專利名稱：：油菜超長鏈脂肪酸合成酶及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于基因工程領域，涉及到一個油菜中的長鏈脂肪酸延長酶的功能。包含了對這個基因編碼蛋白在超長鏈脂肪酸(verylongchainfattyacidelongase)合成代謝中的作用和應用。
背景技術：
：植物油脂中含有多種脂肪酸，如飽和棕櫚酸，硬脂酸，單不飽和油酸，多不飽和亞麻酸等，大部分都是對人體健康有利的，這一點有別于動物性油脂。植物種子中脂類合成相關的代謝無論在生化水平上還是對于一些相關基因的研究都已經(jīng)取得了很大的進展，糖類首先由母體運入胚乳，而后為胚胎所吸收。在油菜種子中油的積累過程中，可以利用蔗糖(sucrose),葡萄糖(glucose),果糖(fructose)等作為碳源。而蔗糖由蔗糖合酶(sucrosesynthase)切開后的產(chǎn)物可以通過胞質(zhì)糖酵解途徑(cytosolicglycolyticpathway)進行代謝。同時在質(zhì)體膜上還有各種轉(zhuǎn)運蛋白(transportor),如葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)運蛋白(Glc-6-Ptranslocates)，丙糖磷酸轉(zhuǎn)運蛋白(triosephosphatetranslocator)，磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)運蛋白(PEPtranslocator)等可以將糖酵解過程中產(chǎn)生的一些中間產(chǎn)物(intermediate)在細胞質(zhì)和質(zhì)體之間進行交換。油菜的質(zhì)體中同時存在著一條與胞質(zhì)中平行的質(zhì)體糖酵解途徑(plastidicglycolyticpathway),與質(zhì)體內(nèi)的淀粉代i射(starchmetabolism)及質(zhì)體戊糖磷酸途徑(plastidic0PPPpathway)具有密切關系。在胞質(zhì)和質(zhì)體的糖酵解途徑中所生產(chǎn)的葡萄糖-6-磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸等均有可能作為碳源參與質(zhì)體內(nèi)脂肪酸的合成。由丙酮酸所產(chǎn)生的乙酰-CoA(acetyl-CoA)作為二碳單位參與了脂肪酸的合成，此后的合成由一系列質(zhì)體內(nèi)的脂肪酸合酶(FAS)所催化。當脂肪酸的碳鏈分子達到16C或18C的時候，脂肪酸鏈將從?；d體蛋白上脫離下來，進入質(zhì)體脂肪酸后續(xù)加工的原核途徑，或被運入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進入真核途徑，進行去飽和、延長的后續(xù)修飾過程。超長鏈脂肪酸(verylongchainfattyacids,VLCFAs)在植物發(fā)育過程中起著非常重要的作用，是構成植物表面被覆的蠟質(zhì)等結構的重要成分，形成植物抵御外界環(huán)境變化的屏障。另外超長鏈脂肪酸在工業(yè)和人類健康的領域也有重要應用。植物油中的芥酸(cis-13-DocosenoicAcid)不利于身體健康，長期食用含芥酸的植物油極易導致冠心病、脂肪肝等，利用基因工程技術降低芥酸含量將是培育低芥酸或零芥酸油菜品種的有效手段之一。另一方面，芥酸又是生產(chǎn)潤滑劑和尼龍的重要原料，利用基因工程技術生產(chǎn)芥酸具巨大的經(jīng)濟價值。神經(jīng)酸(cis-15-TetracosenicAcid)最早發(fā)現(xiàn)于哺乳動物的神經(jīng)組織，故命名為神經(jīng)酸。神經(jīng)酸在神經(jīng)組織和腦組織中含量較3高，是生物膜的重要組成成分，通常作為腦甙中髓質(zhì)(白質(zhì))的標志物。其與生物膜有關的多種特殊生理功能。神經(jīng)酸作為白質(zhì)的組成成份，它的缺乏將導致大腦的損傷。況且人體自身很難生成，只能靠體外攝取來補充。神經(jīng)酸在預防中風，腦癱，帕金森，腦萎縮和延緩腦衰老等多方面都有相當療效。因此，本領域迫切需要提供一種與提高植物油脂中超長鏈脂肪酸有關的蛋白及其編碼基因。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供一種編碼超長鏈脂肪酸合成酶及其片斷、衍生物和類似物的多核苷酸。本發(fā)明的另一個目的是提供這種多核苷酸及其編碼的蛋白的用途。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離的多肽，它包含以下氨基酸序列(i)SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽；(ii)將SEQIDNO:2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有催化延長脂肪酸鏈長的功能的由(i)衍生的多肽。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，所述的核苷酸序列編碼如上所述的多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸的序列如SEQIDNO:l所示。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種載體，它含有如上所述的多核苷酸。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種遺傳工程化的宿主細胞，它含有如上所述的載體或基因組中整合有如上所述的多核苷酸。在本發(fā)明的第五方面，提供了一種如上所述的多肽的制備方法，所述的方法包括步驟(a)在適合表達的條件下，培養(yǎng)如上所述的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出如上所述的多肽。在本發(fā)明的第六方面，提供了一種提高植物油脂中超長鏈脂肪酸含量的方法，所述的方法包括步驟(1)提供攜帶表達載體的宿主菌，所述的表達載體含有如上所述的多核苷酸；(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(1)中的宿主菌接觸，從而使如上所述的多核苷酸轉(zhuǎn)入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉(zhuǎn)入如上所述的多核苷酸的植物細胞或組織或器官再生成植株；優(yōu)選的宿主菌選自大腸桿菌、農(nóng)桿菌；優(yōu)選所述的超長鏈脂肪酸碳鏈長度20-40個；更佳地碳鏈長度20-30個。在本發(fā)明的第七方面，提供了一種如上所述的多肽用途，所述的多肽被用于調(diào)節(jié)植物油脂巾超長鏈脂肪酸的含量；優(yōu)選地，所述的多肽的序列如SEQIDNO:2所示。