本發(fā)明涉及具有ω-3去飽和酶活性的新型多肽及編碼該多肽的基因、以及它們用于生成二十碳五烯酸的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：高度不飽和脂肪酸是具有2個以上不飽和鍵的脂肪酸，可列舉ω-6不飽和脂肪酸的亞油酸(la，18:2n-6)、γ-亞麻酸(gla，18:3n-6)、花生四烯酸(ara，20:4n-6)，ω-3不飽和脂肪酸的α-亞麻酸(ala，18:3n-3)、二十碳四烯酸(eta，20:4n-3)、二十碳五烯酸(epa，20:5n-3)、二十二碳六烯酸(dha，22:6n-3)等。高度不飽和脂肪酸除了作為生物體膜的主要構(gòu)成成分參與膜的流動性調(diào)節(jié)之外，作為生物體功能性成分的前體也很重要。ara或epa在高等動物體內(nèi)是前列腺素、血栓素、白三烯等的前體，dha是腦內(nèi)存在最多的高度不飽和脂肪酸。epa具有血小板聚集抑制作用、血中中性脂肪減少作用、抗動脈硬化作用、血液粘度降低作用、降血壓作用、抗炎作用、抗腫瘤作用等生理作用，被用于藥品、食品、化妝品、飼料等各種領(lǐng)域。此外，近年來，從預(yù)防生活習(xí)慣病的觀點(diǎn)來看，推薦積極攝取ω-3不飽和脂肪酸，是需求增加顯著的脂質(zhì)分子種類。生物體的dha或epa除了從食物攝取以外，在一部分生物中由ala進(jìn)行生物合成。另一方面，由于人無法生物合成ala，因此dha或epa對于人來說在營養(yǎng)學(xué)上是必需脂肪酸。epa主要大量包含于鱈魚、鯡魚、青花魚、鮭魚、沙丁魚、磷蝦等的魚油，利文斯頓島希瓦氏菌(shewanellalivingstonensis)等海洋性低溫細(xì)菌，網(wǎng)粘菌綱(labyrinthulomycetes)等的藻類等中。已知從這些生物資源中提取或純化epa的方法。最常進(jìn)行的是從魚油中純化epa。然而，魚油中的epa含量低，而且來源于魚油的epa根據(jù)提取或純化的方法還存在著殘留魚腥味、或被視為心臟病原因的芥酸的含量增加的問題。近年來，關(guān)系到能量問題等，在細(xì)胞內(nèi)蓄積脂質(zhì)的產(chǎn)脂質(zhì)微生物受到矚目，開發(fā)了以微生物學(xué)方式生產(chǎn)各種脂質(zhì)的方法。例如，利用作為絲狀菌的1種的屬于被孢霉屬(mortierella)的微生物的高度不飽和脂肪酸的生產(chǎn)方法的研究正在進(jìn)行。已知被孢霉屬微生物具有ω-3或ω-6高度不飽和脂肪酸代謝途徑，并生產(chǎn)epa(非專利文獻(xiàn)1)。在專利文獻(xiàn)1中揭示了培養(yǎng)產(chǎn)生epa的被孢霉屬微生物而獲得epa的方法。在專利文獻(xiàn)2中揭示了使用對高山被孢霉(mortierellaalpina)施行突變處理而得的突變株來生產(chǎn)ara或epa的方法。在專利文獻(xiàn)3中揭示了使用將由高山被孢霉分離的ω-3去飽和多肽的基因?qū)虢湍钢卸玫霓D(zhuǎn)化株來生產(chǎn)epa等高度不飽和脂肪酸的方法。但是，被孢霉屬微生物的ω-3去飽和酶的最適溫度低，在菌容易增殖的常溫條件(20℃左右)下無法充分地發(fā)揮作用。因此，即使以通常的培養(yǎng)溫度培養(yǎng)被孢霉屬微生物，也無法高效地生產(chǎn)epa。另外，被孢霉屬微生物的ω-3去飽和酶優(yōu)先與碳鏈長為18的脂肪酸作用，因此利用上述被孢霉屬微生物的以往的方法難以高效地生產(chǎn)碳鏈長為20的epa。因此，需要可以由碳鏈長為20的脂肪酸(例如ara)高效地合成epa的ω-3去飽和酶。專利文獻(xiàn)4中記載了由異絲水霉(saprolegniadiclina)分離的ω-3去飽和酶，專利文獻(xiàn)5中記載了由櫟樹猝死病菌(phytophthoraramorum)分離的δ17去飽和酶，專利文獻(xiàn)6中記載了由瓜果腐霉(pythiumaphanidermatum)分離的δ17去飽和酶?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1:日本特開昭63-14697號公報(bào)專利文獻(xiàn)2:日本特開平11-243981號公報(bào)專利文獻(xiàn)3:日本特開2006-055104號公報(bào)專利文獻(xiàn)4:日本特表2005-515776號公報(bào)專利文獻(xiàn)5:日本特表2009-534032號公報(bào)專利文獻(xiàn)6:日本特表2010-508019號公報(bào)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1:appl.microbiol.biotecnol.,1989,32:1-4。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明所要解決的技術(shù)問題本發(fā)明涉及提供即使在20℃以上的常溫下也具有高的酶活性的ω-3去飽和酶、及具有該ω-3去飽和酶且可高效地生產(chǎn)以高濃度含有epa等ω-3不飽和脂肪酸的油脂的產(chǎn)脂質(zhì)細(xì)胞。另外，本發(fā)明還涉及提供利用了該產(chǎn)脂質(zhì)細(xì)胞的含有大量epa的油脂的工業(yè)生產(chǎn)手段。解決技術(shù)問題用的手段發(fā)明人經(jīng)過各種研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了，即使在常溫下也對碳數(shù)20的脂肪酸具有高ω-3去飽和活性的新型ω-3去飽和酶及編碼該酶的基因。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)在導(dǎo)入有編碼上述ω-3去飽和酶的基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，在常溫下epa等c20的ω-3不飽和脂肪酸的生產(chǎn)效率提高。即，本發(fā)明提供一種多肽，所述多肽由與seqidno:2所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列構(gòu)成，并且具有對于碳數(shù)20的脂肪酸的ω-3去飽和活性；此外，本發(fā)明還提供編碼上述多肽的多核苷酸；此外，本發(fā)明還提供含有上述多核苷酸的載體；此外，本發(fā)明還提供導(dǎo)入有上述多核苷酸的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；進(jìn)而，本發(fā)明提供含二十碳五烯酸的脂質(zhì)的生產(chǎn)方法，該方法包括：培養(yǎng)表達(dá)上述多肽的細(xì)胞；進(jìn)而，本發(fā)明提供二十碳五烯酸的生產(chǎn)方法，該方法包括：純化通過上述方法生產(chǎn)的含二十碳五烯酸的脂質(zhì)。發(fā)明的效果本發(fā)明的ω-3去飽和酶在細(xì)胞容易增殖的20℃以上的常溫條件下對于碳數(shù)20的脂肪酸具有高ω-3去飽和活性，可在epa等c20的ω-3不飽和脂肪酸的生物合成中發(fā)揮作用。因此，如果培養(yǎng)表達(dá)本發(fā)明的ω-3去飽和酶的細(xì)胞，則該細(xì)胞內(nèi)可高效地生產(chǎn)epa等c20的ω-3不飽和脂肪酸。epa是在藥品、食品、化妝品、飼料等各種領(lǐng)域中被使用的重要的高度不飽和脂肪酸，所以可適用于epa的工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)的本發(fā)明在該領(lǐng)域非常有用。附圖說明圖1是高山被孢霉(mortierellaalpina)1s-4中的脂肪酸生物合成途徑；圖2是高山被孢霉用轉(zhuǎn)化二元載體的例子；圖3是實(shí)施例3和5中所制作的ω-3去飽和酶基因?qū)敫呱奖绘呙怪甑闹舅嵘a(chǎn)量。a:1ml培養(yǎng)液中的各脂肪酸的生產(chǎn)量(mg)，b:1mg干燥菌體中的各脂肪酸的生產(chǎn)量(mg)，c:相對于總脂肪酸量的各脂肪酸的組成(%)。宿主株:對照，g#18和g#22:實(shí)施例3中制作的株，c#14和c#16:實(shí)施例5中制作的株。