本發(fā)明蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，具體涉及人成纖維細(xì)胞生長因子21(fgf21)突變體，其編碼基因，以及所述突變體的制備方法和使用所述突變體用于治療2型糖尿病、肥胖、異常血脂癥、或代謝紊亂的方法。

背景技術(shù)：

fgf21屬于成纖維細(xì)胞生長因子(fgf)19亞家族的分泌蛋白，所述成纖維細(xì)胞生長因子(fgf)亞家族包括fgf19、fgf21、和fgf23(itoh等，2004，trendgenet.20：563-69)。fgf21是一種非典型的fgf，其獨(dú)立于肝素，并在葡萄糖、脂類和能量代謝中發(fā)揮功能。其通過上調(diào)glut1表達(dá)，促進(jìn)脂肪細(xì)胞中的葡萄糖攝取，其機(jī)制不同于胰島素。在患有糖尿病的嚙齒動物、猴子和人中，fgf21降低葡萄糖空腹血清濃度，并降低甘油三酯、胰島素和胰高血糖素的空腹血清濃度。此外，在飲食誘導(dǎo)的肥胖嚙齒類動物模型中，施用fgf21導(dǎo)致累計(jì)體重呈劑量依賴性喪失。實(shí)驗(yàn)研究提供了fgf21具有用于治療糖尿病、肥胖、異常血脂癥、代謝綜合癥的藥物學(xué)給藥的支持。

人fgf21易降解，用量大，穩(wěn)定性及藥效較差，因此需要對野生型fgf21進(jìn)行改造，提高人fgf21的有效性和穩(wěn)定性，以減少對患者給藥的劑量。

發(fā)明概述

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了替代性的人fgf21突變體，其編碼基因以及所述突變體的制備方法和用途。

具體而言，本發(fā)明一方面提供了一種人fgf21突變體，其在野生型人fgf21蛋白氨基酸序列的基礎(chǔ)上具有以下氨基酸改變：

1)在野生型人fgf21蛋白氨基酸序列的第31位ala和第32位his之間增加一個cys，并且第43位gly、第44位ala中的任意1個或2個位置處的氨基酸突變?yōu)閏ys，

2)野生型人fgf21蛋白氨基酸序列的第171位pro突變?yōu)間ly；和/或

3)野生型人fgf21蛋白氨基酸序列的第24位至31位的氨基酸片段用5-15個氨基酸，優(yōu)選6-14個氨基酸，更優(yōu)選7-13個氨基酸，還優(yōu)選8-10個氨基酸，最優(yōu)選8個氨基酸的片段替換。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于所述替換的氨基酸片段是任意氨基酸的組合。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于所述替換的氨基酸片段為8個氨基酸的片段，用式x1x2x3x4x5x6x7x8表示。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，x1-x8各自獨(dú)立地選自任意氨基酸，優(yōu)選x1是ser或asp，x2是gly或asp，x3是pro或ala，x4是ala或gln，x5是gly或gln，x6是leu或tyr，x7是ser或his，x8是ser或ala。

本發(fā)明的方案中，基于fgf21的空間結(jié)構(gòu)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，fgf21c端的第171位的氨基酸p容易暴露在表面易被酶所降解，本發(fā)明將其突變?yōu)間，從而增加了fgf21穩(wěn)定性，但不影響fgf21的活性。進(jìn)一步地，本發(fā)明人基于結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，fgf21的n端的第24-31的空間結(jié)構(gòu)為一段loop環(huán)，loop環(huán)的長度在對fgf21的穩(wěn)定性有顯著影響的情況下仍然保持fgf21的活性。此外，基于fgf21的空間結(jié)構(gòu)，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)野生型fgf21的第31位和第32位與第43位和第44位的氨基酸在空間上是靠近的，但是結(jié)構(gòu)不夠穩(wěn)定。經(jīng)過深入研究，本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)：在不影響第23-32位間loop環(huán)的長度的情況下，在第31位和第32位之間插入了一個半胱氨酸cys后，該半胱氨酸通過與第43位或第44位突變的半胱氨酸形成二硫鍵，從而穩(wěn)定了其結(jié)構(gòu)；另外，突變loop環(huán)上的氨基酸，在插入在第31-32位間的cys與第43位或與第44位突變的cys形成二硫鍵并穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上改變第24-31位loop環(huán)的氨基酸組成，能夠充分提高fgf21的活性。

