本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及細(xì)粒棘球絳蟲tsp6重組蛋白及其可溶性表達(dá)方法和純化方法。

背景技術(shù)：

跨膜蛋白6（tsp6）是細(xì)粒棘球絳蟲成蟲cdna文庫中的一個抗原基因。tsp6是一種重要的細(xì)粒棘球絳蟲抗原，可能參與了細(xì)粒棘球絳蟲信號傳導(dǎo)途徑，對于細(xì)胞的生長、分化具有重要的生理意義。tsp6同膜聯(lián)蛋白家族(annexinfamily)成員可能是同源基因，屬于annexin家族。研究該抗原的生理功能，不僅可以了解其對于細(xì)粒棘球蚴的寄生、生長、發(fā)育等生命活動中的重要意義，還可以為治療和預(yù)防包蟲病提供新的藥物靶點(diǎn)和候選疫苗?；谝陨涎芯勘尘?，本發(fā)明構(gòu)建了編碼細(xì)粒棘球絳蟲tsp6基因的原核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，誘導(dǎo)其可溶性表達(dá)，并進(jìn)行蛋白純化，得到了該蛋白，為其今后的免疫原性、生化特性分析以及功能研究奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明通過基因工程技術(shù)，提供了一種細(xì)粒棘球絳蟲tsp6的原核表達(dá)載體pet30a-tsp6，利用該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌（bl21-de3）實(shí)現(xiàn)了tsp6的高水平可溶性表達(dá)，并提供了一種親和層析純化方法，純化出了大量的高純度的重組tsp6，用于tsp6免疫原性、生化特性分析以及功能研究，抗包蟲疫苗、抗包蟲藥物的研發(fā)及囊型包蟲病患者的免疫診斷。

本發(fā)明提供細(xì)粒棘球絳蟲tsp6重組蛋白，所述細(xì)粒棘球絳蟲tsp6重組蛋白的氨基酸序列為序列表seqidno.2。

作為優(yōu)選，所述細(xì)粒棘球絳蟲tsp6重組蛋白編碼的核苷酸序列為序列表seqidno.1中第31位-696位堿基。

本發(fā)明還提供上述細(xì)粒棘球絳蟲tsp6重組蛋白的可溶性表達(dá)，步驟如下：

（1）目的基因tsp6的擴(kuò)增；

（2）構(gòu)建tsp6表達(dá)質(zhì)粒：將步驟（1）制備的目的基因tsp6酶切并純化后，構(gòu)建入pet-30a相應(yīng)的多克隆酶切位點(diǎn)，構(gòu)建質(zhì)粒pet30a-tsp6；

（3）將步驟（2）制備的質(zhì)粒pet30a-tsp6轉(zhuǎn)化入e.colibl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞中，將e.colibl21(de3)-pet30a-tsp6進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，然后加入0.1mmol/l的iptg于18℃，120r/min誘導(dǎo)振蕩培養(yǎng)6h；離心收集細(xì)菌，超聲，收集上清液。

作為優(yōu)選，步驟（3）中所述擴(kuò)大培養(yǎng)是將e.colibl21(de3)-pet30a-tsp6先接種至lb固體培養(yǎng)基上，37℃孵育過夜；然后挑取培養(yǎng)基上單克隆至lb液體培養(yǎng)基中，于37℃，200r/min振蕩培養(yǎng)2小時，使od值至0.6；最后取菌液接種至lb液體培養(yǎng)基中，于37℃，200r/min振蕩培養(yǎng)，使od值至0.6。

本發(fā)明還提供上述細(xì)粒棘球絳蟲tsp6重組蛋白的純化方法，是使用histalon^tmgravitycolumns預(yù)裝柱純化細(xì)粒棘球絳蟲tsp6重組蛋白，然后使用洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫；所述洗脫緩沖液的配方為：300mm/l咪唑，20mm/ltris，500mm/lnacl，ph8.0。

作為優(yōu)選，步驟如下：

（1）加入20mmmes緩沖液于hispurcobalt預(yù)裝柱中沖洗介質(zhì)；

（2）加入超純水，使其緩慢的流過預(yù)裝柱內(nèi)填充的介質(zhì)；

（3）加入結(jié)合緩沖液，使其緩慢流過柱內(nèi)介質(zhì)；所述結(jié)合緩沖液的配方為：20mm/ltris，500mm/lnacl，20mm/l咪唑，ph8.0；