在另一優(yōu)選例中，所述的多肽被用于提高植物油脂中超長鏈脂肪酸的含量；更佳地，所述的多肽的序列如SEQIDNO:2所示。在本發(fā)明的第八方面，提供了一種如上所述的多核苷酸的用途，所述的多核苷酸被用于調(diào)節(jié)植物油脂中超長鏈脂肪酸的含量；優(yōu)選地，所述的多核苷酸的序列如SEQIDNO:1所示。在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸被用于提高植物油脂中超長鏈脂肪酸的含量;更佳地，所述的多核苷酸的序列如SEQIDNO:l所示。在另一優(yōu)選例中，所述的植物選自油菜、fcl藍、白菜、大豆、花生、芝麻、向閂葵、棉花、麻瘋樹、或油棕櫚。據(jù)此，本發(fā)明提供了一種與提高植物油脂中超長鏈脂肪酸有關的蛋白及其編碼基因。圖1顯示了如SEQIDNO:1所示的基岡序列。圖2顯示了SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。圖3顯示了實施例1中cDNA芯片的點樣方案。圖4顯示了如SEQIDNO:1所示序列的基因在植物種子發(fā)育過程中的表達情況。圖5顯示了轉(zhuǎn)入如SEQIDNO:1所示序列的基因的擬南芥中該基因的表達檢測青況；其中FAE表示脂肪酸延長酶(Eatty互cid蘭longase)。具體實施例方式發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次從油菜(5rasw'ca/7邵"s)種子中，利用反轉(zhuǎn)錄篩選到一個新的超長鏈脂肪酸合成酶基因，并對其進行了生物芯片及轉(zhuǎn)基因植株的分析，顯示該基因為獲得植物油脂中超長鏈脂肪酸所必需，它的超表達(overexpression)能提高植物油脂中超長鏈脂肪酸的含量，因此在獲得超長鏈脂肪酸等方面具有良好的應用前景。具體地，發(fā)明人選取了兩個階段的未成熟油菜種子為材料，分別是3-9DAF(dayafterflowering)(libl)和11-19DAF(lib2)，建立了cDNA文庫并進行了測序，從中篩選到了與油菜種子發(fā)育過程中超長鏈脂肪酸合成相關的基因，對于改良油菜種子的品質(zhì)具有重要意義。本發(fā)明提供一種分離的多肽，它包含以下氨基酸序列(i)SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽；(ii)將SEQIDNO:2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有催化延長脂肪酸鏈長的功能的由(i)衍生的多肽。如本文所用，"分離的"是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。如本文所用，術語"包含"和"具有"指核苷酸或氨基酸序列中除了有指定的序列外，其一端或兩端還可含有其它不會影響所述核苷酸或氨基酸序列生物活性的序列。在一個較佳的實施方案中，所述分離的多肽為SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。如本文所用，術語"生物活性"是指使宿主細胞內(nèi)延長脂肪酸鏈長和/或使超長鏈脂肪酸含量提高的功能。在本發(fā)明中，"油菜超長鏈脂肪酸合成酶"，"超長鏈脂肪酸合成酶"，"脂肪酸延長酶"和"P—酮脂酰CoA合酶"可互換使用，都是指具有催化延長脂肪酸鏈長的功能的多肽，是具有SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學合成的產(chǎn)物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明還包括超長鏈脂肪酸合成酶的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語"片段"、"衍生物"和"類似物"是指基本上保持本發(fā)明的天然超長鏈脂肪酸合成酶相同生物學功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(I)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(II)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(III)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(IV)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據(jù)本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。本發(fā)明的多肽還包括具有與超長鏈脂肪酸合成酶相同功能的、SEQIDNO:2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-IO個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術語還包括油菜超長鏈脂肪酸合成酶的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、6誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與超長鏈脂肪酸合成酶DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗超長鏈脂肪酸合成酶的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供其他多肽，如包含超長鏈脂肪酸合成酶或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，如包含超長鏈脂肪酸合成酶或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了超長鏈脂肪酸合成酶的可溶性片段。通常，該片段具有超長鏈脂肪酸合成酶序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約IOO個連續(xù)氨基酸。修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQIDNO:1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，"簡并的變異體"在本發(fā)明中是指編碼具有SEQIDNO:2的蛋白質(zhì)，但與SEQIDNO:1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。編碼SEQIDNO:2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列好各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。