在本發(fā)明的方案中，野生型人fgf21蛋白氨基酸序列在31-32位增加的cys和第43位或44位的cys之間形成穩(wěn)定二硫鍵時，在野生fgf21第23-32位間的氨基酸的長度對于fgf21的穩(wěn)定性影響效果明顯。因此，在本說明書公開內(nèi)容的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠任意選擇所述片段的長度和氨基酸種類來對本發(fā)明進(jìn)行效果可以預(yù)期的改變或改進(jìn)。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于所述替代的氨基酸片段是ddaqqtea(其相應(yīng)的突變體在下文中也稱為fgf21-ag)，編碼該突變體的核酸序列如seqidno：3所示，氨基酸序列如seqidno：4所示。

在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于所述替代的氨基酸片段是sgphglss(其相應(yīng)的突變體在下文中也稱為fgf21-lg)，編碼該突變體的核酸序列如seqidno：5所示，氨基酸序列如seqidno：6所示。

本發(fā)明中“野生型fgf21”是從http：//www.uniprot.org/中搜索fgf21，在得到的結(jié)果中選擇物種(organism)為人類(homosapiens)而得到的。人源fgf21在uniprot的編號為(q9nsa1)，我們得到fgf21的蛋白質(zhì)序列有209個殘基。去除n端28個氨基酸的信號肽，得到的fgf21的序列有181個殘基，即為野生型fgf21序列，其核酸序列為seqidno：2，相應(yīng)氨基酸序列為seqidno：1。

因此，本發(fā)明中所述的“野生型人fgf21蛋白”是指天然存在于人中的成熟fgf21蛋白(下文中也稱為fgf21)，在典型的情況下，其氨基酸序列如seqidno：1所示，或與seqidno：1具有95％以上，優(yōu)選98％以上，更優(yōu)選99％以上的同源性的氨基酸序列。

另一方面，本發(fā)明提供一種核酸，其編碼以上所述的任一突變體。

本發(fā)明還提供一種載體，其包含以上所述的核酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體為表達(dá)載體，更優(yōu)選為原核表達(dá)載體。

本發(fā)明還提供一種宿主細(xì)胞，其包含以上所述的載體。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌(e.coli)細(xì)胞。

本發(fā)明還提供一種制備人fgf21突變體的方法，所述方法包括將所述人fgf21突變體的編碼基因與所述表達(dá)載體可操作性的連接，得到重組表達(dá)載體；將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，收集并純化表達(dá)的蛋白。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法包括將sumo標(biāo)簽基因(sumo標(biāo)簽基因n端有6個his標(biāo)簽)和編碼所述人fgf21突變體的核酸序列依次連接在一起。將該基因與表達(dá)載體可操作性的相連接，得到重組表達(dá)載體；將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，收集并純化所表達(dá)的蛋白，sumo酶切割，再純化。

所述的宿主細(xì)胞為大腸桿菌(e.coli)細(xì)胞。

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，對于本發(fā)明所述的突變體，誘導(dǎo)表達(dá)條件為：10-37℃培養(yǎng)細(xì)胞到od600達(dá)到0.2-1.0時加入終濃度為0.1-1mm的iptg，4-37℃誘導(dǎo)表達(dá)2-20h。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，條件為37℃培養(yǎng)細(xì)胞到od600達(dá)到0.8時加入終濃度為1mm的iptg，25℃誘導(dǎo)表達(dá)6h。