（4）上樣，加入超聲破碎e.colibl21(de3)-pet30a-tsp6提取的上清液，搖動使蛋白與預(yù)裝柱內(nèi)填充的介質(zhì)結(jié)合，離心后，使上清緩慢流過柱內(nèi)介質(zhì)；

（5）加入結(jié)合緩沖液，搖動使之與蛋白充分結(jié)合，然后使液體緩慢流過柱內(nèi)介質(zhì)；所述結(jié)合緩沖液的配方為：20mm/ltris，500mm/lnacl，20mm/l咪唑，ph8.0；

（6）加入1號洗脫液，使其緩慢流過柱內(nèi)介質(zhì)；所述1號洗脫液的配方為：50mm/l咪唑，20mm/ltris，500mm/lnacl，ph8.0；

（7）加入2號洗脫液，使其緩慢流過柱內(nèi)介質(zhì)；所述2號洗脫液的配方為：100mm/l咪唑，20mm/ltris，500mm/lnacl，ph8.0；

（8）加入3號洗脫液，使其緩慢流過柱內(nèi)介質(zhì)；所述3號洗脫液的配方為：200mm/l咪唑，20mm/ltris，500mm/lnacl，ph8.0；（9）加入4號洗脫液，使其緩慢流過柱內(nèi)介質(zhì)，收集洗脫液；所述4號洗脫液的配方為300mm/l咪唑，20mm/ltris，500mm/lnacl，ph8.0。

作為優(yōu)選，所述超聲破碎e.colibl21(de3)-pet30a-tsp6提取的上清液與洗脫緩沖液的體積比為1:2。

本發(fā)明還提供上述細(xì)粒棘球絳蟲tsp6重組蛋白在制備檢測細(xì)粒棘球蚴病的elisa試劑盒中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種檢測細(xì)粒棘球蚴病的elisa試劑盒，所述elisa試劑盒中包被抗原為權(quán)利要求1或2所述的細(xì)粒棘球絳蟲tsp6重組蛋白。

作為優(yōu)選，所述包被抗原用ph9.6的0.05m/l碳酸鹽緩沖液稀釋至終濃度5μg/ml；

作為優(yōu)選，所述試劑盒還包括封閉液，所述封閉液為含有5%脫脂奶粉的tbst，所述百分比的單位為g/ml。

本發(fā)明提供了一種細(xì)粒棘球絳蟲跨膜蛋白6（tsp6）基因，還提供了細(xì)粒棘球絳蟲tsp6基因所編碼的蛋白質(zhì)，并提供了一種細(xì)粒棘球絳蟲tsp6的原核表達(dá)載體pet30a-tsp6。利用該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(bl21-de3)，在較低溫度、較低誘導(dǎo)劑濃度及較短誘導(dǎo)時間條件下誘導(dǎo)該菌，可實(shí)現(xiàn)tsp6的高效可溶性表達(dá)：表達(dá)的重組蛋白質(zhì)大部分為可溶性蛋白，占大腸桿菌可溶性總蛋白70%。然后用hispurcobalt（clontech）親和層析純化重組細(xì)粒棘球絳蟲tsp6，得到tsp6純化蛋白，在使用洗脫緩沖液（300mm/l咪唑，20mm/ltris，500mm/lnacl，ph8.0）時可得到一種新的高純度的細(xì)粒棘球絳蟲tsp6。tsp6重組蛋白表達(dá)量很高，不需要大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)菌，且在特定的誘導(dǎo)條件下呈可溶性表達(dá)，純化該蛋白的操作相當(dāng)簡單，成本也很低，極易重復(fù)使用。本發(fā)明所制備的重組蛋白可以用于囊型包蟲病患者的免疫診斷，其作為免疫抗原能夠被囊型包蟲病患者血清識別，應(yīng)用于間接elisa檢測時，具備較高的特異性和靈敏度，臨床檢測符合率高達(dá)85％。

附圖說明

附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實(shí)施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1為細(xì)粒棘球絳蟲tsp6基因pcr擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果；

圖2為細(xì)粒棘球絳蟲tsp6在不同誘導(dǎo)條件下的原核表達(dá)；

圖3為細(xì)粒棘球絳蟲tsp6親和層析純化結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為市售。

實(shí)施例一細(xì)粒棘球絳蟲tsp6基因序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列

細(xì)粒棘球絳蟲tsp6全長916個核苷酸，最大的開放閱讀框（orf）位于31-696，含666bp，起始密碼子為atg，終止密碼子為taa，編碼221個氨基酸，其核苷酸序列及編碼的氨基酸序列分別見序列表seqidno.1和2。

