本申請(qǐng)是分案申請(qǐng)，其原申請(qǐng)的申請(qǐng)?zhí)枮?01280067236.6，申請(qǐng)日為2012年11月14日，發(fā)明名稱為“人notch受體突變及其應(yīng)用”。本發(fā)明涉及腫瘤學(xué)領(lǐng)域，提供了對(duì)包含導(dǎo)致受體信號(hào)傳導(dǎo)增加的突變的notch受體的鑒定和表征。本發(fā)明還提供使用其的方法和試劑盒。本發(fā)明還提供治療實(shí)體瘤患者的癌的方法，其中所述實(shí)體瘤細(xì)胞包含水平升高的notchicd。
背景技術(shù)：
：癌是發(fā)達(dá)國(guó)家的主要死亡原因之一，僅在美國(guó)，每年就有超過(guò)一百萬(wàn)人被診斷為罹患癌癥并且有500,000人死亡?？偟膩?lái)說(shuō)估計(jì)超過(guò)三分之一的人會(huì)在其一生中發(fā)展某種形式的癌。存在超過(guò)200種不同類型的癌，其中4種——乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌，超過(guò)所有新病例的一半(jemal等,cancerj.clin.53:5-26(2003))。逐漸地，對(duì)癌的治療已經(jīng)從使用全身性作用的細(xì)胞毒性藥物轉(zhuǎn)向包括更具靶向性的療法，所述療法針對(duì)的是使細(xì)胞生長(zhǎng)和存活失調(diào)的機(jī)制。notch受體1～4是跨膜受體蛋白，其通過(guò)依賴于受調(diào)控的蛋白水解的途徑而進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)。在結(jié)合配體后，該受體依次：i)被adam家族的金屬蛋白酶細(xì)胞外切割(brou等,mol.cell.5:207-216(2000)；mumm等molcell5:197-206(2000))；ii)在正好位于跨膜結(jié)構(gòu)域內(nèi)部的賴氨酸殘基上發(fā)生單泛素化(gupta-rossi等,j.cellbiol.166:73-83(2004))；iii)被胞吞(gupta-rossi,2004)；和iv)被γ-分泌酶蛋白水解性切割(destrooper等,nature398:518-522(1999))。該激活過(guò)程中的最后一步允許notch受體的細(xì)胞內(nèi)部分轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，在細(xì)胞核中，其與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，從而改變基因活性。notch受體信號(hào)傳導(dǎo)在細(xì)胞的分化和增殖中和在控制凋亡中起重要作用，這三個(gè)過(guò)程對(duì)于成瘤性轉(zhuǎn)化而言非常重要。notch蛋白的調(diào)控性胞外結(jié)構(gòu)域主要由串聯(lián)排列的為配體結(jié)合所需的egf樣重復(fù)組成(artavanis-tsakonas等science,268:225-232(1995))。在這些egf樣重復(fù)的羧基末端，是另外三個(gè)富半胱氨酸重復(fù)，命名為lin12/notch重復(fù)(lnr)。lnr的下游是被弗林(furin)樣轉(zhuǎn)化酶識(shí)別的蛋白水解性切割序列(rxrr)。對(duì)于notch1，在該位點(diǎn)處的切割會(huì)產(chǎn)生180kda的胞外肽和120kda的胞內(nèi)肽，它們?cè)诩?xì)胞表面保持在一起形成異二聚體受體(blaumueller等，cell90:281-91(1997))。notch的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(notch.icd)挽救功能喪失性notch表型，表明該形式的notch組成性地進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)(fortini,m.e.和s.artavanis-tsakonas.cell75:1245-7(1993))。notch的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域含有三個(gè)可確認(rèn)的結(jié)構(gòu)域：ram結(jié)構(gòu)域、錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域和羧基末端pest結(jié)構(gòu)域。在配體激活時(shí)，notch經(jīng)歷兩次額外的蛋白水解切割，這導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的釋放(weinmaster,g.curropingenetdev.8:436-42(1998))。該notch肽轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，并與稱為csl(cbf,su(h),lag-2)的轉(zhuǎn)錄阻遏物相互作用，將其轉(zhuǎn)化成轉(zhuǎn)錄激活劑。csl/notch相互作用依賴于notch的ram結(jié)構(gòu)域的存在；同時(shí)，轉(zhuǎn)錄活性還需要錨蛋白重復(fù)的存在(hsieh,j.j.等j.virol.71:1938-45(1997))。體內(nèi)和體外研究均表明hes和hey基因是notch/csl依賴性信號(hào)傳導(dǎo)的直接靶標(biāo)(nakagawa等procnatlacadsciusa97:13655-13660(2000))。hes和hey基因是在n-框處結(jié)合dna的bhlh轉(zhuǎn)錄阻遏物。還提出notch通過(guò)csl非依賴性途徑進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)。事實(shí)上，僅錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域的表達(dá)對(duì)于某些形式的notch信號(hào)傳導(dǎo)而言就是充分且必要的(lieber等genesdev.7:1949-1965(1993))。最后，已提出pest結(jié)構(gòu)域與sel-10/泛素依賴性途徑的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換有關(guān)(greenwald,i.currentopinioningenetics&development4:556-62(1994))。之前已經(jīng)示出，(7；9)易位形成了一種notch-t細(xì)胞受體β融合基因，該基因編碼氨基末端缺失的、與icd類似的具有組成性活性notch-1多肽(ellisen等,cell66:649-661(1991)；aster等,coldspringharb.symp.quant.biol.59:125-136(1994))，并且這些截短的組成性活性形式的notch-1在小鼠模型中誘導(dǎo)t-細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞性白血病(t-all)(aster等,mol.cell.biol.20:7505-7515(2000))。事實(shí)上，已在超過(guò)50％的人t-all中報(bào)道了notch-1的激活性突變(weng等,science306:269-271(2004))。已顯示，notch-1的hd結(jié)構(gòu)域內(nèi)的白血病相關(guān)突變使得該受體對(duì)配體非依賴性蛋白水解激活變得敏感(malecki等,mol.cell.biol.26:4642-4651(2006))，而pest結(jié)構(gòu)域中的突變導(dǎo)致cdc4/fbw7介導(dǎo)的變性減少并使notch-1的細(xì)胞內(nèi)切割形式穩(wěn)定(pancewicz等,proc.natl.acad.sci.usa107:16619-16624(2010))。雖然notch-3和notch-4中的激活性突變尚未在人類癌癥中鑒定出，但已知在其他哺乳動(dòng)物中這些notch受體的功能的異常增加能夠引起t-all(notch-2和-3,bellavia等,emboj.19:3337-3348(2000)；rohnj.virol.70:8071-8080(1996)；weng等,mol.cell.biol.23:655-664))、b細(xì)胞淋巴瘤(notch-2,lee等,cancersci.100:920-926(2009))和乳腺癌(notch-4,callahanandrafat,j.mammaryglandbiolneoplasia6:23-36(2001))。鑒定出人實(shí)體腫瘤中新突變，在幫助鑒定癌的存在和鑒定對(duì)notch信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑有響應(yīng)的癌細(xì)胞時(shí)具有診斷用途，由此可以對(duì)用notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑抑制劑的合理癌治療進(jìn)行指導(dǎo)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供對(duì)依賴于異常notch活性來(lái)維持不受控生長(zhǎng)的癌細(xì)胞組的鑒定。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明證明這些細(xì)胞含有突變的notch受體，并且這些突變可以診斷性地用于鑒定可能對(duì)notch抑制劑療法或使notch活性減少的其他因子產(chǎn)生響應(yīng)的癌細(xì)胞。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種編碼突變的人notch1受體的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含在人notch1基因的7279位核苷酸處的缺失。在另一實(shí)施方式中，所述突變是在7279位核苷酸處的鳥(niǎo)嘌呤(g)缺失。本發(fā)明還涉及一種編碼突變的人notch3受體的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含在人notch3基因的6622位的插入。在另一實(shí)施方式中，所述突變是在6622位處的胞嘧啶(c)插入。本發(fā)明還涉及一種編碼突變的人notch3受體的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含在人notch3基因的6096位的插入。在另一實(shí)施方式中，所述突變是在6096位處的胞嘧啶(c)插入。本發(fā)明還涉及一種編碼突變的人notch1受體的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含在人notch1基因的6733位的替換。在另一實(shí)施方式中，所述突變的多核苷酸包含在6733位的腺嘌呤(a)或胞嘧啶(c)。在另一實(shí)施方式中，所述突變是在6733位的鳥(niǎo)嘌呤(g)至腺嘌呤(a)替換或鳥(niǎo)嘌呤(g)至胞嘧啶(c)替換。本發(fā)明還涉及一種編碼突變的人notch1受體的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含在人notch1基因的6788位的替換。在另一實(shí)施方式中，所述突變是在6788位替換為腺嘌呤(a)。在另一實(shí)施方式中，所述突變是在6788位的鳥(niǎo)嘌呤(g)至腺嘌呤(a)替換。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及由本文所述的突變的notch受體編碼的分離的多肽。在又一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種鑒定展示出增加的notch受體信號(hào)傳導(dǎo)的實(shí)體瘤細(xì)胞的方法，所述方法包括鑒定所述細(xì)胞是否在人notch1的富脯氨酸-谷氨酸-絲氨酸-蘇氨酸(pest)結(jié)構(gòu)域或tad結(jié)構(gòu)域中含有突變，其中，所述實(shí)體瘤細(xì)胞選自由以下腫瘤組成的組：神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胃腸道腫瘤、腎腫瘤(renaltumor)、卵巢腫瘤、肝腫瘤、結(jié)直腸腫瘤、子宮內(nèi)膜腫瘤、腎臟腫瘤(kidneytumor)、前列腺腫瘤、甲狀腺腫瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、胰腺腫瘤、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、子宮頸腫瘤、胃腫瘤、膀胱腫瘤、肝細(xì)胞瘤、乳腺腫瘤、結(jié)腸腫瘤、黑素瘤、膽道腫瘤以及頭頸腫瘤。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種鑒定展示出增加的notch受體信號(hào)傳導(dǎo)的實(shí)體瘤細(xì)胞的方法，所述方法包括鑒定所述細(xì)胞是否在人notch2的pest結(jié)構(gòu)域或tad結(jié)構(gòu)域中含有突變，其中所述實(shí)體瘤細(xì)胞選自由以下腫瘤組成的組：肺腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胃腸道腫瘤、腎腫瘤、卵巢腫瘤、肝腫瘤、結(jié)直腸腫瘤、子宮內(nèi)膜腫瘤、腎臟腫瘤、前列腺腫瘤、甲狀腺腫瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、胰腺腫瘤、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、子宮頸腫瘤、胃腫瘤、膀胱腫瘤、肝細(xì)胞瘤、結(jié)腸腫瘤、黑素瘤、膽道腫瘤以及頭頸腫瘤。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種鑒定展示出增加的notch受體信號(hào)傳導(dǎo)的實(shí)體瘤細(xì)胞的方法，所述方法包括鑒定所述細(xì)胞是否在notch3的pest結(jié)構(gòu)域或tad結(jié)構(gòu)域中含有突變，其中所述實(shí)體瘤細(xì)胞選自由以下腫瘤組成的組：肺腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胃腸道腫瘤、腎腫瘤、卵巢腫瘤、肝腫瘤、結(jié)直腸腫瘤、子宮內(nèi)膜腫瘤、腎臟腫瘤、前列腺腫瘤、甲狀腺腫瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、胰腺腫瘤、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、子宮頸腫瘤、胃腫瘤、膀胱腫瘤、肝細(xì)胞瘤、乳腺腫瘤、結(jié)腸腫瘤、黑素瘤、膽道腫瘤以及頭頸腫瘤。在又一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種鑒定展示出增加的notch受體信號(hào)傳導(dǎo)的實(shí)體瘤細(xì)胞的方法，所述方法包括鑒定所述細(xì)胞是否在notch4的pest結(jié)構(gòu)域或tad結(jié)構(gòu)域中含有突變，其中所述實(shí)體瘤細(xì)胞選自由以下腫瘤組成的組：肺腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胃腸道腫瘤、腎腫瘤、卵巢腫瘤、肝腫瘤、結(jié)直腸腫瘤、子宮內(nèi)膜腫瘤、腎臟腫瘤、前列腺腫瘤、甲狀腺腫瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、胰腺腫瘤、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、子宮頸腫瘤、胃腫瘤、膀胱腫瘤、肝細(xì)胞瘤、乳腺腫瘤、結(jié)腸腫瘤、黑素瘤、膽道腫瘤以及頭頸腫瘤。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述突變是錯(cuò)義、無(wú)義或移碼突變。在另一實(shí)施方式中，所述突變是pest結(jié)構(gòu)域的移碼或無(wú)義突變。在另一實(shí)施方式中，所述突變是在人notch1基因的7279位核苷酸處的缺失。在又一實(shí)施方式中，所述突變是在人notch1基因的7279位核苷酸處的鳥(niǎo)嘌呤(g)缺失(b40突變)。在另一實(shí)施方式中，所述突變是在人notch3基因的6622位的插入。在又一實(shí)施方式中，所述突變是在人notch3基因的6622位的胞嘧啶(c)插入(b37突變)。在另一實(shí)施方式中，所述突變是在人notch3基因的6096位的插入。在又一實(shí)施方式中，所述突變是在人notch3基因的6096位的胞嘧啶(c)插入(c31突變)。在另一實(shí)施方式中，所述突變是在人notch1基因的6733位的替換。在又一實(shí)施方式中，所述突變是在人notch1基因的6733位替換為腺嘌呤(a)或胞嘧啶(c)。在又一實(shí)施方式中，所述突變是在人notch1基因的6733位的鳥(niǎo)嘌呤(g)至腺嘌呤(a)替換或鳥(niǎo)嘌呤(g)至胞嘧啶(c)替換(肺_01246突變)。在另一實(shí)施方式中，所述突變是在人notch1基因的6788位的替換。在又一實(shí)施方式中，所述突變是在人notch1基因的6788位替換為腺嘌呤(a)。在又一實(shí)施方式中，所述突變是在人notch1基因的6788位的鳥(niǎo)嘌呤(g)至腺嘌呤(a)替換(乳腺_h12932t突變)。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用抗notch抗體或使用在嚴(yán)格條件下與突變notch多核苷酸雜交的核酸探針來(lái)確定突變的存在。在另一實(shí)施方式中，所述抗體或核酸探針帶有可檢測(cè)的標(biāo)記。在另一實(shí)施方式中，所述標(biāo)記選自由免疫熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、磷光標(biāo)記、酶標(biāo)記、放射性標(biāo)記、抗生物素蛋白/生物素、膠體金顆粒、有色顆粒和磁性顆粒組成的組。在另一實(shí)施方式中，通過(guò)放射性免疫測(cè)定、蛋白質(zhì)印跡測(cè)定、免疫熒光測(cè)定、酶免疫測(cè)定、免疫沉淀測(cè)定、化學(xué)發(fā)光測(cè)定、免疫組織化學(xué)測(cè)定、斑點(diǎn)印跡測(cè)定、狹縫印跡測(cè)定或流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定來(lái)確定所述突變的存在。在另一實(shí)施方式中，通過(guò)rt-pcr來(lái)確定所述突變的存在。在又一實(shí)施方式中，通過(guò)微陣列來(lái)確定所述突變的存在。在再一實(shí)施方式中，通過(guò)核酸測(cè)序來(lái)確定所述突變的存在。本發(fā)明還涉及一種對(duì)癌癥患者群體進(jìn)行分階(stratify)以用notch抑制劑進(jìn)行治療的方法，所述方法包括：(a)確定來(lái)自所述患者的腫瘤細(xì)胞是否含有人notch受體的pest結(jié)構(gòu)域的激活性突變，和(b)基于突變的存在或不存在將所述患者群體分階。本發(fā)明還涉及一種選擇患者以用notch抑制劑進(jìn)行治療的方法，所述方法包括：(a)確定來(lái)自所述患者的腫瘤細(xì)胞是否含有人notch受體的pest結(jié)構(gòu)域的激活性突變，和(b)選擇出其腫瘤細(xì)胞含有所述突變的患者。本發(fā)明還涉及一種確定被診斷為患有癌癥的患者是否可能對(duì)基于notch抑制劑的治療產(chǎn)生響應(yīng)的方法，所述方法包括確定來(lái)自所述患者的腫瘤細(xì)胞是否含有人notch受體的pest結(jié)構(gòu)域的激活性突變的步驟，其中所述突變的存在表明所述患者可能對(duì)治療產(chǎn)生響應(yīng)。本發(fā)明還涉及一種確定被診斷為患有癌癥的患者是否應(yīng)該施用notch抑制劑的方法，所述方法包括確定來(lái)自所述患者的腫瘤細(xì)胞是否含有人notch受體的pest結(jié)構(gòu)域的激活性突變，其中所述突變的存在預(yù)示著所述患者對(duì)notch抑制劑治療具有有利的響應(yīng)。本發(fā)明還涉及一種確定被診斷為患有癌癥的患者是否應(yīng)該繼續(xù)用notch抑制劑進(jìn)行治療的方法，所述方法包括確定來(lái)自所述患者的腫瘤細(xì)胞是否含有人notch受體的pest結(jié)構(gòu)域的激活性突變，其中任一突變的存在表明所述患者可能對(duì)治療產(chǎn)生響應(yīng)，其中所述突變的存在預(yù)示著所述患者對(duì)notch抑制劑治療具有有利的響應(yīng)。本發(fā)明還涉及一種確定用于治療患者癌癥的notch抑制劑的治療功效的方法，所述方法包括確定來(lái)自所述患者的腫瘤細(xì)胞是否含有人notch受體的pest結(jié)構(gòu)域的激活性突變，其中所述突變的存在表明所述notch抑制劑具有治療功效。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述患者是人。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述突變?cè)黾觧otch信號(hào)傳導(dǎo)。在另一實(shí)施方式中，來(lái)自患者的腫瘤細(xì)胞中的至少約0.1％、至少約1％、至少約2％或至少約5％包含所述突變。在另一實(shí)施方式中，所述notch受體是notch1或notch3。在另一實(shí)施方式中，所述突變是錯(cuò)義、無(wú)義或移碼突變。在又一實(shí)施方式中，所述突變是pest結(jié)構(gòu)域的移碼或無(wú)義突變。在另一實(shí)施方式中，所述突變是在人notch1基因的7279位核苷酸處的缺失。在另一實(shí)施方式中，所述突變是在人notch1基因的7279位核苷酸處的鳥(niǎo)嘌呤(g)缺失(b40突變)。在另一實(shí)施方式中，所述突變是在人notch3基因的6622位的插入。在另一實(shí)施方式中，所述突變是在人notch3基因的6622位的胞嘧啶(c)插入(b37突變)。在另一實(shí)施方式中，所述突變是在人notch3基因的6096位的插入。在又一實(shí)施方式中，所述突變是在人notch3基因的6096位的胞嘧啶(c)插入(c31突變)。在另一實(shí)施方式中，所述突變是在人notch1基因的6733位的替換。在又一實(shí)施方式中，所述突變是在人notch1基因的6733位替換為腺嘌呤(a)或胞嘧啶(c)。在又一實(shí)施方式中，所述突變是在人notch1基因的6733位的鳥(niǎo)嘌呤(g)至腺嘌呤(a)替換或鳥(niǎo)嘌呤(g)至胞嘧啶(c)替換(肺_01246突變)。在另一實(shí)施方式中，所述突變是在人notch1基因的6788位的替換。在又一實(shí)施方式中，所述突變是在人notch1基因的6788位替換為腺嘌呤(a)。在又一實(shí)施方式中，所述突變是在人notch1基因的6788位的鳥(niǎo)嘌呤(g)至腺嘌呤(a)替換(乳腺_h12932t突變)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法還包括從所述患者獲得身體樣品。在另一實(shí)施方式中，所述樣品是全血、血漿、血清或組織。在另一實(shí)施方式中，所述癌選自由以下組成的組：肺癌、胃腸道癌、腎癌、卵巢癌、肝癌、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎臟癌、前列腺癌、甲狀腺癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、胰腺癌、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、子宮頸癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、黑素瘤、膽道癌以及頭頸癌。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用抗notch抗體或使用在嚴(yán)格條件下與突變notch多核苷酸雜交的核酸探針來(lái)確定突變的存在。在另一實(shí)施方式中，所述抗體或核酸探針帶有可檢測(cè)的標(biāo)記。在另一實(shí)施方式中，所述標(biāo)記選自由免疫熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、磷光標(biāo)記、酶標(biāo)記、放射性標(biāo)記、抗生物素蛋白/生物素、膠體金顆粒、有色顆粒和磁性顆粒組成的組。在另一實(shí)施方式中，通過(guò)放射性免疫測(cè)定、蛋白質(zhì)印跡測(cè)定、免疫熒光測(cè)定、酶免疫測(cè)定、免疫沉淀測(cè)定、化學(xué)發(fā)光測(cè)定、免疫組織化學(xué)測(cè)定、斑點(diǎn)印跡測(cè)定或狹縫印跡測(cè)定來(lái)確定所述突變的存在。在另一實(shí)施方式中，通過(guò)rt-pcr來(lái)確定所述突變的存在。在另一實(shí)施方式中，通過(guò)微陣列來(lái)確定所述突變的存在。在另一實(shí)施方式中，通過(guò)核酸測(cè)序來(lái)確定所述突變的存在。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法還包括對(duì)所述患者施用notch抑制劑。在另一實(shí)施方式中，所述notch抑制劑是γ-分泌酶抑制劑或抗notch抗體。在另一實(shí)施方式中，所述γ-分泌酶抑制劑選自由以下物質(zhì)組成的組：iii-31-c；n-[n-(3,5-二氟苯乙?；?-l-丙氨酰基]s-苯基甘氨酸叔丁基酯)(dapt)；化合物e；d-螺旋肽294；異香豆素；boc-lys(cbz)ile-leu-環(huán)氧化物；和(z-ll)2-酮。在另一實(shí)施方式中，抗notch抗體是抗notch1抗體。在另一實(shí)施方式中，所述抗notch1抗體阻斷了配體與notch1受體的結(jié)合。在另一實(shí)施方式中，所述抗notch1抗體阻斷了對(duì)notch1受體的切割。在另一實(shí)施方式中，所述抗notch1抗體包含：含有cdr氨基酸序列cdr1(seqidno:5)、cdr2(seqidno:6)和cdr3(seqidno:7)的重鏈可變區(qū)，和含有cdr氨基酸序列cdr1(seqidno:8)、cdr2(seqidno:9)和cdr3(seqidno:10)的輕鏈可變區(qū)。在另一實(shí)施方式中，抗notch抗體是抗notch3抗體。在另一實(shí)施方式中，所述抗notch3抗體阻斷了配體與notch3受體的結(jié)合。在另一實(shí)施方式中，所述抗notch3抗體阻斷了對(duì)notch3受體的切割。在另一實(shí)施方式中，所述抗notch3抗體包含：含有cdr氨基酸序列cdr1(seqidno:23)、cdr2(seqidno:24)和cdr3(seqidno:25)的重鏈可變區(qū)，和含有cdr氨基酸序列cdr1(seqidno:26)、cdr2(seqidno:27)和cdr3(seqidno:28)的輕鏈可變區(qū)。本發(fā)明還涉及一種治療具有實(shí)體瘤的患者的癌癥的方法，所述方法包括對(duì)所述患者施用治療有效量的notch1抑制劑，其中所述患者中的至少一個(gè)實(shí)體瘤細(xì)胞包含人notch1基因中的激活性突變。本發(fā)明還涉及一種治療具有乳腺腫瘤的患者的乳腺癌的方法，所述方法包括對(duì)所述患者施用治療有效量的notch1抑制劑，其中所述患者中的至少一個(gè)乳腺腫瘤細(xì)胞包含人notch1基因中的激活性突變。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述激活性突變是pest結(jié)構(gòu)域突變。在另一實(shí)施方式中，所述突變?cè)黾觧otch信號(hào)傳導(dǎo)。在另一實(shí)施方式中，所述突變包含在人notch1基因的7279位核苷酸處的鳥(niǎo)嘌呤缺失。在又一實(shí)施方式中，所述突變是在人notch1基因的6733位的鳥(niǎo)嘌呤(g)至腺嘌呤(a)替換或鳥(niǎo)嘌呤(g)至胞嘧啶(c)替換(肺_01246突變)。在另一實(shí)施方式中，所述突變是在人notch1基因的6788位的鳥(niǎo)嘌呤(g)至腺嘌呤(a)替換(乳腺_h12932t突變)。本發(fā)明還涉及一種治療具有實(shí)體瘤的患者的癌癥的方法，所述方法包括對(duì)所述患者施用治療有效量的notch3抑制劑，其中所述患者中的至少一個(gè)實(shí)體瘤細(xì)胞包含人notch3基因中的激活性突變。本發(fā)明還涉及一種治療具有乳腺腫瘤的患者的乳腺癌的方法，所述方法包括對(duì)所述患者施用治療有效量的notch3抑制劑，其中所述患者中的至少一個(gè)乳腺腫瘤細(xì)胞包含人notch3基因中的激活性突變。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述激活性突變是pest結(jié)構(gòu)域突變。在另一實(shí)施方式中，所述突變?cè)黾觧otch信號(hào)傳導(dǎo)。在另一實(shí)施方式中，所述突變包含在人notch3基因的6622位的胞嘧啶插入。在又一實(shí)施方式中，所述突變是在人notch3基因的6096位的胞嘧啶(c)插入(c31突變)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述患者是人。在一個(gè)實(shí)施方式中，來(lái)自患者的腫瘤細(xì)胞中的至少約0.1％、至少約1％、至少約2％或至少約5％包含所述突變。在另一實(shí)施方式中，所述notch1抑制劑是γ-分泌酶抑制劑或抗notch1抗體。在另一實(shí)施方式中，所述γ-分泌酶抑制劑選自由以下物質(zhì)組成的組：iii-31-c；n-[n-(3,5-二氟苯乙?；?-l-丙氨?；鵠s-苯基甘氨酸叔丁基酯)(dapt)；化合物e；d-螺旋肽294；異香豆素；boc-lys(cbz)ile-leu-環(huán)氧化物；和(z-ll)2-酮。在另一實(shí)施方式中，所述抗notch1抗體阻斷了配體與notch1受體的結(jié)合。在另一實(shí)施方式中，所述抗notch1抗體阻斷了對(duì)notch1受體的切割。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗notch1抗體包含含有cdr氨基酸序列cdr1(seqidno:5)、cdr2(seqidno:6)和cdr3(seqidno:7)的重鏈可變區(qū)，和含有cdr氨基酸序列cdr1(seqidno:8)、cdr2(seqidno:9)和cdr3(seqidno:10)的輕鏈可變區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗notch1抗體包含重鏈可變區(qū)序列seqidno:14和輕鏈可變區(qū)序列seqidno:18。