本發(fā)明的純化方法是將收集到的菌體用裂解緩沖液(20mmtris-hcl100mmnacl，ph8.0)重懸，進(jìn)行細(xì)胞破碎，離心，收集上清液，將上清液與純化填料混合后孵育0.1-10個小時，將混合物轉(zhuǎn)移到層析柱中，進(jìn)行蛋白的純化，將純化得到的sumo融合的人fgf21突變體蛋白用sumo酶酶切，酶切條件包括：溫度為0-37℃，緩沖液為20mmtris-hcl100mmnaclph，8.0pbs，tris-hcl，ph值為6.8-8.0，切割0-24小時，利用ni金屬螯合親和層析，得到人fgf21突變體，再利用分子排阻層析對fgf21突變體蛋白進(jìn)行再純化。

另一方面，本發(fā)明提供所述突變體在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療2型糖尿病、肥胖、異常血脂癥、或代謝綜合征。

本發(fā)明中所述的“突變”包括氨基酸的置換、缺失、添加。

綜上所述，本發(fā)明的突變體具有野生型fgf21沒有的優(yōu)點(diǎn)。這種優(yōu)點(diǎn)包括改善的藥理學(xué)效力和/或改善的藥物穩(wěn)定性。本發(fā)明的fgf21突變體蛋白具有一種或多種有利的生理學(xué)特征，包括在體內(nèi)具有更顯著的藥效，具有更強(qiáng)熱穩(wěn)定性。另外，本發(fā)明的fgf21變體對2型糖尿病、肥胖、異常脂血癥、或代謝綜合癥、或其任意的治療具有潛在的作用。

附圖簡述

圖1.sumo-fgf21突變體表達(dá)載體示意圖

圖2.純化后sumo-fgf21-lg核酸電泳圖，m是dl5000dnamarker，1是sumo-fgf21-lg基因的純化產(chǎn)物

圖3.純化后sumo-fgf21-ag核酸電泳圖，m是dl5000dnamarker，1是sumo-fgf21-ag基因的純化產(chǎn)物

圖4.純化后pet22b(de3)sumo-fgf21-lg蛋白的sds-page圖

圖5.純化后fgf21-lg蛋白的sds-page圖，m是蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，1是fgf21-lg

圖6.純化后fgf21-ag蛋白的sds-page圖，m是蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，1是fgf21-ag

圖7.fgf21-lg蛋白動物藥效試驗(yàn)(降低血糖)結(jié)果圖。

圖8.fgf21-ag蛋白動物藥效試驗(yàn)(降低血糖)結(jié)果圖。

圖9.fgf21-lg蛋白動物藥效試驗(yàn)(對體重的影響)結(jié)果圖。

圖10.fgf21-ag蛋白動物藥效試驗(yàn)(對體重的影響)結(jié)果圖。

圖11.fgf21-lg蛋白的熱穩(wěn)定性試驗(yàn)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

實(shí)施中實(shí)驗(yàn)主要試劑耗材及儀器：克隆所用引物均為上海生工合成。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)中dna聚合酶(primerstar)、限制性內(nèi)切酶、連接酶、dpni均購于takara公司；dnamarker購于thermo公司；普通dna產(chǎn)物回收試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購于tiangen公司。e.colidh5α菌株，e.colibl21菌株，pet22b-sumo-fgf21質(zhì)粒，sumo蛋白酶購置北京索萊寶科技有限公司。tris、咪唑購于上海生工，其他鹽類購于國藥，濃縮管購于millipore。fplc儀器使用的是ge公司的系統(tǒng)，使用的ni-sepharose層析柱和分子排阻層析柱hiload16/60superdex75pg均購于ge公司。bca試劑盒購于thermo。