具體實(shí)施方式本說明書中，只要沒有另行定義，關(guān)于氨基酸序列或核苷酸序列中的氨基酸或核苷酸的缺失、取代、添加或插入所使用的“一個或多個”可以是例如1～20個，較好是1～10個，更好是1～5個，進(jìn)一步更好是1～4個，又更好是1～3個，又進(jìn)一步更好是1～2個。此外，本說明書中，氨基酸或核苷酸的“添加”包括在序列的一個末端或兩個末端添加一個或多個氨基酸或核苷酸。本說明書中，氨基酸序列或核苷酸序列的同源性可使用karlin和altschul的算法blast(pro.natl.acad.sci.usa,1993,90:5873-5877)或者fasta(methodsenzymol.,1990,183:63-98)來決定?；谠撍惴╞last，開發(fā)了被稱為blastn或blastx的程序(j.mol.biol.,1990,215:403-410)?；赽last，通過blastn來分析核苷酸序列的情況下，參數(shù)設(shè)為例如score=100，wordlength=12。此外，基于blast，通過blastx來分析氨基酸序列的情況下，參數(shù)設(shè)為例如score=50，wordlength=3。使用blast和gappedblast程序的情況下，使用各程序的缺省參數(shù)(defaultparameter)。這些分析方法的具體手法是公知的(參照www.ncbi.nlm.nih.gov)。本說明書中，“嚴(yán)格條件”是指同源性高的核苷酸序列彼此之間，例如具有90%以上、95%以上、98%以上或99%以上的同源性的核苷酸序列彼此之間雜交、而同源性較其低的核苷酸序列彼此之間不雜交的條件。更具體來說，本說明書中的“嚴(yán)格條件”是指可根據(jù)所要求的同源性的高低而改變合適的條件。越是更高嚴(yán)格條件，那么僅同源性更高的序列雜交。作為低嚴(yán)格條件的例子，可列舉5×ssc、5×鄧哈特溶液(denhardt'ssolution)、0.5%sds、50%甲酰胺、32～50℃左右的洗滌條件。作為高嚴(yán)格條件的例子，可列舉6×ssc、0.01medta、1×鄧哈特溶液、0.5%sds、55～68℃左右，或者5×ssc、5×鄧哈特溶液、0.5%sds、50%甲酰胺、55～68℃左右的洗滌條件。作為其他影響雜交的要素，還可考慮探針的濃度或長度、反應(yīng)時間等多種要素。如果是本領(lǐng)域技術(shù)人員，則可參照例如sambrook等,《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(molecularcloning,alaboratorymanual,3rded,coldspringharborlaboratory)(2001)，對上述的條件或要素進(jìn)行適當(dāng)選擇而決定適當(dāng)?shù)膰?yán)格度。本說明書中，目標(biāo)氨基酸序列或核苷酸序列上的、與特定的氨基酸序列或核苷酸序列上的特定的位置或區(qū)域相對的“對應(yīng)位置”或“對應(yīng)區(qū)域”可通過將目標(biāo)氨基酸序列或核苷酸序列與作為基準(zhǔn)的特定序列(參照序列)對齊(序列比對,alignment)以使對各氨基酸序列或核苷酸序列中存在的保守氨基酸殘基或核苷酸賦予最大同源性來決定。序列比對可使用公知的算法來實(shí)施，其順序是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如，序列比對可基于上述的立普曼-帕森(lipman-pearson)法等通過人工操作進(jìn)行，也可通過以缺省設(shè)定使用clustalw多序列比對程序(thompson,j.d.等,1994,nucleicacidsres.,22:4673-4680)來進(jìn)行?；蛘撸€可使用作為clustalw的修訂版的clustalw2或clustalomega。clustalw、clustalw2和clustalomega可在例如歐洲生物信息研究所(europeanbioinformaticsinstitute:ebi[www.ebi.ac.uk/index.html])或國立遺傳學(xué)研究所運(yùn)營的日本dna數(shù)據(jù)庫(ddbj[www.ddbj.nig.ac.jp/welcome-j.html])的網(wǎng)站上利用。本說明書中，“ω-6高度不飽和脂肪酸代謝途徑”是指由亞油酸(la，18:2n-6)生產(chǎn)γ-亞麻酸(gla，18:3n-6)、雙高-γ-亞麻酸(dgla，20:3n-6)、花生四烯酸(ara，20:4n-6)等ω-6高度不飽和脂肪酸的代謝途徑，“ω-3高度不飽和脂肪酸代謝途徑”是指由α-亞麻酸(ala，18:3n-3)生產(chǎn)十八碳四烯酸(sda，18:4n-3)、二十碳四烯酸(eta，20:4n-3)、二十碳五烯酸(epa，20:5n-3)等ω-3高度不飽和脂肪酸的代謝途徑(參照圖1)。此外，本說明書中，“高度不飽和脂肪酸”是指碳鏈長為18以上且不飽和鍵數(shù)為2以上的長鏈脂肪酸。另外，本說明書中，“c20的ω-3不飽和脂肪酸”是指碳數(shù)20的ω-3高度不飽和脂肪酸，作為其例子，可列舉epa、eta。本說明書中，“去飽和活性”是指向脂肪酸鏈中引入碳-碳雙鍵的活性，“去飽和酶”是指具有該去飽和活性的蛋白質(zhì)或多肽。去飽和活性和去飽和酶根據(jù)通過該活性而引入了碳-碳雙鍵的脂肪酸上的位置進(jìn)一步被分類。例如，“ω-3去飽和活性”是指向自脂肪酸的ω末端起第3位與第4位碳之間引入雙鍵的活性，“ω-3去飽和酶”是指具有該活性且產(chǎn)生ω-3不飽和脂肪酸的酶。例如，ω-3去飽和酶可包括：由la(18:2n-6)向ala(18:3n-3)轉(zhuǎn)變的轉(zhuǎn)換酶、由gla(18:3n-6)向sda(18:4n-3)轉(zhuǎn)變的轉(zhuǎn)換酶、由dgla(20:3n-6)向eta(20:4n-3)轉(zhuǎn)變的轉(zhuǎn)換酶、以及由ara(20:4n-6)向epa(20:5n-3)轉(zhuǎn)變的轉(zhuǎn)換酶。本說明書中，“δ17去飽和活性”是指向自脂肪酸的羧基末端起第17位與第18位碳之間引入雙鍵的活性，“δ17去飽和酶”是指具有該活性且產(chǎn)生δ17不飽和脂肪酸的酶。例如，δ17去飽和酶可包括：由dgla(20:3n-6)向eta(20:4n-3)轉(zhuǎn)變的轉(zhuǎn)換酶、以及由ara(20:4n-6)向epa(20:5n-3)轉(zhuǎn)變的轉(zhuǎn)換酶?！唉?3去飽和酶”和“δ17去飽和酶”對于碳數(shù)20的脂肪酸向同樣的位置(自ω末端起第3位與第4位碳之間=自羧基末端起第17位與第18位碳之間)引入不飽和鍵。因此，本說明書中，“對于碳數(shù)20的脂肪酸的ω-3去飽和活性”可換言之為“δ17去飽和活性”。本說明書中，“在常溫下具有酶活性”是指酶活性的最適溫度為20℃以上、較好是20～40℃，或者20℃時具有最適溫度下的活性的70%以上、較好是80%以上的活性。例如，本說明書中，酶“在常溫下具有對于碳數(shù)20的脂肪酸的ω-3去飽和活性”是指該酶對于碳數(shù)20的脂肪酸的ω-3去飽和活性的最適溫度為20～40℃，或者20℃時的該酶對于碳數(shù)20的脂肪酸的ω-3去飽和活性相對于該酶在最適溫度下對于碳數(shù)20的脂肪酸的ω-3去飽和活性為70%以上，較好是80%以上。本說明書中，對于微生物的功能或特性、性狀(trait,形質(zhì))使用的術(shù)語“本來”是用來表示該功能或特性、性狀存在于該微生物的野生型中。對照性地，術(shù)語“外源”用于表示不是一開始就存在于該微生物中、而是從外部引入的功能或特性、性狀。例如，從外部引入某種微生物的基因?yàn)橥庠椿?。外源基因可以是來源于與引入有該基因的微生物同種的微生物的基因，也可以是來源于不同種生物的基因。通過本發(fā)明提供的ω-3去飽和酶是由與seqidno:2所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列構(gòu)成，且在常溫下具有對于碳數(shù)20的脂肪酸的ω-3去飽和活性的多肽。作為該多肽的例子，可列舉由以下的氨基酸序列構(gòu)成，且在常溫下具有對于碳數(shù)20的脂肪酸的ω-3去飽和活性的多肽。