術語"編碼多肽的多核苷酸"可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物好衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50%,較佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，"嚴格條件"是指(一)在較低離子強度好較高溫度下的雜交好洗脫，如0.2xSSC,0.1%SDS,60°C;或(二)雜交時加有變性劑，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.l%Ficoll，42。C等；或(三)僅在兩條序列之間的相同性至少在90%以上，更好是95%以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQIDNO:2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，"核酸片段"的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼超長鏈脂肪酸合成酶的多聚核苷酸。本發(fā)明的超長鏈脂肪酸合成酶核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列來設計引物，并用本領域技術人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得到有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經(jīng)可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或超長鏈脂肪酸合成酶編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞，以及經(jīng)重組技術產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。通過常規(guī)的重組DNA技術(Science,1984:224:1431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列來表達或生產(chǎn)重組的超長鏈脂肪酸合成酶。一般來說有以下步驟(1)用本發(fā)明的編碼超長鏈脂肪酸合成酶的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導合適的宿主細胞；(2)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；(3)從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質(zhì)。本發(fā)明中，超長鏈脂肪酸合成酶多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語"重組表達載體"指本領域熟知的細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因好翻譯控制元件。本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含超長鏈脂肪酸合成酶編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內(nèi)重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點好轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎?，以使其能夠表達蛋白質(zhì)。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如植物細胞。代表性例子有大腸桿菌、鏈霉菌屬、農(nóng)桿菌；真菌細胞如酵母；植物細胞等。本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉(zhuǎn)錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉(zhuǎn)錄。本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當?shù)妮d體、啟動子、增強子和宿主細胞。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規(guī)技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。轉(zhuǎn)化植物也可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如葉盤法。對于轉(zhuǎn)化的植物細胞、組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得超長鏈脂肪酸含量高的植物。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。在上面的方法中的重組多肽可在細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的好其它特性通過各種分離方法分離或純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超濾處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。本發(fā)明還涉及定量或定位檢測超長鏈脂肪酸合成酶水平的測試方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的超長鏈脂肪酸合成酶水平，可用于解釋超長鏈脂肪酸合成酶在提高植物或植物油脂中超長鏈脂肪酸含量方面的重要性。一種檢測樣品中是否存在超長鏈脂肪酸合成酶的方法是利用超長鏈脂肪酸合成酶的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與超長鏈脂肪酸合成酶特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復合物，形成抗體復合物就表示樣品中存在超長鏈脂肪酸合成酶。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(niicroarray)或DNA芯片(又稱"基因芯片")上，用于分析組織中基因的差異表達分析。用超長鏈脂肪酸合成酶特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測超長鏈脂肪酸合成酶的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。