微孔草Δ6-脂肪酸脫飽和酶MsD6D基因家族及其重組表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了微孔草△6-脂肪酸脫飽和酶MsD6D基因家族及其重組表達(dá)載體和應(yīng)用，MsD6D基因家族包括MsD6D1和MsD6D2兩個成員，具有△6-脂肪酸脫飽和酶活性，能夠催化亞油酸形成γ-亞麻酸(GLA)，也能夠催化α-亞麻酸(ALA)形成十八碳四烯酸(SDA)，將MsD6D1和MsD6D2正義轉(zhuǎn)入微孔草自身以后，轉(zhuǎn)基因種子中GLA和SDA含量大幅提高；轉(zhuǎn)入甘藍(lán)型油菜以后，轉(zhuǎn)基因油菜種子中積累了非轉(zhuǎn)基因油菜種子所不具有的GLA和SDA；表明利用MsD6D基因家族能夠創(chuàng)造新資源材料，用于工業(yè)提取GLA和SDA，或直接用于生產(chǎn)富含GLA和SDA的保健型食用油。
【專利說明】微孔草Δ6-脂肪酸脫飽和酶MsD6D基因家族及其重組表達(dá) 載體和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及微孔草Λ 6-脂肪酸脫飽和酶MSD6D基因家 族，還涉及MsD6D基因家族的重組表達(dá)載體和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acids, PUFA)是在碳原子之間 含有兩個以上雙鍵的不飽和脂肪酸，其代謝途徑是以亞油酸（Linoleic acid，LA; C18:3A9，12，n-6)為初始底物，在一系列脂肪酸脫飽和酶（脂肪酸脫氫酶）和脂肪酸 延伸酶的催化下，先后生成Y -亞麻酸（Y-Iinolenic acid, GLA ;C18:3 Δ 6'9'12, n-6)、 α-亞麻酸（α-linolenic acid, ALA ;C18:3 八9'12'15，]1-3)、十八碳四烯酸（8七6&1'1(1〇11；^ 已。1(1，30六，〇(^3(16。3七61:四611〇;[。3。1(1，（7^，018:4八6'9'12'15，11-3)、雙高丫-亞麻酸（0!11^)、 花生四烯酸（ARA)、二十碳五烯酸（EPA，n-3)、二十二碳五烯酸（DPA)、二十二碳六烯酸 (DHA，n-3)等長鏈多不飽和脂肪酸（LC-PUFAs)或超長鏈多不飽和脂肪酸（VLC-PUFAs)。
[0003] PUFA能促進(jìn)生長發(fā)育，調(diào)節(jié)人體的脂質(zhì)代謝，還能治療和預(yù)防心腦血管疾病，同 時(shí)具有免疫調(diào)節(jié)、抗癌、延緩衰老等重要的生理功能，對人類健康起到非常重要的作用。 Ω3(η-3)系列脂肪酸對人體具有重要生理功能，其中ALA是n-3PUFA(EPA、DHA)合成前體； EPA是一類重要的多聚不飽和脂肪酸化學(xué)信使物，在免疫和炎癥反應(yīng)上起至關(guān)重要的作用； DPA是生成DHA的中間產(chǎn)物，對冠心病具有潛在的抑制作用；DHA是視網(wǎng)膜正常發(fā)育和發(fā)揮 其正常功能所必需的，大腦和神經(jīng)組織中DHA含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于機(jī)體其他組織，對神經(jīng)功能發(fā) 揮著至關(guān)重要的作用。Ω6(η-6)系列脂肪酸對人體也具有重要生理功能，其中GLA是組成 人體各組織生物膜的結(jié)構(gòu)材料，也是合成前列腺素的前體，GLA水平的不足可導(dǎo)致體內(nèi)機(jī)能 的紊亂，引起某些疾病，如糖尿病、高血脂等。
[0004] Λ 6-脂肪酸脫飽和酶（Δ 6 fatty acid desaturase，D6D)是一種多功能酶，也是 PUFA生物合成途徑經(jīng)第一步限速酶，它能夠以LA為底物催化合成GLA，也能夠以ALA為底 物催化合成SDA，據(jù)報(bào)道在它哺乳動物中還能夠催化以24C-PUFA為底物的生化反應(yīng)。
[0005] 理論上人體只需要通過食物等途徑攝入足夠的LA和ALA，就可以利用人體自身的 D6D等酶系統(tǒng)將它們分別合成為GLA和EPA、DHA，但殘酷的現(xiàn)實(shí)是人體D6D活性很低而且易 被多種環(huán)境因素（如膳食中的脂肪）所抑制。這就導(dǎo)致人體即使攝入了足夠的底物L(fēng)A和 ALA，但合成GLA、EPA、DHA的水平依然嚴(yán)重不足，因此需要直接攝入GLA、EPA、DHA等來補(bǔ)充 其不足。