(a)seqidno:2所示的氨基酸序列；(b)與seqidno:2所示的氨基酸序列具有90%以上、較好是95%以上、更好是98%以上、進(jìn)一步更好是99%以上的同源性的氨基酸序列；(c)seqidno:2所示的氨基酸序列中，有一個或多個氨基酸被施行了選自缺失、取代、插入和添加的突變而獲得的氨基酸序列；(d)seqidno:4所示的氨基酸序列；(e)與seqidno:4所示的氨基酸序列具有90%以上、較好是95%以上、更好是98%以上、進(jìn)一步更好是99%以上的同源性的氨基酸序列；(f)seqidno:4所示的氨基酸序列中，有一個或多個氨基酸被施行了選自缺失、取代、插入和添加的突變而獲得的氨基酸序列。對于上述氨基酸序列中的氨基酸的缺失、取代、插入和添加的位置無特別限定，只要在突變后的多肽中保持常溫下的對于碳數(shù)20的脂肪酸的ω-3去飽和活性即可。另外，作為本發(fā)明的ω-3去飽和酶，可列舉在上述的(a)～(f)所示的氨基酸序列中各氨基酸可被屬于性質(zhì)類似的氨基酸組的氨基酸取代的蛋白。被類似的氨基酸取代的位置和數(shù)目沒有特別限定，只要取代后的多肽中保持常溫下的對于碳數(shù)20的脂肪酸的ω-3去飽和活性即可。作為性質(zhì)類似的氨基酸，可列舉例如甘氨酸和丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸和異亮氨酸、絲氨酸和蘇氨酸、天冬氨酸和谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺、賴氨酸和精氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸等。較好是本發(fā)明的ω-3去飽和酶為在常溫下、較好是20℃～40℃的溫度下對碳數(shù)20的脂肪酸特異性作用的ω-3去飽和酶。seqidno:2和seqidno:4所示的ω-3去飽和酶均為來源于作為鞭毛菌的1種的plectospiramyriandra的酶。blast分析的結(jié)果表明，seqidno:2和seqidno:4所示的ω-3去飽和酶相互具有約98.9%的高氨基酸序列同源性；另一方面，是具有與公知的蛋白質(zhì)極不相同的氨基酸序列的新的多肽。seqidno:2和seqidno:4所示的ω-3去飽和酶的氨基酸序列與來源于水霉(saprolegnia)等的公知的ω-3去飽和酶(例如專利文獻(xiàn)4～6所揭示的ω-3去飽和酶)的氨基酸序列的序列同源性最高為70%。本發(fā)明人以plectospiramyriandra的基因組為基礎(chǔ)構(gòu)建了由編碼ω-3去飽和酶的假定orf構(gòu)成的多核苷酸。該多核苷酸是由seqidno:1所示的核苷酸序列構(gòu)成的、編碼seqidno:2所示的本發(fā)明的ω-3去飽和酶的多核苷酸。此外，本發(fā)明人通過以plectospiramyriandra的mrna為靶的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得了由seqidno:3所示的核苷酸序列構(gòu)成的cdna。這是編碼seqidno:4所示的本發(fā)明的ω-3去飽和酶的多核苷酸。因此，由seqidno:1或seqidno:3所示的核苷酸序列構(gòu)成的多核苷酸均為不包含內(nèi)含子序列的多核苷酸，是與plectospiramyriandra細(xì)胞內(nèi)存在的基因組dna不同的多核苷酸。因此，本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明的ω-3去飽和酶的多核苷酸(以下也稱為本發(fā)明的ω-3去飽和酶基因)。作為本發(fā)明的ω-3去飽和酶基因的例子，可列舉由以下所示的核苷酸序列構(gòu)成的、編碼在常溫下具有對于碳數(shù)20的脂肪酸的ω-3去飽和活性的多肽的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈。(a)seqidno:1所示的核苷酸序列；(b)與seqidno:1所示的核苷酸序列具有90%以上、較好是95%以上、更好是98%以上、進(jìn)一步更好是99%以上的同源性的核苷酸序列；(c)seqidno:1所示的核苷酸序列中，有一個或多個核苷酸被施行了選自缺失、取代、插入和添加的突變而獲得的核苷酸序列；(d)在嚴(yán)格條件下與seqidno:1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；(e)seqidno:3所示的核苷酸序列；(f)與seqidno:3所示的核苷酸序列具有90%以上、較好是95%以上、更好是98%以上、進(jìn)一步更好是99%以上的同源性的核苷酸序列；(g)seqidno:3所示的核苷酸序列中，有一個或多個核苷酸被施行了選自缺失、取代、插入和添加的突變而獲得的核苷酸序列；或者(h)在嚴(yán)格條件下與seqidno:3所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。對于上述核苷酸序列中的核苷酸的缺失、取代、插入和添加的位置無特別限定，只要突變后的多核苷酸所編碼的多肽保持常溫下對于碳數(shù)20的脂肪酸的ω-3去飽和活性即可。本發(fā)明的ω-3去飽和酶可按照公知的方法、較好是化學(xué)合成法或生物學(xué)合成法制造。作為化學(xué)合成法的例子，可列舉通過常規(guī)方法對側(cè)鏈官能團(tuán)進(jìn)行了保護(hù)的各氨基酸依次結(jié)合而伸長肽鏈的方法。作為生物學(xué)合成法的例子，可列舉由本發(fā)明的ω-3去飽和酶基因表達(dá)本發(fā)明的ω-3去飽和酶后，分離所生成的酶，根據(jù)需要進(jìn)一步純化的方法。以下，對本發(fā)明的ω-3去飽和酶基因的生物學(xué)合成法進(jìn)行更詳細(xì)的說明。首先，制備本發(fā)明的ω-3去飽和酶基因。該基因可基于本發(fā)明的ω-3去飽和酶的氨基酸序列、或plectospiramyriandra等微生物的基因組dna的序列信息，按照公知的方法通過化學(xué)合成法制造，或者可從上述的plectospiramyriandra等微生物分離。從微生物分離本發(fā)明的ω-3去飽和酶基因的情況下，例如可由該微生物的總rna制作cdna文庫，通過從該cdna文庫的篩選來分離作為目標(biāo)的本發(fā)明的基因的cdna。篩選時，基于本發(fā)明的基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)探針或引物，選擇與該探針或引物在嚴(yán)格條件下雜交的cdna即可。或者，可以通過序列特異性逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，由該微生物的總rna選擇性地合成目標(biāo)cdna。所選擇的cdna可通過pcr等公知的方法進(jìn)行擴(kuò)增?；蛘?，本發(fā)明的ω-3去飽和酶基因可以通過利用紫外線照射或位點(diǎn)特異性突變引入之類的公知的突變引入法向按照上述順序分離或合成的基因中引入突變來制作。例如，對于seqidno:1或seqidno:3所示的多核苷酸用公知的方法引入突變，獲得突變多核苷酸。通過考察由該突變多核苷酸表達(dá)的多肽的ω-3去飽和活性而選擇編碼具有所期望的活性的多肽的多核苷酸，可獲得本發(fā)明的ω-3去飽和酶基因。另外，按上述順序制備的本發(fā)明的ω-3去飽和酶基因，較好是結(jié)合引入該基因并使之表達(dá)的細(xì)胞中的密碼子使用頻率，將密碼子最優(yōu)化。各種生物使用的密碼子的信息可從codonusagedatabase(www.kazusa.or.jp/codon)獲得。例如，結(jié)合高山被孢霉(mortierellaalpina)的密碼子使用頻率(www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgispecies=64518)將seqidno:1和seqidno:3所示的ω-3去飽和酶基因進(jìn)行密碼子最優(yōu)化的情況下，分別成為seqidno:5和seqidno:6所示的多核苷酸。因此，作為本發(fā)明的ω-3去飽和酶基因，可列舉以由上述(a)～(h)所示的核苷酸序列構(gòu)成的多核苷酸為基礎(chǔ)，結(jié)合各種生物的密碼子使用頻率將密碼子最優(yōu)化而得的多核苷酸。接著，由所制備的本發(fā)明的ω-3去飽和酶基因表達(dá)本發(fā)明的ω-3去飽和酶。