表1.fgf21分子克隆所使用的引物

^a第1-8位為保護(hù)堿基，第9至14位為限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；

^b第1-3位為保護(hù)堿基，第4至9位為限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。

實(shí)施例1：重組fgf21突變體表達(dá)載體的構(gòu)建

以pet22b-sumo-fgf21質(zhì)粒為模板，第一次突變：利用上游引物171g-f和下游引物171g-r進(jìn)行pcr定點(diǎn)突變。得到fgf21-p171g突變體。第二次突變利用fgf21-p171g突變體為模板，以43c-f為上游引物和43c-r為下游引物進(jìn)行pcr定點(diǎn)突變，得到fgf21-g43c-p171g突變體。第三次突變：利用fgf21-g43c-p171g突變體為模板，以31-32c-f為上游引物和31-32c-r為下游引物進(jìn)行pcr定點(diǎn)突變，得到fgf21-ag突變體。第四次突變：以fgf21-ag為模板，以fgf21-lg-f為上游引物，以fgf21-lg-r為下游引物進(jìn)行突變。得到fgf21-lg突變體。pcr反應(yīng)條件如下。以上突變過程的pcr反應(yīng)體系及反應(yīng)程序如下：

pcr反應(yīng)體系：2×primestarhs(premix)25μl，上游引物(10μm)1μl，下游引物(10μm)1μl，模板μl，ddh2o22μl，總體積50μl。

pcr反應(yīng)程序：第1步、預(yù)變性溫度98℃10mins；第2步、變性溫度98℃10secs；3、退火溫度57℃5secs；第4步、延伸溫度72℃，1min。從第2到4步重復(fù)30個循環(huán)。

每次突變后的產(chǎn)物用dpni酶在37℃酶切反應(yīng)1h。將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并利用膠回收試劑盒回收質(zhì)粒，取1ul質(zhì)粒放入100ul的感受態(tài)細(xì)胞中，將細(xì)胞放入冰上30分鐘，42℃熱激90秒，加入400ullb培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)45分鐘后涂平板，37℃倒置過夜培養(yǎng)。挑去單克隆做為模板，利用sumo-f為上游引物和fgf21-r為下游引物進(jìn)行pcr鑒定，其中fgf21-lg的鑒定結(jié)果如圖2所示，fgf21-ag的鑒定結(jié)構(gòu)如圖3所示。經(jīng)初步鑒定成功的fgf21突變體進(jìn)行基因的測序與結(jié)果分析。樣品由生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行序列測定。采用dnaman軟件進(jìn)行序列分析。序列測定的結(jié)果：突變體fgf21-ag的核酸序列如seqidno.3所示，相應(yīng)氨基酸序列如seqidno.4所示；突變體fgf21-lg的核酸序列如seqidno.5所示，相應(yīng)氨基酸序列如seqidno.6所示。其構(gòu)建載體示意圖見圖1。

將測序成功的含有編碼fgf21突變體的核酸序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到bl21(de3)菌株中，挑取單克隆菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并將菌株保存在-80℃冰箱中。

實(shí)施例2：人重組fgf21突變體的表達(dá)

將fgf21突變體菌株按2％的接種量接種于5mllb培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素)中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)過夜，取過夜培養(yǎng)菌液按2％接種于每瓶中，每2000ml三角瓶裝500mllb培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素)。培養(yǎng)到od600為0.8時加入1.0miptg500ul，在25℃誘導(dǎo)表達(dá)4個小時。4℃，8000r/min離心10分鐘，棄上清，收集菌體，將菌體放于-80℃凍存。

實(shí)施例3：重組人fgf21突變體純化

(1)重組人fgf21突變體初純化

將表達(dá)得到的菌體用裂解緩沖液(50mmtris，300mmnacl，ph8.5)重懸，然后進(jìn)行超聲破碎(30％功率，超2秒，停5秒，總時間45分鐘)，4℃14000rpm離心40分鐘，收集上清液。將上清液加入已經(jīng)用緩沖液預(yù)平衡的ni-sepharose層析柱，4℃旋轉(zhuǎn)混合30分鐘。將溶液穿出后，用5倍柱體積的緩沖液沖洗以去除未結(jié)合的蛋白和雜質(zhì)，再用5倍柱體積的含30mm咪唑的緩沖液(50mmtris，300mmnacl，ph8.5)將非特異性的雜蛋白洗脫下來，再用5倍柱體積的含300mm咪唑的緩沖液(50mmtris，300mmnacl，ph8.5)將目的蛋白洗脫下來，用sds-page檢測純化結(jié)果(結(jié)果見圖4)。