[0006] GLA作為人體內(nèi)必需的不飽和脂肪酸，成年人每日需要量約為36mg/kg。傳統(tǒng)補(bǔ)充 人體EPA和DHA的主要途徑是深海魚油，魚油中的PUFA實(shí)際上是魚通過取食藻類物等而富 集在體內(nèi)的，該種方式受到魚類資源量的極大限制，來源極為有限，缺乏可持續(xù)性，且工藝 復(fù)雜，成本高，價(jià)格昂貴。最近的研究表明，人體能夠利用攝入的SDA迅速而有效地合成為 EPA，進(jìn)一步合成DHA，其效果雖然比直接攝入EPA和DHA略差，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)比攝入ALA的效果好 得多，可以有效解決人體EPA和DHA不足的問題。因此，直接補(bǔ)充EPA和DHA的方式完全可 以由補(bǔ)充SDA的方式所取代。研究發(fā)現(xiàn)，不僅一些真菌和藻類物種中能夠合成SDA，而且少 數(shù)植物也能夠合成SDA，紫草科Ooraginaceae)特別是藍(lán)薊屬（Bchium)植物、少數(shù)報(bào)春花 屬（Primula)植物的種子油脂中富含SDA，原因是它們的D6D酶能夠有效利用ALA生成SDA， 其它植物中SDA的情況以及D6D酶對ALA底物的利用效率問題則有待研究。
[0007] PUFA在市場上一直供不應(yīng)求，而且市場需要量還在不斷地增長。培養(yǎng)藻類和真菌 生產(chǎn)PUFA是一個重要的研究熱點(diǎn)，而且已經(jīng)取得重要成就，但仍然受到操作復(fù)雜、成本高、 價(jià)格貴的困擾。利用植物系統(tǒng)尤其是大宗油料作物的種子來生產(chǎn)PUFA，相比動物、真菌、藻 類等生產(chǎn)途徑，具有容易上規(guī)模、種植簡單、成本相對較低、安全性好的優(yōu)點(diǎn)。雖然大宗油料 作物如油菜、大豆、花生、棉花、向日葵、棕櫚、橄欖中不存在GLA，所有高等植物都不具有合 成EPA和DHA的關(guān)鍵酶，而且通過植物代謝工程生產(chǎn)EPA和DHA在技術(shù)上極其困難，但如果 通過基因工程方式導(dǎo)入既能利用LA也能利用ALA為底物的外源D6D基因，則可以利用大宗 油料作物來生產(chǎn)GLA和SDA，滿足市場需求量，并降低成本。
[0008] 微孔草（Microula sikkimensis)系紫草科微孔草屬的兩年生草本植物，分布于青 藏高原及其毗鄰地帶（如青海、甘肅、四川等）海拔2700-4500m的高寒地帶，對寒、旱、強(qiáng)紫 外線具有很強(qiáng)的適應(yīng)性，種籽種含油率高達(dá)45 %，不飽和脂肪酸高達(dá)90. 5%，油酸和LA含 量較高，ALA含量也可觀，GLA的含量與目前世界熱銷商品月見草油的含量相近，而且還含 有SDA。微孔草在我國西北已人工馴化種植，成為我國特有的稀有油料作物，是能夠同時(shí)提 供多種PUFA (ALA、GLA、SDA)的新油源。但是，天然微孔草籽油中GLA和SDA的含量仍然不 高，通過代謝工程大幅提高其GLA和SDA含量具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0009] 甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.，2n = 38, AACC)為我國五大油料作物之首，經(jīng)濟(jì) 性狀好，產(chǎn)量高，含油量高，抗逆性強(qiáng)，是重要的食用油和蛋白質(zhì)飼料來源，也是重要的工業(yè) 原料。菜子油品質(zhì)改良的重要內(nèi)容是改善其中脂肪酸的成分和含量，對于普通食用型菜籽 油而言，主要集中在降低或消除芥酸，增加油酸的比例，減少易導(dǎo)致油腐敗的ALA的比例， 提高含油量。通過導(dǎo)入外源D6D基因，利用油菜這一傳統(tǒng)大宗油料作物作為生物反應(yīng)器，來 生產(chǎn)GLA、SDA等PUFA，是油菜品質(zhì)改良和分子育種的另一個重要方面，在人類的醫(yī)藥保健 領(lǐng)域具有重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供微孔草λ6-脂肪酸脫飽和酶MSD6D基因家 族，本發(fā)明的目的之二在于提供含有微孔草△ 6-脂肪酸脫飽和酶MsD6D基因家族的重組表 達(dá)載體；本發(fā)明的目的之三在于提供含有上述所述重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化子；本發(fā)明的目的 之四在于提供微孔草Λ 6-脂肪酸脫飽和酶MsD6D基因家族在提高微孔草屬植物Y-亞麻 酸和十八碳四烯酸含量中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之五在于提供微孔草Λ 6-脂肪酸脫飽和 酶MsD6D基因家族在大宗油料作物重建γ -亞麻酸和十八碳四烯酸合成途徑中的應(yīng)用。 [0011] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0012]微孔草Λ 6-脂肪酸脫飽和酶MsD6D基因家族，所述MsD6D基因家族包括MSD6D1和MsD6D2兩個成員；所述MsD6Dl的氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示；所述MsD6D2的氨基 酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
[0013] 優(yōu)選的，所述MsD6Dl的基因序列如SEQ ID NO. 3所示；所述MsD6D2的基因序列如 SEQ ID NO. 4 所示。
[0014] 2、含有所述微孔草Λ 6-脂肪酸脫飽和酶MsD6D基因家族的重組表達(dá)載體。
[0015] 優(yōu)選的，所述重組載體含有MsD6Dl基因編碼區(qū)或MsD6D2基因編碼區(qū)的序列，所述 MsD6Dl基因編碼區(qū)的序列對應(yīng)于SEQ ID NO. 3第133?1479位堿基所示，所述MsD6D2基 因編碼區(qū)的序列對應(yīng)于SEQ ID NO. 4的第340?1689位堿基所示。
[0016] 更優(yōu)選的，所述重組表達(dá)載體是將MsD6Dl基因編碼區(qū)或MsD6D2基因編碼區(qū)的序 列插入PC2301M1NPB載體的NapA啟動子與Nos終止子之間而得；
[0017] 或所述重組表達(dá)載體是MsD6Dl基因編碼區(qū)或MsD6D2基因編碼區(qū)的序列插入 PYES2質(zhì)粒的XbaI和BamHI酶切位點(diǎn)處而得；
[0018] 所述pC2301MlNPB載體由以下方法制備：用HindIII和EcoRI切下pBI121上的 ⑶S基因表達(dá)盒然后插入pCAMBIA2301載體的HindIII和EcoRI酶切位點(diǎn)處，然后用SacI 和XmaI切去⑶S基因后用帶有SacI和XmaI粘性末端的序列連接，得pC2301Ml載體，然后 在PC2301M1載體HindIII酶切位點(diǎn)處連入由MAS啟動子驅(qū)動bar基因表達(dá)、MAS終止子終 止表達(dá)的bar基因表達(dá)盒，得PC2301M1B載體；最后將PC2301M1B載體上的CaMV35S啟動子 用種子特異啟動子NapA替換即得pC230IMlNPB載體。
[0019]3、含有所述重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化子。
[0020] 4、所述微孔草Λ 6-脂肪酸脫飽和酶MsD6D基因家族在提高微孔草屬植物γ -亞 麻酸和十八碳四烯酸含量中的應(yīng)用。
[0021] 5、所述微孔草Λ 6-脂肪酸脫飽和酶MsD6D基因家族在大宗油料作物重建Y-亞 麻酸和十八碳四烯酸合成途徑中的應(yīng)用。
[0022] 優(yōu)選的，所述大宗油料作物為油菜、大豆、花生、棉花、向日葵、棕櫚或橄欖，更優(yōu)選 的，大宗油料作物為油菜；最優(yōu)選的，所述油菜為甘藍(lán)型油菜。
[0023] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了微孔草MsD6D基因家族2個成員MsD6Dl和 MsD6D2的全長cDNA序列和gDNA序列、編碼蛋白序列和結(jié)構(gòu)特征、進(jìn)化關(guān)系、表達(dá)的器官組 織特異性等，并確認(rèn)了 MsD6D基因家族成員均編碼有雙活性的Λ 6-脂肪酸脫飽和酶，采用 轉(zhuǎn)基因技術(shù)將MsD6Dl和MsD6D2基因正義轉(zhuǎn)化微孔草后能夠大幅度提高種子中GLA和SDA 的含量，將MsD6Dl和MsD6D2正義轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜后均能夠引起種子中積累GLA和SDA，證 明MsD6D基因家族在植物GLA和SDA性狀的分子育種方面具有很好的應(yīng)用前景，其轉(zhuǎn)基因 植物可應(yīng)用于工業(yè)提取GLA和SDA，或直接應(yīng)用于生產(chǎn)富含GLA和SDA的保健型食用油。