該酶可通過無細(xì)胞系統(tǒng)來表達(dá)，也可將本發(fā)明的ω-3去飽和酶基因?qū)胨拗骷?xì)胞中獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使本發(fā)明的ω-3去飽和酶在該轉(zhuǎn)化細(xì)胞中表達(dá)。作為導(dǎo)入本發(fā)明的ω-3去飽和酶基因的宿主細(xì)胞，較好是細(xì)菌、真菌、藻類等微生物的細(xì)胞，但無特別限定。向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入基因時，可使用包含本發(fā)明的ω-3去飽和酶基因的載體。用于導(dǎo)入的載體的種類可根據(jù)宿主細(xì)胞的種類、或克隆的方法、基因表達(dá)的方法等適當(dāng)選擇。例如，由存在于細(xì)胞的基因組外的載體上的基因直接表達(dá)本發(fā)明的ω-3去飽和酶的情況下，較好是使用表達(dá)載體。將本發(fā)明的ω-3去飽和酶基因整合至適當(dāng)?shù)妮d體中，將所得的包含本發(fā)明的ω-3去飽和酶基因的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。向細(xì)胞中導(dǎo)入載體時，可使用電穿孔法、粒子槍(基因槍)法、感受態(tài)細(xì)胞法、原生質(zhì)體法、磷酸鈣共沉淀法、根癌農(nóng)桿菌(agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(atmt)法及其改變法(appl.environ.microbiol.,2009,75:5529-5535)等公知的方法。這時，如果事先向載體中整合適當(dāng)?shù)臉?biāo)志基因(markergene)，則能夠以標(biāo)志(marker)的表達(dá)為指標(biāo)，選出導(dǎo)入了包含本發(fā)明的基因的載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。通過上述轉(zhuǎn)化細(xì)胞，表達(dá)本發(fā)明的ω-3去飽和酶。所表達(dá)的本發(fā)明的ω-3去飽和酶可通過公知的蛋白質(zhì)的分離或純化法進(jìn)行分離、以及根據(jù)需要進(jìn)行純化。本發(fā)明的ω-3去飽和酶在細(xì)胞容易增殖的常溫、例如20℃以上的溫度條件下具有高的ω-3去飽和活性，可在epa等c20的ω-3不飽和脂肪酸的生物合成中發(fā)揮作用。因此，如果在常溫下培養(yǎng)表達(dá)本發(fā)明的ω-3去飽和酶的細(xì)胞，則該細(xì)胞容易增殖，且利用在該增殖了的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的本發(fā)明的ω-3去飽和酶進(jìn)行c20的ω-3不飽和脂肪酸的生物合成，因此可高效地生產(chǎn)epa等c20的ω-3不飽和脂肪酸。因此，本發(fā)明提供c20的ω-3不飽和脂肪酸的生產(chǎn)方法，該方法包括：培養(yǎng)表達(dá)本發(fā)明的ω-3去飽和酶的細(xì)胞。作為c20的ω-3不飽和脂肪酸，可列舉eta和epa，較好是epa。此外，本發(fā)明還提供含epa的脂質(zhì)的生產(chǎn)方法，該方法包括：培養(yǎng)表達(dá)本發(fā)明的ω-3去飽和酶的細(xì)胞。進(jìn)而本發(fā)明提供epa的生產(chǎn)方法，該方法包括：純化通過上述本發(fā)明的含epa的脂質(zhì)的生產(chǎn)方法生產(chǎn)的含epa的脂質(zhì)。作為上述表達(dá)本發(fā)明的ω-3去飽和酶的細(xì)胞，可以是本來就表達(dá)該酶的細(xì)胞，或者也可以是經(jīng)過改變而表達(dá)該酶的細(xì)胞。作為本來就表達(dá)本發(fā)明的ω-3去飽和酶的細(xì)胞，可列舉plectospiramyriandra。作為經(jīng)過改變而表達(dá)本發(fā)明的ω-3去飽和酶的細(xì)胞，可列舉如上述的通過本發(fā)明的ω-3去飽和酶基因的導(dǎo)入而獲得了本發(fā)明的ω-3去飽和酶的表達(dá)能力的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。該轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以是來源于植物、細(xì)菌、真菌、藻類等的任意的細(xì)胞，較好是細(xì)菌、真菌、藻類等微生物的細(xì)胞?；蛘?，可對上述plectospiramyriandra進(jìn)行改變而使本發(fā)明的ω-3去飽和酶的表達(dá)提高，并用于本發(fā)明的含epa的脂質(zhì)的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的含epa的脂質(zhì)的生產(chǎn)方法中，上述表達(dá)本發(fā)明的ω-3去飽和酶的細(xì)胞通過本發(fā)明的ω-3去飽和酶的作用來生產(chǎn)epa。因此，該細(xì)胞不僅具有本發(fā)明的ω-3去飽和酶的表達(dá)能力，而且本來還具有生產(chǎn)作為該酶的底物的花生四烯酸(ara)的能力，或者經(jīng)過改變而可生產(chǎn)ara。較好是該細(xì)胞本來就具有ω-6高度不飽和脂肪酸代謝途徑，或者經(jīng)過改變而具有該途徑。更好是該細(xì)胞本來就具有ω-6高度不飽和脂肪酸代謝途徑和ω-3高度不飽和脂肪酸代謝途徑，或者經(jīng)過改變而具有該兩個途徑。如圖1所示，通過ω-6高度不飽和脂肪酸代謝途徑生成的ara通過ω-3去飽和酶的作用而轉(zhuǎn)換成epa?；蛘撸琩gla等碳數(shù)20的ω-6高度不飽和脂肪酸通過ω-3去飽和酶的作用而轉(zhuǎn)換成eta等碳數(shù)20的ω-3高度不飽和脂肪酸，然后由這些ω-3高度不飽和脂肪酸通過ω-3高度不飽和脂肪酸代謝途徑生成epa。因此，作為本發(fā)明的含epa的脂質(zhì)的生產(chǎn)方法中使用的細(xì)胞的優(yōu)選例子，可列舉具有表達(dá)本發(fā)明的ω-3去飽和酶的能力，且具有ω-6高度不飽和脂肪酸代謝途徑而可產(chǎn)生花生四烯酸的產(chǎn)脂質(zhì)微生物(oleaginousmicroorganisms)。更好是該產(chǎn)脂質(zhì)微生物還具有ω-3高度不飽和脂肪酸代謝途徑。作為這樣的產(chǎn)脂質(zhì)微生物的例子，可列舉上述的plectospiramyriandra，以及具有通過ω-6高度不飽和脂肪酸代謝途徑而產(chǎn)生花生四烯酸的能力的產(chǎn)脂質(zhì)微生物，較好是還具有ω-3高度不飽和脂肪酸代謝途徑，且經(jīng)過改變而表達(dá)本發(fā)明的ω-3去飽和酶的產(chǎn)脂質(zhì)微生物。上述經(jīng)過改變而表達(dá)本發(fā)明的ω-3去飽和酶的產(chǎn)脂質(zhì)微生物可通過向具有ω-6高度不飽和脂肪酸代謝途徑并具有產(chǎn)生花生四烯酸的能力，較好是還具有ω-3高度不飽和脂肪酸代謝途徑的產(chǎn)脂質(zhì)微生物中導(dǎo)入本發(fā)明的ω-3去飽和酶基因而獲得。向該產(chǎn)脂質(zhì)微生物中導(dǎo)入本發(fā)明的ω-3去飽和酶基因可按照關(guān)于向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入基因而在上文中記載的順序來進(jìn)行，以下說明更具體的順序。作為適合導(dǎo)入本發(fā)明的ω-3去飽和酶基因的產(chǎn)脂質(zhì)微生物的例子，可列舉plectospira屬菌、酵母菌、和被孢霉(mortierella)屬、毛霉(mucor)屬、傘狀霉(umbelopsis)屬等的絲狀菌等，但并不限于這些例子。作為酵母菌，可列舉子囊菌酵母(ascomycetousyeast)、擔(dān)子菌酵母(basidiomycetousyeast)、裂殖酵母(fissionyeast)、芽殖酵母(buddingyeast)等。