核苷酸序列：

氨基酸序列：

實(shí)施例二細(xì)粒棘球絳蟲tsp6的原核表達(dá)載體pet30a-tsp6的克隆構(gòu)建

1．目的基因tsp6的擴(kuò)增

以細(xì)粒棘球絳蟲pbluescriptⅱsk-tsp6（細(xì)粒棘球絳蟲pbluescriptⅱsk-tsp6從海南醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室獲得，社會公眾也可從該教研室獲得）為模板，根據(jù)細(xì)粒棘球絳蟲tsp6基因序列設(shè)計(jì)如下兩對引物：

上游引物序列為：ggcggatccatggttctgac，含bamhi酶切位點(diǎn)，

下游引物序列為：gcgtcgacttaggcactccg，含sali酶切位點(diǎn)。

擴(kuò)增tsp6基因最大的開放閱讀框（orf）中的基因序列（即31-696位基因序列），pcr反應(yīng)條件：96℃預(yù)變性5min；96℃變性30s，66℃復(fù)性40s，72℃延伸60s，25個循環(huán)；72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

圖1為細(xì)粒棘球絳蟲tsp6基因pcr擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果；其中，m，markerⅲ；1，tsp6pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。

2．構(gòu)建tsp6表達(dá)質(zhì)粒

pcr產(chǎn)物經(jīng)純化后，擴(kuò)增得到片段被bamhi和sali酶切并純化后，構(gòu)建入pet-30a相應(yīng)的多克隆酶切位點(diǎn)，構(gòu)建質(zhì)粒pet30a-tsp6，經(jīng)測序鑒定，tsp6的序列信息與目標(biāo)基因序列一致：核苷酸序列為序列表seqidno.1中第31-696位堿基，編碼221個氨基酸，編碼的氨基酸序列為序列表seqidno.2。

實(shí)施例三細(xì)粒棘球絳蟲tsp6的原核表達(dá)

在不同誘導(dǎo)條件下，重組蛋白的可溶性表達(dá)量有所不同，以下為最佳誘導(dǎo)方法：

制備e.colibl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞，將實(shí)施例2制備得到的質(zhì)粒pet30a-tsp6轉(zhuǎn)化入e.colibl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞中，劃線接種e.colibl21(de3)-pet30a-tsp6至lb固體培養(yǎng)基上，37℃孵育過夜；挑取培養(yǎng)基上單克隆至5mllb液體培養(yǎng)基中，于37℃，200r/min振蕩培養(yǎng)2小時，使od值至0.6；取2ml菌液接種至300mllb液體培養(yǎng)基中，于37℃，200r/min振蕩培養(yǎng)，使od值至0.6；加入iptg（0.1mmol／l）于18℃，120r/min誘導(dǎo)振蕩培養(yǎng)6小時；4℃12000g/min，離心10min收集細(xì)菌；超聲破碎細(xì)菌，功率150w，超聲6s，間歇6s，35min后提取上清，并進(jìn)行sds-page電泳，可見蛋白在上清液中表達(dá)量很高，呈可溶性表達(dá)（見圖2）。重組蛋白質(zhì)大部分為可溶性蛋白，占大腸桿菌可溶性總蛋白70%。

為了尋找到最佳誘導(dǎo)條件，申請人進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)，圖2為細(xì)粒棘球絳蟲tsp6在不同誘導(dǎo)條件下的原核表達(dá)。

其中，a圖中，m：marker；1-4，bl21（de3）-pet30a-tsp6于37℃，iptg分別為1、0.5、0.25、0.1mmol/l，誘導(dǎo)18h后上清液的電泳圖；

b圖中，m：marker；1-4，bl21（de3）-pet30a-tsp6于30℃，iptg分別為1、0.5、0.25、0.1mmol/l，誘導(dǎo)12h后上清液的電泳圖；

c圖中，m：marker；1-4，bl21（de3）-pet30a-tsp6于25℃，iptg分別為1、0.5、0.25、0.1mmol/l，誘導(dǎo)12h后上清液；

d圖中，m：marker；1-3，bl21（de3）-pet30a-tsp6于18℃，iptg分別為0.5、0.25、0.1mmol/l，誘導(dǎo)6h后上清液。