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0025] 圖1為MsD6D基因家族的克隆電泳圖，其中a為MsD6D基因家族保守區(qū)標(biāo)簽序列的 擴(kuò)增（A和B為MsD6D基因家族保守區(qū)擴(kuò)增結(jié)果），b為MsD6Dl和MsD6D2的5' -RACE的巢 式擴(kuò)增（A為MsD6Dl，B為MsD6D2)，c為MsD6Dl的3' -RACE的巢式擴(kuò)增（C為MsD6Dl ;D為 MsD6D2)，d 為 MsD6Dl 和 MsD6D2 的全長 cDNA 擴(kuò)增（C 為 MsD6Dl，D 為 MsD6D2)，M 為 Trans2K plus DNA marker。
[0026] 圖2為MsD6D 1和MsD6D 2的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列圖（A為MsD6D 1，B為MsD6D 2,起始密碼子和終止密碼子加方框，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和poly (A)加尾位點(diǎn)加雙 下劃線（主要位點(diǎn)為粗體）。
[0027] 圖3為MsD6Dl和MsD6D2蛋白的系統(tǒng)分析圖[D6D :Λ 6-脂肪酸脫飽和酶；sD8D : Λ 8-鞘脂脫飽和酶（也簡稱為SLD);角齒蘚（Ceratodon purpureus，CAB94993. 1);地 錢（Marchantia polymorpha，AAT85661. 1);銀蓮花（Anemone leveillei，AAQ10731. 1); 銀蓮花（Anemone leveillei，AAQ10732. I);黑加侖（Ribes nigrum，ADA60230. I);黑加 侖（Ribes nigrum，ADA60228. I);擬南芥（Arabidopsis thaliana，AAM648951);琉璃 苣（Borago officinalis，AAG43277.1);琉璃苣（Borago officinalis，AAD01410.1);藍(lán) 薊（Echium gentianoides，AAL23580. 1);煙草（Nicotiana tabacum，AB031111. 1);油茶 (Camellia oleifera，ADD10720.1);柱花草（Stylosanthes hamata，ABU98945.1);報(bào)春花 (Primula vialii，AAP23036. 1);報(bào)春花（Primula vialii，AAP23035. 1)]。
[0028] 圖4為MsD6Dl和MsD6D2在微孔草各器官中轉(zhuǎn)錄表達(dá)的熒光定量PCR檢測結(jié)果（A 為 MsD6Dl，B 為 MsD6D2)。
[0029]圖 5 為酵母菌株 INVScI 分別轉(zhuǎn) pYES2 (對照）、pYES2-MsD6Dl 和 pYES2-MsD6D2 的脂肪酸GC檢測圖（A :轉(zhuǎn)pYES2質(zhì)粒酵母菌株INVScI脂肪酸GC檢測結(jié)果；B :轉(zhuǎn) pYES2-MsD6Dl質(zhì)粒酵母菌株INVScI脂肪酸GC檢測結(jié)果；C :轉(zhuǎn)pYES2-MsD6D2質(zhì)粒酵母菌 株INVScI脂肪酸GC檢測結(jié)果）。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體 條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第三版，J.薩姆布魯克等 著）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0031] 本發(fā)明實(shí)施例采用的植物材料微孔草（Microula sikkimensis)各器官采自中 國科學(xué)院西北高原生物研究所的青微2號品種（門源縣中國科學(xué)院海北高寒草甸生態(tài)系 統(tǒng)定位研究站內(nèi)，海拔3600-4000m)，同時(shí)收獲其成熟種子用于轉(zhuǎn)基因研究。甘藍(lán)型油菜 (Brassica napus)品種中雙10號種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所張學(xué)昆研究員惠 贈，油菜品種中油821等其它品種材料為自己保存，種植條件為常規(guī)試驗(yàn)條件。