在另一實(shí)施方式中，所述抗notch1抗體是omp-52m51。在一個(gè)施方式中，所述notch3抑制劑是γ-分泌酶抑制劑或抗notch3抗體。在另一實(shí)施方式中，所述γ-分泌酶抑制劑選自由以下物質(zhì)組成的組：iii-31-c；n-[n-(3,5-二氟苯乙?；?-l-丙氨?；鵠s-苯基甘氨酸叔丁基酯)(dapt)；化合物e；d-螺旋肽294；異香豆素；boc-lys(cbz)ile-leu-環(huán)氧化物；和(z-ll)2-酮。在另一實(shí)施方式中，所述抗notch3抗體阻斷了配體與notch3受體的結(jié)合。在另一實(shí)施方式中，所述抗notch3抗體阻斷了對(duì)notch3受體的切割。在另一實(shí)施方式中，所述抗notch3抗體包含含有cdr氨基酸序列cdr1(seqidno:23)、cdr2(seqidno:24)和cdr3(seqidno:25)的重鏈可變區(qū)，和含有cdr氨基酸序列cdr1(seqidno:26)、cdr2(seqidno:27)和cdr3(seqidno:28)的輕鏈可變區(qū)。(59r5)在一個(gè)實(shí)施方式中，所述患者包含三陰性乳腺癌細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法還包括施用第二治療劑。在另一實(shí)施方式中，所述患者之前進(jìn)行癌癥治療失敗。在另一實(shí)施方式中，所述患者具有化療抗性乳腺癌。本發(fā)明還涉及一種鑒定測(cè)試化合物的方法，所述測(cè)試化合物抑制突變的notch受體的存在所誘導(dǎo)的異常細(xì)胞生長(zhǎng)，所述方法包括：(a)將所述測(cè)試化合物與表達(dá)所述突變notch受體的細(xì)胞一起溫育，所述溫育在γ-分泌酶的存在下進(jìn)行；(b)將步驟(a)中的受體活性的量與在不存在所述測(cè)試化合物時(shí)進(jìn)行的溫育的活性進(jìn)行比較，其中，如果在存在所述測(cè)試化合物時(shí)觀察到的活性小于在不存在所述測(cè)試化合物時(shí)觀察到的活性，則所述測(cè)試化合物抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。本發(fā)明還涉及一種試劑盒，所述試劑盒包含至少一種用于特異性地檢測(cè)本發(fā)明的突變notch受體的試劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述試劑是結(jié)合本發(fā)明的突變notch受體的抗體或核酸探針。本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點(diǎn)的一部分將在以下描述中闡述，一部分將通過(guò)所述描述而變得清楚，或者可以通過(guò)實(shí)施本發(fā)明而理解。本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn)可以借助于要素和組合(特別是所附權(quán)利要求中指出的要素和組合)來(lái)實(shí)現(xiàn)和獲得。應(yīng)該理解的是，之前的總體描述和之后的詳細(xì)描述都僅僅是示例性和解釋性的，而不會(huì)限制所要求保護(hù)的發(fā)明。本發(fā)明還提供對(duì)依賴于異常notch活性來(lái)維持不受控生長(zhǎng)的癌細(xì)胞組的鑒定。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明證明這些細(xì)胞中的notchicd水平高于對(duì)照樣品的水平或高于其他參照水平，并證明了腫瘤細(xì)胞中的notchicd水平可以診斷性地用于鑒定可能對(duì)notch抑制劑治療或?qū)κ筺otch活性減少的其他因子產(chǎn)生響應(yīng)的癌細(xì)胞。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種對(duì)癌癥患者群體分階以用notch抑制劑進(jìn)行治療的方法，所述方法包括：(a)確定來(lái)自所述患者的腫瘤細(xì)胞中的notchicd水平，和(b)基于腫瘤細(xì)胞中的notchicd水平將所述患者群體分階。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明還涉及一種選擇患者以用notch抑制劑進(jìn)行治療的方法，所述方法包括：(a)確定來(lái)自所述患者的腫瘤細(xì)胞中的notchicd水平，和(b)選擇出腫瘤細(xì)胞的notchicd水平高于對(duì)照樣品的水平或高于參照水平的患者。本發(fā)明還提供了一種選擇癌癥患者以用notch1抑制劑(例如omp-52m51)進(jìn)行治療的方法，所述方法包括：(a)用抗notch1icd抗體在免疫組織化學(xué)測(cè)定中確定來(lái)自所述患者的實(shí)體瘤細(xì)胞中的notch1icd水平；和(b)選擇出實(shí)體瘤細(xì)胞在所述測(cè)定中得到的h分?jǐn)?shù)為約30以上(或在所述測(cè)定中為約100以上)的患者來(lái)治療。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種確定被診斷為患有癌癥的患者是否可能對(duì)基于notch抑制劑的治療產(chǎn)生響應(yīng)的方法，所述方法包括確定來(lái)自所述患者的腫瘤細(xì)胞中的notchicd水平的步驟，其中，高于參照水平或高于對(duì)照樣品水平的notchicd水平表示所述患者可能對(duì)所述治療產(chǎn)生響應(yīng)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種確定被診斷為患有癌癥的患者是否應(yīng)該施用notch抑制劑的方法，所述方法包括確定來(lái)自所述患者的腫瘤細(xì)胞中的notchicd水平，其中，高于參照水平或高于對(duì)照樣品水平的notchicd水平預(yù)示著所述患者對(duì)notch抑制劑治療具有有利的響應(yīng)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種確定被診斷為患有癌癥的患者是否應(yīng)該繼續(xù)用notch抑制劑進(jìn)行治療的方法，所述方法包括確定來(lái)自所述患者的腫瘤細(xì)胞中的notchicd水平，其中，高于參照水平或高于對(duì)照樣品水平的notchicd水平表示所述患者可能對(duì)notch抑制劑治療產(chǎn)生響應(yīng)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種確定notch抑制劑在治療患者癌癥中的治療功效的方法，所述方法包括確定來(lái)自所述患者的腫瘤細(xì)胞中的notchicd水平，其中，高于參照水平或高于對(duì)照樣品水平的notchicd水平表示所述notch抑制劑具有治療功效。在某些實(shí)施方式中，所述notchicd是notch1icd。在替代性實(shí)施方式中，所述notchicd是notch3icd。在又一實(shí)施方式中，notchicd水平是腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核中的notchicd水平。在另外的實(shí)施方式中，所述方法還包括從所述患者獲得身體樣品。在又一實(shí)施方式中，所述樣品是全血、血漿、血清或組織。在另外的實(shí)施方式中，所述癌選自由以下組成的組：肺癌、胃腸道癌、腎癌、卵巢癌、肝癌、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎臟癌、前列腺癌、甲狀腺癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、胰腺癌、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、子宮頸癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、黑素瘤、膽道癌以及頭頸癌。在又一實(shí)施方式中，所述癌是乳腺癌。在又一實(shí)施方式中，所述癌是小細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、胃癌、食管癌、肝細(xì)胞癌或膽管上皮癌。在另外的實(shí)施方式中，使用特異性地結(jié)合notchicd的試劑來(lái)確定notchicd水平。在又一實(shí)施方式中，所述試劑是抗notchicd抗體。在又一實(shí)施方式中，所述抗notchicd抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。在另外的實(shí)施方式中，所述試劑帶有可檢測(cè)標(biāo)記。在又一實(shí)施方式中，所述標(biāo)記選自由免疫熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、磷光標(biāo)記、酶標(biāo)記、放射性標(biāo)記、抗生物素蛋白/生物素、膠體金顆粒、有色顆粒和磁性顆粒組成的組。在另外的實(shí)施方式中，所述notchicd水平通過(guò)放射性免疫測(cè)定、免疫熒光測(cè)定、酶免疫測(cè)定、化學(xué)發(fā)光測(cè)定或免疫組織化學(xué)測(cè)定來(lái)確定。在又一實(shí)施方式中，所述notchicd水平(和/或與其進(jìn)行比較的參照水平)用h分?jǐn)?shù)來(lái)表征。在另外的實(shí)施方式中，所述方法還包括對(duì)所述患者施用notch抑制劑。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種治療具有實(shí)體瘤的患者的癌癥的方法，所述方法包括：(a)確定所述實(shí)體瘤細(xì)胞中的notchicd水平；和(b)對(duì)所述患者施用治療有效量的notch抑制劑。在一些實(shí)施方式中，所述notchicd是notch1icd，所述notch抑制劑是notch1抑制劑(例如omp-52m51)，并且經(jīng)確定所述實(shí)體瘤細(xì)胞在使用抗notch1icd抗體的免疫組織化學(xué)測(cè)定中的h分?jǐn)?shù)為約30以上。在某些替代性實(shí)施方式中，經(jīng)確定所述實(shí)體瘤細(xì)胞在所述測(cè)定中的h分?jǐn)?shù)為約100以上。在另外的實(shí)施方式中，所述notch抑制劑是γ-分泌酶抑制劑或抗notch抗體。在又一實(shí)施方式中，所述γ-分泌酶抑制劑選自由以下物質(zhì)組成的組：iii-31-c；n-[n-(3,5-二氟苯乙?；?-l-丙氨?；鵠s-苯基甘氨酸叔丁基酯)(dapt)；化合物e；d-螺旋肽294；異香豆素；boc-lys(cbz)ile-leu-環(huán)氧化物；和(z-ll)2-酮。在另外的實(shí)施方式中，所述抗notch抗體是抗notch1抗體。在又一實(shí)施方式中，所述抗notch1抗體阻斷了配體與notch1受體的結(jié)合。在又一實(shí)施方式中，所述抗notch1抗體阻斷了對(duì)notch1受體的切割。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗notch1抗體包含含有cdr氨基酸序列cdr1(seqidno:5)、cdr2(seqidno:6)和cdr3(seqidno:7)的重鏈可變區(qū)，和含有cdr氨基酸序列cdr1(seqidno:8)、cdr2(seqidno:9)和cdr3(seqidno:10)的輕鏈可變區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗notch1抗體包含重鏈可變區(qū)序列seqidno:14和輕鏈可變區(qū)序列seqidno:18。在另一實(shí)施方式中，所述抗notch1抗體是omp-52m51。在另外的實(shí)施方式中，所述抗notch抗體是抗notch3抗體。在又一實(shí)施方式中，所述抗notch3抗體阻斷了配體與notch3受體的結(jié)合。在又一實(shí)施方式中，所述抗notch3抗體阻斷了對(duì)notch3受體的切割。在又一實(shí)施方式中，所述抗notch3抗體包含含有cdr氨基酸序列cdr1(seqidno:23)、cdr2(seqidno:24)和cdr3(seqidno:25)的重鏈可變區(qū)，和含有cdr氨基酸序列cdr1(seqidno:26)、cdr2(seqidno:27)和cdr3(seqidno:28)的輕鏈可變區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗notch3抗體包含重鏈可變區(qū)序列seqidno:30和輕鏈可變區(qū)序列seqidno:32。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗notch3抗體是59r5。在另外的實(shí)施方式中，所述患者是人。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種治療具有實(shí)體瘤的患者的癌癥的方法，所述方法包括：對(duì)所述患者施用治療有效量的notch1抑制劑，其中所述患者中的實(shí)體瘤細(xì)胞(a)包含水平高于參照水平或高于對(duì)照樣品中發(fā)現(xiàn)的水平的notch1icd；或(b)特征在于在使用抗notch1icd抗體的免疫組織化學(xué)測(cè)定中的h分?jǐn)?shù)為約30以上(或?yàn)榧s100以上)。在另外的實(shí)施方式中，所述notch1抑制劑是γ-分泌酶抑制劑或抗notch1抗體。在又一實(shí)施方式中，所述γ-分泌酶抑制劑選自由以下物質(zhì)組成的組：iii-31-c；n-[n-(3,5-二氟苯乙?；?-l-丙氨酰基]s-苯基甘氨酸叔丁基酯)(dapt)；化合物e；d-螺旋肽294；異香豆素；boc-lys(cbz)ile-leu-環(huán)氧化物；和(z-ll)2-酮。在另外的實(shí)施方式中，所述抗notch1抗體阻斷了配體與notch1受體的結(jié)合。在又一實(shí)施方式中，所述抗notch1抗體阻斷了對(duì)notch1受體的切割。在另一實(shí)施方式中，所述抗notch1抗體包含含有cdr氨基酸序列cdr1(seqidno:5)、cdr2(seqidno:6)和cdr3(seqidno:7)的重鏈可變區(qū)，和含有cdr氨基酸序列cdr1(seqidno:8)、cdr2(seqidno:9)和cdr3(seqidno:10)的輕鏈可變區(qū)。在另外的實(shí)施方式中，所述患者是人。在另外的實(shí)施方式中，所述方法還包括施用第二治療劑。在另外的實(shí)施方式中，所述患者之前進(jìn)行癌癥治療失敗。在又一實(shí)施方式中，所述患者包含三陰性乳腺癌細(xì)胞。在又一實(shí)施方式中，所述患者具有化療抗性乳腺癌。在另外的實(shí)施方式中，所述患者具有小細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、胃癌、食管癌、肝細(xì)胞癌或膽管上皮癌。在另外的實(shí)施方式中，使用特異性地結(jié)合notchicd的試劑來(lái)確定notchicd水平。在又一實(shí)施方式中，所述試劑是抗notchicd抗體。在又一實(shí)施方式中，所述抗notchicd抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。在另外的實(shí)施方式中，所述試劑帶有可檢測(cè)標(biāo)記。在又一實(shí)施方式中，所述標(biāo)記選自由免疫熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、磷光標(biāo)記、酶標(biāo)記、放射性標(biāo)記、抗生物素蛋白/生物素、膠體金顆粒、有色顆粒和磁性顆粒組成的組。在另外的實(shí)施方式中，所述notchicd水平通過(guò)放射性免疫測(cè)定、免疫熒光測(cè)定、酶免疫測(cè)定、化學(xué)發(fā)光測(cè)定或免疫組織化學(xué)測(cè)定來(lái)確定。在又一實(shí)施方式中，所述notchicd水平用h分?jǐn)?shù)表征。附圖說(shuō)明圖1：新鑒定的omp-b40和omp-b37notch突變的示意性圖示。(a)omp-b40突變的特征為在人notch1基因的7279位核苷酸處的鳥(niǎo)嘌呤(g)的雜合性缺失。該缺失引起notch1的pest結(jié)構(gòu)域的閱讀框移碼(g2427fs)。(b)omp-b37突變的特征為在人notch3基因的6622核苷酸處的胞嘧啶(c)的純合性插入，這引起pest結(jié)構(gòu)域的2208位氨基酸處的閱讀框移碼(p2208fs)。notch的示意性圖示采用自weng等,science306:269-271(2004)。圖2：含有omp-b40或omp-b37突變的異種移植物腫瘤中的notch表達(dá)分析。(a)抗notch1.icd抗體與切下的notch1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(notch1.icd)發(fā)生特異性反應(yīng)，并且在omp-b40異種移植物腫瘤的細(xì)胞核組分中檢測(cè)到截短的切下的notch1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。(b)抗notch3.icd抗體與切下的notch3.icd發(fā)生特異性反應(yīng)，并且在omp-b37異種移植物腫瘤的細(xì)胞核組分中檢測(cè)到截短的切下的notch3.icd。(c)截短的notch1icd和截短的notch3icd主要見(jiàn)于omp-b40和omp-b37異種移植物腫瘤的細(xì)胞核組分中。這兩種腫瘤系分別攜帶有notch1和notch3的pest結(jié)構(gòu)域的突變。在攜帶野生型notch1的omp-c31和omp-ov38異種移植物腫瘤中未檢測(cè)到核notch1icd和notch3icd，但omp-c31在notch3基因中含有6172insc(het)[p2033fs]突變。圖3a-3d：omp-b40乳腺腫瘤中notch1拮抗劑的活性。(a)omp-b40腫瘤中omp-52m51人源化抗notch1抗體的劑量依賴性活性。(b)將抗notch1抗體omp-52m51、紫杉醇或omp-52m51與紫杉醇的組合施用至omp-b40異種移植物小鼠。單獨(dú)的或與紫杉醇組合的omp-52m51都極大地減少了異種移植物動(dòng)物中的腫瘤體積。圖3c和圖3d：在具有notch1激活性突變的乳腺癌模型中，omp-52m51抗notch1抗體阻斷了notch1.icd的累積。如ihc測(cè)定所檢測(cè)到的，用作單獨(dú)試劑或與紫杉醇組合的omp-52m51抗notch1抑制了notch1.icd的累積。圖4：經(jīng)抗notch1治療的omp-b40乳腺腫瘤的致瘤性。將來(lái)自經(jīng)對(duì)照抗體治療的腫瘤和經(jīng)omp-52m51人源化抗notch1抗體治療的腫瘤的腫瘤細(xì)胞各自注入10只小鼠中。在不進(jìn)行進(jìn)一步治療的情況下使腫瘤生長(zhǎng)92天。在注射了經(jīng)對(duì)照抗體治療的細(xì)胞的10只小鼠中，每一只中都出現(xiàn)了omp-b40腫瘤生長(zhǎng)；而在注射了之前經(jīng)omp-52m51治療的細(xì)胞的10只小鼠中，僅有2只在第92天產(chǎn)生可檢出的腫瘤生長(zhǎng)，這表明omp-52m51治療減少了上述細(xì)胞的后續(xù)致瘤性。圖5：omp-b37乳腺腫瘤中notch2/3拮抗劑的活性。對(duì)omp-b37異種移植物小鼠施用抗notch2/3抗體59r5或?qū)φ湛贵w。與施用對(duì)照抗體時(shí)相比，59r5極大地減少了異種移植物動(dòng)物中的腫瘤體積。圖6a-6b：omp-b37乳腺腫瘤中抗notch2/3抗體的活性。對(duì)omp-b37異種移植物小鼠施用抗notch2/3抗體59r5、紫杉醇或59r5與紫杉醇的組合。圖6a：?jiǎn)为?dú)的或與紫杉醇組合的59r5都極大地減少了異種移植物動(dòng)物中的腫瘤體積。圖6b：59r5抗notch2/3抗體增加了e鈣黏蛋白的表達(dá)，表明上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(emt)的逆轉(zhuǎn)。圖7a-7c：圖7a：omp-c31中notch3移碼突變的sanger色譜圖。圖7b：肺_01246中notch1錯(cuò)義突變的sanger色譜圖。圖7c：乳腺_h12932t中notch1錯(cuò)義突變的sanger色譜圖。notch的示意性圖示采用自weng等,science306:269-271(2004)。圖8：通過(guò)免疫組織化學(xué)對(duì)激活的notch1-icd進(jìn)行核定位。圖9a-9c：圖9a：實(shí)體腫瘤中的notch1.icd篩選。顯示了h分?jǐn)?shù)≥30的樣品的頻率。圖9b：食管癌樣品的n1.icdihc分析。圖9c：胃癌中的notch1.icd篩選。顯示了h分?jǐn)?shù)≥30的樣品的頻率。圖10：omp-lu61小細(xì)胞肺癌中omp-52m51人源化抗notch1抗體的活性。圖11：omp-c63結(jié)腸癌中omp-52m51人源化抗notch1抗體的活性。圖12：omp-c11、omp-c20和omp-c40腫瘤細(xì)胞中，與伊立替康組合的omp-52m51人源化抗notch1抗體的活性。圖13a-13d：對(duì)notch1和notch3突變蛋白的螢光素酶測(cè)定。圖13a：用編碼notch1全長(zhǎng)野生型(notch1_wt)或notch1_g2427fs突變(omp-b40)多肽的dna瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pc3細(xì)胞。在不存在外源性配體時(shí)評(píng)估了notch信號(hào)傳導(dǎo)所介導(dǎo)的螢光素酶活性。圖13b：用編碼notch3全長(zhǎng)野生型(notch3_wt)、notch3_p2033fs突變(omp-c31)或notch3_p2208fs突變(omp-b37)多肽的dna瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pc3細(xì)胞和a549細(xì)胞。在不存在外源性配體時(shí)評(píng)估了notch螢光素酶活性。圖13c：用編碼notch3_p2033fs(omp-c31)多肽的dna瞬時(shí)轉(zhuǎn)染了的pc3細(xì)胞中的jag1(1-500ng/30μl)的劑量響應(yīng)曲線。圖13d：用編碼notch3_p2208fs(omp-b37)的dna瞬時(shí)轉(zhuǎn)染了的pc3細(xì)胞中的jag1(1-500ng/30μl)的劑量響應(yīng)曲線。*＝使用t檢驗(yàn)時(shí)notch全長(zhǎng)野生型相對(duì)于n3.突變的p值<.05。圖14a-14d：a2g1抗notch1抗體的治療抑制了omp-b40乳腺腫瘤模型中的腫瘤生長(zhǎng)和notchiicd的累積，并與用γ分泌酶抑制劑(gsi)進(jìn)行治療時(shí)相比胃腸道毒性的嚴(yán)重程度更低。圖15：omp-c31結(jié)腸腫瘤中59r5抗notch2/3抗體的活性。圖16a-16d：根據(jù)螢光素酶報(bào)道測(cè)定中的測(cè)量，52m51抗notch1抗體抑制了g2427fs(omp-b40)和r2328wnotch1_突變多肽的活性。圖16a和圖16b顯示了在濃度逐漸增加的52m51抗體的存在下，在分別用dll4和jag1刺激后，在表達(dá)g2427fs(omp-b40)notch1_突變多肽的pc3細(xì)胞中觀察到的螢火蟲(chóng)螢光素酶與海腎螢光素酶的活性比。圖16c和圖16d顯示了在濃度逐漸增加的52m51抗體的存在下，在分別用dll4和jag1刺激后，在表達(dá)r2328wnotch1_突變多肽的pc3細(xì)胞中觀察到的螢火蟲(chóng)螢光素酶與海腎螢光素酶的活性比。圖16a-16d都還包括了用不表達(dá)重組notch1多肽的對(duì)照pc3細(xì)胞獲得的數(shù)據(jù)。圖17：omp-b37乳腺腫瘤中notch2/3拮抗劑的活性。在具有notch3激活性突變的乳腺癌模型中，omp-59r5抗notch2/3抗體阻斷了notch3.icd的累積。具體實(shí)施方式i.定義為了本發(fā)明的目的，以下定義了如下術(shù)語(yǔ)。應(yīng)該注意的是，術(shù)語(yǔ)“一個(gè)”或“一種”實(shí)體是指一個(gè)或多個(gè)該實(shí)體，例如“一種notch受體多肽”理解為代表包含notch受體氨基酸的一種或多種多肽。因此，本文中術(shù)語(yǔ)“一種”(或“一個(gè)”)、“一種或多種”和“至少一種”能夠互換使用。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“多肽”意在涵蓋單數(shù)的“多肽”以及復(fù)數(shù)的“多肽”，并且是指由通過(guò)酰胺鍵(也稱為肽鍵)線性連接的單體(氨基酸)組成的分子。術(shù)語(yǔ)“多肽”是指兩個(gè)以上氨基酸的任何一條或多條鏈，并不是指特定長(zhǎng)度的產(chǎn)物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白質(zhì)”、“氨基酸鏈”或任何其他用于指代兩個(gè)以上氨基酸的一條或多條鏈的術(shù)語(yǔ)也包括在“多肽”的定義內(nèi)，并且術(shù)語(yǔ)“多肽”可以用來(lái)代替任何這些術(shù)語(yǔ)或與之互換使用。術(shù)語(yǔ)“多肽”還意在指多肽在表達(dá)后的經(jīng)修飾產(chǎn)物，包括但不限于糖基化、乙?；?、磷酸化、酰胺化、被已知的保護(hù)性/封閉性基團(tuán)衍生化、蛋白水解性切割或被非天然存在的氨基酸修飾。多肽可以源自天然生物來(lái)源或通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生，但不必從指定的核酸序列翻譯得到。其可以以任何方式產(chǎn)生，包括化學(xué)合成。“分離的”生物組分(例如核酸分子或蛋白)已經(jīng)基本上被分離出或純化出，從而已離開(kāi)該組分所天然存在的有機(jī)體的細(xì)胞中的其他生物組分，即其他染色體和染色體外dna和rna、蛋白和細(xì)胞器。已經(jīng)“分離的”的核酸和蛋白質(zhì)包括通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化的核酸和蛋白質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)還包括通過(guò)在宿主細(xì)胞中重組表達(dá)而制備的核酸和蛋白質(zhì)以及化學(xué)合成的核酸。當(dāng)以單數(shù)或復(fù)數(shù)形式使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”通常是指任何多聚核糖核苷酸或多聚脫氧核糖核苷酸，其可以是未經(jīng)修飾的rna或dna或是經(jīng)修飾的rna或dna。因此，例如，本文定義的多核苷酸包括但不限于單鏈和雙鏈dna、包括單鏈和雙鏈區(qū)域的dna、單鏈和雙鏈rna、包括單鏈和雙鏈區(qū)域的rna、包含dna和rna的雜交分子(其可以為單鏈的或更通常為雙鏈的，或包括單鏈和雙鏈區(qū)域)。因此，出于穩(wěn)定性或其他原因而修飾了主鏈的dna或rna是在本文中該術(shù)語(yǔ)所意指的“多核苷酸”。此外，包含不常見(jiàn)堿基(例如肌苷)或經(jīng)修飾的堿基(例如氚化堿基)的dna或rna也包括在本文定義的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”內(nèi)。通常，術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”包括未經(jīng)修飾的多核苷酸的所有經(jīng)化學(xué)修飾、酶修飾和/或代謝學(xué)修飾的形式。多核苷酸可以通過(guò)各種方法制備，包括以體外重組dna為媒介的技術(shù)和在細(xì)胞和有機(jī)體中表達(dá)dna。當(dāng)用于描述目標(biāo)物時(shí)，本文所用的術(shù)語(yǔ)“天然存在的”或“野生型”是指該目標(biāo)物可以在自然界中發(fā)現(xiàn)。例如，如下多肽或多核苷酸序列是野生型的：其存在于有機(jī)體(包括病毒)中，可以從天然來(lái)源分離出并且尚未在實(shí)驗(yàn)室中被人類有意修飾，等等。本文所用的“突變”是指通過(guò)體細(xì)胞突變而產(chǎn)生的變異，例如，在給定受試對(duì)象中僅出現(xiàn)在疾病細(xì)胞中的非先天性變異。此類體細(xì)胞獲得性變異的實(shí)例包括經(jīng)常導(dǎo)致各種參與癌癥發(fā)展的基因的功能改變的點(diǎn)突變。突變類型包括堿基替換點(diǎn)突變(即轉(zhuǎn)換或顛換)、缺失和插入。錯(cuò)義突變是將另一種氨基酸引入所編碼的蛋白的序列中的突變，無(wú)義突變是引入新終止密碼子的突變。對(duì)于插入或缺失，突變可以是框內(nèi)(不改變總體序列的框)或移碼突變，其可導(dǎo)致大量密碼子的錯(cuò)讀(經(jīng)常因在替代性框中存在終止密碼子而導(dǎo)致所編碼產(chǎn)物的異常終止)。本發(fā)明的突變可發(fā)現(xiàn)于受試對(duì)象的一個(gè)等位基因上(雜合子)或全部?jī)蓚€(gè)等位基因上(純合子)。影響notch受體的結(jié)構(gòu)域、特別是pest結(jié)構(gòu)域(富含脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)的功能的激活性突變可以包括通過(guò)截短而消除一部分或全部結(jié)構(gòu)域的突變(例如無(wú)義突變或移碼突變)。激活性突變還可以包括位于結(jié)構(gòu)域本身中(例如在pest結(jié)構(gòu)域內(nèi))的阻礙結(jié)構(gòu)域功能的錯(cuò)義突變?！凹せ钚酝蛔儭笔鞘筺otch組成性地活躍、對(duì)配體刺激過(guò)度敏感或異常表達(dá)的體細(xì)胞突變。在一些實(shí)施方式中，激活性突變引起增加的notch信號(hào)傳導(dǎo)。notch信號(hào)傳導(dǎo)的量可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法確定。簡(jiǎn)言之，將來(lái)自突變notch多肽的信號(hào)傳導(dǎo)的量與來(lái)自野生型notch多肽的notch信號(hào)傳導(dǎo)的量進(jìn)行比較。