(2)重組人fgf21突變體酶切純化

檢測透析后的融合蛋白：以分子摩爾比為0.1％的比例加入sumo酶，在4℃下酶切2h，向酶切后的蛋白溶液加入終濃度為20mm咪唑，然后加入到已經(jīng)用緩沖液(50mmtris，300mmnacl，ph8.5)預(yù)平衡的ni-sepharose層析柱上，4℃旋轉(zhuǎn)混合30分鐘。收集流穿的溶液，用濃縮管將樣品濃縮到10mg/ml，再經(jīng)superdex75分子排阻層析柱純化，分子排阻層析緩沖液(20mmpbs，100mmnacl，ph7.2)，得到的蛋白即為fgf21突變體蛋白，實(shí)驗(yàn)中的fgf21及突變體如fgf21-lg和fgf21-ag蛋白都是用上述方法純化。并經(jīng)12％sds-page電泳檢測，其中fgf21-lg蛋白的sds-page凝膠電泳結(jié)果如圖5，fgf21-ag蛋白的sds-page凝膠電泳結(jié)果見圖6。

實(shí)施例4：fgf21突變體降血糖實(shí)驗(yàn)

使用突變體蛋白進(jìn)行動物降血糖實(shí)驗(yàn)。將ob/ob小鼠模型分成3組，每組8只，分別為載體對照組，即注射生理鹽水，fgf21組和fgf21-lg組，實(shí)施方式為背部皮下注射，0.1mg/kg/天，連續(xù)給藥七天，并且記錄每天給藥前的血糖值，如圖7所示，fgf21-lg(如圖7)組相對于野生型fgf21蛋白而言表現(xiàn)出更強(qiáng)的藥效。同樣，以fgf21-ag進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)，實(shí)施方式為0.6mg/kg/天，并記錄每天給藥前的血糖值。實(shí)驗(yàn)說明fgf21-ag同樣有很明顯的降血糖作用，結(jié)果如圖8所示。

實(shí)施例5：fgf21突變體降體重實(shí)驗(yàn)

使用fgf21突變體蛋白進(jìn)行動物的降體重試驗(yàn)。將ob/ob小鼠分成4組，分別為載體對照組，即注射生理鹽水，fgf21組和人fgf21-lg組，fgf21-ag組，每組8只。將純化后的蛋白按照0.6mg/kg/天給藥，連續(xù)給藥6天，并且記錄6天后體重變化，實(shí)驗(yàn)證實(shí)fgf21-lg(如圖9)和fgf21-ag(如圖10)組相對于野生型fgf21蛋白具有更明顯的減輕體重作用，具有更強(qiáng)的藥效。

實(shí)施例6：熱穩(wěn)定性試驗(yàn)

使用人fgf21突變蛋白進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，利用圓二色譜(cd)對fgf21及fgf21-lg進(jìn)行變溫實(shí)驗(yàn)，20-95℃，每5℃作為一個測試點(diǎn)進(jìn)行測試。測試結(jié)果為fgf21的轉(zhuǎn)化溫度在69℃，而fgf21-lg的轉(zhuǎn)化溫度在98℃，實(shí)驗(yàn)證明人fgf21-lg相對于野生型fgf21具有更強(qiáng)的熱穩(wěn)定性(如圖11)。同樣，利用fgf21-ag，得到類似的cd結(jié)果。