[0032] 本發(fā)明實(shí)施例采用的試劑及試劑盒：SMARTer? RACE cDNA Amplification Kit為 美國 Clontech 公司產(chǎn)品；PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)、SYEJR? Premix Ex Taq? II (Tli RNaseH Plus) ROX plus、DNA Ligation Kit、 pMD18_T、pMD19_T、Taq DNA 聚合酶、DNase I (RNase-free)及 buffer、RNase Inhibitor、 DL-2000及λ-HindIII DNA Marker購自大連寶生物（TaKaRa)生物工程有限公司；小量 植物組織RNA抽提試劑盒、膠回收試劑盒、小量法質(zhì)粒抽提試劑盒購自上海華舜生物技術(shù) 有限公司；限制性內(nèi)切酶購自立陶宛MBI Fermentas公司；MS(Murashige&Skoog medium， including vitamins)培養(yǎng)基為荷蘭 Duchefa 公司產(chǎn)品；DL_2000plus、Easy-Taq 酶、dNTPs 等試劑購自北京全式金（Transgen)生物技術(shù)有限公司；X-Gluc (5-brom〇-4-chlor〇-3_ind olyl-0-D-glucuronic acid)、利福平（Rif)、鏈霉素（Str)、卡那霉素（Kan)、氨節(jié)青霉素 (Amp)、瓊脂糖、Tris、CTAB、Tris 飽和酌·（pH = 8. 0)、Tryptone、Yeast Extract、X-gal、 IPTG、CTAB等其它生化與分子生物學(xué)試劑購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；植物 激素購自上海稼豐園藝用品等公司。
[0033] 本發(fā)明實(shí)施例采用的主要儀器：Veriti?多重控溫PCR儀購自美國Applied Biosystems公司；CFX96熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；氣相色譜儀（Gas Chromatography，GC)為日本島津GC-7A型；以及分子生物學(xué)和基因工程的其它儀器設(shè)備。
[0034] 本發(fā)明實(shí)施例所用PCR引物和銜接子序列由上海英駿/英濰捷基公司、上海生工 或北京六合華大公司完成。
[0035] 實(shí)施例1、微孔草D6D (MsD6D)基因家族的克隆
[0036] (1)微孔草基因組總DNA和總RNA的提取
[0037] 取微孔草植株的嫩葉，采用十六烷基三甲基溴化胺（CTAB)法提取基因組總DNA， 采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳法和分光光度法評價(jià)核酸樣品的質(zhì)量和濃度。結(jié)果顯示，提取 的微孔草基因組總DNA的完整性好，平均分子量略大于λ-HindIII DNA Marker的23kb條 帶，RNA消化完全，分光光度法檢測其純度也較高，可用于PCR擴(kuò)增。
[0038] 同時(shí)，以微孔草的根（Ro)、莖（St)、葉（Le)、蕾（Bu)、花（Fl)、早期種子（ES)、中期 種子（MS)、后期種子（LS)為材料，分別采用小量植物組織RNA抽提試劑盒提取總RNA，用 DNase I去除總RNA中含有的DNA雜質(zhì)，電泳檢測總RNA的質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)測定總RNA 的濃度和純度。電泳檢測表明獲得的總RNA特征條帶清晰，無明顯RNA降解和DNA污染，分 光光度法檢測評價(jià)的質(zhì)量也較好，能夠滿足后述實(shí)驗(yàn)的要求，然后儲存于_80°C冰箱備用。
[0039] (2)微孔草種子RACE總cDNA第一鏈的獲得
[0040] 取微孔草各發(fā)育階段的總RNA各1 μ g混合，采用SMARTer? RACE cDNA Amplification Kit 按照其說明書操作，分別得到 5' -RACE-Ready cDNA 和 3' -RACE-Ready cDNA第一鏈備用。
[0041] (3)MsD6D基因家族保守區(qū)的擴(kuò)增