本文所用的“增加的notch信號(hào)傳導(dǎo)”或“增強(qiáng)的notch信號(hào)傳導(dǎo)”是指與含有野生型notch多肽的細(xì)胞中的notch信號(hào)傳導(dǎo)相比，在含有突變notch多肽的細(xì)胞中notch信號(hào)傳導(dǎo)的量更高?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的多種方法來(lái)檢測(cè)notch信號(hào)傳導(dǎo)。示例性方法包括但不限于notchicd蛋白質(zhì)印跡或免疫組織化學(xué)(ihc)(參見(jiàn)wu等,nature,464:1052-1059(2010))。通常，正常組織中的表達(dá)/信號(hào)傳導(dǎo)是比較用的標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)確定高于正常水平的信號(hào)傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方式中，使用來(lái)自與所關(guān)注的細(xì)胞鄰近的正常組織的細(xì)胞來(lái)確定信號(hào)傳導(dǎo)水平。在一些notchicd測(cè)定中，正常組織中的notchicd水平檢測(cè)不到，因此高于背景的任何信號(hào)將認(rèn)為是增加的。本文所用的術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”是指設(shè)定組件的位置以使得它們的關(guān)系允許它們以計(jì)劃的方式發(fā)揮功能。控制序列與編碼序列“可操作地連接”是以下述方式連接：在與控制序列相容的條件下實(shí)現(xiàn)編碼序列的表達(dá)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“控制序列”是指實(shí)現(xiàn)其所連接的編碼序列的表達(dá)和加工所必需的多核苷酸序列。此類控制序列的性質(zhì)視宿主有機(jī)體而有所不同；在原核生物中，此類控制序列通常包括啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止序列；在真核生物中，此類控制序列通常包括啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列。術(shù)語(yǔ)“控制序列”意圖至少包括對(duì)于表達(dá)和加工而言必須存在的所有組件，并且還可以包括在存在時(shí)會(huì)帶來(lái)益處的其他組件，例如前導(dǎo)序列和融合伴侶序列。兩個(gè)核酸序列或兩個(gè)氨基酸序列之間的相似性以兩個(gè)序列之間的相似程度表達(dá)，還稱作“序列同一性”。序列同一性通常以百分比同一性(或相似性或同源性)來(lái)度量，該百分比越高，兩個(gè)序列越相似。當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)方法比對(duì)時(shí)，人notch受體和相應(yīng)的cdna或基因序列的同源物或直系同源物會(huì)擁有相對(duì)高度的序列同一性。當(dāng)直系同源蛋白或基因或cdna源自親緣關(guān)系更接近的物種(例如人和黑猩猩序列)時(shí)，與親緣關(guān)系更遠(yuǎn)的物種(例如人和秀麗隱桿線蟲(chóng)(c.elegans)序列)相比，同源性會(huì)更為顯著。用于進(jìn)行比較的序列比對(duì)方法是本領(lǐng)域公知的。以下文獻(xiàn)描述了多種程序和比對(duì)算法：smith和watermanadv.appl.math.2:482,1981；needleman和wunschj.mol.biol.48:443,1970；pearson和lipmanproc.natl.acad.sci.usa85:2444,1988；higgins和sharpgene,73:237-244,1988；higgins和sharpcabios5:151-153,1989；corpet等nuc.acidsres.16,10881-90,1988；huang等computerappls.inthebiosciences8:155-65,1992；以及pearson等meth.mol.bio.24:307-31,1994。altschul等j.mol.biol.215:403-410,1990對(duì)序列比對(duì)方法和同源性計(jì)算進(jìn)行了詳細(xì)的考量。ncbibasiclocalalignmentsearchtool(blast)(altschul等j.mol.biol.215:403-410,1990)可獲自多種來(lái)源，包括美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(ncbi,bethesda,md.)和互聯(lián)網(wǎng)，以與序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx關(guān)聯(lián)使用。舉例而言，為了比較大于約30個(gè)氨基酸的氨基酸序列，使用利用設(shè)為默認(rèn)參數(shù)的默認(rèn)blosum62矩陣(空位存在罰分為11，每個(gè)殘基空位罰分為1)的blast2序列功能。當(dāng)比對(duì)短肽(少于約30個(gè)氨基酸)時(shí)，使用采用設(shè)為默認(rèn)參數(shù)的pam30矩陣(起始空位罰分為9，延伸空位罰分為1)的blast2序列功能來(lái)進(jìn)行比對(duì)。兩個(gè)核酸分子緊密相關(guān)的另一指征是這兩個(gè)分子在嚴(yán)格條件下相互雜交。嚴(yán)格條件是序列依賴性的，并且在不同環(huán)境參數(shù)下是不同的。通常，將嚴(yán)格條件選擇為比在確定的離子強(qiáng)度和ph下的特定序列的熱解鏈溫度(tm)低約5℃～20℃。tm是使50％的靶序列與完全匹配的探針或互補(bǔ)鏈保持雜交的溫度(在確定的離子強(qiáng)度和ph下)。核酸雜交條件和嚴(yán)格度的計(jì)算可參見(jiàn)sambrook等(見(jiàn)molecularcloning:alaboratorymanual,cshl,newyork,1989)和tijssen(laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology--hybridizationwithnucleicacidprobes第1部分，第2章,elsevier,newyork,1993)。在嚴(yán)格條件下與人notch受體編碼序列雜交的核酸分子通常會(huì)在50℃的2×ssc洗滌條件下與基于人notch多核苷酸或基于notch多核苷酸的選定部分的探針雜交。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，不顯示高度序列同一性的核酸序列也可以編碼相似的氨基酸序列。應(yīng)該理解的是，可以使用該簡(jiǎn)并性來(lái)改變核酸序列從而產(chǎn)生全都編碼基本上相同的蛋白的多種核酸分子。在本發(fā)明的背景下，提到在任何特定notch受體中列出的“至少一種”、“至少兩種”、“至少三種”突變等時(shí)，是指所列出突變的任一種或任何組合和所有組合。“notch”是調(diào)節(jié)許多細(xì)胞過(guò)程、特別是發(fā)育時(shí)的細(xì)胞過(guò)程的膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子。在響應(yīng)于配體結(jié)合時(shí)，其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(icd)通過(guò)兩種蛋白酶而釋放。所釋放的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域進(jìn)入細(xì)胞核，并且與dna結(jié)合蛋白相互作用，從而激活轉(zhuǎn)錄。notch的胞外結(jié)構(gòu)域和關(guān)聯(lián)蛋白含有最多36個(gè)egf樣結(jié)構(gòu)域，之后是三個(gè)notch(dsl)結(jié)構(gòu)域。胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(icd)含有六個(gè)錨蛋白重復(fù)和包括pest結(jié)構(gòu)域的羧基末端延伸。notch1和notch2icd另外包含反式激活結(jié)構(gòu)域(tad)?！皀otch”涵蓋notch受體家族的所有成員。對(duì)notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑和受其影響的狀況的描述可例如參見(jiàn)wo98/20142和wo00/36089。本文所用的“notch抑制劑”、“notch拮抗劑”、“抗notch治療劑”或“抗notch劑”包括部分或完全阻斷、抑制或中和notch途徑的生物活性的任何化合物。示例性的notch抑制化合物包括但不限于γ-分泌酶抑制劑，例如iii-31-c；n-[n-(3,5-二氟苯乙?；?-l-丙氨?；鵠s-苯基甘氨酸叔丁基酯)(dapt)；化合物e；d-螺旋肽294；異香豆素；boc-lys(cbz)ile-leu-環(huán)氧化物；和(z-ll)2-酮(參見(jiàn)kornilova等,j.biol.chem.278:16479-16473(2003))；以及描述于以下文獻(xiàn)的那些化合物：wo01/90084、wo02/30912、wo01/70677、wo03/013506、wo02/36555、wo03/093252、wo03/093264、wo03/093251、wo03/093253、wo2004/039800、wo2004/039370、wo2005/030731、wo2005/014553、wo2004/089911、wo02/081435、wo02/081433、wo03/018543、wo2004/031137、wo2004/031139、wo2004/031138、wo2004/101538、wo2004/101539和wo02/47671以及美國(guó)專利申請(qǐng)第2003/0114496號(hào)。具體的γ-分泌酶抑制劑還描述于美國(guó)專利第6,984,663和7,304,094號(hào)。具體的抗體notch抑制劑描述于本文以及wo2010/005566和wo2010/005567，所有這些文獻(xiàn)都通過(guò)援引并入本文。notch抑制劑還包括notch配體拮抗劑?！皀otch抑制劑”、“notch拮抗劑”、“抗notch治療劑”或“抗notch劑”還涵蓋結(jié)合notch受體的抗體。術(shù)語(yǔ)“抗體”是指免疫球蛋白分子，其通過(guò)免疫球蛋白分子的可變區(qū)內(nèi)的至少一個(gè)抗原識(shí)別部位或抗原結(jié)合部位來(lái)識(shí)別并特異性地結(jié)合靶標(biāo)，例如蛋白質(zhì)、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂質(zhì)或者它們的組合。本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”涵蓋了完整的多克隆抗體、完整的單克隆抗體、抗體片段(例如fab、fab'、f(ab')2和fv片段)、單鏈fv(scfv)突變抗體、多特異性抗體(例如由至少兩個(gè)完整抗體產(chǎn)生的雙特異性抗體)、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、包含抗體的抗原識(shí)別部位的融合蛋白、和包含抗原識(shí)別部位的任何其他修飾的免疫球蛋白分子，只要這些抗體展現(xiàn)所需的生物活性即可。抗體可以是免疫球蛋白的五個(gè)主要類別中的任一個(gè)：iga、igd、ige、igg和igm，或者，基于其重鏈恒定區(qū)的身份(分別稱作α、δ、ε、γ和μ)，可以是其亞類(同型)(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)。不同類別的免疫球蛋白具有不同且公知的亞基結(jié)構(gòu)以及三維構(gòu)造?？贵w可以是裸抗體，或綴合至其他分子，包括但不限于毒素和放射性同位素。術(shù)語(yǔ)“抗體片段”是指完整抗體的一部分，并且指完整抗體的抗原決定性可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括但不限于fab、fab'、f(ab')2和fv片段、線性抗體、單鏈抗體以及由抗體片段形成的多特異性抗體。術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指參與高特異性地識(shí)別并結(jié)合單一抗原決定簇或表位的同種抗體群體。這與多克隆抗體相反，多克隆抗體通常包括針對(duì)不同抗原決定簇的不同抗體的混合物。術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”涵蓋了完整和全長(zhǎng)的單克隆抗體以及抗體片段(例如，fab、fab'、f(ab')2、fv片段)、單鏈(scfv)突變抗體、包含抗體部分的融合蛋白、和包含抗原識(shí)別部位的任何其他經(jīng)修飾的免疫球蛋白分子。此外，“單克隆抗體”是指以多種方式制造的此類抗體，所述方式包括但不限于雜交瘤產(chǎn)生、噬菌體選擇、重組表達(dá)和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。本文使用的術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”是指非人類(例如鼠類)抗體的形式，其為含有最小限度非人類(例如鼠類)序列的特異性免疫球蛋白鏈、嵌合免疫球蛋白或其片段。術(shù)語(yǔ)“人抗體”是指由人產(chǎn)生的抗體或使用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)制造的具有對(duì)應(yīng)于人產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列的抗體。人抗體的該定義包括完整或全長(zhǎng)抗體及其片段。術(shù)語(yǔ)“嵌合抗體”是指免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自兩個(gè)以上物種的抗體。通常，輕鏈和重鏈的可變區(qū)對(duì)應(yīng)于源自一個(gè)哺乳動(dòng)物物種(例如，小鼠、大鼠、兔等)的具有所需特異性、親和力和/或能力的抗體可變區(qū)，而恒定區(qū)與源自另一物種(通常是人類)的抗體中的序列同源，從而避免在該物種中引發(fā)免疫應(yīng)答。術(shù)語(yǔ)“表位”或“抗原決定簇”在本文中可互換使用，是指能夠被特定抗體識(shí)別并特異性結(jié)合的抗原部分。當(dāng)抗原是多肽時(shí)，表位既可由連續(xù)的氨基酸形成(通常稱為“線性表位”)，也可由通過(guò)蛋白的三級(jí)折疊而并置的不連續(xù)氨基酸形成(通常稱為“構(gòu)象表位”)。由連續(xù)氨基酸形成的表位在蛋白變性時(shí)通常會(huì)保留，而通過(guò)三級(jí)折疊形成的表位在蛋白變性時(shí)通常會(huì)喪失。表位通常包括處在獨(dú)特空間構(gòu)象中的至少3個(gè)、或更常見(jiàn)的至少5個(gè)或8～10個(gè)氨基酸。術(shù)語(yǔ)“特異性地結(jié)合”或“特異性結(jié)合”是指與其它物質(zhì)(包括非關(guān)聯(lián)蛋白)相比，結(jié)合劑或抗體與表位或蛋白質(zhì)的反應(yīng)或締合更為頻繁、更為迅速、更為持久、親和力更高或以上的一些組合。在某些實(shí)施方式中，“特異性地結(jié)合”是指例如抗體與蛋白結(jié)合的kd為約0.1mm以下，更通常小于約1μm。在某些實(shí)施方式中，“特異性地結(jié)合”是指抗體與蛋白結(jié)合的kd有時(shí)為至少約0.1μm以下，有時(shí)為至少約0.01μm以下。本文所用的術(shù)語(yǔ)“分階”是指根據(jù)特定的疾病狀態(tài)或狀況的特征將受試對(duì)象分成不同類別或階層。例如，對(duì)罹患notch介導(dǎo)的癌癥的受試對(duì)象群體進(jìn)行分階包括基于突變的存在(腫瘤分類)和/或基于疾病的嚴(yán)重性(例如輕度、中期和晚期等)分類受試對(duì)象。術(shù)語(yǔ)“受試對(duì)象”是指任何動(dòng)物(例如，哺乳動(dòng)物)，包括但不限于人、非人靈長(zhǎng)類和嚙齒動(dòng)物等，其是特定治療的接受者。通常，對(duì)于人類受試對(duì)象，在本文中術(shù)語(yǔ)“受試對(duì)象”和“患者”可互換使用。本文中用于獲得定量和定性數(shù)據(jù)的“正?！笔茉噷?duì)象或來(lái)自“正常”受試對(duì)象的樣品是指已經(jīng)由或會(huì)由醫(yī)師評(píng)估為不具有notch介導(dǎo)的細(xì)胞增殖紊亂或以異常notch信號(hào)傳導(dǎo)為特征的紊亂的受試對(duì)象?！皩?duì)照樣品”是指來(lái)自可比較的對(duì)照細(xì)胞(通常無(wú)疾病)的單獨(dú)樣品。其可以來(lái)自同一受試對(duì)象，或來(lái)自正常的或不具有用來(lái)獲得患病樣品或測(cè)試樣品的相同疾病的另一受試對(duì)象。本文使用術(shù)語(yǔ)“預(yù)后”來(lái)指對(duì)癌癥可導(dǎo)致的死亡或進(jìn)展的可能性的預(yù)測(cè)，包括腫瘤疾病(例如notch介導(dǎo)的癌癥)的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移性擴(kuò)展和藥物抗性。本文所用的術(shù)語(yǔ)“預(yù)測(cè)”是指作出受試對(duì)象的后果具有顯著增強(qiáng)或下降的可能性(有利的預(yù)后或不利的預(yù)后)的決定。其還可以包括notch抑制劑可以是治療有效的或未發(fā)現(xiàn)其具有治療性的可能性。該術(shù)語(yǔ)還用于指以下情況的可能性：患者對(duì)藥物或藥物組產(chǎn)生有利或不利的響應(yīng)以及這些響應(yīng)的程度；或患者在手術(shù)除去原發(fā)性腫瘤和/或化學(xué)治療后會(huì)存活一定時(shí)間且癌癥不會(huì)復(fù)發(fā)。本發(fā)明的預(yù)測(cè)性方法可在臨床上用于通過(guò)為任何具體患者選擇最恰當(dāng)?shù)闹委熌Ｊ蕉鞒鲋委煕Q定。因此，在預(yù)測(cè)患者是否可能有利地響應(yīng)于基于notch的治療方案(例如使用給定藥物或藥物組合(例如γ分泌酶抑制劑或其他notch抑制劑)的化學(xué)治療)時(shí)，或在預(yù)測(cè)用notch抑制劑進(jìn)行治療方案后和/或終止化學(xué)治療或其他治療模式后患者是否可能長(zhǎng)期存活時(shí)，本發(fā)明的預(yù)測(cè)性方法是有價(jià)值的工具。術(shù)語(yǔ)“癌癥”或“癌變”是指或描述通常以不受控的細(xì)胞生長(zhǎng)為特征的哺乳動(dòng)物中的生理學(xué)狀況。癌癥的“病理學(xué)”包括使患者的健康受損的所有現(xiàn)象。這包括但不限于異常或不受控的細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、干擾相鄰細(xì)胞的正常功能、以異常水平釋放細(xì)胞因子或其他分泌產(chǎn)物、炎性或免疫響應(yīng)的抑制或惡化、瘤形成、癌變前期、惡性腫瘤、對(duì)周圍或遠(yuǎn)端組織或器官(例如淋巴結(jié))的侵襲，等等?？梢允褂帽砻鲗?duì)患者有益的任何終點(diǎn)來(lái)評(píng)估“患者響應(yīng)”，包括但不限于：(1)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的某種程度的抑制，包括減緩和完全遏制生長(zhǎng)；(2)腫瘤細(xì)胞數(shù)量減少；(3)腫瘤尺寸減??；(4)抑制(即，減少、減緩或完全停止)了腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)到相鄰?fù)庵芷鞴俸?或組織；(5)抑制(即，減少、減緩或完全停止)了轉(zhuǎn)移；(6)抗腫瘤免疫響應(yīng)增強(qiáng)，其可能但不一定導(dǎo)致腫瘤的消退或排斥；(7)與腫瘤相關(guān)的一種或多種癥狀的某種程度的緩解；(8)治療后存活時(shí)間的延長(zhǎng)；和/或(9)治療后給定時(shí)間點(diǎn)的死亡率下降?！澳[瘤輔助療法”是在原始(主要)療法之前的附加或輔助療法。腫瘤輔助療法包括例如化學(xué)療法、放射療法和激素療法。因此，可以在手術(shù)前施用化學(xué)療法以使腫瘤收縮，從而使手術(shù)能夠更有效，或在之前不可手術(shù)的腫瘤的可能情況下施用化學(xué)療法。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“響應(yīng)”是指根據(jù)recist(實(shí)體瘤中的響應(yīng)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn))，患者或腫瘤在施用試劑后顯示出完全響應(yīng)或部分響應(yīng)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“非響應(yīng)”是指根據(jù)recist，患者或腫瘤在施用試劑后顯示出穩(wěn)定的疾病或進(jìn)行性疾病。recist描述于例如therasse等,2000年2月,"newguidelinestoevaluatetheresponsetotreatmentinsolidtumors,"j.natl.cancerinst.92(3):205-216，通過(guò)援引將其全部?jī)?nèi)容并入本文。示例性試劑包括針對(duì)notch多肽的特異性結(jié)合劑，包括但不限于抗notch抗體?！拔蓙y”是任何可受益于一種或多種治療的狀況。這包括慢性和急性紊亂或疾病，包括使哺乳動(dòng)物傾向于患有所討論的紊亂的那些病理狀況。本文中待治療的紊亂的非限制性實(shí)例包括良性和惡性腫瘤，特別是乳腺癌、直腸癌、卵巢癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、腎臟癌、結(jié)腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、前列腺癌或膀胱癌。“治療”或“療法”是指治療性治療和預(yù)防性或防御性措施。術(shù)語(yǔ)“治療有效量”是指對(duì)于治療哺乳動(dòng)物的疾病或紊亂有效的藥物的量。在癌癥情況下，以非限制性實(shí)例而言，治療有效量的抗notch治療可以：減少癌細(xì)胞的數(shù)量；減少腫瘤尺寸；抑制(即某種程度上減緩，優(yōu)選是停止)癌細(xì)胞浸潤(rùn)到周圍器官中；抑制(即某種程度上減緩，優(yōu)選是停止)腫瘤轉(zhuǎn)移；某種程度上抑制腫瘤生長(zhǎng)；和/或某種程度上緩解與所述紊亂有關(guān)的一種或多種癥狀。在所述藥物可以預(yù)防癌細(xì)胞生長(zhǎng)和/或殺死存在的癌細(xì)胞的情況下，其可以是細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑和/或細(xì)胞毒劑。對(duì)于癌癥治療，體內(nèi)功效可以例如通過(guò)評(píng)估腫瘤負(fù)荷或體積、疾病進(jìn)展時(shí)間(ttp)和/或確定應(yīng)答率(rr)來(lái)測(cè)量。ii.激活性notch突變的鑒定本文公開(kāi)了notch受體中的突變，這些突變引起激活的notch蛋白的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致受體信號(hào)傳導(dǎo)增加。這些突變與例如癌癥等腫瘤形成性疾病相關(guān)，由此可用來(lái)例如評(píng)估癌癥患者是否會(huì)對(duì)notch拮抗劑療法產(chǎn)生響應(yīng)。在哺乳動(dòng)物中，notch家族有4個(gè)成員：notch1(tan1)、notch2、notch3和notch4/int-4。人notch蛋白的示例性序列包括但不限于：人notch1，由genbank登錄號(hào)nm_017617.3所示的mrna序列編碼，并具有g(shù)enbank登錄號(hào)np_060087所示的氨基酸序列；人notch2，由genbank登錄號(hào)nm_024408所示的mrna序列編碼，并具有g(shù)enbank登錄號(hào)np_077719所示的氨基酸序列；人notch3，由genbank登錄號(hào)nm_000435.2所示的mrna序列編碼，并具有g(shù)enbank登錄號(hào)np_000426所示的氨基酸序列；和人notch4，由genbank登錄號(hào)nm_004557所示的mrna序列編碼，并具有g(shù)enbank登錄號(hào)np_004548所示的氨基酸序列。notch1～4的代表性野生型序列分別示于seqidno:1～4。使用nm_017617.3作為參照序列來(lái)確定本文提供的notch1突變的位置。使用nm_000435.2作為參照序列來(lái)確定本文提供的notch3突變的位置。核苷酸位置的編號(hào)始于notch起始密碼，其中起始atg密碼子的腺嘌呤(例如nm_017617.3的第1位殘基和nm_000435.2的第77位殘基)對(duì)應(yīng)于第1位。notch在細(xì)胞表面表達(dá)為單次跨膜的異二聚體受體。配體也是dsl(delta/serrate/lag-2)家族的跨膜蛋白，其不僅能在相鄰細(xì)胞上表達(dá)，還能在表達(dá)notch受體的同一細(xì)胞上表達(dá)。受體-配體相互作用觸發(fā)了在接近跨膜結(jié)構(gòu)域的胞外s2位點(diǎn)處和在s3位點(diǎn)處的蛋白水解。據(jù)認(rèn)為，tnf-α轉(zhuǎn)化酶(tace)和早老蛋白(presenillin)-1依賴性γ-分泌酶分別負(fù)責(zé)s2和s3位點(diǎn)處的蛋白水解加工。最終的切割釋放了羧基末端胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(icd)，其包含側(cè)接有核定位信號(hào)的7個(gè)錨蛋白重復(fù)序列、富脯氨酸-谷氨酸-絲氨酸-蘇氨酸(pest)結(jié)構(gòu)域和反式激活結(jié)構(gòu)域(tad)。然后icd轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，募集例如mastermind和p300等共激活劑，并與csl(cbf/suppressorofhairless/lag-1)因子結(jié)合。在不存在notch信號(hào)傳導(dǎo)時(shí)，與輔阻遏劑聯(lián)結(jié)的csl蛋白遏制靶基因轉(zhuǎn)錄。因此，notch信號(hào)傳導(dǎo)將對(duì)csl靶基因的轉(zhuǎn)錄遏制轉(zhuǎn)換成對(duì)其的轉(zhuǎn)錄激活。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及腫瘤細(xì)胞的鑒定，所述腫瘤細(xì)胞的至少一部分含有導(dǎo)致notch信號(hào)傳導(dǎo)增加的激活性notch突變。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述突變是notch的pest結(jié)構(gòu)域突變。pest結(jié)構(gòu)域突變是在最小pest結(jié)構(gòu)域本身內(nèi)出現(xiàn)的突變，以及在該結(jié)構(gòu)域的上游出現(xiàn)并導(dǎo)致pest結(jié)構(gòu)域消除(例如插入終止密碼子)或?qū)е聲?huì)改變pest結(jié)構(gòu)域序列的移碼的突變。最小pest結(jié)構(gòu)域序列示于表1中。在另一實(shí)施方式中，所述突變位于notch的反式激活結(jié)構(gòu)域(tad)。表：最小notch受體pest結(jié)構(gòu)域來(lái)源參照序列aa序列核苷酸位置氨基酸位置notch1ccds43905fltpspesp(seqidno:33)7525-75502509-2517notch2ccds908yltpspesp(seqidno:34)7240-72662414-2422notch3ccds12326yltpspesp(seqidno:34)6730-67562244-2252notch4nm_004557.3ltpspe(seqidno:35)5914-59311972-1977在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種分離的突變?nèi)薾otch1多核苷酸，所述多核苷酸包含7279位核苷酸處的雜合性缺失。在又一實(shí)施方式中，所述突變notch1包含7279位核苷酸處的鳥(niǎo)嘌呤(g)的雜合性缺失(refseqnm_017617.3；seqidno:1)。本文將該notch1突變稱為omp-b40。omp-b40突變引起notch1的pest結(jié)構(gòu)域的閱讀框移碼(g2427fs)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種分離的突變?nèi)薾otch3多核苷酸，所述多核苷酸包含6622位核苷酸處的純合性插入。在又一實(shí)施方式中，所述突變notch3包含6622位核苷酸處的胞嘧啶(c)純合性插入(refseqnm_000435.2；seqidno:3)。本文將該notch3突變稱為omp-b37。該插入引起pest結(jié)構(gòu)域的2208位氨基酸的的閱讀框移碼(p2208fs)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種分離的突變?nèi)薾otch3多核苷酸，所述多核苷酸包含6096位核苷酸處的雜合性插入。在又一實(shí)施方式中，所述突變notch3包含6096位核苷酸處的胞嘧啶(c)雜合性插入(refseqnm_000435.2；seqidno:3)。本文將該notch3突變稱為omp-c31。該插入引起ank結(jié)構(gòu)域的2033位氨基酸的閱讀框移碼(p2033fs)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種分離的突變?nèi)薾otch1多核苷酸，所述多核苷酸包含6733位核苷酸處的雜合性替換。在又一實(shí)施方式中，所述突變notch1包含6733位核苷酸處的鳥(niǎo)嘌呤(g)至腺嘌呤(a)的雜合性替換(refseqnm_017617.3；seqidno:1)。本文將該notch1突變稱為肺_01246。該替換引起tad結(jié)構(gòu)域的2245位氨基酸處的gly至arg的錯(cuò)義突變(g2245r)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種分離的突變?nèi)薾otch1多核苷酸，所述多核苷酸包含6788位核苷酸處的雜合性替換。