可見，根據(jù)本發(fā)明的突變體與野生型相比具有更強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。

sequencelisting

<110>中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院

<120>人fgf21突變體、其制備方法及用途

<130>ib177786

<160>18

<170>patentinversion3.1

<210>1

<211>181

<212>prt

<213>homosapiens

<400>1

hisproileproaspserserproleuleuglnpheglyglyglnval

151015

argglnargtyrleutyrthraspaspalaglnglnthrglualahis

202530

leugluilearggluaspglythrvalglyglyalaalaaspglnser

354045

progluserleuleuglnleulysalaleulysproglyvalilegln

505560

ileleuglyvallysthrserargpheleucysglnargproaspgly

65707580

alaleutyrglyserleuhispheaspproglualacysserphearg

859095

gluleuleuleugluaspglytyrasnvaltyrglnserglualahis

100105110

glyleuproleuhisleuproglyasnlysserprohisargasppro

115120125

alaproargglyproalaargpheleuproleuproglyleupropro

130135140

alaleuprogluproproglyileleualaproglnproproaspval

145150155160

glyserseraspproleusermetvalglyproserglnglyargser

165170175

prosertyralaser

180

<210>2

<211>543

<212>dna

<213>homosapiens

<400>2

caccccatccctgactccagtcctctcctgcaattcgggggccaagtccggcagcggtac60

ctctacacagatgatgcccagcagacagaagcccacctggagatcagggaggatgggacg120

gtggggggcgctgctgaccagagccccgaaagtctcctgcagctgaaagccttgaagccg180

ggagttattcaaatcttgggagtcaagacatccaggttcctgtgccagcggccagatggg240

gccctgtatggatcgctccactttgaccctgaggcctgcagcttccgggagctgcttctt300

gaggacggatacaatgtttaccagtccgaagcccacggcctcccgctgcacctgccaggg360

aacaagtccccacaccgggaccctgcaccccgaggaccagctcgcttcctgccactacca420

ggcctgccccccgcactcccggagccacccggaatcctggccccccagccccccgatgtg480

ggctcctcggaccctctgagcatggtgggaccttcccagggccgaagccccagctacgct540

tcc543

<210>3

<211>546

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

caccccatccctgactccagtcctctcctgcaattcgggggccaagtccggcagcggtac60

ctctacacagatgatgcccagcagacagaagcttgccacctggagatcagggaggatggg120

acggtggggtgcgctgctgaccagagccccgaaagtctcctgcagctgaaagccttgaag180

ccgggagttattcaaatcttgggagtcaagacatccaggttcctgtgccagcggccagat240

ggggccctgtatggatcgctccactttgaccctgaggcctgcagcttccgggagctgctt300

cttgaggacggatacaatgtttaccagtccgaagcccacggcctcccgctgcacctgcca360

gggaacaagtccccacaccgggaccctgcaccccgaggaccagctcgcttcctgccacta420

ccaggcctgccccccgcactcccggagccacccggaatcctggccccccagccccccgat480

gtgggctcctcggaccctctgagcatggtgggaggttcccagggccgaagccccagctac540

gcttcc546

<210>4

<211>182

<212>prt

<213>人工序列

<400>4

hisproileproaspserserproleuleuglnpheglyglyglnval

151015

argglnargtyrleutyrthraspaspalaglnglnthrglualacys

202530

hisleugluilearggluaspglythrvalglycysalaalaaspgln

354045

serprogluserleuleuglnleulysalaleulysproglyvalile

505560

glnileleuglyvallysthrserargpheleucysglnargproasp

65707580

glyalaleutyrglyserleuhispheaspproglualacysserphe

859095

arggluleuleuleugluaspglytyrasnvaltyrglnsergluala

100105110

hisglyleuproleuhisleuproglyasnlysserprohisargasp

115120125

proalaproargglyproalaargpheleuproleuproglyleupro

130135140

proalaleuprogluproproglyileleualaproglnproproasp

145150155160

valglyserseraspproleusermetvalglyglyserglnglyarg

165170175

serprosertyralaser

180

<210>5

<211>546

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

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<212>dna

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<212>dna

<213>人工序列

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<211>38

<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

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<212>dna

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<212>dna

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<212>dna

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