[0042]通過 Vector NTI Advance 9. 0 對琉璃苣（Borago officinalis)、藍(lán)薊（Echium gentianoides)、草玉梅（Anemone leveiIlei)、高穗花報(bào)春（Primula vialii)等植物 的D6D基因進(jìn)行多重比對，根據(jù)保守點(diǎn)設(shè)計(jì)兼并引物，上游引物為FBD6D0,下游引物為 RBD6D0,具體序列如表1所示。然后以3' -RACE-Ready cDNA 1 μ 1為模板，F(xiàn)BD6D0和RBD6D0 為引物，擴(kuò)增MsD6D基因家族的保守區(qū)序列。PCR反應(yīng)的程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性2min ;94°C變 性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸2min，35個循環(huán)；72°C延伸lOmin。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 電泳檢測，結(jié)果如圖1中a所示。結(jié)果顯示，擴(kuò)增出了 1條近I. 4kb的特異條帶，然后回收 特異條帶，并進(jìn)行TA克隆后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，送7個陽性克隆子測序，將測序結(jié)果進(jìn)行多重比 對后發(fā)現(xiàn)獲得了 2個獨(dú)立基因（unigene)的標(biāo)簽序列，凈長度分別為1350bp和1353bp (不 計(jì)弓I物上的人工酶切位點(diǎn)）。經(jīng) nucleotide blast (http: //blast, ncbi. nlm. nih. gov/) l：匕 對后發(fā)現(xiàn)它們均與植物特別是紫草科D6D基因最同源，表明該序列為MsD6D基因家族2個 成員的標(biāo)簽序列，分別命名為MsD6Dl和MsD6D2,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示。
[0043] (4) MsD6D基因家族5' -cDNA末端和3' -cDNA末端的擴(kuò)增
[0044] 根據(jù)克隆獲得的保守區(qū)標(biāo)簽序列，分析保守區(qū)序列的同源性后，設(shè)計(jì)了克 隆 MsD6Dl 和 MsD6D25' 端的 4 個反向引物，分別如下 RBD6D5-1、RBD6D5-2、RMsD6D2S、 RMsD6D2SN，其引物序列如表1所示。然后以5' -RACE-Ready cDNA 1 μ L為模板，用引物組 合UPM與RBD6D5-1和UPM與RMsD6D2S分別進(jìn)行MsD6Dl和MsD6D2基因的5'-RACE的第一 次PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性2min ;94°C變性30sec，62°C退火30sec，72°C延 伸lmin，22個循環(huán)；72°C延伸lOmin。再以第一次擴(kuò)增PCR產(chǎn)物0. IyL為模板，用引物組合 NUP與RBD6D5-2和NUP與RMsD6D2SN分別進(jìn)行MsD6Dl和MsD6D2基因的5' -RACE的巢式 PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序同第一次PCR擴(kuò)增，區(qū)別為退火溫度為60°C且擴(kuò)增30個循環(huán)。將 巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果如圖1中b所示。結(jié)果顯示，MsD6Dl和MsD6D2基因 的5' -RACE均產(chǎn)生了 1條約800bp的寬帶，與其它植物D6D基因序列預(yù)測的長度相近?；?收MsD6Dl和MsD6D2基因的5'-RACE擴(kuò)增條帶、經(jīng)TA克隆后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將轉(zhuǎn)化子用PCR 進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，MsD6D2插入片段存在長度多態(tài)性，根據(jù)檢測結(jié)果各送7個代表性克隆 子測序，結(jié)果表明MsD6Dl的5' -cDNA末端凈長度為737bp和735bp，MsD6D2的5' -cDNA末 端凈長度為 896bp、850bp、836bp、820bp、754bp、751bp、702bp、699bp、670bp、619bp 和 575bp 11種，且短片段包含在長片段序列內(nèi)，表明MsD6Dl和MsD6D2的5'-cDNA具有長度多態(tài)性， 這可能由轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的位置不同而引起的。