在又一實(shí)施方式中，所述突變notch1包含6788位核苷酸處的胞嘧啶(c)至胸腺嘧啶(t)的雜合性替換(refseqnm_017617.3；seqidno:3)。本文將該notch1突變稱為乳腺_h12932t。該替換引起tad結(jié)構(gòu)域的2263位氨基酸處的arg至gln的錯(cuò)義突變(r2263q)。表2：notch突變本發(fā)明的多肽可以使用例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)等dna擴(kuò)增方法來(lái)克隆(參見(jiàn)例如sambrook等(1989)molecularcloning:alaboratorymanual,第2版,coldspringharbour,n.y.；berger&kimmel(1987)methodsinenzymology.第152卷)。因此，例如，可以使用含有一個(gè)限制性位點(diǎn)的正義引物和含有另一個(gè)限制性位點(diǎn)的反義引物對(duì)編碼突變notch多肽的核酸分子進(jìn)行pcr擴(kuò)增。這會(huì)產(chǎn)生編碼具有末端限制性位點(diǎn)的所需序列或亞序列的核酸。然后可以將該核酸容易地連接到具有合適的對(duì)應(yīng)限制性位點(diǎn)的載體中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于所要表達(dá)的序列容易地選擇合適的pcr引物。還可以通過(guò)定點(diǎn)誘變來(lái)添加合適的限制性位點(diǎn)(參見(jiàn)gillman和smithgene8:81-97(1979)；roberts等nature328:731-4(1987))。將外源性核酸引入宿主細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域公知的，并且會(huì)隨著所用的宿主細(xì)胞而變化。合適的技術(shù)包括但不限于右旋糖苷介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、聚凝胺介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、病毒感染、將多核苷酸包封到脂質(zhì)體中和將dna直接顯微注射到細(xì)胞核中。在一些實(shí)施方式中，所述多核苷酸包括嵌合多肽的編碼序列，所述編碼序列與例如有助于多肽從宿主細(xì)胞表達(dá)和分泌的多核苷酸(例如前導(dǎo)序列，其用作分泌序列，用于控制多肽從細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)出)在同一閱讀框中融合。具有前導(dǎo)序列的多肽是前蛋白(preprotein)，并且其前導(dǎo)序列能夠被宿主細(xì)胞切割從而形成所述多肽的成熟形式。所述多核苷酸還可以編碼蛋白前體(proprotein)，其為成熟蛋白加上額外的5'氨基酸殘基。具有前體序列(prosequence)的成熟蛋白是蛋白前體，并且是所述蛋白的失活形式。一旦前體序列被切割，則留下具有活性的成熟蛋白。在一些實(shí)施方式中，所述多核苷酸包括成熟多肽的編碼序列，所述編碼序列與例如允許對(duì)所編碼的多肽進(jìn)行純化的標(biāo)記序列在同一閱讀框中融合。例如，所述標(biāo)記序列可以是由pqe-9載體提供的六聚組氨酸，以用于在細(xì)菌宿主的情況下對(duì)與所述標(biāo)記融合的成熟多肽進(jìn)行純化，或者當(dāng)使用哺乳動(dòng)物宿主(例如cos-7細(xì)胞)時(shí)，標(biāo)記序列可以是源自流感血凝素蛋白的血凝素(ha)標(biāo)簽。本發(fā)明的突變多肽通常使用表達(dá)載體來(lái)表達(dá)并純化。表達(dá)載體可以是自復(fù)制型染色體外載體或是整合到宿主基因組中的載體。通常，表達(dá)載體包括與編碼靶蛋白的核酸可操作地連接的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控性核酸序列?？刹僮鬟B接的dna序列可以是鄰接或非鄰接的。用于連接dna序列的方法是本領(lǐng)域公知的，包括使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和連接。轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控性核酸會(huì)通常適合于用來(lái)表達(dá)靶蛋白的宿主細(xì)胞，例如優(yōu)選使用來(lái)自大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控性核酸序列來(lái)在大腸桿菌中表達(dá)靶蛋白。對(duì)于各種宿主細(xì)胞，本領(lǐng)域已知許多種類的合適的表達(dá)載體和合適的調(diào)控序列。表達(dá)多肽的方法在本領(lǐng)域是公知的(例如sambrook等(1989)molecularcloning,alaboratorymanual,第2版,1-3卷,coldspringharborlaboratory；berger和kimmel(1987)guidetomolecularcloningtechniques,methodsinenzymology,152卷,academicpress,inc.,sandiego,calif.；ausubel等(1995)currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,inc.,ny)。通常，轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控性序列可以包括但不限于啟動(dòng)子序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列和增強(qiáng)子或激活因子序列。啟動(dòng)子序列編碼組成性或誘導(dǎo)性啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是天然存在的啟動(dòng)子或雜合啟動(dòng)子。組合超過(guò)一個(gè)啟動(dòng)子的元件的雜合啟動(dòng)子也是本領(lǐng)域已知的。表達(dá)載體可以包含另外的元件。例如，表達(dá)載體可以具有兩種復(fù)制系統(tǒng)，因此允許其保持在兩種有機(jī)體中，例如在哺乳動(dòng)物中或昆蟲(chóng)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，和在原核宿主中進(jìn)行克隆和擴(kuò)增。此外，為了整合表達(dá)載體，表達(dá)載體含有至少一條與宿主細(xì)胞基因組中的序列同源的序列，優(yōu)選在表達(dá)構(gòu)建體兩側(cè)具有兩條同源序列。通過(guò)選擇用于包含在載體中的合適的同源序列，可以將整合載體引導(dǎo)至宿主細(xì)胞中的特定基因座。用于整合載體的構(gòu)建體在本領(lǐng)域是公知的。另外，表達(dá)載體可以包括選擇性標(biāo)記基因，以允許選擇已轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。選擇性基因是本領(lǐng)域公知的，并且會(huì)根據(jù)所用的宿主細(xì)胞而有所不同。本發(fā)明的多肽可以通過(guò)以下方法來(lái)制造：在合適的條件下培養(yǎng)用含有突變notch多肽的編碼核酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化了的宿主細(xì)胞，從而誘導(dǎo)或引起突變多肽的表達(dá)。蛋白表達(dá)的適合條件將隨著表達(dá)載體和宿主細(xì)胞的選擇而有所不同，并且會(huì)由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)容易地確定。例如，為了在表達(dá)載體中使用組成性啟動(dòng)子，可以對(duì)宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖進(jìn)行優(yōu)化；而為了使用誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，提供用于誘導(dǎo)的合適生長(zhǎng)條件。此外，在一些實(shí)施方式中，收集時(shí)機(jī)是重要的，例如當(dāng)使用桿狀病毒體系時(shí)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到可以針對(duì)在所選擇的宿主細(xì)胞中的表達(dá)而對(duì)編碼序列進(jìn)行優(yōu)化。合適的宿主細(xì)胞包括酵母、細(xì)菌、古細(xì)菌、真菌和昆蟲(chóng)及動(dòng)物細(xì)胞，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞。宿主細(xì)胞包括但不限于黑腹果蠅(drosophilamelanogaster)細(xì)胞、釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)和其他酵母、大腸桿菌、枯草桿菌(bacillussubtilis)、sf9細(xì)胞、c129細(xì)胞、293細(xì)胞、鏈孢霉屬(neurospora)、bhk、cho、cos、hela細(xì)胞、hepg2細(xì)胞和人細(xì)胞及細(xì)胞系。本發(fā)明的突變notch多肽還可使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)制成融合蛋白。例如，可以將notch多肽制成融合蛋白來(lái)增加表達(dá)、增加血清半衰期或?qū)⑵渑c標(biāo)簽多肽連接，所述標(biāo)簽多肽提供能夠被抗標(biāo)簽抗體選擇性結(jié)合的表位。示例性的標(biāo)簽或融合伴侶包括myc表位、免疫球蛋白fc結(jié)構(gòu)域和6-組氨酸。表位標(biāo)簽通常位于靶蛋白的氨基末端或羧基末端。靶蛋白的此類帶表位標(biāo)簽的形式的存在可以使用針對(duì)標(biāo)簽多肽的抗體來(lái)檢測(cè)。因此，表位標(biāo)簽使靶蛋白能夠容易地通過(guò)使用抗標(biāo)簽抗體或結(jié)合表位標(biāo)簽的其他類型的親和基質(zhì)的親和純化來(lái)得到純化。本發(fā)明的notch多肽可以在表達(dá)后純化和分離。通常使用例如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜等分析化學(xué)技術(shù)來(lái)確定純度和同質(zhì)性。如果蛋白是在制品中占主導(dǎo)地位的物質(zhì)，則蛋白基本上是純化的。術(shù)語(yǔ)“純化”表示蛋白在電泳凝膠中產(chǎn)生基本上一條帶。例如，這意味著該蛋白為至少85％純，例如至少95％純，例如至少99％純。根據(jù)樣品中存在何種其他成分，本發(fā)明的notch多肽可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方式來(lái)分離和純化。標(biāo)準(zhǔn)純化方法包括電泳技術(shù)、分子技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)和色譜技術(shù)，包括離子交換色譜、疏水色譜、親和色譜和反相hplc色譜以及色譜聚焦。例如，靶蛋白可以使用親和柱來(lái)純化。還可以使用與蛋白濃縮組合的超濾和滲濾技術(shù)。合適的純化技術(shù)在本領(lǐng)域是標(biāo)準(zhǔn)的(通常參見(jiàn)r.scopes(1982)proteinpurification,springer-verlag,n.y.；deutcher(1990)methodsinenzymology第182卷:guidetoproteinpurification,academicpress,inc.n.y.)。所需的純化程度會(huì)根據(jù)多肽的用途而有所不同。在一些情況下，不需要純化。在一些實(shí)施方式中，notch多核苷酸或多肽可以包含異源性氨基酸序列或一種或多種通常不與notch多肽聯(lián)結(jié)的其他部分(例如，抗微生物劑、治療劑、前藥、肽、蛋白質(zhì)、酶、脂質(zhì)、生物學(xué)響應(yīng)修飾劑、藥劑、淋巴因子、異源性抗體或其片段、可檢測(cè)標(biāo)記、聚乙二醇(peg)以及兩種以上任何上述試劑的組合)。在其他實(shí)施方式中，notch多核苷酸或多肽可以包含選自由以下標(biāo)記組成的組的可檢測(cè)標(biāo)記：酶、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記、放射性標(biāo)記或兩種以上任何上述可檢測(cè)標(biāo)記的組合。本發(fā)明還涵蓋與notch受體的突變形式特異性地結(jié)合的抗體以及制造所述抗體的方法?！芭c突變notch受體特異性地結(jié)合”的抗體的定義是：對(duì)該受體的突變形式的親和力是對(duì)野生型形式的親和力的至少100倍的抗體。制造所述抗體的方法可以包括將突變受體蛋白注入合適的動(dòng)物中，或優(yōu)選地，注射包括突變發(fā)生區(qū)的短肽。這些肽的長(zhǎng)度應(yīng)該至少為5個(gè)氨基酸，并且可以單獨(dú)注射或組合注射。制造和選擇抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，這可見(jiàn)于標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)中，例如harlow,等,antibodies,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,n.y.(1988)；klein,immunology:thescienceofself-nonselfdiscrimination(1982)；kennett,等,monoclonalantibodiesandhybridomas:anewdimensioninbiologicalanalyses(1980)；和campbell,laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology中的"monoclonalantibodytechnology"(1984)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”是指包括完整分子以及保留了他們結(jié)合抗原的能力的片段，例如fab和f(ab)2片段。多克隆抗體源自用合適的抗原免疫化的動(dòng)物的血清。單克隆抗體可以使用參考文獻(xiàn)中教導(dǎo)的雜交瘤技術(shù)來(lái)制備，例如hammerling等,在monoclonalantibodiesandt-cellhybridomas中,elsevier,n.y.,563-681頁(yè)(1981)。通常，該技術(shù)包括用完整蛋白或源自其的片段來(lái)免疫化有免疫能力的動(dòng)物(通常為小鼠)。然后從免疫化的動(dòng)物中提取脾細(xì)胞，并將其與合適的骨髓瘤細(xì)胞(例如sp2o細(xì)胞)融合。而后，將所得的雜交瘤細(xì)胞選擇性地保持在hat培養(yǎng)基中，然后通過(guò)有限稀釋來(lái)進(jìn)行克隆(wands等,gastroenterology80:225-232(1981))。然后對(duì)通過(guò)該選擇而獲得的細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定，以鑒定出分泌優(yōu)先與notch1、notch3的突變形式或其他notch受體的突變形式結(jié)合的抗體的克隆。針對(duì)突變notch受體的抗體還可以用于純化完整受體或這些受體的片段(大體上參見(jiàn)dean,等,affinitychromatograph,apracticalapproach,irlppress(1986))。通常，將抗體固定在色譜基質(zhì)(例如sepharose4b)上。然后將基質(zhì)填裝入柱中，并使含有突變受體的制品在促進(jìn)結(jié)合的條件下(例如在低鹽條件下)通過(guò)該柱。然后將該柱洗滌，并使用促進(jìn)抗體解離的緩沖液(例如具有改變的ph或鹽濃度的緩沖液)來(lái)洗脫所結(jié)合的受體。將洗脫的受體蛋白轉(zhuǎn)移到所選緩沖液中(例如通過(guò)透析)，而后貯存或直接使用。純化的受體可用于下述免疫測(cè)定中或用于產(chǎn)生測(cè)定用抗體。在notch受體的序列中激活性突變的發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生多種診斷、預(yù)后和治療方法以作為其他實(shí)施方式。對(duì)激活性突變的鑒定還使得能夠在早期鑒定出具有對(duì)notch拮抗劑療法特別敏感的腫瘤的受試對(duì)象。本文描述的對(duì)激活性突變的鑒定為早期治療以及具體的治療選擇提供了契機(jī)。iii.診斷應(yīng)用當(dāng)存在于癌中時(shí)，notch的突變同型是notch抑制劑、免疫療法和其他新型靶向途徑的治療靶標(biāo)。由于激活的notch突變未在所有腫瘤中發(fā)現(xiàn)，所以，通過(guò)對(duì)癌細(xì)胞中是否存在notch基因突變而進(jìn)行治療前分析，對(duì)患者的選擇將得到優(yōu)化，以進(jìn)行靶向突變的notch受體的治療。用于檢測(cè)本發(fā)明的notch突變的方法包括在核酸水平或蛋白質(zhì)水平確定突變的存在的任何方法。此類方法是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于蛋白質(zhì)印跡、rna印跡、dna印跡、elisa、免疫沉淀、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)、核酸測(cè)序、核酸雜交技術(shù)、核酸逆轉(zhuǎn)錄方法和核酸擴(kuò)增方法，例如pcr。在一些實(shí)施方式中，診斷分析可以基于針對(duì)這些突變的pcr類測(cè)定，其中使用例如一種或多種以下途徑：通過(guò)凝膠電泳的尺寸分級(jí)分離、直接測(cè)序、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(sscp)、高壓液相色譜(包括部分變性hplc)、等位基因-特異性雜交、擴(kuò)增阻礙突變篩選、通過(guò)寡核苷酸微陣列進(jìn)行的notch突變篩選、限制性片段多態(tài)性、maldi-tof質(zhì)譜或多種相關(guān)技術(shù)(abu-duhier等,br.j.haematol.,113:983-988,2001；kottaridis等,blood,98:1752-1759,2001；choy等,ann.hum.gen.,63:383-391,1999；grompe,naturegenetics,5:111-117,1993；perlin和szabady,hum.mutat.,19:361-373,2002；amos和patnaik,hum.mutat.,19:324-333,2002；cotton,hum.mutat.,19:313-314,2002；stirewalt等,blood,97:3589-3595,2001；hung等,bloodcoagul.fibrinolysis,13:117-122,2002；larsen等,pharmacogenomics,2:387-399,2001；shchepinov等,nucleicacidsres.,29:3864-3872,2001)。在特定實(shí)施方式中，使用例如針對(duì)突變notch受體的抗體或下游notch信號(hào)傳導(dǎo)蛋白在蛋白質(zhì)水平檢測(cè)notch蛋白中的突變(其導(dǎo)致notch信號(hào)傳導(dǎo)增加)。這些抗體可用于多種方法中，例如蛋白質(zhì)印跡、elisa、免疫沉淀或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。免疫測(cè)定在一個(gè)實(shí)施方式中，使用對(duì)突變notch蛋白具有特異性的抗體來(lái)檢測(cè)身體樣品中notch突變的存在。此處所用的短語(yǔ)“身體樣品”是指可以檢出其中的notch突變的任何樣品，包括細(xì)胞、組織或體液。此類身體樣品的實(shí)例包括但不限于血液、淋巴液、尿、婦科液(gynecologicalfluid)、活檢、羊水和涂片。身體樣品可以通過(guò)多種技術(shù)從患者獲得。收集各種身體樣品的方法是本領(lǐng)域公知的。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括從患者獲得身體樣品并使所述身體樣品與至少一種針對(duì)突變notch蛋白的抗體接觸。此類免疫測(cè)定方法可以手動(dòng)進(jìn)行或自動(dòng)進(jìn)行。用于檢測(cè)抗體結(jié)合的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的?？贵w與突變notch蛋白的結(jié)合可以使用化學(xué)試劑來(lái)檢測(cè)，所述化學(xué)試劑產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)，該信號(hào)對(duì)應(yīng)于抗體結(jié)合的水平，并因此對(duì)應(yīng)于突變notch蛋白的存在。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用與帶標(biāo)記的聚合物綴合的二抗來(lái)檢測(cè)抗體結(jié)合。帶標(biāo)記的聚合物的實(shí)例包括但不限于聚合物-酶綴合物。這些復(fù)合物中的酶通常用來(lái)催化抗原-抗體結(jié)合部位處的色素原沉積，由此產(chǎn)生與所關(guān)注的突變的表達(dá)水平對(duì)應(yīng)的細(xì)胞染色。特別關(guān)注的酶包括辣根過(guò)氧化物酶(hrp)和堿性磷酸酶(ap)。可以使用市售的抗體檢測(cè)系統(tǒng)，例如dakoenvision+系統(tǒng)(dakonorthamerica,inc.,carpinteria,calif.)和mach3系統(tǒng)(biocaremedical,walnutcreek,calif.)來(lái)實(shí)施本發(fā)明。抗體結(jié)合檢測(cè)可以通過(guò)將抗體與可檢測(cè)物質(zhì)偶聯(lián)來(lái)促進(jìn)?？蓹z測(cè)物質(zhì)的實(shí)例包括各種酶、輔基(prostheticgroup)、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料和放射性材料。合適的酶的實(shí)例包括辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復(fù)合物的實(shí)例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素以及抗生物素蛋白/生物素；合適的熒光材料的實(shí)例包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪基胺熒光素、丹酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料的實(shí)例包括魯米諾；生物發(fā)光材料的實(shí)例包括螢光素酶、螢光素和水母發(fā)光蛋白；合適的放射性材料的實(shí)例包括125i、131i、35s或3h。免疫測(cè)定，從最簡(jiǎn)單最直接的意義上來(lái)說(shuō)，就是結(jié)合測(cè)定。在一些實(shí)施方式中，免疫測(cè)定是本領(lǐng)域已知的各種類型的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)和放射性免疫測(cè)定(ria)。容易意識(shí)到的是，該檢測(cè)不限于此類技術(shù)，還可以使用蛋白質(zhì)印跡、斑點(diǎn)印跡和facs分析等?；诤怂岬募夹g(shù)在其他實(shí)施方式中，在核酸水平上檢測(cè)notch突變的存在。用于評(píng)估notch突變的表達(dá)和鑒定的核酸類技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)直接核酸測(cè)序來(lái)鑒定notch突變。許多表達(dá)檢測(cè)方法使用分離的rna?？梢允褂萌魏尾会槍?duì)mrna的分離進(jìn)行選擇的rna分離技術(shù)來(lái)從身體樣品中純化rna(參見(jiàn)例如ausubel,編,1999,currentprotocolsinmolecularbiology(johnwiley&sons,newyork)。另外，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)容易地處理大量組織樣品，例如chomczynski的一步rna分離法(美國(guó)專利第4,843,155號(hào))。術(shù)語(yǔ)“探針”是指能夠選擇性地與特別指定的靶標(biāo)生物分子(例如，核苷酸轉(zhuǎn)錄物或由其編碼的蛋白質(zhì)或?qū)?yīng)于突變notch蛋白的蛋白)結(jié)合的任何分子。探針可由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用已知的技術(shù)合成，或源自合適的生物學(xué)制品?？梢詫⑻结樚貏e設(shè)計(jì)成用可檢測(cè)標(biāo)記來(lái)標(biāo)記?？捎米魈结樀姆肿拥膶?shí)例包括但不限于rna、dna、蛋白質(zhì)(包括肽)、抗體和有機(jī)分子。來(lái)自突變notch蛋白的分離的mrna可以在雜交或擴(kuò)增測(cè)定中檢測(cè)，所述測(cè)定包括但不限于mrna測(cè)序法、dna或rna印跡分析、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析和探針陣列。用于檢測(cè)mrna水平的一個(gè)方法包括使分離的mrna接觸能夠與被檢測(cè)基因所編碼的mrna雜交的核酸分子(探針)。所述核酸探針可以為例如全長(zhǎng)cdna或其一部分，例如長(zhǎng)度為至少7、15、30、50、100、250或500個(gè)核苷酸的寡核苷酸，并且足以在嚴(yán)格條件下與編碼本發(fā)明的突變notch多肽的mrna或基因組dna特異性地雜交。mrna與探針的雜交表明所關(guān)注的突變正在表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方式中，將mrna固定在固相表面上并與探針接觸，例如，通過(guò)使分離的mrna在瓊脂糖凝膠上電泳，并將該mrna從凝膠轉(zhuǎn)移到例如硝酸纖維素等膜上。在替代性實(shí)施方式中，將探針固定在固相表面上并使mrna與探針接觸，例如與affymetrix基因芯片陣列(santaclara,calif.)中的探針接觸。可以容易地對(duì)已知的mrna檢測(cè)法進(jìn)行修改以用于檢測(cè)本發(fā)明的notch突變的存在。用于檢測(cè)樣品中的突變notchmrna的存在的替代性方法包括核酸擴(kuò)增過(guò)程，例如通過(guò)rt-pcr(mullis于1987年在美國(guó)專利第4,683,202號(hào)中提出的實(shí)驗(yàn)實(shí)施方式)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(barany,1991,proc.natl.acad.sci.usa,88:189193)、自維持序列復(fù)制(guatelli,1990,proc.natl.acad.sci.usa,87:18741878)、轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增系統(tǒng)(kwoh,1989,proc.natl.acad.sci.usa,86:11731177)、q-β復(fù)制酶(lizardi,1988,bio/technology,6:1197)、滾動(dòng)環(huán)復(fù)制(lizardi,u.s.pat.no.5,854,033)或任何其他核酸擴(kuò)增方法來(lái)進(jìn)行的擴(kuò)增過(guò)程；然后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)檢測(cè)所擴(kuò)增的分子。如果核酸分子以非常低的量存在，則這些檢測(cè)方案對(duì)于檢測(cè)這些核酸分子而言特別有用。在本發(fā)明的特定方面，通過(guò)定量發(fā)熒光rt-pcr(即system)來(lái)評(píng)估notch突變的存在。此類方法通常使用寡核苷酸引物對(duì)，該引物對(duì)位于包含所關(guān)注的notch突變的區(qū)域兩側(cè)。設(shè)計(jì)對(duì)已知序列具有特異性的寡核苷酸引物的方法是本領(lǐng)域已知的。微陣列在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，使用微陣列來(lái)檢測(cè)生物樣品中notch突變的存在。由于其可再現(xiàn)性，微陣列特別適合于該目的。dna微陣列提供一種同時(shí)測(cè)量大量基因或針對(duì)所關(guān)注的分子的不同部位的大量寡核苷酸探針的表達(dá)水平的方法。每個(gè)陣列都由連接至固相載體的呈可再現(xiàn)模式的捕獲探針組成。使經(jīng)標(biāo)記的rna或dna在陣列上與互補(bǔ)探針雜交，然后通過(guò)例如激光掃描來(lái)檢測(cè)。確定陣列上各探針的雜交強(qiáng)度，并將其轉(zhuǎn)化成代表相對(duì)基因表達(dá)水平的定量值。參見(jiàn)美國(guó)專利第6,040,138、5,800,992和6,020,135、6,033,860以及6,344,316，通過(guò)援引將它們并入本文。高密度寡核苷酸陣列對(duì)于確定樣品中的大量rna的基因表達(dá)譜圖而言特別有用。使用機(jī)械合成方法合成這些陣列的技術(shù)描述于例如美國(guó)專利第5,384,261號(hào)中，通過(guò)援引將其全文并入本文中。雖然優(yōu)選平面陣列表面，但可以在幾乎任何形狀的表面或甚至多重表面上制造陣列。陣列可以是位于珠、凝膠、聚合物表面、纖維(例如光纖)、玻璃或任何其他合適的基底上的肽或核酸，參見(jiàn)美國(guó)專利第5,770,358、5,789,162、5,708,153、6,040,193和5,800,992號(hào)，在此通過(guò)援引將其每一篇都全部并入本文?？梢砸钥紤]診斷學(xué)或全包式(all-inclusive)裝置的其他操作的方式來(lái)組裝陣列。參見(jiàn)例如美國(guó)專利第5,856,174和5,922,591號(hào)，通過(guò)援引將其并入本文?？