本發(fā)明的一個實例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的多核苷酸是從油菜種子cDNA文庫中分離出的，其序列如SEQIDNO:1所示，它包含的多核苷酸序列全長為1674個堿基，編碼全長為477個氨基酸的超長鏈脂肪酸合成酶(SEQIDNO:2)。超長鏈脂肪酸合成酶具有明確催化植物中超長鏈脂肪酸合成的功能，為提高植物或植物油脂中超長鏈脂肪酸的含量提供了新的途徑，因而具有巨大的應用前景?？梢詫胄蛄腥鏢EQIDNO:1所示的基因，可改變現(xiàn)有優(yōu)良農(nóng)作物品種的生長發(fā)育情況，獲得超長鏈脂肪酸的含量高的油菜、花生、甘藍、白菜、大豆、芝麻、向日葵、棉花、麻瘋樹、和油棕櫚等產(chǎn)油經(jīng)濟農(nóng)作物，解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中存在的實際問題。本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本案說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于1、首次從油菜種子中分離得到該編碼超長鏈脂肪酸合成酶的核苷酸序列；2、首次分離得到得到一個油菜中的超長鏈脂肪酸合成酶(P-酮脂酰CoA合酶)，并證明它參與到了碳鏈長度在20以上的超長鏈脂肪酸的延長。下面將結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分比和份數(shù)按重量計。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。轉(zhuǎn)基因植物材料中目的基因的表達水平檢測植物材料總RNA的提取一、實驗步驟1、組織在液氮中預冷，在RetschMM301型研磨儀中研磨成粉末；2、加入lml的Trizol(購自Invitrogen公司，產(chǎn)品目錄號15596-018),劇烈震蕩，室溫靜置5分鐘；3、4°C，12000rpm離心10分鐘，從每管中吸取上清至另一1.5mleppendorf管；4、加入200ul氯仿，用力震蕩1分鐘，室溫靜置3分鐘5、4°C，12000rpm離心15分鐘，從每管中吸取上清至另一1.5mleppendorf管；6、每一管中加入O.5ml異丙醇，混勻后室溫靜置10分鐘(RNA沉淀)；7、4°C，12000rpm離心10分鐘；8、棄其上清，每一管中加入1.2ml的75%乙醇，洗滌沉淀及離心管壁；9、4'C，7500rpm離心5min,棄上清，空氣中干燥5分鐘；10、加入30ulRNase-free水，55-60°C,10分鐘至完全溶解，進行紫外分析測定(0D260)。反轉(zhuǎn)錄PCR合成cDNA和PCR檢測基因表達水平1、冰上，在1.5ml的eppendorf管中加入下列體系(反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Toyobo公司，貨號，75580N4):5XRT緩沖液4uld,s2uloligodTlulRnase抑制劑(RNaseinhibitor)lulReverTraAcelulTotalRNA蕓2ugRNase-freewater力卩至20ul2、用移液器吹吸混勻，瞬時離心；3、30°C，10分鐘，42°C，1小時，95°C，5分鐘，4°C，10分鐘。4、利用PCR檢測基因表達水平(所用引物Actin8-S:5'-GATGCTGATGACATTCAACCT-3'，Actin8-A:5'-GAAGTGAGAAACCCTCGTAG-3'FAE-S:5'-TCCCGCTTCAGCAGGATATG-3'，F(xiàn)AE-A:5'-GAACCAGAGGACCCAAAGTG-3')。二、儀器與設備1、RetschMM301型研磨儀。2、Eppendof震蕩加熱器。3、Eppendof離心機。4、Beckman冷凍離心機。5、BeckmanDU-640分光光度計。6、BioRad電泳儀。7、Tanongis-2008凝膠成像系統(tǒng)。8、MJresearchPTC-100PCR儀。植物材料中脂肪酸含量的測定一、實驗步驟1、取330mg植物材料(擬南芥或油菜種子)，液氮迅速研磨，迅速移入2毫升離心管中，加入1.4毫升甲醇，終止酶活，充分振蕩。112、加入50微升十九酸甲酯儲存液(10毫克十九酸甲酯/毫升正己烷)，加入50微升水(導電率小于O.05us)，振蕩。3、測PH值，調(diào)整到PH5—6。4、7(TC劇烈震蕩十五分鐘，一分鐘時輕開蓋子。5、14000g離心三分鐘。6、上清移入8毫升玻璃瓶，沉淀加l毫升氯仿，振蕩，37'C搖5分鐘。7、14000g離心3分鐘，上清并入8毫升玻璃瓶，加1.4毫升純水，振蕩，測PH。8、加入l毫升氯仿，震蕩，4000rpm，離心十五分鐘。9、取出脂相，加l毫升甲醇/硫酸(97:3)，IO(TC，4小時。10、加入4毫升水，振蕩，4000rpm,15分，離心，棄去水相，重復兩次。11、加無水硫酸鈉干燥過夜，上清轉(zhuǎn)入新的玻璃瓶。12、用氮吹儀濃縮至約80微升。13、加10微升吡啶和10微升，MSTFA，37°C,30分鐘。14、將樣品適當稀釋后，用氣質(zhì)聯(lián)用儀(gaschromatographytomassspectrometry)測脂肪酸組分與含量。二、儀器與設備1、RetschMM301型研磨儀。2、Eppendof震蕩加熱器。3、Eppendof離心機。4、WealtecHB-1加熱器。5、安普公司氮吹儀。6、Agilent5975insert(HP-l色譜柱)氣質(zhì)聯(lián)用儀。實施例1獲得多核苷酸序列樣品全部RNA抽提一、操作步驟1.組織(油菜種子3—9DAF/11—1卯AF，擬南芥蓮座葉)放入用液氮預冷過的碾缽中，在液氮中研磨至粉末狀，轉(zhuǎn)至勻漿管，加入lml的Trizol(購自GIBCOBRL公司，產(chǎn)品目錄號15596-026)，勻漿；2.室溫放置5分鐘；3.加入200ul氯仿，用力震蕩1分鐘，冰浴20分鐘；4.4°C,12000rpm,20min離心；5.從每管中吸取上清至另一1.5ml印pendorf管。加入等體積-20'C預冷的異丙醇，混勻后-80。C沉淀過夜(RNA沉淀)；6.4°C，13000rpm離心20min后,去上清;7.加入10ml4。C預冷的75%乙醇，洗滌沉淀及離心管壁；8.4°C，13000rpm離心5min,棄上清；9.加入適量400ulMilli-Q水，至完全溶解，進行紫外分析測定。操作說明根據(jù)GIBCOBRL公司的Trizol試劑操作說明書進行。二、質(zhì)量檢測1.紫外分析(檢測儀器GENEQUIANTII,以下同類型檢測使用的儀器不變)2.電泳檢測(電泳儀FR-280，上海復日，電泳條件1.1%瓊脂糖凝膠，EB染色；100V、20min)檢測合格邁RNA純化一、操作步驟1)將上述抽提得到的全部RNA(totalRNA)各取lOOug用不含RNA酶的水(RNase-freewater)溶解至指定體積500ul,將樣品放65。