[0045] 根據(jù)前面克隆獲得的保守區(qū)標(biāo)簽序列，分析保守區(qū)序列的同源性后，設(shè)計(jì)克隆 MsD6DD6Dl 和 MsD6DD6D2 3'端 4 個正向引物，分別如下：FBD6D3-1、FBD6D3-2、FMsD6DD6D2S、 FMsD6DD6D2SN，引物序列如表1所示。然后以3'-RACE-Ready cDNA IyL為模板，用引物組 合FBD6D3-1與UPM和FMsD6D2S與UPM分別對MsD6Dl和MsD6D2基因的3'-RACE進(jìn)行第一 次PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序同5' -RACE。取第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物0. 1 μ L為模板，分別用引物組 合 FBD6D3-2 與 NUP 和 FMsD6D2SN 與 NUP 進(jìn)行 MsD6Dl 和 MsD6D2 的 3' -RACE 的巢式 PCR 擴(kuò) 增，PCR反應(yīng)程序同第一次PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果分別如圖1中c所 示。結(jié)果顯示MsD6Dl 3'-RACE產(chǎn)生了約 650bp的條帶，MsD6D23'-RACE產(chǎn)生了約 400bp 的條帶，與根據(jù)其它植物D6D基因序列預(yù)測的長度相近。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收、經(jīng)TA克 隆后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后將轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果表明，MsD6D2 3'-RACE的克隆子存在 插入長度的多態(tài)性，分別送8個MsD6Dl 3' -RACE和4個MsD6D2 3' -RACE代表性的克隆子 測序，結(jié)果表明 MsD6Dl 的 3'-cDNA 末端凈長度為 601bp、573bp、550bp、536bp、477bp、447bp 這6種，MsD6D2的3' -cDNA末端凈長度為413bp、311bp、289bp這3種，長度多態(tài)性可能由 poly(A)加尾位置不同而引起的。
[0046] (5)MsD6D基因家族全長cDNA和gDNA的克隆
[0047] 根據(jù)MsD6D基因家族的保守區(qū)、5'-RACE、3'-RACE的測序結(jié)果，利用軟件可以分別 拼接出MsD6Dl和MsD6D2的全長cDNA序列，然后分別設(shè)計(jì)了 MsD6Dl全長cDNA和gDNA的 擴(kuò)增引物組合FMsD6Dl與RMsD6Dl、MsD6D2全長cDNA和gDNA的擴(kuò)增引物組合FMsD6D2u或 FMsD6D2d與RMsD6D2,引物序列如表1所示。
[0048]以 3' -RACE-Ready cDNA 1 μ L 為模板，分別用引物組合 FMsD6Dl 與 RMsD6Dl、 FMsD6D2u 與 RMsD6D2、FMsD6D2d 與 RMsD6D2 進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C 預(yù)變性 2min ; 94°C變性lmin，56-60°C退火lmin，72°C延伸2min，35個循環(huán)；72°C延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn) 行電泳檢測，結(jié)果如圖1中d所示。結(jié)果顯示分別獲得了約I. 8kb和2. Okb/1. 8kb的特異條 帶，將擴(kuò)增條件進(jìn)行回收、經(jīng)TA克隆后轉(zhuǎn)化大腸桿菌、送克隆子測序。結(jié)果表明，MsD6Dl的 全長cDNA為1818bp，核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示；MsD6D2的全長cDNA分別為1973bp 或1779bp，核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示和SEQ ID NO. 4所示第195位至1973位所示， 擴(kuò)增獲得的全長cDNA序列與拼接序列一致。