梢詫⒕幋a突變notch蛋白的核酸置于基底上的陣列上，例如芯片(如dna芯片或微芯片)上的陣列上。還可以這些陣列置于其他基底上，例如微量滴定板、珠或微球。將核酸連接至合適的基底上的方法和基底本身描述于例如美國(guó)專利第5,981,956、5,922,591、5,994,068號(hào)(genelogic'sflow-thruchipoprobearrayso)，美國(guó)專利第5,858,659、5,753,439、5,837,860號(hào)，以及l(fā)uminex的flowmetrix技術(shù)(例如，微球)(美國(guó)專利第5,981,180和5,736,330號(hào))。根據(jù)本發(fā)明的方法篩選基因組材料樣品中的多個(gè)突變，通常使用寡核苷酸探針的陣列來(lái)進(jìn)行。針對(duì)大量的特定突變，這些陣列可以總體是“鋪瓦式(tiled)”的?！颁佂摺蓖ǔＪ侵复_定的寡核苷酸探針組的合成，該探針組由與所關(guān)注的靶序列互補(bǔ)的序列以及該序列的預(yù)先選擇的變體(例如一個(gè)或多個(gè)指定位置被基本單體(即核苷酸)組中的一個(gè)或多個(gè)成員替換)組成。鋪瓦策略在公開(kāi)的pct申請(qǐng)wo95/11995中有詳細(xì)討論，通過(guò)援引將其全部?jī)?nèi)容并入本文中以用于所有目的?！鞍行蛄小笔侵副昏b定為編碼所關(guān)注的突變多肽或其部分的序列。在特定方面，針對(duì)許多特定的已鑒定的notch突變，對(duì)陣列進(jìn)行鋪瓦。具體而言，將陣列鋪瓦成包括許多檢測(cè)塊(detectionblock)，每個(gè)檢測(cè)塊對(duì)于特定突變或突變組是特異性的。例如，可以將檢測(cè)塊鋪瓦成包括許多探針，所述探針跨越覆蓋了包括特定突變或突變組的序列區(qū)段。為了確保得到與每種變體互補(bǔ)的探針，可以成對(duì)合成在例如雙等位堿基處不同的探針。通過(guò)比較分析，可以對(duì)任何特定的突變確定最佳的鋪瓦布局。例如，可以容易地使用三聯(lián)體(triplet)以上的檢測(cè)區(qū)段來(lái)選擇該最佳鋪瓦策略。另外，通常將陣列鋪瓦成易于閱讀和分析。例如，在檢測(cè)塊內(nèi)鋪瓦的探針通常布置成使得在橫跨檢測(cè)塊進(jìn)行閱讀時(shí)探針是連續(xù)鋪瓦的，即沿著靶序列以一次一個(gè)或多個(gè)核苷酸推進(jìn)。一旦針對(duì)一組突變對(duì)陣列進(jìn)行了合適的鋪瓦，便使靶核酸與該陣列雜交并掃描。通過(guò)公知的擴(kuò)增技術(shù)(例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr))來(lái)擴(kuò)增包括一種或多種之前鑒定的突變的靶核酸序列。通常，這包括使用與靶序列的位于突變上游和下游的兩段鏈互補(bǔ)的引物序列。還可以使用不對(duì)稱pcr技術(shù)。然后使所擴(kuò)增的靶標(biāo)(通常引入標(biāo)記)與陣列在合適的條件下雜交。在完成雜交并洗滌陣列后，掃描陣列以確定陣列上的與靶序列雜交的位置。從掃描獲得的雜交數(shù)據(jù)的形式通常是作為陣列上位置的函數(shù)的熒光強(qiáng)度。雖然初步描述了單檢測(cè)塊，例如用于檢測(cè)單突變，但是在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的陣列會(huì)包括多個(gè)檢測(cè)塊，因此能夠分析多個(gè)特定突變。在替代性設(shè)置中，通常會(huì)理解的是，檢測(cè)塊可以集中到單個(gè)陣列內(nèi)或多個(gè)分開(kāi)的陣列中，從而可以在靶標(biāo)與陣列雜交期間使用不同的最佳條件。例如，可以經(jīng)常期望的是，可以將落入基因組序列的富gc延伸區(qū)(stretch)內(nèi)的多態(tài)性與落入富at區(qū)段內(nèi)的多態(tài)性分開(kāi)進(jìn)行檢測(cè)。這允許對(duì)每種情況的雜交條件進(jìn)行單獨(dú)優(yōu)化。在一種方法中，將分離自樣品的總mrna轉(zhuǎn)化成帶標(biāo)記的crna或cdna，然后使其與含有本發(fā)明的一種或多種突變的寡核苷酸陣列雜交。將每個(gè)樣品與單獨(dú)的陣列雜交。通過(guò)參考存在于陣列上和樣品中的合適的對(duì)照，可以計(jì)算出相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。除了直接檢測(cè)突變notch蛋白之外，預(yù)期激活的notch突變會(huì)產(chǎn)生獨(dú)特的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)譜圖(例如增加的信號(hào)傳導(dǎo))，其能夠借助于全基因表達(dá)譜或通過(guò)分析各種信號(hào)傳導(dǎo)中間物的激活來(lái)檢測(cè)。雖然單獨(dú)的突變是有用的診斷性生物標(biāo)志，在一個(gè)實(shí)施方式中，可以使用突變的組合來(lái)提供對(duì)具體治療狀態(tài)的預(yù)測(cè)值。具體而言，檢測(cè)樣品中的多個(gè)突變可以增加測(cè)試的靈敏度和/或特異性。有時(shí)將至少兩個(gè)突變的組合稱為“突變譜圖”或“突變指紋”。已發(fā)現(xiàn)一組惡性疾病(包括血液性瘤和實(shí)體瘤)的發(fā)病機(jī)理與腫瘤細(xì)胞中增加的notch介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。增加的notch介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)可以與激活性notch突變(例如本文描述的notch突變)的存在關(guān)聯(lián)起來(lái)。其還可以與減少或消除notch信號(hào)傳導(dǎo)的負(fù)向調(diào)節(jié)劑的活性的突變相關(guān)。參見(jiàn)，例如westhoff等,procnatlacadsci2009年12月29日；106(52):22293–22298。增加的notch介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)可以與notchicd的過(guò)表達(dá)相關(guān)。由于激活的notch信號(hào)傳導(dǎo)并非伴隨所有腫瘤，所以，通過(guò)對(duì)癌細(xì)胞中是否存在升高水平的notchicd而進(jìn)行治療前分析，對(duì)患者的選擇將得到優(yōu)化，以進(jìn)行靶向notch信號(hào)傳導(dǎo)的治療。檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中notchicd水平的方法可以包括檢測(cè)生物樣品中notchicd多肽的存在的任何方法。此類方法是本領(lǐng)域公知的，并且包括但不限于蛋白質(zhì)印跡、狹縫印跡、elisa、免疫沉淀、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫組織化學(xué)(ihc)和質(zhì)譜。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用ihc確定腫瘤樣品中的notchicd水平。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用特異性地結(jié)合notchicd的試劑來(lái)確定notchicd的水平?？梢允褂萌魏握故境雠cnotchicd的特異性結(jié)合的分子實(shí)體來(lái)確定樣品中的notchicd水平。特異性結(jié)合劑包括但不限于抗體、抗體模擬物和多核苷酸(例如適體)。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，通過(guò)用于檢測(cè)notchicd的特定測(cè)定來(lái)確定所需特異性程度。例如，在包括基于多肽尺寸分離多肽的方法(例如蛋白質(zhì)印跡)中，可以使用既與全長(zhǎng)notch又與notchicd特異性結(jié)合的試劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，一種方法采用與notch1icd、notch2icd、notch3icd或notch4icd特異性結(jié)合的試劑來(lái)分別確定notch1icd、notch2icd、notch3icd或notch4icd的水平。在另一實(shí)施方式中，一種方法采用與notch1icd、notch2icd、notch3icd和notch4icd中的至少兩種、至少三種或全部四種特異性結(jié)合的試劑來(lái)確定被所述試劑特異性結(jié)合的notchicd的組合水平。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法采用與notch1icd特異性結(jié)合的試劑來(lái)確定樣品中的notch1icd水平。在又一實(shí)施方式中，該方法使用與notch3icd特異性結(jié)合的試劑來(lái)確定樣品中的notch3icd水平。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用對(duì)notchicd具有特異性的抗體來(lái)確定notchicd的水平。在另一實(shí)施方式中，所述抗體是單克隆抗體。抗notchicd的特異性抗體可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法產(chǎn)生。參見(jiàn)例如tagami等,mol.cell.biol.28(1):165-176?？筺otchicd特異性抗體還可以獲自商購(gòu)來(lái)源。參見(jiàn)例如r&dsystems,抗人notch-2胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域抗體,目錄號(hào)baf3735。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗notchicd特異性抗體與notchicd特異性結(jié)合，但不與notch顯著結(jié)合。在另一實(shí)施方式中，抗notchicd特異性抗體與notch1icd、notch2icd、notch3icd或notch4icd特異性結(jié)合。在另一實(shí)施方式中，抗notchicd特異性抗體與notch1icd、notch2icd、notch3icd或notch4icd中的至少兩種、至少三種或全部四種特異性結(jié)合?？筺otchicd抗體可以是單克隆抗體、多克隆抗體、人源化抗體、人抗體、嵌合抗體或其抗原結(jié)合片段。在又一實(shí)施方式中，該抗體與固定且包埋的組織樣品中的notchicd特異性結(jié)合。組織樣品可以是福爾馬林固定的組織樣品。組織樣品可以是石蠟包埋的組織樣品。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用與notchicd特異性結(jié)合的試劑(例如抗體)來(lái)確定身體樣品中notchicd的水平。此處所用的短語(yǔ)“身體樣品”是指可以確定其中的notchicd的水平的任何樣品，包括細(xì)胞、組織或體液。此類身體樣品的實(shí)例包括但不限于：血液、淋巴液、尿、婦科液、活檢、組織、羊水、通過(guò)外科手術(shù)摘除而獲得的實(shí)體組織樣品、病理學(xué)試樣、存檔樣品、組織培養(yǎng)物或源自其的細(xì)胞以及其子代、以及從任何這些來(lái)源制備的切片或涂片。身體樣品可以通過(guò)多種技術(shù)從患者獲得。收集各種身體樣品的方法是本領(lǐng)域公知的。該術(shù)語(yǔ)還包括個(gè)體中存在的樣品以及獲自或源自該個(gè)體的樣品。例如，樣品可以是通過(guò)活組織檢查獲得的試樣的組織切片，或放置在組織培養(yǎng)物中或適應(yīng)于組織培養(yǎng)物的細(xì)胞。樣品還可以是亞細(xì)胞組分或提取物，或者是粗制的或基本上純的核酸分子或蛋白制品。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括從患者獲得身體樣品并使所述身體樣品與至少一種與notchicd特異性結(jié)合的抗體接觸。此類免疫測(cè)定方法可以手動(dòng)進(jìn)行或自動(dòng)進(jìn)行。用于檢測(cè)抗體結(jié)合的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。與notchicd結(jié)合的抗體可以使用化學(xué)試劑來(lái)檢測(cè)，所述化學(xué)試劑產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)，該信號(hào)對(duì)應(yīng)于抗體結(jié)合的水平，并因而對(duì)應(yīng)于notchicd的水平。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用與帶標(biāo)記的聚合物綴合的二抗來(lái)檢測(cè)notchicd抗體結(jié)合。帶標(biāo)記的聚合物的實(shí)例包括但不限于聚合物-酶綴合物。這些復(fù)合物中的酶通常用于催化抗原-抗體結(jié)合部位處的色素原沉積，由此產(chǎn)生與所關(guān)注的突變的表達(dá)水平對(duì)應(yīng)的細(xì)胞染色。特別關(guān)注的酶包括辣根過(guò)氧化物酶(hrp)和堿性磷酸酶(ap)。在本發(fā)明的方法中，可以使用市售的抗體檢測(cè)系統(tǒng)，例如dakoenvision+系統(tǒng)(dakonorthamerica,inc.,carpinteria,calif.)和mach3系統(tǒng)(biocaremedical,walnutcreek,calif.)?？贵w結(jié)合檢測(cè)可以通過(guò)將notchicd抗體與可檢測(cè)標(biāo)記偶聯(lián)來(lái)促進(jìn)?？蓹z測(cè)標(biāo)記的實(shí)例包括各種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料和放射性材料。合適的酶的實(shí)例包括辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復(fù)合物的實(shí)例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素以及抗生物素蛋白/生物素；合適的熒光材料的實(shí)例包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪基胺熒光素、丹酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料的實(shí)例包括魯米諾；生物發(fā)光材料的實(shí)例包括螢光素酶、螢光素和水母發(fā)光蛋白；合適的放射性材料的實(shí)例包括125i、131i、35s或3h。與notchicd結(jié)合的抗體的水平可以用本領(lǐng)域已知的多種方法來(lái)定量，例如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)、免疫熒光、免疫組織化學(xué)和放射性免疫測(cè)定(ria)。notchicd水平的檢測(cè)不限于此類技術(shù)，還可以使用蛋白質(zhì)印跡、斑點(diǎn)印跡和facs分析等。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括確定亞細(xì)胞區(qū)室(例如細(xì)胞溶膠或細(xì)胞核)中的notchicd水平。在一個(gè)實(shí)施方式中，本文所述的方法包括確定細(xì)胞核中的notchicd水平。在一個(gè)實(shí)施方式中，核notchicd水平可以通過(guò)從樣品中分離出核蛋白組分來(lái)確定。在另一實(shí)施方式中，核notchicd水平通過(guò)顯微鏡檢來(lái)確定。此類核notchicd確定方法可以手動(dòng)進(jìn)行或自動(dòng)進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)顯微鏡檢來(lái)確定腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核中的notchicd水平。例如可以通過(guò)免疫熒光、免疫組織化學(xué)和放射性免疫測(cè)定來(lái)確定notchicd水平。在一個(gè)實(shí)施方式中，核notchicd水平通過(guò)免疫組織化學(xué)(ihc)來(lái)確定。樣品中的核notchicd水平可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何評(píng)分系統(tǒng)來(lái)表示。可以基于notchicd特異性染色的強(qiáng)度或基于notchicd陽(yáng)性細(xì)胞的百分比來(lái)對(duì)腫瘤樣品中的notchicd水平進(jìn)行評(píng)分。在一個(gè)實(shí)施方式中，將腫瘤樣品中的核notchicd水平表示為樣品中包含可檢測(cè)量的notchicd的細(xì)胞的比例，例如百分比。例如，樣品中的核notchicd水平可以表示為腫瘤樣品中呈notchicd陽(yáng)性的細(xì)胞核所占的10％、20％、30％、40％等。在另一實(shí)施方式中，腫瘤樣品中的核notchicd水平通過(guò)評(píng)估腫瘤樣品中的細(xì)胞核染色強(qiáng)度來(lái)確定。例如，根據(jù)細(xì)胞核的notchicd特異性染色強(qiáng)度，腫瘤樣品可以表征為陰性、弱染色和中等或強(qiáng)染色。在又一實(shí)施方式中，腫瘤樣品中的核notchicd水平通過(guò)評(píng)估notchicd特異性物的強(qiáng)度和頻率來(lái)確定。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用h分?jǐn)?shù)來(lái)表征腫瘤樣品中的核notchicd水平。使用從0(對(duì)應(yīng)于無(wú)染色)至3+(對(duì)應(yīng)于最強(qiáng)染色)的半定量強(qiáng)度標(biāo)度來(lái)為樣品中的細(xì)胞核評(píng)定染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)。對(duì)落入各個(gè)類別(即0、1+、2+和3+)的細(xì)胞核的百分比進(jìn)行計(jì)數(shù)。使用以下公式來(lái)計(jì)算細(xì)胞核染色的h分?jǐn)?shù)。h分?jǐn)?shù)＝(0的％)*0+(1+的％)*1+(2+的％)*2+(3+的％)*3。h分?jǐn)?shù)產(chǎn)生了從0至300的連續(xù)變量。本文所述方法的另一方面是將在測(cè)試樣品中檢到的notchicd水平與預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)水平或參照水平(例如，對(duì)照樣品的notchicd水平)進(jìn)行比較。對(duì)照樣品可以是以與測(cè)試樣品相似的方式獲自患者的樣品，其中所述對(duì)照樣品不包含腫瘤細(xì)胞。對(duì)照樣品還可以是以與測(cè)試樣品相似的方式獲自沒(méi)有腫瘤或癌癥的受試對(duì)象的樣品。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括將notchicd水平與預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)或參照水平或?qū)φ账奖容^。術(shù)語(yǔ)“預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)”、“參照水平”和“對(duì)照水平”在某些情況下在本文中可互換使用。在一個(gè)實(shí)施方式中，預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)是在可比較的對(duì)照樣品(例如不包含腫瘤或癌細(xì)胞的樣品)中測(cè)得的基線notchicd水平。在另一實(shí)施方式中，預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)是在包含不表達(dá)升高水平的notchicd的癌細(xì)胞的樣品中測(cè)得的基線notchicd水平。在又一實(shí)施方式中，預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)是在包含對(duì)notch拮抗劑或抑制劑(例如抗notch抗體)治療無(wú)響應(yīng)的癌細(xì)胞的樣品中測(cè)得的基線notchicd水平。在另一實(shí)施方式中，預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)是在分離的細(xì)胞系中測(cè)得的基線notchicd水平。所述細(xì)胞系可以源自癌樣品?？梢詫?duì)該細(xì)胞系進(jìn)行重組操作以表達(dá)notch或nothicd。在一些替代性實(shí)施方式中，參照水平或預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)并不基于正常細(xì)胞中的notchicd水平，而是基于腫瘤細(xì)胞中的notchicd水平。在一些實(shí)施方式中，與notchicd(例如notch1icd)水平進(jìn)行比較的參照水平或預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)是h分?jǐn)?shù)值。在一些實(shí)施方式中，參照水平是約10、約20、約30、約50或約100的h分?jǐn)?shù)。在一些實(shí)施方式中，參照水平是約30的h分?jǐn)?shù)。在一些實(shí)施方式中，h分?jǐn)?shù)來(lái)自用抗notch1icd抗體進(jìn)行的免疫組織化學(xué)測(cè)定(“notch1icdihc測(cè)定”)。在一些實(shí)施方式中，如果在notch1icdihc測(cè)定中患者腫瘤的h分?jǐn)?shù)為約30以上，則將該患者選作用抗notch1抗體或本文描述的其他抗notch治療劑治療的對(duì)象，且/或?qū)ζ溥M(jìn)行該治療。在一些此類實(shí)施方式中，將患者選作用omp-52m51或者包含omp-52m51的六個(gè)cdr和/或可變區(qū)的抗體治療的對(duì)象，且/或?qū)ζ溥M(jìn)行該治療。在一些替代性實(shí)施方式中，如果在notch1icdihc測(cè)定中患者腫瘤的h分?jǐn)?shù)為約50以上，則將該患者選作用抗notch1抗體或本文描述的其他抗notch治療劑治療的對(duì)象，且/或?qū)ζ溥M(jìn)行該治療。在一些此類實(shí)施方式中，將患者選作用omp-52m51或者包含omp-52m51的六個(gè)cdr和/或可變區(qū)的抗體治療的對(duì)象，且/或?qū)ζ溥M(jìn)行該治療。在一些替代性實(shí)施方式中，如果在notch1icdihc測(cè)定中患者腫瘤的h分?jǐn)?shù)為約100以上，則將該患者選作用抗notch1抗體或本文描述的其他抗notch治療劑(包括但不限于omp-52m51或包含omp-52m51的六個(gè)cdr和/或可變區(qū)的抗體)治療的對(duì)象，且/或?qū)ζ溥M(jìn)行該治療。iv.抗notch劑抗notch治療劑是阻斷或減少notch信號(hào)傳導(dǎo)或與notch配體的相互作用的拮抗劑。notch受體的激活依賴于配體誘導(dǎo)的蛋白水解。dsl配體的結(jié)合導(dǎo)致在ntm的胞外部分中的s2處的切割。γ-分泌酶復(fù)合物在位點(diǎn)3處進(jìn)一步切割，這引起ntm的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(icd)的釋放，使得該結(jié)構(gòu)域移位至細(xì)胞核。在細(xì)胞核中，icd形成多蛋白復(fù)合物，該復(fù)合物通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子和支架蛋白(例如mastermind樣-1-3，其募集共激活劑)結(jié)合而激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。核icd壽命短，其是破壞的靶標(biāo)，該破壞機(jī)制涉及所有notch受體共有的pest結(jié)構(gòu)域的羧基末端破壞盒。因此，抗notch治療劑可以是抑制notch激活的任何試劑，包括但不限于靶向配體結(jié)合區(qū)和lnrhd結(jié)構(gòu)域的試劑。在一些實(shí)施方式中，抗notch治療劑是抗體，例如與notch受體特異性結(jié)合的抗體(即抗notch抗體)。在一些實(shí)施方式中，所述抗體特異性地結(jié)合人notch受體。通常而言，抗notch劑通過(guò)至少攜帶激活性突變的notch受體來(lái)靶向信號(hào)傳導(dǎo)。例如，將抗notch1治療劑用于治療攜帶notch1激活性突變的患者。在另一實(shí)施方式中，抗notch劑通過(guò)icd表達(dá)水平高于預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)水平或參照水平的notch受體來(lái)靶向信號(hào)傳導(dǎo)。例如，將抗notch1治療劑用于治療具有notch1icd水平高于預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)或參照水平的腫瘤細(xì)胞的患者。在一些實(shí)施方式中，抗notch劑是γ-分泌酶的抑制劑。由于γ-分泌酶抑制劑也能夠防止notch受體激活，因此已測(cè)試了數(shù)種形式的γ-分泌酶抑制劑的抗腫瘤效應(yīng)。首先，最初的γ-分泌酶抑制劑，il-x(cbz-il-cho)，在ras轉(zhuǎn)化的成纖維細(xì)胞中顯示出具有notch1依賴性抗成瘤活性。據(jù)報(bào)道，在來(lái)自小鼠的黑素瘤和卡波西肉瘤的細(xì)胞系和/或異種移植物中，三肽γ-分泌酶抑制劑(z-leu-leu-nle-cho)抑制腫瘤生長(zhǎng)(currycl等，oncogene24:6333-44(2005))。用二肽γ-分泌酶抑制劑n-[n-(3,5-二氟苯乙?；?-l-丙氨酰基]s-苯基甘氨酸叔丁基酯(dapt)進(jìn)行的治療也在t-all動(dòng)物模型中導(dǎo)致髓母細(xì)胞瘤生長(zhǎng)的顯著減少并誘導(dǎo)g0-g1細(xì)胞周期阻滯和凋亡(o'neilj.等,blood107:781–5(2006))。另一γ-分泌酶抑制劑，二苯并氮卓，已經(jīng)顯示出在apc-/-(min)小鼠的腸道腺瘤中抑制上皮細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)杯形細(xì)胞分化(vanesjh,等,nature435:959–63(2005))。近來(lái)，由三肽γ-分泌酶抑制劑或notch3特異性小干擾rna造成的notch3功能性失活在過(guò)表達(dá)notch3的腫瘤細(xì)胞系中導(dǎo)致細(xì)胞增殖受抑制并誘導(dǎo)凋亡，但在具有最小量的notch3表達(dá)的細(xì)胞系中卻非如此(parkjt等，cancerres.,66:6312-8(2006))。此外，針對(duì)復(fù)發(fā)性或難治性t-all患者和晚期乳腺癌，notch抑制劑mk0752(由merck,whitehousestation,nj開(kāi)發(fā))的i期臨床試驗(yàn)已經(jīng)啟動(dòng)。抗notch抗體還通過(guò)與notch受體結(jié)合并阻斷其與notch配體的結(jié)合而充當(dāng)notch拮抗劑?？筺otch劑還涵蓋與notch配體特異性結(jié)合的抗體(抗notch配體抗體)。本發(fā)明的notch受體/配體抗體可以用本領(lǐng)域已知的任何常規(guī)手段制備。在一些實(shí)施方式中，抗notch抗體是單克隆抗體。單克隆抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何手段制備(goding,monoclonalantibodies:principlesandpractice,academicpress,1986)。單克隆抗體可以使用雜交瘤方法制備，例如kohler和milstein(1975)nature256:495中描述的雜交瘤方法。單克隆抗體也可以使用如美國(guó)專利第4,816,567號(hào)中描述的重組dna方法制造。所需物種的重組單克隆抗體或其片段可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)從表達(dá)所需要物種的cdr的噬菌體展示文庫(kù)中分離出(mccafferty等,nature,348:552-554(1990)；clackson等,nature,352:624-628(1991)；marks等,j.mol.biol.,222:581-597(1991))。在一些實(shí)施方式中，抗notch抗體是人源化抗體。人源化抗體是在可變區(qū)內(nèi)含有最小限度的來(lái)自非人(例如鼠類)抗體的序列的抗體。在施用給人受試對(duì)象時(shí)，治療上使用此類抗體來(lái)減少抗原性和hama(人抗小鼠抗體)響應(yīng)。人源化抗體可以使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)產(chǎn)生(jones等,nature,321:522-525(1986)；riechmann等,nature,332:323-327(1988)；verhoeyen等,science,239:1534-1536(1988))?？梢酝ㄟ^(guò)將人抗體的cdr替換成具有所需特異性、親和力和/或能力的非人抗體(例如小鼠、大鼠、兔、倉(cāng)鼠等)的cdr而使抗體人源化。人源化抗體可以通過(guò)在人可變區(qū)的框架區(qū)中和/或在所替換的非人殘基中對(duì)額外的殘基進(jìn)行替換而得到進(jìn)一步修飾，從而精煉和優(yōu)化抗體特異性、親和力和/或能力。在另外的實(shí)施方式中，抗notch抗體是完全人抗體。人抗體可以使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)制備。可以產(chǎn)生體外免疫化的或從產(chǎn)生針對(duì)靶抗原的抗體的免疫化個(gè)體分離出的永生化人b淋巴細(xì)胞(參見(jiàn)例如cole等,monoclonalantibodiesandcancertherapy,alanr.liss,77頁(yè)(1985)；boerner等,1991,j.immunol.,147(1):86-95；和美國(guó)專利第5,750,373號(hào))。