C保溫3分鐘，取出振勻；2)加入oligo-dT(QIAGEN,Cat.NO.70042)寡聚纖維素的柱子，將樣品放70°C3分鐘；3)取出樣品室溫放20分鐘，離心2分鐘，上清吸出后凍存于-2(TC;4)沉淀中加入400ul清洗緩沖液(washingbuffer)(kit提供，QIAGEN,Cat.NO.70042，以下相同)，至取出樣品室溫15分鐘，離心2分鐘，棄上清；5)將離心柱(spinc。l翻)轉(zhuǎn)入一新1.5ml離心管，在spincolumn加入400ul清洗緩沖液，離心管離心l分鐘；6)將離心柱轉(zhuǎn)入一個新1.5ml離心管，在柱上加入lOOul10mMTris-HC1，離心l分鐘，收集離心液；7)吸取10ulmRNA紫外分析。二、質(zhì)量檢測紫外分析(檢測儀器GENEQUIANTII)，檢驗合格。cDNA合成、酶切及分級分離一、操作步驟cDNA第一鏈合成1.在一個0.5ml滅菌離心管中加入以下試劑1^1樣品polyA+RNA(平行對照反應用1^1[1pg]的對照RNA)1^1SMARTIV寡核苷酸(5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3')l|ulCDSIII/3'PCR引物(5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-IN-3'(N=A,G,C，orT;N-1=A,G，orC))加2pi的去離子水補充體積到5^1;2.混勻試劑并稍稍離心；3.72°C溫浴2分鐘；4.冰浴2分鐘，稍稍離心后加入下列試劑2.0pi5X第一條鏈緩沖液1.0|alDTT(20mM)1.0pldNTP混合物(10mM)131.0ulPowerScript反轉(zhuǎn)錄酶10.0pi總體積5.混勻試劑并稍稍離心；6.42°C溫浴1小時；7.將離心管置于冰上終止第一鏈合成。LDPCR擴增cDNA1.將PCR儀預熱到95°C;2.反應管中加入下列試劑2^1cDNA第一鏈80^1去離子水10^110XAdvantage2PCR緩沖液2jul50XdNTP混合物2pl5'PCR引物(5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3')2plCDSIII/3'PCR引物(5'-八丌0^0八00(^0八060060^八0八？0-3003(^-1N-3'(N=A,G，C，orT;N_1=A,G，orC))2(j!50XAdvantage2PolymeraseMixlOOpl總體積3.輕拍混勻各組分，稍稍離心后放到已預熱(95°C)的PCR儀(HYBAIDPCREXPRESS,以下操作中使用的PCR儀不變)4.按下面程序開始PCR:95°C1分鐘22個循環(huán)95°C15秒68°C6分鐘5.循環(huán)結束后取樣品電泳檢測(電泳儀FR-280,上海復日，電泳條件1.1%瓊脂糖凝膠，EB染色；100V、20分鐘)蛋白酶K消化1.吸取50pi擴增的dscDNA(2-3pg)到一0.5-ml滅菌的離心管中，加入2pi蛋白酶K(20pg/|Lil)。2.混勻試劑并稍稍離心。3.45°C溫浴20min，稍稍離心。4.加入50pi去離子水。5.加100pi酚氯仿異戊醇抽提。6.14，000rpm離心5min。7，收集上層液體到另一干凈的離心管中。8.加入等體積的氯仿異戊醇混勻。9.14,000rpm離心5min。10.收集上層液體到另一干凈的離心管中。11.加入1/10體積的3M乙酸鈉，2.5倍體積95%的室溫乙醇，室溫條件下立即14，000rpm離心20min。12.倒掉上清，用100pl80%乙醇洗沉淀物。13.空氣干燥沉淀物約10min。14.加79pi的去離子水溶解沉淀。I消化1.在一O.5-ml離心管中加入序列試劑79pic麵10|ul10X5T/緩沖液10pi5YYI酶1pi100XBSAioo總體積充分混勻，50°C溫浴2hr。3.加2pl1%二甲苯胺染料。cDNA的分級分離1.準備好16個收集管，標記1一16。2.準備好spin-400柱子(ClonTech，Cat.NO.634901的操作要求)。3.用700pi的緩沖液洗柱子。4.待洗柱緩沖液流完，將上面的酶切產(chǎn)物約100pl平穩(wěn)地加到膠層中間，直到產(chǎn)物全部滲到膠面下。5.加100pl緩沖液使染料層下降數(shù)毫米，放置好第一收集管。6.加600pl的緩沖液并開始收集滴出的液體，每管收集35pl。7.合并第9一15(l—7)管，-20°C乙醇沉淀過夜。8.14,000rpm離心20min。棄上清，室溫干燥10min。9.加20pl去離子水溶解沉淀。二.質(zhì)量檢測電泳檢測(電泳儀FR-280,上海復日，電泳條件1.1%瓊脂糖凝膠，EB染色;100V、10min)，檢測合格。將cDNA與pBSF載體相連操作步驟1.反應管中加入下列試劑c廳2.0piVector(500ng/ml)2.0pi10XLigation緩沖液1.0piATP(10mM)1.0piT4DNA連接酶1.0)al去離子水_3.0Ul總體積(|al)10.0pi2.16°CPCR儀上過夜(HYBAIDPCREXPRESS)。*注克隆載體pBSF為pBluescriptIISK的改造載體，具體是將EcoRI和NotI之間的序列改造為SfiIA和SfiIB接頭序列，酶切后可定向插入cDNA片斷(SfiIA—SfiIB)重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化一.操作步驟1.取200ul感受態(tài)宿主菌(大腸桿菌DH-5a)至滅菌的50ml離心管中，放置冰水浴融化；。2.加入上述lul連接液，輕輕混勻后置于冰上45min。；3.42。C水浴熱休克90sec,迅速放入冰上2min;4.加入2mlLB培養(yǎng)基(不含抗生素)，37'C搖床，轉(zhuǎn)速《150rpm，復蘇45min;5.取200ul菌液涂布于9cm培養(yǎng)皿上(Apr-IPTG/x-galLB固體培養(yǎng)基)，37°C過夜。IPTG和x-gal為上海生工生物工程技術有限公司的產(chǎn)品cDNA芯片的制備一、試驗方法l.操作步驟目的基因(質(zhì)粒形式)PCR擴增1.1從-20。C冰箱中取出油菜基因模板，在室溫條件下靜置至完全溶解，混勻后再置于96孔板離心機上稍做離心；1.2用單道微量移液器在PCR反應液專用加樣槽中加入適量的通用引物、dNTP、PCR緩沖液、MgCla及Taq酶(均為TAKARA公司產(chǎn)品)配制成Mixture,混勻。依次用相應的12道微量移液器在PCR板中加入ddH20、反應Mixture及模板，封上Tape膜，置于96孔板離心機稍離心，放入96孔板PCR儀中，按下列程序進行PCR反應。94。C30秒；94。C30秒；56。C30秒；72'C2分鐘；回到②35個循環(huán)；72°C6分鐘；l(TC(或4。C)保持。1.3PCR完畢，取出產(chǎn)物板，放于-2(TC冰柜中有序保存，備電泳(如需立刻電泳放于4'C保存)。2.操作步驟電泳2.1配制1%(質(zhì)量/體積比)的瓊脂糖凝膠。