[0049] 然后以基因組總DNA1μL為模板，用引物組合FMsD6Dl與RMsD6Dl、FMsD6D2u與 RMsD6D2、FMsD6D2d與RMsD6D2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物回收，經(jīng)TA克隆、然后測序。結(jié)果 顯示，以DNA為模板擴(kuò)增獲得序列與獲得的全長cDNA序列完全一致，說明這兩個基因均沒 有內(nèi)含子。
[0050] 表l、MsD6D基因家族克隆引物
[0051]

【權(quán)利要求】
1. 微孔草A 6-脂肪酸脫飽和酶MsD6D基因家族，其特征在于：所述MsD6D基因家族包 括MsD6Dl和MsD6D2兩個成員；所述MsD6Dl的氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示；所述MsD6D2 的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
2. 權(quán)利要求1所述的微孔草A 6-脂肪酸脫飽和酶MsD6D基因家族，其特征在于：所述 MsD6Dl的基因序列如SEQ ID NO. 3所示；所述MsD6D2的基因序列如SEQ ID NO. 4所示。
3. 含有權(quán)利要求2所述微孔草A 6-脂肪酸脫飽和酶MsD6D基因家族的重組表達(dá)載體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體，其特征在于：所述重組載體含有MsD6Dl基因 編碼區(qū)或MsD6D2基因編碼區(qū)的序列，所述MsD6Dl基因編碼區(qū)的序列對應(yīng)于SEQ ID NO. 3 第133?1479位堿基所示，所述MsD6D2基因編碼區(qū)的序列對應(yīng)于SEQ ID NO. 4的第340? 1689位堿基所示。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于：所述重組表達(dá)載體是將MsD6Dl 基因編碼區(qū)或MsD6D2基因編碼區(qū)的序列插入pC2301MlNPB載體的NapA啟動子與Nos終止 子之間而得； 或所述重組表達(dá)載體是MsD6Dl基因編碼區(qū)或MsD6D2基因編碼區(qū)的序列插入pYES2質(zhì) 粒的Xbal和BamHI酶切位點(diǎn)處而得； 所述PC2301M1NPB載體由以下方法制備：用Hindlll和EcoRI切下pBI121上的⑶S 基因表達(dá)盒然后插入PCAMBIA2301載體的Hindlll和EcoRI酶切位點(diǎn)處，然后用SacI和 Xmal切去⑶S基因后用帶有SacI和Xmal粘性末端的序列連接，得pC2301Ml載體，然后在 PC2301M1載體Hindlll酶切位點(diǎn)處連入由MAS啟動子驅(qū)動bar基因表達(dá)、MAS終止子終止 表達(dá)的bar基因表達(dá)盒，得PC2301M1B載體；最后將PC2301M1B載體上的CaMV35S啟動子用 種子特異啟動子NapA替換即得PC2301M1NPB載體。
6. 含有權(quán)利要求3?5任一項(xiàng)所述重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化子。
7. 權(quán)利要求1或2所述微孔草A 6-脂肪酸脫飽和酶MsD6D基因家族在提高微孔草屬 植物亞麻酸和十八碳四烯酸含量中的應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求1或2所述微孔草A 6-脂肪酸脫飽和酶MsD6D基因家族在大宗油料作物 重建亞麻酸和十八碳四烯酸合成途徑中的應(yīng)用。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于：所述大宗油料作物為油菜、大豆、花生、棉 花、向日葵、棕櫚或橄欖。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于：所述大宗油料作物為油菜。
【文檔編號】C12N15/53GK104357464SQ201410657684
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月18日
【發(fā)明者】柴友榮, 柴成燕, 付春, 韓發(fā), 王瑞, 練劍平, 馬赑, 周雪榮 申請人:西南大學(xué)