作為上述中優(yōu)選的例子，可列舉高山被孢霉(mortierellaalpina，以下的本說明書中有時稱為m.alpina)、mortierellachlamydospora、長枝被孢霉(mortierellaelongata)、微小被孢霉(mortierellaexigua)、喜濕被孢霉(mortierellahygrophila)、mortierellaepigama、mortierellaacrotona、小被孢霉(mortierellaminutissima)、木棲柱被孢霉(mortierellalignicola)、mortierellaclonocystis、矮被孢霉(mortierellanana)、土生被孢霉(mortierellahumicola)、貝勒被孢霉(mortierellabainieri)、透明被孢霉(mortierellahyaline)、mortierellaglobalpina、矮小傘霉(umbelopsisnana)、深黃傘形霉(umbelopsisisabellina)等被孢霉屬微生物，更優(yōu)選列舉高山被孢霉(m.alpina)、mortierellaclonocystis、矮被孢霉(mortierellanana)、土生被孢霉(mortierellahumicola)、貝勒被孢霉(mortierellabainieri)、透明被孢霉(mortierellahyaline)、mortierellaglobalpina等。另外，上述適合導(dǎo)入本發(fā)明的基因的產(chǎn)脂質(zhì)微生物只要具有ω-6高度不飽和脂肪酸代謝途徑并具有產(chǎn)生花生四烯酸的能力，還可以是上述的plectospira屬、酵母和被孢霉(mortierella)屬、毛霉(mucor)屬、傘狀霉(umbelopsis)屬等的微生物的突變株。該突變株不需要表達(dá)本發(fā)明的ω-3去飽和酶以外的ω-3去飽和酶，所以可以是缺少該微生物本來具有的ω-3去飽和酶的缺損株。作為這樣的突變株或缺損株的例子，可列舉m.alpina1s-4(agric.biol.chem.,1987,51(3):785-790)、m.alpinast1358(biosci.biotechnol.biochem.,2010,74:908-917)等。上述產(chǎn)脂質(zhì)微生物的突變株或缺損株可通過常規(guī)方法，例如采用甲磺酸乙酯(ems)、甲磺酸甲酯(mms)、n-甲基-n-硝基-n-亞硝基胍(j.gen.microbiol.,1992,138:997-1002)、5-溴脫氧尿苷(brdu)、順鉑、絲裂霉素c等誘變劑進(jìn)行的處理、或采用放射線照射、紫外線照射、高熱處理等的突變誘發(fā)、或者采用rnai的基因表達(dá)抑制等來獲得。本發(fā)明的ω-3去飽和酶基因可被導(dǎo)入上述微生物的基因組內(nèi)，或者也可在整合于表達(dá)載體的狀態(tài)下導(dǎo)入基因組外。不論哪種情況下，都較好是本發(fā)明的ω-3去飽和酶基因與包含該基因的載體一起導(dǎo)入。用于基因?qū)氲妮d體可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)導(dǎo)入基因的微生物的種類、或克隆的方法、基因表達(dá)的方法等適當(dāng)選擇。例如，作為針對被孢霉(mortierella)屬微生物向基因組外導(dǎo)入基因所使用的載體，可列舉pd4載體(appl.environ.microbiol.,2000,66(11):4655-4661)、pdzeo載體(j.biosci.bioeng.,2005,100(6):617-622)、pdura5載體(appl.microbiol.biotechnol.,2004,65(4):419-425)、pdx載體(curr.genet.,2009,55(3):349-356)、pbig3ura5(appl.environ.microbiol.,2009,75:5529-5535)等。另外，較好是上述載體中包含用于使所整合的本發(fā)明的基因表達(dá)的啟動子序列或轉(zhuǎn)錄終止信號序列，或者用于選擇導(dǎo)入有目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化體的選擇標(biāo)志基因。作為啟動子，較好是高表達(dá)啟動子。例如，作為被孢霉屬微生物用的優(yōu)選高表達(dá)啟動子，可列舉來源于m.alpina的pp3啟動子和ssa2啟動子、以及對這些啟動子的序列進(jìn)行取代、缺失、添加等而改變了的啟動子，但只要可使導(dǎo)入的基因高表達(dá)，并不限于這些例子。作為選擇標(biāo)志基因，例如可列舉卡那霉素抗性基因、鏈霉素抗性基因、萎銹靈(carboxin)抗性基因、博來霉素(zeocin)抗性基因、潮霉素抗性基因等耐藥性基因；與亮氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、色氨酸、賴氨酸等氨基酸營養(yǎng)缺陷型突變(auxotrophicmutation)互補(bǔ)的基因，與尿嘧啶、腺嘌呤等核酸堿基營養(yǎng)缺陷型突變互補(bǔ)的基因等。作為優(yōu)選的選擇標(biāo)志基因的例子，可列舉與尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型突變互補(bǔ)的基因。例如，開發(fā)有m.alpina的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型突變株(biosci.biotechnol.biochem.,2004,68:277-285)。對于這樣的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷株，作為選擇標(biāo)志基因可以使用乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶基因(ura3基因)、或者乳清核苷酸焦磷酸化酶基因(ura5基因)。對于用于構(gòu)建載體的順序或所使用的試劑種類、例如限制酶或連接酶等的種類，無特別限定。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可按照通常的知識，或者適當(dāng)使用市售品來構(gòu)建載體?？捎糜谙騧.alpina中導(dǎo)入本發(fā)明的ω-3去飽和酶基因的轉(zhuǎn)化二元載體的例子示于圖2。該載體中，在作為恒定的高表達(dá)啟動子的ssa2啟動子的下游連接有編碼本發(fā)明的ω-3去飽和酶的多核苷酸(pmd17xxmod)，還整合有作為終止子的sdhb終止子、作為轉(zhuǎn)化體的選擇標(biāo)志的ura5基因。作為將本發(fā)明的ω-3去飽和酶基因直接導(dǎo)入微生物的基因組內(nèi)的方法，可列舉同源重組法。準(zhǔn)備同時包含本發(fā)明的基因和作為導(dǎo)入目的地的基因組的互補(bǔ)序列的載體，若將該載體導(dǎo)入到微生物中，則通過同源重組將本發(fā)明的ω-3去飽和酶基因整合至該微生物的基因組上的靶位置?？筛鶕?jù)需要向該載體中同時整合上述的啟動子序列、轉(zhuǎn)錄終止信號序列或者選擇標(biāo)志基因。關(guān)于向微生物中導(dǎo)入載體的手段，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可根據(jù)微生物或載體的種類適當(dāng)選擇。例如，向被孢霉屬微生物等真菌類中導(dǎo)入載體的情況下，可列舉電穿孔法、粒子槍(基因槍)法、atmt法及其改變法(appl.environ.microbiol.,2009,75:5529-5535)等，較好是atmt法及其改變法，但只要可獲得穩(wěn)定保持目標(biāo)性狀的轉(zhuǎn)化體，基因?qū)敕ú⒉幌抻谶@些方法。另外，本發(fā)明的含epa的脂質(zhì)的生產(chǎn)方法中所使用的、表達(dá)本發(fā)明的ω-3去飽和酶的細(xì)胞，可施行激活其ω-6高度不飽和脂肪酸代謝途徑這樣的改變。例如，通過向該細(xì)胞中導(dǎo)入編碼δ12去飽和酶的基因而使該酶高表達(dá)，可促進(jìn)該細(xì)胞內(nèi)的由油酸向亞油酸的轉(zhuǎn)變，可激活ω-6高度不飽和脂肪酸代謝途徑。該途徑的激活會使作為本發(fā)明的酶底物的ω-6高度不飽和脂肪酸量增加，故其結(jié)果是epa的產(chǎn)生得到促進(jìn)?；蛘?，通過向表達(dá)本發(fā)明的ω-3去飽和酶的細(xì)胞中導(dǎo)入編碼δ15去飽和酶的基因而使該酶高表達(dá)，可促進(jìn)由la向ala、或由gla向sda的轉(zhuǎn)變，可激活ω-3高度不飽和脂肪酸代謝途徑。