2.2用12道微量移液器從PCR產(chǎn)物板每孔中取樣品加入到L25X上樣緩沖液r中混勻，按順序?qū)右褐鹋偶拥侥z點樣孔內(nèi)。150V電泳0.5hr。2.3在電泳成像儀上拍攝電泳圖譜，并用熱敏打印機打印出圖譜照片，質(zhì)檢確認PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量。3.操作步驟PCR產(chǎn)物純化(異丙醇純化法)①②③④⑤⑥⑦3.1將質(zhì)檢合格的PCR產(chǎn)物板揭去Tape膜，用12道微量移樣器取適量NaAc(pH=7.0，3mol/L)和異丙醇依次加入PCR產(chǎn)物板中，混勻，于-2(TC冰柜或冰箱中沉淀過夜(或-2CTC靜置3hr以上)。3.2沉淀完畢，將96孔板置96孔板離心機，4500rpm離心30min,傾去上清液，倒置5分鐘。3.3每孔中加入75%乙醇lOO)il，輕輕混勻后置96孔板離心機中4500rpm離心20分鐘。傾去上清液，室溫靜置干燥4小時以上。4.操作步驟點樣4.1將96孔PCR板中干燥的PCR產(chǎn)物溶于點樣稀釋液(博星基因芯片公司生產(chǎn))中(每孔加16W左右點樣稀釋液)，充分溶解。4.2用十二道微量移液器將96孔PCR板中的樣品按一定順序移至384孔板(Genetix公司生產(chǎn))中。4.3打開OmniGrid點樣儀，裝上MicroQuill2000點樣針(MajerPrecision公司生產(chǎn))，按點樣方案設計程序(點樣方案見附圖一)，放上384孔樣品板及待點樣基片(博星基因芯片公司自產(chǎn))，運行程序開始點樣。5.操作步驟點樣后處理5.1點樣完成的芯片置點樣儀中水合30分鐘、室溫干燥2小時。5.2以封閉液(博星基因芯片公司生產(chǎn))封閉15分鐘、水沖洗、室溫干燥后備用。說明本芯片共點有8192個基因(每基因1個點)，其中包括8095個待研究基因和控制系統(tǒng)(空白對照81個、陰性對照16個)所點制成的芯片共8192個點，分為32個亞矩陣，每個亞矩陣中有16*16個點，點間距為0.281mm。二、材料與設備1.TAKARA公司引物(T3:5'AATTAACCCTCACTAAAGGG3'，T7:5'GTAATACGACTCACTATAGGGC3')2.TAKARA公司dNTP3.TAKARA公司PCR緩沖液4.TAKARA公司MgC125.TAKARA公司Taq酶6.博星基因芯片公司基片7.博星基因芯片公司點樣稀釋液8.博星基因芯片公司封閉液9.Genetix公司384孔板10.MJResearch公司MJResearchPTC-225PCR儀11.Sigma公司Sigma4-15C離心機12.GeneMachines公司OmniGrid點樣儀13.Gilson公司Gilson單道微量移液器1714.Eppendorf公司Eppendorf十二道微量移液器通過cDNA芯片研究基因表達譜流程一、試劑I.UNIzol2.異丙醇3.氯仿4.75%乙醇(RNase-free)5.Milli-Q水(RNase-free)6.無水乙醇7.dNTPs8.Cy5-dCTP和Cy3-dCTP9.雜交試劑110.標記試劑III.雜交試劑212.標記試劑II13.反轉(zhuǎn)錄酶14.標記試劑III15.反轉(zhuǎn)錄引物16.洗片試劑l17.反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液18.洗片試劑219.DTT20.洗片試劑3二、儀器與設備I.電動玻璃勻漿機2.電子天平3.低溫高速離心機4.低溫高速臺式離心機5.超凈工作臺6.制冰機7.電熱恒溫水槽8.電泳槽9.電泳儀10.微波爐II.凝膠成像儀12.臺式離心機13.核酸定量分析儀14.移液槍15.可調(diào)電爐16.旋渦混合器17.雜交箱18.雜交艙19.S-200純化柱20.真空濃縮儀21.蓋玻片22.芯片掃描儀三、探針標記與雜交1、預雜交1)配制預雜交液雜交試劑1加入到的E卯enderf管中，振蕩混勻后，加入雜交試劑2混勻。2)將配制好的預雜交液放入95'C水浴鍋內(nèi)變性2分鐘，將待預雜交的玻片放入95'C水浴鍋內(nèi)變性30sec，玻片取出后即放入無水乙醇中30sec，晾干。3)將已變性的預雜交液加到玻片的點樣區(qū)域內(nèi)，蓋上蓋玻片，放入雜交箱內(nèi)42'C預雜交5—6小時。2、標記探針(以下在冰浴中進行)1)于一已滅菌的1.5mLEppendorf管內(nèi)依次加入以下試劑(反應終體積為50wL，以下試劑均為RNase-free):ddH2023tiL逆轉(zhuǎn)錄引物5uL(Oligodt)總RNA30-50ug振蕩混勻，置于7(TC水浴10分鐘。取出后，迅速置于冰上。2)分別加入以下試劑逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液10ULDTT5uLdNTPs4yL3)而后在暗室中加入以下試劑逆轉(zhuǎn)錄酶2uLCy5-dCTP或Cy3-dCTP3yL4)用手指彈打管壁以混勻樣品，水浴2分鐘。將Eppendorf管置于42'C水浴2小時。5)依次在Eppendorf管中加入標記試劑I4nl，65'C水浴10分鐘后加入標記試劑II4ul?；靹?，合并對照組、實驗組。避光，真空抽干至50yL左右。6)乙醇沉淀純化DNA。7)將柱體在旋渦混合器上劇烈振蕩搖勻，懸浮內(nèi)溶的樹脂。將柱頂端的小帽旋松四分之一圈，掰斷柱下端的密封頭。8)將柱置于一個1.5ml的Eppendorf管中，以3000rpm離心1分鐘將柱置于另一個新的1.5mlEppendorf管中，去掉頂端的帽，將樣品慢慢加到樹脂上表面的中間，注意不要攪動柱體。以3000rpm離心2分鐘，經(jīng)純化的樣品流出，被收集在支持用的Eppendorf管中。9)加入標記試劑III8nl，真空抽干。3、雜交1)在抽干的探針管中加6.5wL雜交試劑I，充分混勻，使探針溶解。再加入6.5uL雜交試劑II，混勻備用。2)將預雜交的玻片取出，用ddH20沖去蓋玻片。3)將探針置于95'C水浴中變性2分鐘；玻片置于95'C水浴中變性30sec,玻片取出浸無水乙醇30sec，探針取出后迅速置于冰上。4)將探針置于芯片上，用蓋玻片覆蓋，置于雜交艙中，用Parafilm密封，放入42'C雜交箱內(nèi)雜交過夜(16—18h)。4、洗片1)用0.5%的洗滌液1沖洗玻片，去除蓋玻片。2)準備兩個染色缸，分別裝有0.5%的洗片試劑1+2%的洗片試劑2、5%的洗片試劑3，放入6(TC水浴鍋中。3)將玻片依次浸入以上兩個染色缸中洗滌10分鐘。4)用0.5%的洗滌液1沖洗玻片，晾干后掃描。二.實驗結果1.計算菌落數(shù)及藍白斑比例菌落數(shù)1700/板；其中藍斑40;重組率約97.6%2.庫容量庫容量=菌落數(shù)><連接產(chǎn)物量=1600X10X10X7^1.0X10619試驗結果發(fā)明人通過對克隆的測序分離到了這個脂肪酸延長酶基因，并對其進行了生物芯片及轉(zhuǎn)基因植株的分析。