另外，人抗體可以從噬菌體文庫(kù)中選擇，其中該噬菌體文庫(kù)表達(dá)人抗體(vaughan等,1996,nat.biotech.,14:309-314；sheets等,1998,proc.nat'l.acad.sci.,95:6157-6162；hoogenboom和winter,1991,j.mol.biol.,227:381；marks等,1991,j.mol.biol.,222:581)。人抗體還可以在含有人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠中制造，所述小鼠能夠在免疫化時(shí)產(chǎn)生各種各樣的人抗體而不產(chǎn)生內(nèi)源性免疫球蛋白。該方法描述于美國(guó)專利第5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425和5,661,016號(hào)中。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗notch抗體特異性地結(jié)合notch受體的配體結(jié)合區(qū)。在其他實(shí)施方式中，抗notch抗體與notch受體的不包含配體結(jié)合區(qū)的一個(gè)或多個(gè)egf樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合。在另一實(shí)施方式中，抗notch抗體與notch受體的lnr-hd負(fù)向調(diào)節(jié)區(qū)中的表位結(jié)合。在另一實(shí)施方式中，抗notch抗體阻斷了對(duì)notch受體的切割。在一些實(shí)施方式中，抗notch劑是特異性結(jié)合notch配體(包括δ-樣配體和jagged蛋白)的抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗notch劑是結(jié)合δ-樣配體4(dll4)的抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗notch劑是結(jié)合jagged1或2的抗體。在一些實(shí)施方式中，抗notch抗體是由雜交瘤產(chǎn)生的抗體，所述雜交瘤于2008年8月7日保藏于atcc，atcc保藏號(hào)為pta-9405，也稱為“鼠類52m51”。鼠類52m51抗體詳細(xì)地描述于2009年7月8日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)pct/us2009/003995(公開(kāi)號(hào)wo2010/005567)中，，本文通過(guò)援引并入其全部?jī)?nèi)容。在一些實(shí)施方式中，抗notch抗體是人源化抗notch抗體，并包含含有cdr氨基酸序列cdr1(seqidno:5)、cdr2(seqidno:6)和cdr3(seqidno:7)的重鏈可變區(qū)，和含有cdr氨基酸序列cdr1(seqidno:8)、cdr2(seqidno:9)和cdr3(seqidno:10)的輕鏈可變區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方式中，人源化抗notch抗體包含重鏈可變區(qū)序列seqidno:14和輕鏈可變區(qū)序列seqidno:18。在一些實(shí)施方式中，抗notch抗體是由質(zhì)粒編碼的omp-52m51人源化抗體，該質(zhì)粒于2008年10月15日保藏于atcc，atcc保藏號(hào)為pta-9549，也稱為“52m51h4l3”。本文中術(shù)語(yǔ)“52m51h4l3”、“omp-52m51”和“52m51”可互換使用。52m51h4l3還詳細(xì)地描述于2009年7月8日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)pct/us2009/003995(公開(kāi)號(hào)wo2010/005567)和美國(guó)專利公開(kāi)第2011/0311552號(hào)中，本文通過(guò)援引并入這兩篇的全部?jī)?nèi)容。omp-52m51包含重鏈可變區(qū)序列seqidno:14和輕鏈可變區(qū)序列seqidno:18。在一些實(shí)施方式中，抗notch抗體是與抗體omp-52m51競(jìng)爭(zhēng)與人notch1的特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方式中，抗notch抗體是由雜交瘤產(chǎn)生的抗體，所述雜交瘤于2009年7月6日保藏于atcc，atcc保藏號(hào)為pta-10170，也稱為59r5。59r5抗體還詳細(xì)地描述于2009年7月8日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)第12/499,627號(hào)(作為美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)第2010/0111958號(hào)公開(kāi))中，本文通過(guò)援引并入其全部?jī)?nèi)容?？筺otch抗體59r5包含含有cdr氨基酸序列cdr1(seqidno:23)、cdr2(seqidno:24)和cdr3(seqidno:25)的重鏈可變區(qū)，和含有cdr氨基酸序列cdr1(seqidno:26)、cdr2(seqidno:27)和cdr3(seqidno:28)的輕鏈可變區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方式中，59r5抗體包含重鏈可變區(qū)序列seqidno:30和輕鏈可變區(qū)序列seqidno:32。在一些實(shí)施方式中，抗notch抗體是與抗體59r5競(jìng)爭(zhēng)與人notch2或notch3的特異性結(jié)合的抗體。其他抗notch抗體是本領(lǐng)域已知的?？筺otch抗體可以獲自商購(gòu)來(lái)源(例如，santacruzbiotechnology,inc.目錄號(hào)sc-6014是山羊多克隆抗體，其與人notch1的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合)。在一些實(shí)施方式中，notch拮抗劑可以是描述于以下文獻(xiàn)中的抗notch抗體中的一種：2008年5月31日提交的美國(guó)專利第7,919,092號(hào)；2008年1月24日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)第12/010,421號(hào)(作為美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)第2009/0047285號(hào)公開(kāi))；2011年1月13日提交的國(guó)際申請(qǐng)pct/us2011/021135(作為國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)第wo2011/088215號(hào)公開(kāi))；2008年6月3日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)第12/156,590號(hào)(作為美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)第2009/0258026號(hào)公開(kāi))；2007年12月17日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)第11/958,099號(hào)(作為美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)第2008/0226621號(hào)公開(kāi))。v.突變的notch多肽在篩選測(cè)定中的應(yīng)用本發(fā)明的方法也具有其他應(yīng)用。例如，突變的notch多肽可用于篩選體外或體內(nèi)調(diào)節(jié)notch的表達(dá)的化合物，該化合物進(jìn)而可用于治療或預(yù)防患者的癌癥。在另一實(shí)例中，突變的notch多肽可用于監(jiān)視對(duì)癌癥治療的響應(yīng)。在一些實(shí)施方式中，本公開(kāi)內(nèi)容還涉及針對(duì)化合物的治療、檢測(cè)、分析、改善、逆轉(zhuǎn)和/或預(yù)防腫瘤形成(尤其是癌變前損傷)的能力來(lái)篩選測(cè)試化合物的新方法。具體而言，本公開(kāi)內(nèi)容提供可用于治療、改善、逆轉(zhuǎn)和/或預(yù)防腫瘤形成(包括癌變前損傷)的測(cè)試化合物的鑒定方法。可以通過(guò)將本文所述的新型的激活性notch變體暴露至化合物來(lái)測(cè)試所關(guān)注的化合物，如果化合物抑制notch變體之一，則進(jìn)一步就該化合物的抗腫瘤形成性來(lái)評(píng)價(jià)該化合物。這些化合物可以包括但不限于小分子抑制劑、核酸和抗體。一個(gè)方面包括用來(lái)鑒定可有效治療、預(yù)防和改善腫瘤形成的化合物的篩選方法，所述方法包括確定所述化合物是否抑制異種移植物模型中的notch變體腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。在相關(guān)實(shí)施方式中，可以對(duì)測(cè)試化合物的抑制表1的一種或多種突變notch多肽的能力進(jìn)行測(cè)量。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到，用來(lái)測(cè)量特定notch突變生物標(biāo)志物的活性的技術(shù)會(huì)根據(jù)突變物的功能和性質(zhì)而有所不同。可以向罹患癌癥或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)展癌癥的患者施用能夠調(diào)節(jié)表1的任何突變notch多肽的活性的測(cè)試化合物。vi.治療方法抗notch治療劑，例如γ-分泌酶抑制劑和抗notch受體/配體抗體，還可用于治療其中不受控的生長(zhǎng)與本文所述的notch受體突變相關(guān)的癌細(xì)胞。抗notch治療劑還可用于治療notchicd高于本文所述的預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)的癌細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，可將抗notch劑用于抑制腫瘤生長(zhǎng)、誘導(dǎo)分化、和/或減小腫瘤體積。另外，本發(fā)明提供了一種降低受試對(duì)象中的腫瘤的致瘤性的方法，所述方法包括向具有notch激活性突變和/或具有激活的notch的受試對(duì)象施用治療有效量的抗notch劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，腫瘤細(xì)胞包含激活性notch突變。在另一實(shí)施方式中，腫瘤細(xì)胞包含激活的notch。腫瘤細(xì)胞的notch可以通過(guò)多種機(jī)制激活。例如，腫瘤細(xì)胞的notch的激活原因可以是腫瘤細(xì)胞在notch調(diào)節(jié)因子(例如但不限于fbw7)中包含突變。在另一非限制性實(shí)例中，notch激活可緣于numb表達(dá)的喪失。在一些實(shí)施方式中，腫瘤包含癌干細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，腫瘤中的癌干細(xì)胞頻率通過(guò)施用抗notch劑而降低。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗notch治療劑可用于治療其中至少約1％、至少約2％、至少約3％、至少約5％、至少約10％、至少約25％或至少約50％的腫瘤細(xì)胞在notch受體中包含激活性突變的腫瘤。在另一實(shí)施方式中，抗notch劑可用于治療其中至少約0.1％、至少約1％、至少約2％或至少約5％的腫瘤細(xì)胞包含本發(fā)明的激活性突變的腫瘤。在另一實(shí)施方式中，抗notch治療劑可用于治療其中至少約1％、至少約2％、至少約3％、至少約5％、至少約10％、至少約25％或至少約50％的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核包含微弱、中等或強(qiáng)notchicd特異性ihc染色的腫瘤。在又一實(shí)施方式中，抗notch劑可用于治療特征在于使用本文所述的免疫組織化學(xué)染色方法時(shí)抗notchicd的h分?jǐn)?shù)為至少約10、至少約20、至少約30、至少約40、至少約50或至少約100的腫瘤。在另一實(shí)施方式中，抗notch劑可用于治療特征在于使用本文所述的免疫組織化學(xué)染色方法時(shí)抗notchicd的h分?jǐn)?shù)大于約10、大于約20、大于約30、大于約40、大于約50或大于約100的腫瘤。在一些實(shí)施方式中，用抗notch治療劑治療的癌是選自由以下癌組成的組的實(shí)體瘤：肺癌、胃腸道癌、腎癌、卵巢癌、肝癌、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎臟癌、前列腺癌、甲狀腺癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、胰腺癌、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、子宮頸癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、黑素瘤、膽道癌以及頭頸癌。在又一實(shí)施方式中，所述癌是乳腺癌。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗notch治療劑可用于治療三陰性(雌激素受體(er-)、孕激素受體(pr-)和her2(her2-))乳腺癌細(xì)胞(tnbc)。在又一實(shí)施方式中，所述癌是小細(xì)胞癌。在又一實(shí)施方式中，所述癌是小細(xì)胞肺癌、胃癌、食管癌、肝細(xì)胞癌或膽管上皮癌。在另一實(shí)施方式中，所述癌是膽道癌。在一個(gè)實(shí)施方式中，可將抗notch治療劑特別用于治療已經(jīng)進(jìn)行了某種形式的治療的患者。在另一實(shí)施方式中，抗notch劑用于治療之前進(jìn)行癌癥治療失敗的患者。失敗的癌癥治療包括但不限于化學(xué)治療、輔助治療、腫瘤輔助治療和它們的組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗notch劑用于治療具有化療抗性的腫瘤。在另一實(shí)施方式中，抗notch劑用于治療具有化療抗性的乳腺癌。在另一實(shí)施方式中，抗notch劑用于治療具有化療抗性的tnbc。在一些實(shí)施方式中，抗notch劑用于治療之前進(jìn)行癌癥治療失敗的患者的乳腺癌、小細(xì)胞肺癌、胃癌、食管癌、肝細(xì)胞癌或膽管上皮癌。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療方法包括首先測(cè)試從患者取得的含有癌細(xì)胞的生物樣品，從而確定是否存在notch受體的突變形式或這些細(xì)胞是否包含高于預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)的notchicd水平。然后，對(duì)于已證明樣品中存在突變或升高的notchicd的患者，使用干擾notch受體活性的notch抑制劑來(lái)進(jìn)行治療。施用劑量將取決于所治療的具體病況、施用途徑和本領(lǐng)域公知的臨床考慮。劑量可以逐漸增加直到檢測(cè)到有益效果，例如腫瘤生長(zhǎng)減緩。notch抑制劑然后可以以單劑量方案或多劑量方案提供，并且可以單獨(dú)給藥，或與其他治療劑聯(lián)合給藥。對(duì)突變notch受體相關(guān)的癌的治療與任何施用途徑和劑型都相容。根據(jù)所治療的具體病況，某些劑型傾向于比其他劑型更方便或更有效。例如，在治療皮膚癌時(shí)優(yōu)選局部施用，而對(duì)于實(shí)體瘤可以優(yōu)選胃腸外施用。除了胃腸外和局部制品之外，試劑還可以口服、經(jīng)口、內(nèi)部、鼻內(nèi)、直腸、陰道、舌部和透皮施用。具體的劑型包括片劑、丸劑、膠囊、粉末、氣溶膠、栓劑、皮膚貼片、胃腸外和口服液體，包括懸浮液、溶液和乳液。也可以使用持釋劑型。所有劑型都可以使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)制備(參見(jiàn)例如remington'spharmaceuticalsciences,第16版,easton,pa.(1980))。在一些實(shí)施方式中，抗notch治療劑(例如抗notch抗體)的施用可以是靜脈內(nèi)注射或靜脈內(nèi)施用。在一些實(shí)施方式中，施用為靜脈內(nèi)輸注。在一些實(shí)施方式中，抗notch劑的施用可以通過(guò)非靜脈內(nèi)途徑。抗notch抗體或其他抗notch治療劑的合適劑量取決于要治療的疾病類型、疾病的嚴(yán)重性和進(jìn)程、疾病的響應(yīng)性、施用抗體或試劑是為了治療目的還是預(yù)防目的、之前的治療、患者臨床史，等等，都由治療醫(yī)師來(lái)裁量?？贵w或試劑可以施用一次或在一系列治療中施用，所述治療持續(xù)數(shù)天至數(shù)月或直到達(dá)到治愈或?qū)崿F(xiàn)疾病狀態(tài)的縮減(例如腫瘤尺寸的減少)為止。最佳定量給藥方案可以從患者體內(nèi)的藥物累積的測(cè)量結(jié)果來(lái)計(jì)算，并且會(huì)根據(jù)個(gè)體拮抗劑的相對(duì)效力而有所不同。給藥醫(yī)師可以容易地確定最佳劑量、定量給藥方法和重復(fù)率。通常，劑量為0.01μg～100mg/千克體重，并且可每天、每周、每月或每年給藥一次或多次。治療醫(yī)師可以基于所測(cè)得的抗體或試劑在體液或組織中的停留時(shí)間和濃度來(lái)估算定量給藥的重復(fù)率。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，所用的劑量將視所要實(shí)現(xiàn)的臨床目標(biāo)而變化。在一些實(shí)施方式中，抗notch抗體的各劑量為約0.25mg/kg～約15mg/kg。在一些實(shí)施方式中，各劑量為約0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mg/kg。在一些實(shí)施方式中，各劑量為約0.5mg/kg。在一些實(shí)施方式中，各劑量為約1mg/kg。在一些實(shí)施方式中，各劑量為約2.5mg/kg。在一些實(shí)施方式中，各劑量為約5mg/kg。在一些實(shí)施方式中，各劑量為約7.5mg/kg。在一些實(shí)施方式中，各劑量為約10mg/kg。在一些實(shí)施方式中，各劑量為約12.5mg/kg。在一些實(shí)施方式中，各劑量為約15mg/kg。在一些實(shí)施方式中，使用間歇式定量給藥方案向患者施用本文描述的方法中所用的抗notch抗體或其他抗notch治療劑，該方案在某些情況下可以減少與施用所述抗notch抗體或試劑相關(guān)的副作用和/或毒性。本文所用的“間歇式定量給藥”是指使用超過(guò)每周1次的定量給藥間隔的定量給藥方案，例如每2周定量給藥一次，每3周1次，每4周1次，等等。在一些實(shí)施方式中，治療人患者的癌癥的方法包括按照間歇式定量給藥方案向患者施用有效劑量的抗notch抗體或試劑。在一些實(shí)施方式中，治療人患者的癌癥的方法包括按照間歇式定量給藥方案向患者施用有效劑量的抗notch抗體或試劑，并且增加所述抗notch抗體或試劑的治療指數(shù)。在一些實(shí)施方式中，間歇式定量給藥方案包括向患者施用起始劑量的抗notch治療劑，并且約每2周1次施用后續(xù)劑量的抗notch治療劑。在一些實(shí)施方式中，間歇式定量給藥方案包括向患者施用起始劑量的抗notch治療劑，并且約每3周1次施用后續(xù)劑量的抗notch治療劑。在一些實(shí)施方式中，間歇式定量給藥方案包括向患者施用起始劑量的抗notch治療劑，并且約每4周1次施用后續(xù)劑量的抗notch治療劑。在一些實(shí)施方式中，用于所述方法中的抗notch抗體是omp-52m51，或包含omp-52m51的6個(gè)cdr和/或可變區(qū)的抗體，并且約每3周向受試對(duì)象靜脈內(nèi)施用約0.25mg/kg～約10mg/kg的劑量的所述抗體。在一些替代性實(shí)施方式中，用于所述方法中的抗notch抗體是omp-59r5，或包含omp-59r5的6個(gè)cdr和/或可變區(qū)的抗體，并且約每2～3周向受試對(duì)象靜脈內(nèi)施用約2.5mg/kg～約7.5mg/kg(例如約2.5mg/kg、約5mg/kg,或約7.5mg/kg)的劑量的所述抗體。在一些實(shí)施方式中，除了施用例如抗notch抗體等抗notch治療劑之外，所述方法或治療還包括施用至少一種額外的治療劑或療法。額外的治療劑或療法可以在施用抗notch治療劑之前、同時(shí)和/或之后施用。在一些實(shí)施方式中，至少一種額外的治療劑或療法包括1種、2種、3種或更多種額外的治療劑或療法。具有至少兩種治療劑的聯(lián)合療法常常使用通過(guò)不同的作用機(jī)制起作用的試劑，雖然這不是必須的。施用具有不同作用機(jī)制的試劑的聯(lián)合療法可以產(chǎn)生加成或協(xié)同效應(yīng)。聯(lián)合療法可以允許使用與單一療法相比更低劑量的每種試劑，由此減少毒副作用。聯(lián)合療法可以降低發(fā)展抗性癌細(xì)胞的可能性。應(yīng)該意識(shí)到的是，抗notch治療劑與額外的治療劑或療法的組合可以以任意順序施用或同時(shí)施用。在一些實(shí)施方式中，將向之前已經(jīng)歷第二治療劑或療法治療的患者施用所述抗notch治療劑。在一些實(shí)施方式中，抗notch治療劑和第二治療劑或療法會(huì)基本上同時(shí)或同步施用。例如，可以向正在接受第二治療劑(例如化療)的受試對(duì)象施用抗notch治療劑。在一些實(shí)施方式中，在用第二治療劑治療1年內(nèi)施用抗notch治療劑。在一些替代實(shí)施方式中，在用第二治療劑進(jìn)行任何治療10、8、6、4或2個(gè)月內(nèi)施用抗notch治療劑。在某些實(shí)施方式中，在用第二治療劑進(jìn)行任何治療4、3、2或1周內(nèi)施用抗notch治療劑。在一些實(shí)施方式中，在用第二治療劑進(jìn)行任何治療5、4、3、2或1天內(nèi)施用抗notch治療劑。還應(yīng)該意識(shí)到的是，兩種(或更多種)試劑或治療可以在大約數(shù)小時(shí)或數(shù)分鐘內(nèi)(即基本上同時(shí))施用給受試對(duì)象。在一些實(shí)施方式中，使用間歇式定量給藥方案向患者施用抗notch治療劑，這在某些情況下可以減少與施用抗notch治療劑相關(guān)的副作用和/或毒性。本文所用的“間歇式定量給藥”是指使用超過(guò)每周1次的定量給藥間隔的定量給藥方案，例如每2周定量給藥一次，每3周1次，每4周1次，等等。在一些實(shí)施方式中，治療人患者的癌癥的方法包括按照間歇式定量給藥方案向患者施用有效劑量的抗notch治療劑。在一些實(shí)施方式中，治療人患者的癌癥的方法包括按照間歇式定量給藥方案向患者施用有效劑量的抗notch治療劑，并且增加所述抗notch治療劑的治療指數(shù)。在一些實(shí)施方式中，間歇式定量給藥方案包括向患者施用起始劑量的抗notch治療劑，并且約每2周1次施用后續(xù)劑量的抗notch治療劑。在一些實(shí)施方式中，間歇式定量給藥方案包括向患者施用起始劑量的抗notch治療劑，并且約每3周1次施用后續(xù)劑量的抗notch治療劑。在一些實(shí)施方式中，間歇式定量給藥方案包括向患者施用起始劑量的抗notch治療劑，并且約每4周1次施用后續(xù)劑量的抗notch治療劑。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，所用的劑量將視所要實(shí)現(xiàn)的臨床目標(biāo)而變化。在一些實(shí)施方式中，抗notch抗體的各劑量為約0.25mg/kg～約15mg/kg。在一些實(shí)施方式中，各劑量為約0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mg/kg。在一些實(shí)施方式中，各劑量為約0.5mg/kg。在一些實(shí)施方式中，各劑量為約1mg/kg。在一些實(shí)施方式中，各劑量為約2.5mg/kg。在一些實(shí)施方式中，各劑量為約5mg/kg。在一些實(shí)施方式中，各劑量為約7.5mg/kg。在一些實(shí)施方式中，各劑量為約10mg/kg。在一些實(shí)施方式中，各劑量為約12.5mg/kg。在一些實(shí)施方式中，各劑量為約15mg/kg。用于治療癌癥的治療劑包括但不限于：抗生素，例如柔紅霉素、多柔比星、米托蒽醌和伊達(dá)比星；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，例如依托泊甙、替尼泊苷和托泊替康；dna合成抑制劑，例如卡鉑；dna損傷劑，例如環(huán)磷酰胺、苯達(dá)莫司汀、苯丁酸氮芥、丙卡巴肼、達(dá)卡巴嗪和異環(huán)磷酰胺；細(xì)胞毒素酶，例如天冬酰胺酶和培門冬酶；酪氨酸激酶抑制劑，例如甲磺酸伊馬替尼、達(dá)沙替尼、普納替尼(ponatinib)和尼洛替尼；抗代謝藥，例如阿扎胞苷、氯法拉濱、阿糖胞苷、克拉屈濱、氟達(dá)拉濱、羥基脲、巰嘌呤、甲氨蝶呤、硫鳥(niǎo)嘌呤、普拉曲沙和奈拉濱；合成激素，例如潑尼松、潑尼松龍和地塞米松；抗有絲分裂劑，例如長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春堿；單克隆抗體，例如利妥昔單抗(如rituxan)、阿侖珠單抗、奧法木單抗(ofatumumab)；放射性免疫治療劑，例如碘i131托西莫單抗(如bexxar)或替伊莫單抗(如zevalin)；mtor抑制劑，例如替西羅莫司；組蛋白去乙?；敢种苿?，例如伏立諾他(vorinostat)和羅米地辛(romidepsin)；造血干細(xì)胞動(dòng)員劑，例如普樂(lè)沙福；細(xì)胞毒性重組蛋白，例如地尼白介素-2(denileukindifitox)；蛋白質(zhì)合成抑制劑，例如高三尖杉酯堿(omacetaxine)；免疫調(diào)節(jié)藥，例如沙立度胺和來(lái)那度胺；細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，例如夫拉平度(flavopiridol)；和蛋白酶體抑制劑，例如硼替佐米(如velcade)，以及它們的組合?？梢耘c抗notch治療劑聯(lián)合施用的治療劑包括上述名稱的治療劑以及其他化療劑。因此，在一些實(shí)施方式中，所述方法或治療包括聯(lián)合施用抗notch治療劑和化療劑或者多種不同的化療劑的混合物。用抗notch治療劑進(jìn)行的治療可以在施用化療劑之前、同時(shí)或之后發(fā)生。聯(lián)合施用可以包括共施用(以單藥物制劑形式或使用多種單獨(dú)的制劑)或者任意順序的連續(xù)施用，但連續(xù)施用通常是在一定時(shí)間段內(nèi)，從而使所有活性劑都能夠同時(shí)發(fā)揮其生物活性。此類化療劑的制備和定量給藥方案可以根據(jù)制造商的說(shuō)明來(lái)獲得，或者由有熟練的從業(yè)者根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。此類化學(xué)療法中的制備和定量給藥方案還描述于chemotherapyserviceeditorm.c.perry,williams&wilkins,baltimore,md(1992)中。可用于本發(fā)明的化療劑包括但不限于：烷基化劑，例如噻替派和環(huán)磷酰胺；烷基磺酸鹽，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，例如苯佐替派、卡波醌、美妥替哌和烏瑞替哌；乙烯亞胺類和甲基蜜胺類(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、三乙烯蜜胺、三乙烯磷酰胺、三乙烯硫代磷酰胺和三羥甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥類，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯代磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥、異環(huán)磷酰胺、氮芥、鹽酸氧化氮芥、美法侖、新氮芥、苯芥膽甾醇、潑尼氮芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亞硝基脲類，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，例如阿克拉霉素、放線菌素、安曲霉素、重氮絲氨酸、博萊霉素、放線菌素c、加利車霉素、卡拉比星(carabicin)、洋紅霉素、嗜癌霉素、色霉素、放線菌素d、柔紅霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-l-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊達(dá)比星、麻西羅霉素、絲裂霉素、霉酚酸、諾加霉素、橄欖霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑霉素、鏈脲菌素、殺結(jié)核菌素、烏苯美司、凈司他丁、佐柔比星；抗代謝藥，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-fu)；葉酸類似物，例如二甲葉酸、甲氨蝶呤、蝶羅呤、三甲曲沙；嘌呤類似物，例如氟達(dá)拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥(niǎo)嘌呤；嘧啶類似物例如安西他濱、阿扎胞苷、6-阿扎尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、雙脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷、5-fu；雄激素類，例如卡魯睪酮、丙酸屈他雄酮、環(huán)硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)酯；抗腎上腺藥(anti-adrenals)，例如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補(bǔ)充劑，例如亞葉酸；醋葡醛內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依達(dá)曲沙；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；elfornithine；依利醋銨；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達(dá)明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達(dá)醇；硝氨丙吖啶；噴司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基肼；丙卡巴肼；psk；丙亞胺；西佐非蘭；鍺螺胺；替奴佐酸；三亞胺醌；2,2′,2″-三氯三乙胺；烏拉坦；長(zhǎng)春地辛；達(dá)卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(ara-c)；紫杉烷類，例如紫杉醇和多西他賽；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫鳥(niǎo)嘌呤；巰嘌呤；鉑類似物，例如順鉑和卡鉑；長(zhǎng)春堿；鉑；依托泊苷；異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素c；米托蒽醌；長(zhǎng)春新堿；長(zhǎng)春瑞濱；諾維本；諾消靈；替尼泊苷；道諾霉素；氨喋呤；希羅達(dá)；伊班膦酸鹽；cpt-11；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑rfs2000；二氟甲基鳥(niǎo)氨酸；視黃酸；埃斯波霉素；卡培他濱；以及上述任一種的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物?