另外，還可向表達(dá)本發(fā)明的ω-3去飽和酶的細(xì)胞中導(dǎo)入編碼δ12去飽和酶的基因和編碼δ15去飽和酶的基因這兩者。本發(fā)明的含epa的脂質(zhì)的生產(chǎn)方法中，通過以上順序得到的表達(dá)本發(fā)明的ω-3去飽和酶的細(xì)胞被接種于液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。關(guān)于培養(yǎng)的條件，可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)細(xì)胞的種類進(jìn)行最優(yōu)化。例如，該細(xì)胞為真菌的情況下，可將菌株的孢子、菌絲、或者預(yù)先培養(yǎng)而得的預(yù)培養(yǎng)液接種于上述培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。作為培養(yǎng)基的碳源，可列舉葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米淀粉、甘油、甘露醇、脂質(zhì)、烷烴、烯烴等，但并不限于這些例子。作為氮源，可列舉蛋白胨、酵母提取物、麥芽提取物、肉提取物(肉膏)、酪蛋白氨基酸、玉米漿、大豆蛋白、脫脂大豆、棉籽粕、麥麩等天然氮源，除此之外，還可列舉尿素等有機(jī)氮源、以及硝酸鈉、硝酸銨、硫酸銨等無機(jī)氮源，但并不限于這些例子。另外，還可添加大豆油、椰油、玉米油等脂質(zhì)。添加的脂質(zhì)較好是大豆油、玉米油等含大量亞油酸的油脂，更好是大豆油。此外，作為微量營養(yǎng)源，還可適當(dāng)添加磷酸鹽、硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸銅等無機(jī)鹽、或者維生素等。這些培養(yǎng)基成分只要是不妨礙所培養(yǎng)的微生物生長的濃度即可，無特別限定。例如，在培養(yǎng)基中碳源可為0.1～40質(zhì)量%、較好是1～25質(zhì)量%，氮源可為0.01～10質(zhì)量%、較好是0.1～10質(zhì)量%的濃度。在培養(yǎng)m.alpina或其突變株的情況下，可優(yōu)選使用后述的czapek培養(yǎng)基、czapek-dox培養(yǎng)基、葡萄糖/酵母提取物(以下也稱為“gy”)培養(yǎng)基、sc培養(yǎng)基等?；蛘?，對于被孢霉屬微生物用的培養(yǎng)基，還可參考公知的文獻(xiàn)(例如國際公開第98/29558號)。培養(yǎng)基的ph值可為4～10，較好是6～9。培養(yǎng)可以是通氣攪拌培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)或靜置培養(yǎng)。為了促進(jìn)上述細(xì)胞的增殖以增加epa的產(chǎn)量，較好是該細(xì)胞的培養(yǎng)在最適生長溫度下進(jìn)行。例如，該細(xì)胞可在約5～60℃、較好是約10～50℃、更好是約10～40℃、進(jìn)一步更好是約20～40℃、又更好是約20～30℃下進(jìn)行培養(yǎng)。例如，細(xì)胞為m.alpina或其突變株的情況下，優(yōu)選在約10～40℃、較好是約20～40℃、更好是約20～30℃下進(jìn)行培養(yǎng)。該細(xì)胞的培養(yǎng)期間可以是例如2～20天，較好是2～14天。需要說明的是，對于被孢霉屬微生物的培養(yǎng)方法，還可參考公知的文獻(xiàn)(例如日本特開平6-153970號公報(bào))。通過按照上述順序培養(yǎng)表達(dá)本發(fā)明的ω-3去飽和酶的細(xì)胞，從而在該細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)出含有大量epa的脂質(zhì)。培養(yǎng)結(jié)束后，對培養(yǎng)液實(shí)施離心分離、過濾等常用的手段來分離細(xì)胞。例如，將培養(yǎng)液離心分離或過濾而除去液體部分，對所分離的細(xì)胞進(jìn)行清洗后，通過冷凍干燥、風(fēng)干等進(jìn)行干燥，獲得干燥細(xì)胞?？赏ㄟ^有機(jī)溶劑提取等公知的方法，由該細(xì)胞提取作為目標(biāo)的脂質(zhì)。作為有機(jī)溶劑，可列舉己烷、醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、氯仿、環(huán)己烷、苯、甲苯、二甲苯等高度不飽和脂肪酸的溶解性高且可與水分離的溶劑?；蛘?，也可以將這些有機(jī)溶劑組合使用。通過減壓等從提取物中蒸餾除去有機(jī)溶劑，可提取目標(biāo)脂質(zhì)。或者，也可不干燥細(xì)胞而由濕細(xì)胞進(jìn)行脂質(zhì)的提取。所得的脂質(zhì)可適當(dāng)使用脫膠、脫酸、脫臭、脫色、柱處理、蒸餾等普通方法進(jìn)一步純化。上述提取的脂質(zhì)中，除了作為本發(fā)明的方法的目標(biāo)物的epa以外，還包含成為夾雜物的各種脂肪酸。因此，可進(jìn)一步純化上述脂質(zhì)而獲得純度更高的epa。還可從脂質(zhì)直接分離epa，但較好是暫且將脂質(zhì)中的脂肪酸轉(zhuǎn)變成其與低級醇的酯衍生物后，分離作為目標(biāo)的epa的酯衍生物。酯衍生物可根據(jù)碳數(shù)、雙鍵的數(shù)量、位置的不同等，通過使用各種分離純化操作來進(jìn)行分離，因此可容易地獲得目標(biāo)脂肪酸的酯衍生物。然而，與epa碳數(shù)相同且雙鍵數(shù)量差一個的花生四烯酸難以與epa分離，因此較好是在含有epa的脂質(zhì)中花生四烯酸少。酯衍生物較好是乙酯衍生物。酯化可使用含有鹽酸、硫酸、bf3等酸催化劑、或者甲醇鈉、氫氧化鉀等堿催化劑的低級醇?？梢詫y配合物法(例如日本專利第2786748號、日本專利第2895258號、日本專利第2935555號、日本專利第3001954號)、柱層析法、低溫結(jié)晶法、尿素添加分離法等單獨(dú)或組合使用，由所得的酯衍生物分離作為目標(biāo)的epa的酯衍生物。將分離的epa的酯衍生物用堿水解后，用醚、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑提取，從而可純化epa。epa可以以鹽的形式進(jìn)行純化。在以工業(yè)規(guī)模進(jìn)行基于本發(fā)明的含有大量epa的脂質(zhì)的生產(chǎn)的情況下，例如可在罐中等大規(guī)模培養(yǎng)表達(dá)本發(fā)明的ω-3去飽和酶的產(chǎn)脂質(zhì)微生物，用壓濾機(jī)等過濾，回收細(xì)胞，干燥后，用球磨機(jī)等將細(xì)胞粉碎，用有機(jī)溶劑提取脂質(zhì)。此外，還已知多種以工業(yè)規(guī)模提取微生物中的成分加以利用的方法、由脂質(zhì)純化epa的方法，也可將這些方法適當(dāng)改變而用于本發(fā)明的方法。為了使用本發(fā)明的ω-3去飽和酶生產(chǎn)eta，較好是在上述表達(dá)本發(fā)明的ω-3去飽和酶的細(xì)胞中降低δ5去飽和酶的活性。由此，該細(xì)胞主要生產(chǎn)eta代替epa。細(xì)胞的δ5去飽和酶活性的降低例如可通過在δ5去飽和酶缺損株中表達(dá)本發(fā)明的酶、或者用rnai抑制細(xì)胞中的δ5去飽和酶的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。細(xì)胞的培養(yǎng)、由細(xì)胞提取含eta的脂質(zhì)、eta的純化的順序與上述的epa的情形同樣。通過本發(fā)明得到的epa、eta或它們的鹽可用于人或非人動物用的藥品、化妝品、食品、飼料等的制造。作為該藥品的劑型，可列舉例如片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、糖漿劑、干糖漿劑、溶液劑、懸浮劑等口服制劑，灌腸劑、栓劑等經(jīng)腸制劑，點(diǎn)滴劑，注射劑，外用劑，經(jīng)皮、經(jīng)粘膜、經(jīng)鼻劑，吸入劑，貼劑等。此外，作為該化妝品的形態(tài)，可列舉霜、乳液、洗劑、懸浮液、凝膠、粉末、面膜、薄片、貼布、棒、餅等化妝品通?？刹捎玫娜我庑螒B(tài)。較好的是，上述藥品或化妝品可以是用于血小板聚集抑制、血中中性脂肪減少、抗動脈硬化、血液粘度降低、降血壓、抗炎、抗腫瘤的藥品或者化妝品。