結果如下fattyacidelongase,P-Ketoacyl-CoAsynthase,CloneNO.b038h061脂肪酸延長酶(p-酮脂酰-CoA-合酶，fattyacidelongase,p-Ketoacyl-CoAsynthase)基因序列如圖1所示；該基因的蛋白序列如圖2所示。實施例2基因在種子發(fā)育過程中的表達通過實施例1所述的芯片實驗的過程，得到如圖4所示的結果。結果表明，該脂肪酸延長酶在油菜種子發(fā)育早期表達并逐漸降低到花后17天幾乎不表達，而后到種子發(fā)育后期又逐漸升高。實施例3基因過量表達植株中脂肪酸含量I材料和方法異源轉(zhuǎn)化擬南芥(col-0)，購自植生所。植物表達載體為改造后的pCAMBIA2301載體，具體為在多克隆位點前加入CaMV35S啟動子，pCAMBIA2301載體購自CAMBIA公司。1、發(fā)明人將實施例1中的脂肪酸延長酶基因的全長cDNA序列構建于改造過的植物表達載體p2301(在多克隆位點前加入35S強啟動子)中，轉(zhuǎn)入擬南芥(col-0)中得到該基因的過量表達植株。在CaMV35S啟動子的驅(qū)動下，該基因強表達于轉(zhuǎn)基因植株中。2、轉(zhuǎn)基因植株中該基因的表達檢測按上述的轉(zhuǎn)基因植物材料中目的基因的表達水平檢測方法進行檢測，結果見圖5。由轉(zhuǎn)基因植物中基因表達水平可以看出在160，166，168三個株系中目的基因表達是比較高的。3、轉(zhuǎn)基因植株種子中脂肪酸含量和組分的測定用上述植物材料中脂肪酸含量測定方法進行。發(fā)明人檢測了這三個株系種子中的脂肪酸組份與變化，見表l。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表l的結果表明，在三個獨立的轉(zhuǎn)基因株系中，和野生型相比脂肪酸組份有較為一致的變化，即碳鏈長度在20及以上的脂肪酸組份在三個株系中都有一致的升高，尤其是FA24:1和FA24:0的百分含量是野生型的二倍以上。證明了該基因在長鏈脂肪酸的合成中起到了一定的作用。實施例4基因過量表達植株中脂肪酸含量II材料和方法油菜種子，植物表達載體為改造后的pCAMBIA2301載體發(fā)明人按實施例3的方法將該p2301載體同時進行了油菜的轉(zhuǎn)化(35S強啟動子)，并得到了一個轉(zhuǎn)基因株系，該株系得脂肪酸成份變化如表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表2的結果表明，和野生型相比脂肪酸組份在轉(zhuǎn)基因株系中也有變化，即是FA24:1和FA24:0的百分含量是野生型的將近兩倍。證明了該基因在長鏈脂肪酸的合成中起到了一定的作用。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。序列表<110>中國科學院上海生命科學研究院〈120〉油菜超長鏈脂肪酸合成酶及其應用<130〉081647<160〉2<170〉Patentlnversion3.3〈210>1<211〉1673<212〉DNA<213〉Brassicanapus<400〉1gggccac犯cacagcttact犯gagcaaacacaacaaactttttctactcttctttccsc60"tgtttagggaaaaactxcaatgaagaatttaaagatgtttttct"tcaagatcttgttcat120ctcatt犯tggtagcattatcc3tgaaaggatctgggatcaacttag朋gatctacaa肌180cttttttcaccataacctagetaaccataacccttctttcatttcctctgcttttcctgtt240gaccatctacatgttaagccgacccaaacccgtttacctcgtcgacttctcctgctacct300cccaccgtcccatctcaaggtcagtgtcaaaacactgatggaacatgcgagacgtgcaag360aga^gc3ggcgtgtgttggaag33C犯agagaeicg￡ict￡itttgattg3gtttcagcag犯420gactcttgaacgttccggtctcggtcaagaaacatgtatccccgagggtctccaatgctt480cccgcttcagcaggatatggcggcttcacgtaaagagacggcgg犯gtcatattcggagc540gcttgacaatctcttccgcaacaccggtgtaaagcctggcgagatcggtatcttggtggt600gaattctagcacatttaatccaactccatcacttgcttccatgattgttaacaaatacaa660actcagagacaacatcaagagtct犯atcttggaggaatgggttgcagtgctggagtceit720agccattgatgttgcaaagggattattacaagttcataggaacacttacgccatcgtagt780aagcac3g3gaacatcactcagaacttgtatctgggga犯^cawtc^tgctagtcac840caactgtttgttccgggtcggtggagccgctattctgctctctaacagatctagagaccg900gtcacgcgcg犯gtacgagcttcttcatsccgtaaggatccstaccggatctgatgatag960gtcctttgagtgtgcaacacaggaagaagatgaagatggtat犯tcggagttaccttgac1020aaagaatctaccaatggtggctgcaaggactcttaagatcaatatcgccactttgggtcc1080tctggttcttttttaggccgtatcceicgctattacacgttcc^tga犯ggagttgas犯ggtggaagaggaggcgtctaeig犯gctagcactatacaccctctaatagagaatgacacttttctttgtgggacttcaaatgagcUgagtcacaggtttacattcctcactcgcctttgggtaatacttag犯gaagtaagcatttctgagctgtctcccttcgagctcttggcaaattaaacgttaaggctttgggatccttcggttccaggttttaeiacaatccgtggtgt肌csgcgga柳ttgttctgtttgggatggacagattggctctacgatccggttgagtttggtttgttcatgtctctggaccatttatggttgtttcttacgtttgttgtatggtattcttcagagcttgttccaaagtttcgcatgtaagaattgcgtatgtttaatg〈210〉2<211>477<212>PRT<213〉Brassican即us<400〉2MetLysAsnLeuLysMetPhePhePheLyslieLeuPhelieSerLeu151015MetValAlaLeuSerMetLysGlySerGlylieAsnLeuGluAspLeu202530GinAsnPhePheHisHisAsnLeuGluThrlieThrLeuLeuSerPhe354045ProLeuLeuPheLeuLeuThrlieTyrMetLeuSerArgProLysPro505560ValTyrLeuValAspPheSerCysTyrLeuProProSerHisLeuLys1140120012601320gatttggtatgagttggcttatacagaagctaaaggaaggatgaaggaaggcgacaggat138014401500gattgatatttaattttgtggtttaggccatgttggctatttatcgaactatctatcttt1560162016736570758023ValSerValLysThrLeuMetGluHisAlaArgArgAlaArgGluAla859095GlyValCysTrpLysAsnLysGluAsnAspTyrLeulieGluPheGin100105110GinLysThrLeuGluArgSerGlyLeuGlyGinGluThrCysliePro115120125GluGlyLeuGinCysPheProLeuGinGinAspMetAlaAlaSerArg130135140LysGluThrAlaGluValliePheGlyAlaLeuAspAsnLeuPheArg145150155160AsnThrGlyValLysProGlyGlulieGlylieLeuValValAsnSer165170175SerThrPheAsnProThrProSerLeuAlaSerMetlieValAsnLys180185190TyrLysLeuArgAspAsnlieLysSerLeuAsnLeuGlyGlyMetGly195200205CysSerAlaGlyVallieAlalieAspValAlaLysGlyLeuLeuGin210215220ValHisArgAsnThrTyrAlalieValValSerThrGluAsnlieThr225230235240GinAsnLeuTyrLeuGlyLysAsnLysSerMetLeuValThrAsnCys245250255LeuPheArgValGlyGlyAlaAlalieLeuLeuSerAsnArgSerArg260265270AspArgSerArgAlaLysTyrGluLeuLeuHisThrValArglieHis275280285ThrGlySerAspAspArgSerPheGluCysAlaThrGinGluGluAsp290295300GluAspGlylielieGlyValThrLeuThrLysAsnLeuProMetVal305310315320AlaAlaArgThrLeuLyslieAsnlieAlaThrLeuGlyProLeuVal325330335LeuProMetLysGluLysLeuAlaPhePheValThrPheLeuLysLys340345350LysTyrPheArgProGluLeuLysAsnTyrThrProAspPheLys匕eu355360365AlaPheGluHisPheCyslieHisAlaGlyGlyArgAlaLeulieAsp370375380GluLeuGluLysAsnLeuLysLeuSerProLeuHisValGluAlaSer385390395400ArgMetThrLeuHisArgPheGlyAsnThrSerSerSerSerlieTrp405410415TyrGluLeuAlaTyrThrGluAlaLysGlyArgMetLysGluGlyAsp420425430ArglieT卬GinlieAlaLeuGlySerGlyPheLysCysAsnSerSer435440445ValTrpValAlaLeuArgAsnValLysProSerValHisAsnProTrp450455460GluAspCysMetAspArgTyrProValGlulieAsplie4654704752權利要求1.一種分離的多肽，其特征在于，它包含以下氨基酸序列(i)SEQIDNO2氨基酸序列的多肽，或(ii)將SEQIDNO2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有催化延長脂肪酸鏈長的功能的由(i)衍生的多肽。2.—種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，所述的核苷酸序列編碼如權利要求1所述的多肽。3.如權利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸的序列如SEQIDNO:1所示。4.一種載體，其特征在于，它含有如權利要求2所述的多核苷酸。5.—種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有如權利要求4所述的載體或基因組中整合有如權利要求2所述的多核苷酸。6.—種如權利要求1所述的多肽的制備方法，其特征在于，所述的方法包括步驟(a)在適合表達的條件下，培養(yǎng)如權利要求5所述的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出如權利要求l所述的多肽。7.—種提高植物油脂中超長鏈脂肪酸含量的方法，其特征在于，所述的方法包括步驟(1)提供攜帶表達載體的宿主菌，所述的表達載體含有如權利要求2所述的多核苷酸；(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(1)中的宿主菌接觸，從而使如權利要求2所述的多核苷酸轉(zhuǎn)入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉(zhuǎn)入如權利要求2所述的多核苷酸的植物細胞或組織或器官再生成植株；優(yōu)選的宿主菌選自大腸桿菌、農(nóng)桿菌；優(yōu)選所述的超長鏈脂肪酸碳鏈長度20-40個；更佳地碳鏈長度20-30個。8.—種如權利要求1所述的多肽用途，其特征在于，所述的多肽被用于調(diào)節(jié)植物油脂中超長鏈脂肪酸的含量；優(yōu)選所述的多肽的序列如SEQIDNO:2所示。9.一種如權利要求2所述的多核苷酸的用途，其特征在于，所述的多核苷酸被用于調(diào)節(jié)植物油脂中超長鏈脂肪酸的含量；優(yōu)選所述的多核苷酸的序列如SEQIDNO:1所示。10.如權利要求8或9任一所述的用途，其特征在于，所述的植物選自油菜、甘藍、白菜、大豆、花生、芝麻、向日葵、棉花、麻瘋樹、或油棕櫚。全文摘要本發(fā)明公開了一種多核苷酸，它的超表達可以提高植物中超長鏈脂肪酸的含量，本發(fā)明還公開了這種多核苷酸表達的氨基酸序列。本發(fā)明還公開了所述多核苷酸的用途。文檔編號C12N1/21GK101560504SQ20081003608公開日2009年10月21日申請日期2008年4月16日優(yōu)先權日2008年4月16日發(fā)明者武國章,沈思師,亞牛,薛紅衛(wèi)申請人:中國科學院上海生命科學研究院