；焺┻€包括用于調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì)腫瘤的作用的抗激素劑，例如抗雌激素劑，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬、易維特(keoxifene)、ly117018、奧那司酮和托瑞米芬(fareston)；以及抗雄激素劑，例如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述任一種的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。在一些實(shí)施方式中，所述化療劑是拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑。拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑是干擾拓?fù)洚悩?gòu)酶(例如拓?fù)洚悩?gòu)酶i或ii)的作用的化療劑。拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑包括但不限于鹽酸多柔比星、檸檬酸柔紅霉素、鹽酸米托蒽醌、放射菌素d、依托泊苷、鹽酸托泊替康、替尼泊苷和伊立替康，以及這些中任一種的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。在一些實(shí)施方式中，所述化療劑是抗代謝藥?？勾x藥是結(jié)構(gòu)與正常生化反應(yīng)所需的代謝物類似的化學(xué)物質(zhì)，但是其區(qū)別足以干擾細(xì)胞的一種或多種正常功能，例如細(xì)胞分裂?？勾x藥包括，但不限于，吉西他濱、氟尿嘧啶、卡培他濱、甲氨蝶呤鈉、雷替曲塞(ralitrexed)、培美曲塞、喃氟啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷、硫鳥(niǎo)嘌呤、5-氮胞苷、6-巰基嘌呤、硫唑嘌呤、6-硫鳥(niǎo)嘌呤、噴司他丁、磷酸氟達(dá)拉濱和克拉屈濱，以及這些中任何一種的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。在一些實(shí)施方式中，所述化療劑是抗有絲分裂劑，包括但不限于結(jié)合微管蛋白的試劑。在一些實(shí)施方式中，所述試劑是紫杉烷。在一些實(shí)施方式中，所述試劑是紫杉醇或多西他賽，或紫杉醇或多西他賽的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。在一些替代實(shí)施方式中，抗有絲分裂劑包括長(zhǎng)春花生物堿，例如長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春瑞濱或長(zhǎng)春地辛，或其藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。在一些實(shí)施方式中，治療包括聯(lián)合施用本發(fā)明所述的抗notch治療劑和放射療法。用抗notch治療劑進(jìn)行的治療可以在施用放射療法之前、同時(shí)或之后發(fā)生。此類放射療法的劑量方案可由熟練的醫(yī)學(xué)從業(yè)者來(lái)確定。在一些實(shí)施方式中，在放射治療之后施用抗notch抗體或其他抗notch治療劑。在一些實(shí)施方式中，與放射療法一起施用抗notch抗體或其他抗notch治療劑。在一些實(shí)施方式中，第二治療劑包括抗體。因此，治療可以包括聯(lián)合施用本發(fā)明的抗notch治療劑與針對(duì)另外的腫瘤相關(guān)抗原的其他抗體(包括包括但不限于結(jié)合egfr、erbb2、dll4或nf-κb的抗體)。示例性的抗dll4抗體描述于例如美國(guó)專利第7,750,124號(hào)中。另外的抗dll4抗體描述于例如國(guó)際專利公開(kāi)wo2008/091222和wo2008/0793326以及美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)第2008/0014196、2008/0175847、2008/0181899和2008/0107648中。聯(lián)合施用可以包括共施用(以單藥物制劑形式或使用多種單獨(dú)的制劑)或者任意順序的連續(xù)施用，但連續(xù)施用通常是在一定時(shí)間段內(nèi)，從而使所有活性劑都能夠同時(shí)發(fā)揮其生物活性。此外，用本文描述的抗notch治療劑進(jìn)行的治療可以包括與一種或多種細(xì)胞因子(例如，淋巴因子、白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子和/或生長(zhǎng)因子)的聯(lián)合治療，或可以伴隨有手術(shù)摘除腫瘤、癌細(xì)胞或治療醫(yī)師認(rèn)為必需的其他任何療法。vii.試劑盒還提供了用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒。“試劑盒”是指包含至少一種用于特異性地檢測(cè)本發(fā)明的突變notch受體或特異性地檢測(cè)notchicd的試劑(例如抗體、核酸探針等)的任何制品(例如包裝物或容器)。試劑盒可以作為用來(lái)實(shí)施本發(fā)明的方法的套件來(lái)促銷、分售或銷售。另外，試劑盒可以含有描述試劑盒并且包含其使用說(shuō)明資料的藥品說(shuō)明書(shū)。在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒。此類試劑盒與手動(dòng)篩選和自動(dòng)化篩選都兼容。為了進(jìn)行免疫測(cè)定分析，試劑盒包含至少一種針對(duì)突變notch受體的抗體或至少一種針對(duì)notchicd的抗體，以及用于檢測(cè)與突變的notch受體或notchicd結(jié)合的抗體的化學(xué)品。在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，可以使用任何檢測(cè)抗原-抗體結(jié)合的化學(xué)品。在一些實(shí)施方式中，檢測(cè)用化學(xué)品包括與二抗綴合的帶標(biāo)記的聚合物。例如，可以提供與催化抗原-抗體結(jié)合部位處的色素原沉積的酶綴合的二抗。此類酶以及將它們用于檢測(cè)抗體結(jié)合的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。在一個(gè)實(shí)施方式中，試劑盒包括與帶hrp標(biāo)記的聚合物綴合的二抗。還可以提供與所綴合的酶相容的色素原(例如在帶hrp標(biāo)記的二抗的情況下為dab)和與溶液相容的色素原(例如過(guò)氧化氫)，以封閉非特異性染色。本發(fā)明的試劑盒還可以包含過(guò)氧化物酶阻斷劑(例如過(guò)氧化氫)和蛋白質(zhì)阻斷劑(例如純化的酪蛋白)。另外，所述試劑盒可以包含用于使用微陣列實(shí)施本發(fā)明方法的試劑(例如在固相載體上的微珠)或用于通過(guò)核酸擴(kuò)增來(lái)實(shí)施本發(fā)明方法的試劑(包括寡核苷酸引物和dna聚合酶)。試劑盒中可以包括陽(yáng)性和/或陰性對(duì)照來(lái)驗(yàn)證按照本發(fā)明使用的試劑的活性和正確使用。對(duì)照可以包括：已知對(duì)所關(guān)注的notch突變或notchicd的存在呈陽(yáng)性或陰性的樣品，例如組織切片、固定在載玻片上的細(xì)胞等；或包含突變的notch受體或notchicd的其他樣品。對(duì)照的設(shè)計(jì)和使用是標(biāo)準(zhǔn)的，并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)能力。還應(yīng)意識(shí)到的是，本發(fā)明方法中的任何步驟或所有步驟都可以由人實(shí)施或以自動(dòng)化方式進(jìn)行。因此，身體樣品的制備、樣品染色和notch突變或notchicd的檢測(cè)的步驟可以是自動(dòng)化的。本公開(kāi)內(nèi)容的實(shí)施方式可以參照以下實(shí)施例進(jìn)一步得到限定。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，無(wú)需背離本發(fā)明的范圍即可實(shí)施對(duì)材料和方法的許多改進(jìn)。實(shí)施例實(shí)施例1：omp-b40和omp-b37notch突變的鑒定采集源自人原發(fā)性腫瘤的低傳代異種移植物腫瘤，切碎并使用膠原酶和胰蛋白酶在之前所述的hbss培養(yǎng)基中消化(dylla等，plosone.2008,36:e2428)。為了消除(deplete)小鼠細(xì)胞，將新制備的單細(xì)胞與生物素化的抗小鼠h-2kd(克隆sf1-1.1,biolegend)和抗小鼠cd45(30-f11,biolegend)一起在冰上溫育。用facs緩沖液facs緩沖液(1×漢克氏緩沖鹽水溶液(hbss)、2％熱失活胎牛血清和25mmhepesph7.4)洗滌2次以除去未結(jié)合的抗體。然后向單懸浮液中添加抗生蛋白鏈菌素磁珠(88817；pierce)并在4℃溫育。收集未結(jié)合的人腫瘤細(xì)胞，并使用bioneeraccuprep基因組dna提取試劑盒(bioneerca)從純化的腫瘤細(xì)胞中提取總基因組dna。使用qiagenrepli-g全基因組擴(kuò)增試劑盒按照制造商的操作規(guī)程(qiagenca)將dna擴(kuò)增和純化。使用3730xldna測(cè)序儀(appliedbiosystems)進(jìn)行對(duì)notch1的外顯子26(432nt)、32(148nt)和34(1488nt)以及notch3的外顯子33(1053nt)的測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與notch1(nm_017617.3)、notch2(nm_024408.2)和notch3(nm_000435.2)的refseq核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)。使用mutationsurveyor(softgeneticspa)和sequencher(genecodsmi)軟件來(lái)鑒定突變。在人notch1基因中，經(jīng)鑒定，omp-b40突變?cè)趏mp-b40-p2乳腺腫瘤中是7279核苷酸位點(diǎn)處的鳥(niǎo)嘌呤(g)雜合性缺失(refseqnm_017617.3)(圖1a)。omp-b40-p2乳腺腫瘤是來(lái)自化療治療后癌癥仍進(jìn)展的患者的最小限度傳代的乳腺腫瘤樣品。該乳腺腫瘤是三陰性的，并且是小細(xì)胞型乳腺腫瘤。在所分析樣品中，還鑒定出在4735位核苷酸處的tgg的多態(tài)性雜合性插入，認(rèn)為其不具有功能顯著性。上述g缺失引起notch1的pest結(jié)構(gòu)域中的閱讀框移碼(g2427fs)。pest結(jié)構(gòu)域的移碼突變可以使notch1的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(icd)穩(wěn)定并導(dǎo)致notch途徑的激活。在人notch3基因中，經(jīng)鑒定，omp-b37突變?cè)趏mp-b37-p2乳腺腫瘤中是6622核苷酸位點(diǎn)處的胞嘧啶(c)純合性插入(nm_000435.2)，這引起pest結(jié)構(gòu)域的2208位氨基酸處的閱讀框移碼(p2208fs)(圖1b)。omp-b37-p2乳腺腫瘤是最小限度傳代的三陰性乳腺腫瘤樣品。pest結(jié)構(gòu)域的移碼突變可以使notch3的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(icd)穩(wěn)定并由此導(dǎo)致該腫瘤中notch途徑的功能獲得性激活。為了分析蛋白的表達(dá)和定位，用對(duì)照載體、notch1.icd表達(dá)質(zhì)粒、notch2.icd表達(dá)質(zhì)粒、notch3.icd表達(dá)質(zhì)粒、notch1.全長(zhǎng)(fl)表達(dá)質(zhì)?；騨otch3.fl表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞。經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和異種移植物腫瘤的細(xì)胞核組分和細(xì)胞質(zhì)組分使用ne-per細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)提取試劑盒(thermoscientific)來(lái)制備，在4-12％tris-甘氨酸凝膠上分離，并轉(zhuǎn)移至pvdf膜。每個(gè)泳道加載100μg總蛋白。分別用notch1肽(vllsrkrrrqhgqlw；seqidno:36)和notch3肽(vmvarrkrehstlw；seqidno:37)使兔免疫化以產(chǎn)生針對(duì)切下的notch1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(icd)和notch3icd的抗體。蛋白質(zhì)印跡物用兔抗notch1.icd抗體(60ng/ml)、抗notch3.icd抗體(400ng/ml)、抗總notch1抗體(cellsignalingtechnology,1:1000)、抗總notch3抗體(cellsignalingtechnology,1:1000)和抗β-肌動(dòng)蛋白抗體(sigma-aldrich,1:5000)探測(cè)，然后用hrp綴合的抗兔二抗或hrp綴合的抗小鼠二抗(cellsignalingtechnology,1:3000)探測(cè)。如圖2所示，抗notch1.icd抗體針對(duì)切下的notch1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(notch1.icd)特異性地反應(yīng)，并且檢測(cè)出在omp-b40異種移植物腫瘤的細(xì)胞核組分中的截短的切下的notch1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(圖2a)。圖2b顯示抗notch3.icd抗體針對(duì)切下的notch3.icd特異性地反應(yīng)，并且檢測(cè)出在omp-b37異種移植物腫瘤的細(xì)胞核組分中的截短的切下的notch3.icd。圖2c顯示出截短的notch1icd和截短的notch3icd主要見(jiàn)于omp-b40和omp-b37異種移植物腫瘤的細(xì)胞核組分中。這兩種腫瘤系分別攜帶notch1和notch3的pest結(jié)構(gòu)域的突變。在攜帶野生型notch1的omp-c31和omp-ov38異種移植物腫瘤中，未檢測(cè)到細(xì)胞核notch1icd和notch3icd，但omp-c31在notch3基因中含有6172insc(het)[p2033fs]突變，該突變不認(rèn)為是激活性突變(數(shù)據(jù)未示出)。實(shí)施例2：omp-b40腫瘤中notch1拮抗劑的活性將b40p3腫瘤細(xì)胞皮下注射至6～7周齡雌性nod/scid小鼠的左肋中(300,000個(gè)細(xì)胞/小鼠)。每周監(jiān)視小鼠，使腫瘤生長(zhǎng)，直到腫瘤達(dá)到約140mm3(注射后78天)。將小鼠隨機(jī)分成5個(gè)治療組，并用對(duì)照抗體或不同劑量(0.3mg/kg,1mg/kg,3mg/kg,10mg/kg)的omp-52m51人源化抗notch1抗體進(jìn)行治療。每周兩次腹膜內(nèi)給藥該抗體。每周一次通過(guò)卡尺測(cè)量來(lái)監(jiān)視腫瘤生長(zhǎng)。在所測(cè)試的所有劑量下，omp-52m51治療都導(dǎo)致了腫瘤體積相對(duì)于對(duì)照的減小(圖3a)。將解離的omp-b40p3腫瘤細(xì)胞重懸浮于注射介質(zhì)(含有100ng/mlvegf和100ng/mlbfgf的pbs以及0.5x基質(zhì)膠)中，并皮下注射至6～7周齡雌性nod/scid小鼠的左肋中(300,000個(gè)細(xì)胞/小鼠)。每周監(jiān)視小鼠，使腫瘤生長(zhǎng)，直到腫瘤達(dá)到約140mm3(注射后78天)。將小鼠隨機(jī)分成4個(gè)治療組(n＝10只小鼠/組)，并用對(duì)照抗體、抗notch1抗體omp-52m51、紫杉醇或者omp-52m51與紫杉醇的組合來(lái)進(jìn)行治療。每周兩次以15mg/kg的劑量腹膜內(nèi)施用抗體，每周1次以20mg/kg的劑量施用紫杉醇。每周一次通過(guò)卡尺測(cè)量來(lái)監(jiān)視腫瘤生長(zhǎng)。紫杉醇和omp-52m51治療組導(dǎo)致了與對(duì)照相比57.3％(p<0.03)和21.8％(p<0.0001)的腫瘤體積減少，而紫杉醇+52m51組合治療的小鼠與對(duì)照相比顯示出了18.4％(p<0.0001)的腫瘤體積減少，與單獨(dú)的紫杉醇相比顯示出了32.1％(p<0.03)的減少(圖3b)。如以下實(shí)施例7中所述，通過(guò)ihc測(cè)定檢測(cè)到omp-52m51治療組還顯示出notch1.icd的減少(圖3c和d)。omp-52m51在b40腫瘤模型中展示出的抗腫瘤活性水平是令人驚奇的高活性水平。還在omp-b40腫瘤中分析了notch1治療對(duì)癌干細(xì)胞頻率的影響。用對(duì)照mab或omp-52m51(15mg/kg，每周兩次)治療o(wú)mp-b40乳腺腫瘤，將omp-b40乳腺腫瘤分離、解離成單細(xì)胞，并通過(guò)用抗小鼠抗體進(jìn)行陰性選擇來(lái)純化異種移植物中的人腫瘤細(xì)胞。將來(lái)自經(jīng)對(duì)照和omp-52m51治療的腫瘤的1000個(gè)腫瘤細(xì)胞各自注射到10只小鼠中。在不進(jìn)行進(jìn)一步治療的情況下使腫瘤生長(zhǎng)92天。圖4示出了對(duì)照組(黑色方塊)和omp-52m51組(灰色圓形)在第92天的腫瘤體積。在注射了用對(duì)照抗體治療過(guò)的細(xì)胞的10只小鼠中，每一只都出現(xiàn)了omp-b40腫瘤生長(zhǎng)；而在注射了預(yù)先用omp-52m51治療過(guò)的細(xì)胞的10只小鼠中，僅有2只在第92天產(chǎn)生了可檢出的腫瘤生長(zhǎng)，這表明omp-52m51治療減少了細(xì)胞的后續(xù)致瘤性。實(shí)施例3：notch3拮抗劑在omp-b37腫瘤中的活性將解離的譜系消減omp-b37p4腫瘤細(xì)胞重懸浮于注射介質(zhì)(pbs和0.5x基質(zhì)膠)中，并皮下注射至6～7周齡雌性nod/scid小鼠的右肋中(27,000個(gè)細(xì)胞/小鼠)。每周監(jiān)視小鼠，使腫瘤生長(zhǎng)，直到腫瘤為約80mm3(注射后49天)。將小鼠隨機(jī)分成兩個(gè)治療組(n＝11只小鼠/組)，并用15mg/kg對(duì)照抗體或20mg/kg59r5抗notch2/3抗體每周給藥一次(圖5)。每周一次通過(guò)卡尺測(cè)量來(lái)監(jiān)視腫瘤生長(zhǎng)。治療5周后，在經(jīng)59r5治療的組中看到腫瘤體積減少56.6％(p<0.003)。紫杉醇與抗notch2/3的組合在omp-b37乳腺腫瘤中的活性。向omp-b37異種移植物小鼠施用抗notch2/3抗體59r5、紫杉醇或59r5與紫杉醇的組合。最初，將b37p2腫瘤細(xì)胞皮下注射至6～7周齡雌性nod/scid小鼠的右肋中。每周監(jiān)視小鼠，使腫瘤生長(zhǎng)，直到腫瘤為約80mm3。然后向小鼠施用對(duì)照抗體、59r5抗notch2/3抗體、紫杉醇、或者59r5抗notch2/3抗體與紫杉醇的組合(圖6)。每周一次通過(guò)卡尺測(cè)量來(lái)監(jiān)視腫瘤生長(zhǎng)。單獨(dú)的或與紫杉醇組合的59r5都極大地減少了異種移植動(dòng)物中的腫瘤體積(圖6a)。59r5治療還增加了e-鈣黏蛋白的表達(dá)，表明上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(emt)的逆轉(zhuǎn)(圖6b)。實(shí)施例4：omp-c31突變的鑒定采集源自人原發(fā)性結(jié)直腸腫瘤的低傳代(p-2)omp-c31異種移植物腫瘤，切碎并使用膠原酶和胰蛋白酶在之前所述的hbss培養(yǎng)基中消化(dylla等plosone.2008,36:e2428)。為了消除小鼠細(xì)胞，將新制備的單細(xì)胞與生物素化的抗小鼠h-2kd(克隆sf1-1.1,biolegend,ca)和抗小鼠cd45(30-f11,biolegend,ca)一起在冰上溫育。用facs緩沖液facs緩沖液(1×漢克氏緩沖鹽水溶液(hbss)、2％熱失活胎牛血清和25mmhepesph7.4)洗滌2次除去未結(jié)合的抗體。然后向單懸浮液中添加dynabeads@抗生蛋白鏈菌素磁珠(invitrogen,ca)并在4℃溫育。收集未結(jié)合的人腫瘤細(xì)胞，并使用bioneeraccuprep基因組dna提取試劑盒(bioneerca)從純化的腫瘤細(xì)胞中提取總基因組dna。使用qiagenrepli-g全基因組擴(kuò)增試劑盒按照制造商的操作規(guī)程(qiagenca)將dna擴(kuò)增和純化。在abi3730xldna分析儀(appliedbiosystems,ca)中進(jìn)行人notch3外顯子25、外顯子26和外顯子33(1053nt)的測(cè)序。使用正向和反向引物對(duì)約500bp的擴(kuò)增子進(jìn)行了測(cè)序。用sequencherv4.10(genecodes,mi)將測(cè)序結(jié)果與notch3refseq核苷酸序列(nm_000435.2)進(jìn)行比對(duì)。使用mutationsurveyor(softgenetics,pa)鑒定突變/indels，并在sequencher軟件中手動(dòng)檢查。在omp-c31-p2結(jié)直腸腫瘤中，在人notch3基因的6096位核苷酸處鑒定出胞嘧啶(c)的雜合性突變/插入(nm_000435.2)，這導(dǎo)致ank結(jié)構(gòu)域中2033位氨基酸處的閱讀框移碼(p2033fs)(圖7a)。該移碼突變是導(dǎo)致notch3icn穩(wěn)定性增加的激活性突變。實(shí)施例5：肺_01246突變的鑒定從120個(gè)人乳腺腫瘤中獲得總dna樣品，并使用qiagenrepli-g全基因組擴(kuò)增試劑盒按照制造商的操作規(guī)程(qiagenca)將dna擴(kuò)增和純化。在abi3730xldna分析儀(appliedbiosystems,ca)中進(jìn)行notch1外顯子26(432nt)和外顯子34(1488nt)的測(cè)序。使用正向和反向引物對(duì)約500bp的擴(kuò)增子進(jìn)行了測(cè)序。用sequencherv4.10(genecodes,mi)將測(cè)序結(jié)果與notch1refseq序列(nm_017617.3)進(jìn)行比對(duì)。使用mutationsurveyor(softgenetics,pa)鑒定突變/indels，并在sequencher軟件中手動(dòng)檢查。為了檢測(cè)腫瘤樣品中腫瘤細(xì)胞的小亞類中可能存在的突變，使用illuminahiseq2000對(duì)notch1外顯子26和34進(jìn)行了靶向測(cè)序。簡(jiǎn)言之，使用在5'末端設(shè)計(jì)有獨(dú)特條形碼(barcode)的特異性pcr引物對(duì)兩個(gè)notch1外顯子的基因組區(qū)進(jìn)行pcr擴(kuò)增。在對(duì)樣品進(jìn)行qiagenpcr純化試劑盒凈化(clean-up)后，合并pcr產(chǎn)物，并根據(jù)illumina操作規(guī)程(illumina,ca)使用條形碼化的適配子(adaptor)構(gòu)建雙末端文庫(kù)。在illuminahiseq2000上進(jìn)行100bp的雙末端測(cè)序。產(chǎn)生序列數(shù)據(jù)后，用fastqc程序(babrahaminstitute,uk)評(píng)估數(shù)據(jù)品質(zhì)。使用burrows-wheeleralignment(bwa)將序列讀數(shù)與ucsc人基因組hg19組件匹配。除去重復(fù)讀數(shù)后，用samtools(li等2009,bioinformatics,25:2078)和varscan(koboldt等2009,bioinformatics,25:2283)或gatk(mckenna等2010,genomeres,20:1297)來(lái)識(shí)別(call)核苷酸變化，并通過(guò)annovar(wang等2010,nucleicacidsresearch,38:e164)進(jìn)行注釋。在一個(gè)肺腫瘤(肺_01246)中鑒定出雜合性錯(cuò)義突變g6733a(p.g2245r,nm_000435.2)(圖7b)。該突變位于notch1tad結(jié)構(gòu)域中。該突變?cè)趖細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞性白血病中報(bào)道過(guò)(gutierrez等2009,blood,114:647)。通過(guò)illuminahiseq2000靶向測(cè)序，還在來(lái)自integrativegenomicsviewer(igv)的反義編碼鏈中鑒定出了該錯(cuò)義突變(c->t)。實(shí)施例6：乳腺_h12932t突變的鑒定從80個(gè)人乳腺腫瘤中獲得總dna樣品，并使用qiagenrepli-g全基因組擴(kuò)增試劑盒按照制造商的操作規(guī)程(qiagenca)將dna擴(kuò)增和純化。在abi3730xldna分析儀(appliedbiosystems,ca)中進(jìn)行notch1外顯子26(432nt)和外顯子34(1488nt)的測(cè)序。使用正向和反向引物對(duì)約500bp的擴(kuò)增子進(jìn)行了測(cè)序。用sequencherv4.10(genecodes,mi)將測(cè)序結(jié)果與notch1refseq序列(nm_017617.3)進(jìn)行比對(duì)。使用mutationsurveyor(softgenetics,pa)鑒定突變/indels，并在sequencher軟件中手動(dòng)檢查。為了檢測(cè)腫瘤樣品中腫瘤細(xì)胞的小亞類中可能存在的突變，使用illuminahiseq2000對(duì)notch1外顯子26和34進(jìn)行了靶向測(cè)序。簡(jiǎn)言之，使用在5'末端設(shè)計(jì)有獨(dú)特條形碼的特異性pcr引物對(duì)兩個(gè)notch1外顯子的基因組區(qū)進(jìn)行pcr擴(kuò)增。在對(duì)樣品進(jìn)行qiagenpcr純化試劑盒凈化后，合并pcr產(chǎn)物，并根據(jù)illumina標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(illumina,ca)使用條形碼化的適配子構(gòu)建雙末端文庫(kù)。在illuminahiseq2000上進(jìn)行100bp的雙末端測(cè)序。產(chǎn)生序列數(shù)據(jù)后，用fastqc程序(babrahaminstitute,uk)評(píng)估數(shù)據(jù)品質(zhì)。使用burrows-wheeleralignment(bwa)將序列讀數(shù)與ucsc人基因組hg19組件匹配。除去重復(fù)讀數(shù)后，用samtools(li等2009,bioinformatics,25:2078)和varscan(koboldt等2009,bioinformatics,25:2283)或gatk(mckenna等2010,genomeres,20:1297)來(lái)識(shí)別核苷酸變化，并通過(guò)annovar(wang等2010,nucleicacidsresearch,38:e164)進(jìn)行注釋。在一個(gè)乳腺腫瘤中鑒定出雜合性錯(cuò)義突變g6788a(p.r2263q,nm_000435.2)(圖7c)。該突變位于notch1tad結(jié)構(gòu)域中。通過(guò)illuminahiseq2000靶向測(cè)序，還在來(lái)自integrativegenomicsviewer(igv)的反義編碼鏈中鑒定出了該錯(cuò)義突變(c->t)。實(shí)施例7：激活的notch1的免疫組織化學(xué)開(kāi)發(fā)了經(jīng)親和純化的notch1.icd(n1.icd)兔多克隆抗體，其結(jié)合notch1的切割位點(diǎn)，并特異性地檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)的激活的notch1。使用標(biāo)準(zhǔn)ihc操作規(guī)程的酪胺化物信號(hào)擴(kuò)增(tsa)改進(jìn)技術(shù)來(lái)進(jìn)行notch1.icd免疫組織化學(xué)(ihc)染色。將載玻片脫蠟，復(fù)水，然后在biocaredecloaker臺(tái)式壓力鍋中在熱和壓力下于dakotrs溶液(dako#s1699)中進(jìn)行抗原修復(fù)。用磷酸鹽緩沖鹽水中的6％h2o2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，然后施加蛋白質(zhì)封閉(casblock,invitrogen#008120)。在4℃以合適的稀釋度將一抗溫育過(guò)夜。