上述藥品或化妝品含有epa、eta或它們的鹽作為有效成分。上述藥品或化妝品還可含有作為藥物可接受的載體或作為化妝品可接受的載體，例如賦形劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、表面活性劑、ph調(diào)節(jié)劑、分散劑、乳化劑、防腐劑、抗氧化劑、著色劑、醇、水、水溶性高分子、香料、甜味劑、矯味劑、酸味劑等，還可根據(jù)需要含有其他有效成分，例如藥效成分、化妝成分等。上述藥品或化妝品可通過根據(jù)劑型向epa、eta或它們的鹽中配合上述載體或其他有效成分，按照常規(guī)方法進(jìn)行調(diào)制而制造。上述藥物或化妝品中的epa或eta的含量根據(jù)其劑型而不同，通常為0.1～99質(zhì)量%、較好是1～80質(zhì)量%的范圍。上述飲食品或飼料含有epa、eta或它們的鹽作為有效成分。這些飲食品或飼料可以是以血小板聚集抑制作用、血中中性脂肪減少作用、抗動脈硬化作用、血液粘度降低作用、降血壓作用、抗炎作用、抗腫瘤作用等效果為目的，并標(biāo)識了該內(nèi)容的健康食品、功能性飲食品、特定保健用飲食品、患者用飲食品，用于家畜、賽馬、觀賞動物等的飼料，寵物食品等。上述飲食品或飼料的形態(tài)無特別限定，包括可配合epa、eta或它們的鹽的所有形態(tài)。例如，作為該飲食品的形態(tài)，可以是固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)，或者可列舉片劑、咀嚼片、粉劑、膠囊、顆粒、飲料、凝膠、糖漿、經(jīng)管經(jīng)腸營養(yǎng)用流食等各種形態(tài)。作為具體的飲食品的形態(tài)的例子，可列舉綠茶、烏龍茶或紅茶等茶飲料，咖啡飲料、清涼飲料、果凍飲料、運(yùn)動飲料、乳飲料、碳酸飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料、發(fā)酵乳飲料、粉末飲料、可可飲料、酒精飲料、純凈水等飲料，黃油、果醬、人造奶油等涂抹食品類、撒在飯上的粉狀食品(ふりかけ)、蛋黃醬、起酥油、卡仕達(dá)醬、調(diào)味品類、面包類、米飯類、面類、意大利面、味噌湯、豆腐、牛乳、酸奶、湯或沙司類、點(diǎn)心(例如餅干或曲奇類、巧克力、糖果、蛋糕、冰淇淋、口香糖、片劑(tablet))等。上述飼料能夠以與飲食品幾乎相同的組成或形態(tài)使用，所以本說明書中關(guān)于飲食品的記載對于飼料也同樣可以適用。上述飲食品或飼料可通過配合epa、eta或它們的鹽、以及飲食品或飼料的制造中所用的其他飲食品原材料、各種營養(yǎng)素、各種維生素、礦物質(zhì)、氨基酸、各種油脂、各種添加劑(例如呈味成分、甜味劑、有機(jī)酸等酸味劑、表面活性劑、ph調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、色素、香料)等，按照常規(guī)方法進(jìn)行調(diào)制而制造?；蛘撸梢酝ㄟ^向通常所食用的飲食品或飼料中配合epa、eta或它們的鹽來制造本發(fā)明所述的飲食品或飼料。上述飲食品或飼料中的epa或eta的含量根據(jù)食品的形態(tài)而不同，通常為0.01～80質(zhì)量%、較好是0.1～50質(zhì)量%、更好是1～30質(zhì)量%的范圍。實(shí)施例以下，使用實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍并不限定于以下的實(shí)施例。(培養(yǎng)基)gy培養(yǎng)基：2%(w/v)葡萄糖、1%酵母提取物；czapek-dox瓊脂培養(yǎng)基：3%蔗糖、0.2%nano3、0.1%kh2po4、0.05%kcl、0.05%mgso4?7h2o、0.001%feso4?7h2o、2%瓊脂，ph6.0；ypd培養(yǎng)基：將多聚蛋白胨(polypeptone)20g、酵母提取物10g、腺嘌呤0.4g、瓊脂20g和葡萄糖20g在1000ml水中稀釋；lb-mg瓊脂培養(yǎng)基：1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、85mmnacl、0.5mmmgso4?7h2o、0.5mmnaoh、1.5%瓊脂，ph7.0；基本培養(yǎng)基(mm)：10mmk2hpo4、10mmkh2po4、2.5mmnacl、2mmmgso4?7h2o、0.7mmcacl2、9μmfeso4?7h2o、4mm(nh4)2so4、10mm葡萄糖，ph7.0；誘導(dǎo)培養(yǎng)基(im)：向mm中加入0.5%(w/v)甘油、200μm乙酰丁香酮、40mm2-(n-嗎啉基)乙磺酸(mes)，調(diào)至ph5.3；sc培養(yǎng)基：5.0g不含氨基酸和硫酸銨的酵母氮源(yeastnitrogenbasew/oaminoacidsandammoniumsulfate)(difco)、1.7g(nh4)2so4、20g葡萄糖、20g瓊脂、20mg腺嘌呤、30mg酪氨酸、1.0mg甲硫氨酸、2.0mg精氨酸、2.0mg組氨酸、4.0mg賴氨酸、4.0mg色氨酸、5.0mg蘇氨酸、6.0mg異亮氨酸、6.0mg亮氨酸、6.0mgl-苯丙氨酸。實(shí)施例1ω-3去飽和酶的鑒定將plectospiramyriandra在gy培養(yǎng)基10ml中在28℃下振蕩培養(yǎng)5天，回收菌體。將收集的菌體放入2ml管中，使用珠粒振蕩器(yasuikikai)以1700rpm、10秒×2次的條件將其破碎。用isogen(bio-rad)按照產(chǎn)品指南由破碎的菌體提取mrna。將所提取的mrna用primescripttmiihighfidelityrt-pcrkit(takara)和引物[5'-gaaatggccgacgtgaacacctcctcgc-3'(seqidno:7)和5'-ctatgcgcgcttggtgagcacctcgc-3'(seqidno:8)]進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，制備seqidno:3所示的cdna。該cdna編碼seqidno:4所示的氨基酸序列的多肽。接著，由seqidno:3的序列，進(jìn)行plectospiramyriandra的基因組dna搜索，鑒定對應(yīng)的基因組dna序列。進(jìn)而，從該基因組dna序列除去內(nèi)含子設(shè)計(jì)多核苷酸，以它為基礎(chǔ)化學(xué)合成dna。設(shè)計(jì)的多核苷酸由seqidno:1的核苷酸序列構(gòu)成，編碼seqidno:2所示的氨基酸序列的多肽。seqidno:2與seqidno:4在全氨基酸序列355個殘基中有4個氨基酸不同(氨基酸序列同源性約98.9%)。將上述中制備的cdna(seqidno:3)整合至酵母表達(dá)用載體pye22m(biosci.biotech.biochem.,1995,59:1221-1228)中，通過電穿孔法將該載體導(dǎo)入釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)invsc1株(色氨酸營養(yǎng)缺陷型的產(chǎn)油酵母)中，進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。對于上述中制備的合成dna(seqidno:1)也同樣地構(gòu)建載體，制作轉(zhuǎn)化株。將各轉(zhuǎn)化株在ypd培養(yǎng)基中在28℃下培養(yǎng)1天，由整合的cdna表達(dá)多肽。需要說明的是，在該培養(yǎng)條件下，該產(chǎn)油酵母本來的ω-3去飽和酶并未表達(dá)。接著，向培養(yǎng)基中添加各種ω-6不飽和脂肪酸：亞油酸(la，18:2n-6)、γ-亞麻酸(gla，18:3n-6)、雙高-γ-亞麻酸(dgla，20:3n-6)或者花生四烯酸(ara，20:4n-6)并在28℃下培養(yǎng)2天，然后通過氣液色譜法(glc)測定通過ω-3去飽和而生成的對應(yīng)的ω-3不飽和脂肪酸：α-亞麻酸(ala，18:3n-3)、十八碳四烯酸(sda，18:4n-3)、二十碳四烯酸(eta，20:4n-3)或者二十碳五烯酸(epa，20:5n-3)的量。