(zhì)粒；
第三組(pFlag-CMV-2組；第3組)利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將 pFlag-CMV-2表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)與質(zhì)粒比例為1 X IO5個(gè)細(xì)胞1 μ g質(zhì)粒。
3、轉(zhuǎn)染4 后，吸棄上清，每孔加入500微升誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含100 μ g/ml維生素C、 5mM β-甘油磷酸鈉、100ng/ml BMP-2的α-MEM培養(yǎng)基)進(jìn)行誘導(dǎo)。
4、誘導(dǎo)7 后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，然后用ALP染色試劑盒(Sigma，產(chǎn)品目錄號(hào)為86-C)染色并用ALP活性測(cè)定試劑盒(WakhLabAssay ALP)進(jìn)行活性測(cè)定(ALP染色和活性檢測(cè)方法均按試劑盒說明書進(jìn)行)。
空白孔不接種細(xì)胞且不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，其它同上。
ALP染色后的細(xì)胞照片見圖7?？梢娕c第三組相比，第一組(Flag-FBXL15_ Δ F組) 成骨細(xì)胞的數(shù)量顯著降低，第二組(Flag-FBXL15組)成骨細(xì)胞的數(shù)量顯著升高，即FBXL15 蛋白促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，F(xiàn)BXL15-AF蛋白抑制成骨細(xì)胞分化。
ALP活性檢測(cè)試劑盒利用對(duì)硝基苯酚磷酸鹽(p-Nitrophenylphosphate)在pH9. 8 緩沖液中可被堿性磷酸酶(ALP)水解為對(duì)硝基苯酚(p-Nitrophenol)和磷酸鹽，釋放的對(duì)硝基苯酚在溶液中呈現(xiàn)黃色的特性，通過測(cè)定黃色溶液的吸光度來反映對(duì)硝基苯酚的濃度從而表征ALP的活性。因此ALP活性測(cè)定試劑盒得到的原始結(jié)果為405nm波長(zhǎng)下溶液的吸光值(A)。用對(duì)硝基苯酚制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，函數(shù)式為y (吸光值)=1.2Xx(對(duì)硝基苯酚濃度)。
ALP的相對(duì)活性通過下面公式換算得到
ALP 舌個(gè)生(nmol p-NP/min/mg protein) = C*a/t*c ；
C 樣品中對(duì)硝基苯酚的濃度，A樣品-Ase (nmol/uL)；
a:樣品的稀釋倍數(shù)；
t 反應(yīng)時(shí)間(min)；
c 樣品中蛋白含量(mg/uL)；
pFlag-CMV-2 組的 ALP 活性為 105. 5士 10. 3，F(xiàn)lag_FBXL15_ΔF 組的 ALP 活性為 94. 7 士 14. 7，F(xiàn)lag-FBXL15 組的 ALP 活性為 170. 7 士 18. 5。
各組的ALP活性比較見圖8。結(jié)果顯示，F(xiàn)BXL15表達(dá)能明顯增強(qiáng)成骨細(xì)胞的分化， FBXL15-Δ F則表現(xiàn)出顯性負(fù)效應(yīng)，一定程度上抑制成骨細(xì)胞的分化。
權(quán)利要求
1.FBXL15蛋白、所述FBXL15蛋白的編碼基因或含有所述編碼基因的重組表達(dá)載體在如下①或②中的應(yīng)用①促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化；②制備促進(jìn)所述成骨細(xì)胞分化的產(chǎn)品； 所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)；所述FBXL15蛋白的編碼基因是如下⑴或⑵或(3)所述的DNA分子(1)序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子；(3)與(1)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白的 DNA分子。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述成骨細(xì)胞為UMR106細(xì)胞。
3.FBXL15蛋白或其編碼基因在如下③或④中的應(yīng)用③促進(jìn)Smurfl蛋白的降解；④制備促進(jìn)所述Smurfl蛋白降解的產(chǎn)品； 所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)；所述FBXL15蛋白的編碼基因是如下⑴或⑵或(3)所述的DNA分子(1)序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子；(3)與(1)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白的 DNA分子；所述Smurfl蛋白是如下(c)或(d)(c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(d)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列3衍生的蛋白質(zhì)。
4.FBXL15蛋白或其編碼基因在如下⑤或⑥中的應(yīng)用⑤促進(jìn)Smurfl蛋白的泛素化；⑥制備促進(jìn)所述Smurfl蛋白泛素化的產(chǎn)品； 所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)；所述FBXL15蛋白的編碼基因是如下⑴或⑵或(3)所述的DNA分子 (1)序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子；(3)與(1)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白的 DNA分子；所述Smurfl蛋白是如下(c)或(d)(c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(d)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列3衍生的蛋白質(zhì)。
5.FBXL15蛋白或其編碼基因在如下⑦或⑧中的應(yīng)用⑦增強(qiáng)BMP通路活性；⑧制備增強(qiáng)所述BMP通路活性的產(chǎn)品；所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)；所述FBXL15蛋白的編碼基因是如下⑴或(2)或(3)所述的DNA分子(1)序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子；(3)與(1)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白的 DNA分子。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述FBXL15蛋白通過抑制Smurfl蛋白增強(qiáng)BMP通路活性；所述Smurfl蛋白是如下(c)或(d)(c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(d)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列3衍生的蛋白質(zhì)。
7.核酸，為序列表的序列10所示核酸、序列表的序列11所示核酸或序列表的序列9所示核酸。
8.FBXL15蛋白的抑制劑在降低FBXL15蛋白的編碼基因的表達(dá)量中的應(yīng)用；所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
9.FBXL15 蛋白的抑制劑在如下(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)或(VIII)中的應(yīng)用(I)延長(zhǎng)細(xì)胞和/或組織和/或生物體內(nèi)源Smurfl蛋白的半衰期；(II)抑制所述Smurfl蛋白的降解；(III)抑制所述Smurfl蛋白的泛素化；(IV)抑制BMP通路活性；(V)制備延長(zhǎng)細(xì)胞和/或組織和/或生物體內(nèi)源Smurfl蛋白的半衰期的產(chǎn)品；(VI)制備抑制所述Smurfl蛋白降解的產(chǎn)品；(VII)制備抑制所述Smurfl蛋白泛素化的產(chǎn)品；(VIII)制備抑制BMP通路活性的產(chǎn)品； 所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)；所述Smurfl蛋白是如下(c)或(d)(c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(d)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列3衍生的蛋白質(zhì)。
10.如權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征在于所述抑制劑為權(quán)利要求7所述的核酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種FBXL15蛋白及其抑制劑以及它們的應(yīng)用。本發(fā)明保護(hù)FBXL15蛋白、所述FBXL15蛋白的編碼基因或含有所述編碼基因的重組表達(dá)載體在促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化中的應(yīng)用。FBXL15蛋白或其編碼基因還可用于促進(jìn)Smurf1蛋白的降解、促進(jìn)Smurf1蛋白的泛素化、增強(qiáng)BMP通路活性。所述FBXL15蛋白是由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。FBXL15本身能明顯增強(qiáng)成骨細(xì)胞的分化，即促進(jìn)骨形成，可用于治療骨質(zhì)疏松等疾病。
文檔編號(hào)C07K14/47GK102504021SQ201110375338
公開日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月3日
發(fā)明者何珊, 崔宇, 張令強(qiáng), 賀福初, 邢桂春 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所