然后將切片與dako兔hrp聚合物(dako#k4011)一起溫育，再與經(jīng)fitc標(biāo)記的tsa底物(perkinelmer#nel701001kt)一起溫育。然后用hrp-綴合的抗fitc抗體(rockland#rl700-103-096)檢測(cè)fitc，并添加dab底物(dako#k3468)以使抗體-檢測(cè)復(fù)合物可視化。如實(shí)施例2所述，皮下注射30萬(wàn)個(gè)omp-b40腫瘤細(xì)胞，并使其生長(zhǎng)至平均體積為150mm3。此時(shí)，即研究開(kāi)始后78天，將小鼠隨機(jī)分組并開(kāi)始治療。小鼠每周兩次接受15mg/kg的對(duì)照抗體或15mg/kg的omp-52m51人源化抗體，并且每周使用20mg/kg紫杉醇或不使用紫杉醇，所有施用都通過(guò)腹膜內(nèi)注射。平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，每組10只動(dòng)物。單獨(dú)的或與紫杉醇組合的52m51都極大地減少了異種移植物動(dòng)物中的腫瘤體積(圖3b)。從使用或不使用紫杉醇的經(jīng)對(duì)照和omp-52m51治療的小鼠中采集omp-b40腫瘤。對(duì)來(lái)自omp-b40的腫瘤進(jìn)行ihc分析，從而使用特異性識(shí)別notch1-icd的兔多克隆抗體檢測(cè)notch1的激活形式。omp-52m51和“omp-52m51+紫杉醇”阻斷了細(xì)胞核中的notch-icd累積(圖3d)。因此，notch1-icdihc測(cè)定充當(dāng)omp-52m51的關(guān)鍵生物標(biāo)志，并且可用于監(jiān)視腫瘤組織中的藥效動(dòng)力學(xué)響應(yīng)和notch途徑的活性。實(shí)施例8：通過(guò)免疫組織化學(xué)對(duì)激活的notch1進(jìn)行細(xì)胞核定位使用檢測(cè)激活形式的notch1受體的notch1-icd測(cè)定來(lái)篩選一組腫瘤。在omp-b40乳腺腫瘤、omp-lu61肺腫瘤、omp-c63結(jié)腸腫瘤和omp-lu33肺腫瘤中檢測(cè)到了notch1-icd(圖8)。omp-lu61和omp-c63不具有已知的notch1突變。ihc是定量的，并以h分?jǐn)?shù)報(bào)告。h分?jǐn)?shù)＝(3×(％3+細(xì)胞核))+(2×(％2+細(xì)胞核))+(1×(％1+細(xì)胞核))。圖9顯示了實(shí)體瘤(包括食管癌樣品)的notch1.icd篩選結(jié)果。顯示了h分?jǐn)?shù)≥30的樣品的頻率。包括omp-b40、omp-lu61和omp-c63在內(nèi)的具有升高的notch1-icd的腫瘤顯示出對(duì)omp-52m51人源化抗notch1抗體治療的顯著敏感性(圖9、10和11)。與之相反，不具有notch1-icd染色的腫瘤(例如omp-lu33)未顯示出對(duì)omp-52m51抗notch1抗體治療的顯著敏感性(數(shù)據(jù)未示出)。這些數(shù)據(jù)表明可以使用notch1-icd測(cè)定作為用來(lái)選擇對(duì)omp-52m51治療會(huì)產(chǎn)生響應(yīng)的患者的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志。實(shí)施例9：使用omp-52m51人源化抗體和伊立替康的聯(lián)合治療將2萬(wàn)個(gè)omp-c11腫瘤細(xì)胞重懸浮在由pbs和0.5x基質(zhì)膠組成的注射介質(zhì)中，并皮下注射至小鼠中。omp-c11細(xì)胞的n1.icd的ihch分?jǐn)?shù)為約34。omp-c11細(xì)胞是針對(duì)fbw7的雜合性突變。在注射腫瘤細(xì)胞后1天開(kāi)始治療，并在實(shí)驗(yàn)期間持續(xù)。小鼠每周兩次接受15mg/kglz1對(duì)照抗體或omp-52m51抗notch1抗體，其作為單獨(dú)療法或與每周1次施用7.5mg/kg伊立替康組合。通過(guò)腹膜內(nèi)注射來(lái)施用抗體和伊立替康。實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖12。腫瘤體積顯示為每組n＝10只動(dòng)物的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。單獨(dú)的omp-52m51將腫瘤生長(zhǎng)減少至對(duì)照抗體治療組中觀察到的腫瘤生長(zhǎng)的53％(第54天，p＝0.046)。omp-52m51+伊立替康的聯(lián)合治療將腫瘤生長(zhǎng)減少至接受對(duì)照抗體+伊立替康組合的組中觀察到的腫瘤生長(zhǎng)的44％(第96天，p＝0.044)。將18萬(wàn)個(gè)omp-c20腫瘤細(xì)胞重懸浮在由pbs和0.5x基質(zhì)膠組成的注射介質(zhì)中，并皮下注射。omp-c20細(xì)胞的n1.icdihch分?jǐn)?shù)為約58。omp-c20細(xì)胞是針對(duì)fbw7的雜合性突變。在注射腫瘤細(xì)胞后1天開(kāi)始治療，并在實(shí)驗(yàn)期間持續(xù)。小鼠每周兩次接受15mg/kg1b7.11對(duì)照抗體或omp-52m51抗notch1抗體，其作為單獨(dú)療法或與每周1次施用7.5mg/kg伊立替康組合。通過(guò)腹膜內(nèi)注射來(lái)施用抗體和伊立替康。實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖12。腫瘤體積顯示為每組n＝10只動(dòng)物的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。單獨(dú)的omp-52m51將腫瘤生長(zhǎng)減少至對(duì)照抗體治療組中觀察到的腫瘤生長(zhǎng)的34％(第70天，p＝<0.001)。omp-52m51+伊立替康的組合治療將腫瘤生長(zhǎng)減少至接受對(duì)照抗體+伊立替康組合的組中觀察到的腫瘤生長(zhǎng)的41％(第111天，p＝0.0001)。還使用基本如上文所述的體內(nèi)異種移植物模型確定了omp-c40腫瘤細(xì)胞對(duì)omp-52m51抗notch1抗體單獨(dú)治療或?qū)mp-52m51抗notch1抗體與伊立替康的組合治療的敏感性。omp-c20細(xì)胞的n1.icdihch分?jǐn)?shù)為約23。omp-c40細(xì)胞攜帶兩個(gè)野生型拷貝的fbw7。實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖12。在omp-52m51治療組和對(duì)照抗體治療組之間，腫瘤生長(zhǎng)不存在顯著差異。實(shí)施例10：突變的notch1和notch3多肽的信號(hào)傳導(dǎo)notch突變表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：使用agilentquikchangeiixl定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?agilent；lajolla,ca)產(chǎn)生notch1和notch3突變序列。使用agilent引物設(shè)計(jì)站點(diǎn)制造pcr引物。根據(jù)操作規(guī)程在pcdna3.1和其他反應(yīng)液中使用50ngdsdnanotch野生型模板運(yùn)行pcr反應(yīng)。為了進(jìn)行足夠的擴(kuò)增，將熱循環(huán)儀調(diào)整為68℃下2.5分鐘/kb質(zhì)粒長(zhǎng)度。然后用dpni限制性酶消化所擴(kuò)增的dna，并使用xl10-gold超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將dna在lb-氨芐青霉素平板上鋪板，并使其生長(zhǎng)過(guò)夜。挑選菌落，將其提供至elimbio(hawyard,ca)測(cè)序以確認(rèn)突變的存在。對(duì)突變陽(yáng)性的克隆進(jìn)行大量提取以產(chǎn)生額外的dna。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行全長(zhǎng)測(cè)序，以確保不存在其他突變。螢光素酶測(cè)定：將pc3、hela和a549細(xì)胞置于10cm皿上(100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/9ml培養(yǎng)基)并使其在37℃/5％co2下生長(zhǎng)過(guò)夜。細(xì)胞培養(yǎng)基為dmem+高葡萄糖、10％fbs、1％hepes和1％pen/strep(invitrogen；carlsbad,ca)。使用optimem、fugene6、2μghnotch.wt或pcdna或notch.突變體、2μgpgl4_8xcbs、2μgpcdna3_哺乳動(dòng)物和0.5μgpgl3_rl.cmv準(zhǔn)備dna轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染試劑混合并在室溫下溫育15分鐘，而后添加至細(xì)胞。在37℃/5％co2下將經(jīng)轉(zhuǎn)染的pc3細(xì)胞溫育過(guò)夜。在轉(zhuǎn)染的同時(shí)，每孔用30μlpbs中的hjag1(31.25-500ng)(r&dsystems；minneapolis,mn)或用無(wú)配體的30μlpbs包被96孔板。在4℃將經(jīng)包被的平板貯存過(guò)夜。24小時(shí)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染之后，收集細(xì)胞并按70μl/孔添加至經(jīng)包被的96孔板中，而后在37℃/5％co2下溫育過(guò)夜。使用dual-glo螢光素酶測(cè)定系統(tǒng)(promega；madison,wi)評(píng)估notch活性。采用螢火蟲(chóng)螢光素酶與海腎螢光素酶的比值來(lái)計(jì)算notch活性。用編碼notch1全長(zhǎng)野生型(notch1_wt)多肽或notch1_g2427fs(omp-b40)突變多肽的dna瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pc3細(xì)胞。使用dual-glo螢光素酶系統(tǒng)在不存在外源性配體的情況下評(píng)估notch介導(dǎo)的螢光素酶激活。用編碼notch3全長(zhǎng)野生型(notch3_wt)多肽、notch3_p2033fs(omp-c31)多肽或notch3_p2208fs(omp-b37)多肽的dna瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pc3細(xì)胞和a549細(xì)胞。pc3細(xì)胞和a549細(xì)胞都具有非常低水平的內(nèi)源性notch配體，例如dll4或jag1。使用dual-glo螢光素酶系統(tǒng)在不存在外源性配體的情況下評(píng)估notch介導(dǎo)的螢光素酶活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖13b中。在上述兩個(gè)細(xì)胞系中，notch3_p2033fs(6096insc,omp-c31)和notch3_p2208fs(6620insc,omp-b37)是激活性突變。針對(duì)轉(zhuǎn)染有編碼notch3_p2033fs(omp-c31)的dna的pc3細(xì)胞中的jag1(1-500ng/30μl)制作了劑量響應(yīng)曲線(圖13c)。針對(duì)轉(zhuǎn)染有編碼notch3_p2208fs(omp-b37)的dna的pc3細(xì)胞中的jag1(1-500ng/30μl)制作了劑量響應(yīng)曲線(圖13d)。notch3_p2033fs(omp-c31)多體和notch3_p2208fs(omp-b37)多肽的由jag1介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)顯著高于野生型notch3的信號(hào)傳導(dǎo)。實(shí)施例10：突變的notch1和notch3多肽的信號(hào)傳導(dǎo)notch突變表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：使用agilentquikchangeiixl定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?agilent；lajolla,ca)產(chǎn)生notch1和notch3突變序列。使用agilent引物設(shè)計(jì)站點(diǎn)制造pcr引物。根據(jù)操作規(guī)程在pcdna3.1和其他反應(yīng)液中使用50ngdsdnanotch野生型模板運(yùn)行pcr反應(yīng)。為了進(jìn)行足夠的擴(kuò)增，將熱循環(huán)儀調(diào)整為68℃下2.5分鐘/kb質(zhì)粒長(zhǎng)度。然后用dpni限制性酶消化所擴(kuò)增的dna，并使用xl10-gold超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將dna在lb-氨芐青霉素平板上鋪板，并使其生長(zhǎng)過(guò)夜。挑選菌落，將其提供至elimbio(hawyard,ca)測(cè)序以確認(rèn)突變的存在。對(duì)突變陽(yáng)性的克隆進(jìn)行大量提取以產(chǎn)生額外的dna。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行全長(zhǎng)測(cè)序，以確保不存在其他突變。實(shí)施例11：notch1拮抗劑在omp-b40腫瘤中的活性為了測(cè)試抗notch1抗體與γ-分泌酶抑制劑相比時(shí)的效果，發(fā)明人使用了在notch1中含有激活性突變的omp-b40乳腺腫瘤模型。將75,000個(gè)omp-b40乳腺腫瘤細(xì)胞注射至nod-scid小鼠中。使腫瘤生長(zhǎng)50天，直到腫瘤達(dá)到120mm3的平均體積。將帶有腫瘤的小鼠(n＝10的組)每周或每隔一周用對(duì)照抗體(1b7.11,10mg/kg)治療；每周或每隔一周用3mg/kg或10mg/kg的抗notch1(a2g1，其為既識(shí)別鼠類notch1又識(shí)別人notch1的抗notch1抗體)治療；或者每周5次用150mg/kg或300mg/kg的γ-分泌酶抑制劑(gsi)治療。通過(guò)腹膜內(nèi)注射按劑量給予抗體，并通過(guò)灌胃按劑量給予gsi化合物。在指定的天數(shù)測(cè)量腫瘤體積。將數(shù)據(jù)繪制為平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差。分別如圖14a和b所示，gsi和a2g1抗notch1抗體都抑制了腫瘤生長(zhǎng)。每周10mg/kg的a2g1和300mg/kg的gsi所致的腫瘤生長(zhǎng)抑制程度相似。使用選擇性地識(shí)別notch1icd的切割形式的抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，從而分析了腫瘤裂解物中激活的notch1的存在(圖14c)。a2g1抗notch1抗體是比notch1激活的γ-分泌酶抑制劑更有效的抑制劑。還通過(guò)組織學(xué)分析檢查了對(duì)胃腸道毒性的影響(圖14d)。每周10mg/kg的a2g1抗notch1抗體所導(dǎo)致的胃腸道毒性的嚴(yán)重程度比300mg/kg的gsi(qdx5)更低。因此，單克隆抗體的選擇性notch1抑制被更好地耐受，并且就在攜帶激活性notch1突變的腫瘤中抑制notch1信號(hào)傳導(dǎo)而言比gsi更有效。實(shí)施例12：omp-c31結(jié)腸腫瘤中59r5抗notch2/3抗體的活性。為了測(cè)試59r5抗notch2/3抗體對(duì)含有notch3中的激活性突變的腫瘤的影響，使用了omp-c31結(jié)腸腫瘤模型。將5,000個(gè)omp-c31結(jié)腸腫瘤細(xì)胞皮下注射至nod-scid小鼠中。注射腫瘤細(xì)胞2天后開(kāi)始給藥。用對(duì)照抗體(1b7.11)或59r5抗notch2/3抗體治療攜帶腫瘤的小鼠(n＝10的組)。在實(shí)驗(yàn)期間通過(guò)腹膜內(nèi)注射每周按10mg/kg的劑量施用抗體。在指定的天數(shù)測(cè)量腫瘤體積。將數(shù)據(jù)繪制為平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差(圖15)。59r5抗notch2/3抗體相對(duì)于對(duì)照抗體治療組抑制了omp-c31腫瘤生長(zhǎng)(p＝0.0005)。實(shí)施例13：52m51抗notch1抗體抑制g2427fs和r2328w突變notch1多肽的由配體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方式中，確定了52m51notch1受體抗體的阻斷具有g(shù)2427fs和r2328w(westhoff等,procnatlacadsci2009年12月29日；106(52):22293–22298)突變的notch1多肽的由配體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的能力。用以下載體共轉(zhuǎn)染pc3細(xì)胞：(a)表達(dá)g2427fs、r2328w或野生型notch1的載體；(b)包含位于螢火蟲(chóng)螢光素酶報(bào)道基因上游的notch響應(yīng)性啟動(dòng)子的pgl4_8xcbs載體；(c)表達(dá)maml(一種notch的轉(zhuǎn)錄輔因子)的pcdna3_哺乳動(dòng)物載體，和(d)表達(dá)海腎螢光素酶的pgl3_rl.cmv載體。用空載體代替(a)來(lái)轉(zhuǎn)染對(duì)照細(xì)胞。使用optimem,fugene6準(zhǔn)備dna轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染試劑混合并在室溫溫育15分鐘，之后添加至細(xì)胞。在37℃/5％co2下將經(jīng)轉(zhuǎn)染的pc3細(xì)胞溫育過(guò)夜。在向細(xì)胞添加轉(zhuǎn)染試劑時(shí)，每孔用30μlpbs中的hdll4(12.5ng)或hjag1(125ng)(r&dsystems；minneapolis,mn)或無(wú)配體的30μlpbs包被96孔板。在4℃將經(jīng)包被的板貯存過(guò)夜。24小時(shí)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染之后，收集細(xì)胞并按70μl/孔添加至經(jīng)包被的96孔板中，而后在37℃/5％co2下溫育過(guò)夜。在添加經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞之前至少1小時(shí)，將52m51抗notch1抗體按10ul/孔(1.6-1000ng/ml)添加到向96孔板中。使用dual-glo螢光素酶測(cè)定系統(tǒng)(promega；madison,wi)評(píng)估notch活性。通過(guò)確定螢火蟲(chóng)螢光素酶與海腎螢光素酶的活性比來(lái)計(jì)算notch活性。圖16a和b分別顯示出了在用dll4和jag1刺激后的表達(dá)g2427fs(omp-b40)notch1突變多肽的pc3細(xì)胞中觀察到的螢火蟲(chóng)螢光素酶與海腎螢光素酶的活性比。圖16c和d分別顯示出了在用dll4和jag1刺激后的表達(dá)r2328wnotch1突變多肽的pc3細(xì)胞中觀察到的螢火蟲(chóng)螢光素酶與海腎螢光素酶的活性比。表達(dá)g2427fs或r2328wnotch1的pc3細(xì)胞與不表達(dá)重組notch1的細(xì)胞相比具有明顯更高的螢火蟲(chóng)螢光素酶-海腎螢光素酶活性比。此外，52m51抗notch1抗體以劑量依賴性方式減少g2427fs和r2328wnotch1多肽所介導(dǎo)的螢火蟲(chóng)螢光素酶-海腎螢光素酶活性比的增加。實(shí)施例14：對(duì)經(jīng)治療的omp-b37乳腺腫瘤的notch3icdihc分析通過(guò)ihc檢查了在用notch2/3拮抗劑和/或化療劑治療后的包含notch3激活性突變的omp-b37腫瘤細(xì)胞中的notch3.icd累積。如以上實(shí)施例3的第二段所述，用omp-59r5抗notch2/3抗體、紫杉醇或者omp-59r5與紫杉醇的組合治療o(wú)mp-b37異種移植物小鼠，并從經(jīng)治療的小鼠中分離出腫瘤樣品。開(kāi)發(fā)與notch3的切割位點(diǎn)結(jié)合并檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)的激活的notch3的notch3icd("n3.icd")兔單克隆抗體。使用n3.icd抗體和標(biāo)準(zhǔn)ihc操作規(guī)程對(duì)所述腫瘤樣品進(jìn)行notch3icdihc，其中，在ph9的targetretrievalsolution(dako)中進(jìn)行抗原修復(fù)，在4℃溫育抗體過(guò)夜，并利用基于過(guò)氧化物酶的envisiontm+聚合物(dako)和dab+(dako)進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)利用bonferroni校正的單因素方差分析確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。所獲得的結(jié)果示于圖17中。相對(duì)于經(jīng)pbs治療的細(xì)胞中的notch3.icd累積，omp-59r5抗notch2/3抗體治療顯著地抑制了omp-b37乳腺腫瘤細(xì)胞中的notch3.icd累積。相對(duì)于僅用紫杉醇治療的細(xì)胞中檢測(cè)到的累積，“omp-59r5抗notch2/3+紫杉醇”組合治療顯著地抑制了omp-b37細(xì)胞中的notch3.icd累積。seqidno:1人notch1基因(野生型)atgccgccgctcctggcgcccctgctctgcctggcgctgctgcccgcgctcgccgcacgaggcccgcgatgctcccagcccggtgagacctgcctgaatggcgggaagtgtgaagcggccaatggcacggaggcctgcgtctgtggcggggccttcgtgggcccgcgatgccaggaccccaacccgtgcctcagcaccccctgcaagaacgccgggacatgccacgtggtggaccgcagaggcgtggcagactatgcctgcagctgtgccctgggcttctctgggcccctctgcctgacacccctggacaatgcctgcctcaccaacccctgccgcaacgggggcacctgcgacctgctcacgctgacggagtacaagtgccgctgcccgcccggctggtcagggaaatcgtgccagcaggctgacccgtgcgcctccaacccctgcgccaacggtggccagtgcctgcccttcgaggcctcctacatctgccactgcccacccagcttccatggccccacctgccggcaggatgtcaacgagtgtggccagaagcccgggctttgccgccacggaggcacctgccacaacgaggtcggctcctaccgctgcgtctgccgcgccacccacactggccccaactgcgagcggccctacgtgccctgcagcccctcgccctgccagaacgggggcacctgccgccccacgggcgacgtcacccacgagtgtgcctgcctgccaggcttcaccggccagaactgtgaggaaaatatcgacgattgtccaggaaacaactgcaagaacgggggtgcctgtgtggacggcgtgaacacctacaactgccgctgcccgccagagtggacaggtcagtactgtaccgaggatgtggacgagtgccagctgatgccaaatgcctgccagaacggcgggacctgccacaacacccacggtggctacaactgcgtgtgtgtcaacggctggactggtgaggactgcagcgagaacattgatgactgtgccagcgccgcctgcttccacggcgccacctgccatgaccgtgtggcctccttctactgcgagtgtccccatggccgcacaggtctgctgtgccacctcaacgacgcatgcatcagcaacccctgtaacgagggctccaactgcgacaccaaccctgtcaatggcaaggccatctgcacctgcccctcggggtacacgggcccggcctgcagccaggacgtggatgagtgctcgctgggtgccaacccctgcgagcatgcgggcaagtgcatcaacacgctgggctccttcgagtgccagtgtctgcagggctacacgggcccccgatgcgagatcgacgtcaacgagtgcgtctcgaacccgtgccagaacgacgccacctgcctggaccagattggggagttccagtgcatctgcatgcccggctacgagggtgtgcactgcgaggtcaacacagacgagtgtgccagcagcccctgcctgcacaatggccgctgcctggacaagatcaatgagttccagtgcgagtgccccacgggcttcactgggcatctgtgccagtacgatgtggacgagtgtgccagcaccccctgcaagaatggtgccaagtgcctggacggacccaacacttacacctgtgtgtgcacggaagggtacacggggacgcactgcgaggtggacatcgatgagtgcgaccccgacccctgccactacggctcctgcaaggacggcgtcgccaccttcacctgcctctgccgcccaggctacacgggccaccactgcgagaccaacatcaacgagtgctccagccagccctgccgccacgggggcacctgccaggaccgcgacaacgcctacctctgcttctgcctgaaggggaccacaggacccaactgcgagatcaacctggatgactgtgccagcagcccctgcgactcgggcacctgtctggacaagatcgatggctacgagtgtgcctgtgagccgggctacacagggagcatgtgtaacatcaacatcgatgagtgtgcgggcaacccctgccacaacgggggcacctgcgaggacggcatcaatggcttcacctgccgctgccccgagggctaccacgaccccacctgcctgtctgaggtcaatgagtgcaacagcaacccctgcgtccacggggcctgccgggacagcctcaacgggtacaagtgcgactgtgaccctgggtggagtgggaccaactgtgacatcaacaacaatgagtgtgaatccaacccttgtgtcaacggcggcacctgcaaagacatgaccagtggctacgtgtgcacctgccgggagggcttcagcggtcccaactgccagaccaacatcaacgagtgtgcgtccaacccatgtctgaaccagggcacgtgtattgacgacgttgccgggtacaagtgcaactgcctgctgccctacacaggtgccacgtgtgaggtggtgctggccccgtgtgcccccagcccctgcagaaacggcggggagtgcaggcaatccgaggactatgagagcttctcctgtgtctgccccacgggctggcaagggcagacctgtgaggtcgacatcaacgagtgcgttctgagcccgtgccggcacggcgcatcctgccagaacacccacggcggctaccgctgccactgccaggccggctacagtgggcgcaactgcgagaccgacatcgacgactgccggcccaacccgtgtcacaacgggggctcctgcacagacggcatcaacacggccttctgcgactgcctgcccggcttccggggcactttctgtgaggaggacatcaacgagtgtgccagtgacccctgccgcaacggggccaactgcacggactgcgtggacagctacacgtgcacctgccccgcaggcttcagcgggatccactgtgagaacaacacgcctgactgcacagagagctcctgcttcaacggtggcacctgcgtggacggcatcaactcgttcacctgcctgtgtccacccggcttcacgggcagctactgccagcacgatgtcaatgagtgcgactcacagccctgcctgcatggcggcacctgtcaggacggctgcggctcctacaggtgcacctgcccccagggctacactggccccaactgccagaaccttgtgcactggtgtgactcctcgccctgcaagaacggcggcaaatgctggcagacccacacccagtaccgctgcgagtgccccagcggctggaccggcctttactgcgacgtgcccagcgtgtcctgtgaggtggctgcgcagcgacaaggtgttgacgttgcccgcctgtgccagcatggagggctctgtgtggacgcgggcaacacgcaccactgccgctgccaggcgggctacacaggcagctactgtgaggacctggtggacgagtgctcacccagcccctgccagaacggggccacctgcacggactacctgggcggctactcctgcaagtgcgtggccggctaccacggggtgaactgctctgaggagatcgacgagtgcctctcccacccctgccagaacgggggcacctgcctcgacctccccaacacctacaagtgctcctgcccacggggcactcagggtgtgcactgtgagatcaacgtggacgactgcaatccccccgttgaccccgtgtcccggagccccaagtgctttaacaacggcacctgcgtggaccaggtgggcggctacagctgcacctgcccgccgggcttcgtgggtgagcgctgtgagggggatgtcaacgagtgcctgtccaatccctgcgacgcccgtggcacccagaactgcgtgcagcgcgtcaatgacttccactgcgagtgccgtgctggtcacaccgggcgccgc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