其結(jié)果是，碳數(shù)20的dgla和ara均轉(zhuǎn)換成了對應(yīng)的ω-3不飽和脂肪酸，但碳數(shù)18的la和gla未轉(zhuǎn)換成對應(yīng)的ω-3不飽和脂肪酸。由此確認(rèn)，上述合成dna(seqidno:1)所編碼的多肽(seqidno:2)和上述cdna(seqidno:3)所編碼的多肽(seqidno:4)均為在常溫下對碳數(shù)20的脂肪酸具有底物特異性作用的ω-3去飽和酶(即δ17去飽和酶)(表1)。[表1]*1:轉(zhuǎn)換率(%)=[生成物的量/(反應(yīng)后的底物的量+生成物的量)]×100。實(shí)施例2ω-3去飽和酶基因?qū)胗幂d體的制作結(jié)合m.alpina將seqidno:1的核苷酸序列進(jìn)行密碼子最優(yōu)化，獲得seqidno:5所示的多核苷酸。在該seqidno:5所示的多核苷酸的cds的上游和下游構(gòu)建spei和bamhi位點(diǎn)，克隆至spma-rq(ampr)質(zhì)粒中。將制備的質(zhì)粒用spei和bamhi限制酶進(jìn)行處理，將所得的基因的片段與包含作為恒定高表達(dá)啟動子的ssa2啟動子的質(zhì)粒pbig35(由京都府立大學(xué)提供的pbig2rhph2改變而成，記載于appl.environ.microbiol.,2009,75:5529-5535)連接，構(gòu)建表達(dá)盒。再使該表達(dá)盒與尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型型標(biāo)志基因(ura5)串聯(lián)連接，構(gòu)建轉(zhuǎn)化用二元載體、pbigssa2ppmd17genome-intronmod(圖2)。實(shí)施例3ω-3去飽和酶基因?qū)胫甑闹谱鲗.alpina(尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型株)在含0.05mg/ml尿嘧啶的czapek-dox瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，收集培養(yǎng)物，然后用miracloth(calbiochem)進(jìn)行過濾，從而制作m.alpina的孢子懸浮液。通過以下說明的atmt法(appl.environ.microbiol.,2009,75:5529-5535)，向該m.alpina(尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型株)中導(dǎo)入實(shí)施例2中構(gòu)建的pbigssa2ppmd17genome-intronmod載體，制作ω-3去飽和酶導(dǎo)入株。通過電穿孔法向根癌農(nóng)桿菌(agrobacteriumtumefaciensc58c1，由京都府立大學(xué)提供)中導(dǎo)入上述二元載體pbigssa2ppmd17genome-intronmod，在lb-mg瓊脂培養(yǎng)基中，在28℃下培養(yǎng)48小時。通過pcr法選出包含該載體的根癌農(nóng)桿菌。將具有該載體的根癌農(nóng)桿菌用基本培養(yǎng)基(mm)培養(yǎng)2天，以5800×g進(jìn)行離心分離，加入新鮮的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(im)，制作懸浮液。用旋轉(zhuǎn)振蕩器在28℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)該懸浮液8～12小時，直至od660由0.4變成3.7。將培養(yǎng)后的菌懸浮液100μl與等量的上述m.alpina懸浮液(108ml-1)混合，涂布于承載有硝基纖維素膜(直徑70mm，硬化低灰級50，whatman)的共培養(yǎng)培養(yǎng)基(與im同樣的組成，但含有5mm葡萄糖和1.5%瓊脂來代替10mm葡萄糖)，在23℃下培養(yǎng)2～5天。共培養(yǎng)后，將該膜移至不含尿嘧啶、而含有50g/ml頭孢噻肟和50g/ml壯觀霉素、0.03%尼羅藍(lán)a(sigma)的sc培養(yǎng)基中，在28℃下培養(yǎng)5天。將來自可視的真菌集落的菌絲移至新鮮的不含尿嘧啶的sc培養(yǎng)基中。將可在不含尿嘧啶的sc培養(yǎng)基中增殖，但在包含5-氟乳清酸(5-foa)的gy培養(yǎng)基中無法增殖的菌體判斷為穩(wěn)定保持性狀的ω-3去飽和酶基因?qū)胫辍榱诉x擇穩(wěn)定保持性狀的轉(zhuǎn)化體，進(jìn)行該操作3次。實(shí)施例4ω-3去飽和酶基因?qū)胗幂d體的制作結(jié)合m.alpina將seqidno:3的核苷酸序列進(jìn)行密碼子最優(yōu)化，獲得seqidno:6所示的多核苷酸。除了使用該seqidno:6所示的多核苷酸以外，與實(shí)施例2同樣地進(jìn)行操作，構(gòu)建轉(zhuǎn)化用二元載體pbigssa2ppmd17cdnamod(圖2)。實(shí)施例5ω-3去飽和酶基因?qū)胫甑闹谱鞒耸褂胮bigssa2ppmd17cdnamod作為基因?qū)胗幂d體以外，通過與實(shí)施例3同樣的順序制作ω-3去飽和酶導(dǎo)入株。實(shí)施例6由ω-3去飽和酶基因?qū)胫晟a(chǎn)ω-3不飽和脂肪酸將實(shí)施例3和5中得到的ω-3去飽和酶基因?qū)雖.alpina株分別在4ml的gy培養(yǎng)基中在28℃下以120rpm需氧培養(yǎng)3、7和10天。作為對照，將未導(dǎo)入該ω-3去飽和酶基因的m.alpina株同樣地進(jìn)行培養(yǎng)。通過抽濾從各培養(yǎng)液中回收菌體，在120℃下干燥3小時。向干燥菌體中加入含0.5mg/ml的內(nèi)標(biāo)(m.alpina無法進(jìn)行生物合成的碳數(shù)23的飽和脂肪酸)的二氯甲烷溶液1ml和鹽酸甲醇2ml，通過55℃、2小時的溫浴將脂肪酸甲酯化。向反應(yīng)液中加入蒸餾水1ml和己烷4ml，提取己烷層，進(jìn)行減壓離心，回收脂肪酸甲酯。將所回收的樣品溶解于氯仿，通過氣液色譜法(glc)測定樣品中的脂肪酸組成。glc使用島津公司制gc-2010、使用glsciences公司制毛細(xì)管柱tc70(0.25mm×60m)，以柱溫180℃、氣化室溫度250℃、檢測器溫度250℃、載氣he、補(bǔ)充氣體(make-upgas)n2、h2流量40ml/min、空氣流量400ml/min、分流比50、分析時間30min的條件進(jìn)行。對于所提取的各脂肪酸的量，根據(jù)glc圖的峰面積值以內(nèi)標(biāo)的脂肪酸量作為基準(zhǔn)進(jìn)行定量，算出每1ml培養(yǎng)液和每1mg干燥菌體的各脂肪酸的量。進(jìn)而，求出各脂肪酸相對于總脂肪酸量的比例。其結(jié)果是，實(shí)施例3和實(shí)施例5的ω-3去飽和酶基因?qū)胫曛?，分別可見最多40.8%和39.6%的epa的蓄積(圖3)。另一方面，對照株中未產(chǎn)生epa(無法測定蓄積)。實(shí)施例7ω-3去飽和酶活性的比較在保有本發(fā)明的ω-3去飽和酶的plectospiramyriandra與被報(bào)道保有δ17去飽和酶的異絲水霉(saprolegniadiclina)(例如專利文獻(xiàn)4)之間，比較對于碳數(shù)20的脂肪酸的ω-3去飽和活性。另外，對于其他8種異絲水霉相似菌(類縁菌)也考察了ω-3去飽和活性。將表2中記載的plectospiramyriandra(nbrcno.32548)、異絲水霉(nbrcno.32710)及其他8種菌株分別在5ml的gy培養(yǎng)基中在28℃下培養(yǎng)7天，通過氣液色譜法(glc)測定培養(yǎng)后的培養(yǎng)基中作為ω-3去飽和酶的產(chǎn)物的epa(20:5n-3)和作為其底物的ara(20:4n-6)的量。其結(jié)果是，如表2所示，對于plectospiramyriandra而言，與異絲水霉及其相似菌相比，epa相對于ara的含有比率高。由這些結(jié)果提示，plectospiramyriandra的ω-3去飽和酶是由ara向epa的轉(zhuǎn)換效率高，可高效地產(chǎn)生epa的酶。[表2]。當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12