由圖2中可見，在誘導(dǎo)溫度為37℃，iptg分別為1、0.5、0.25、0.1mmol/l，誘導(dǎo)18h后，上清液中未見呈可溶性表達(dá)的tsp6；將誘導(dǎo)溫度降至30℃，iptg分別為1、0.5、0.25、0.1mmol/l，誘導(dǎo)12h后，上清液中仍未見呈可溶性表達(dá)的tsp6；進(jìn)一步降低誘導(dǎo)溫度至25℃，iptg分別為1、0.5、0.25、0.1mmol/l，誘導(dǎo)12h后，上清液中仍未見呈可溶性表達(dá)的tsp6；繼續(xù)將誘導(dǎo)溫度降至18℃，iptg分別為0.5、0.25、0.1mmol/l，誘導(dǎo)6h后，可見用0.1mmol/liptg誘導(dǎo)后上清液中出現(xiàn)了呈可溶性表達(dá)的tsp6，且表達(dá)量很高，占大腸桿菌可溶性總蛋白的70%左右，故將此條件作為tsp6原核誘導(dǎo)表達(dá)的最優(yōu)條件。

實(shí)施例四細(xì)粒棘球絳蟲tsp6的親和層析純化

應(yīng)用hispurcobalt（clontech）純化系統(tǒng)純化目的蛋白。histalon^tmgravitycolumns預(yù)裝柱購自日本clontech公司，型號為：635655。

在滴加各種物質(zhì)時，滴加速度為1滴/15秒。

不同的純化方法得到的重組蛋白的純化效果不同，需要對純化方法進(jìn)行優(yōu)化。以下為部分優(yōu)化過程：

加入20ml超純水于histalon^tmgravitycolumns預(yù)裝柱中，使其緩慢的流過柱內(nèi)填充的介質(zhì)；加入20ml結(jié)合緩沖液（50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph8.0），使其緩慢的流過柱內(nèi)填充的介質(zhì)；上樣，加入4ml通過超聲破碎e.colibl21(de3)-pet30a-tsp6提取的上清液，控制流速使其緩慢流過柱內(nèi)介質(zhì)并收集；加入40ml漂洗緩沖液（50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，20mm/l咪唑，ph8.0），控制流速使其緩慢流過柱內(nèi)介質(zhì)，以洗脫雜蛋白；加入100mm/l咪唑洗脫液（100mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其緩慢流過柱內(nèi)介質(zhì)并收集；加入200mm/l咪唑洗脫液（200mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其緩慢流過柱內(nèi)介質(zhì)并收集；加入300mm/l咪唑洗脫液（300mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其緩慢流過柱內(nèi)介質(zhì)并收集；加入400mm/l咪唑洗脫液（400mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其緩慢流過柱內(nèi)介質(zhì)并收集；加入500mm/l咪唑洗脫液（500mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其緩慢流過柱內(nèi)介質(zhì)并收集。將收集的洗脫液分別進(jìn)行sds-page分析，檢查蛋白的純化程度，見圖3中的a圖。

圖3為細(xì)粒棘球絳蟲tsp6親和層析純化結(jié)果。

其中，在a圖中，m：marker；1，bl21（de3）-pet30a-tsp6上清原樣；2，蛋白上樣過柱后流穿液；3，100mm/l咪唑洗脫液；4，200mm/l咪唑洗脫液；5，300mm/l咪唑洗脫液；6，400mm/l咪唑洗脫液；7，500mm/l咪唑洗脫液。

由圖3中的a圖可見：分別用100mm/l、200mm/l、300mm/l、400mm/l、500mm/l咪唑洗脫液均能夠?qū)⒛康牡鞍紫疵撓聛恚峭瑫r也將雜蛋白洗脫下來，純化效果不好，故進(jìn)一步優(yōu)化蛋白純化條件，使用以下方法進(jìn)行純化。

加入30ml20mmmes（2-（n-嗎啉）-乙磺酸，ph5.0）緩沖液于histalon^tmgravitycolumns預(yù)裝柱中沖洗介質(zhì)；加入30ml超純水，使其緩慢的流過柱內(nèi)填充的介質(zhì)；加入10mltris-結(jié)合緩沖液（20mm/ltris，500mm/lnacl，20mm/l咪唑，ph8.0），控制流速使其緩慢流過柱內(nèi)介質(zhì)；上樣，加入5ml通過超聲破碎e.colibl21(de3)-pet30a-tsp6提取的上清液，控制流速使其緩慢流過柱內(nèi)介質(zhì)；加入20mltris-結(jié)合緩沖液（20mm/ltris，500mm/lnacl，20mm/l咪唑，ph8.0），控制流速使液體緩慢流過柱內(nèi)介質(zhì)；加入1號洗脫液（50mm/l咪唑，20mm/ltris，500mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其緩慢流過柱內(nèi)介質(zhì)并收集；加入2號洗脫液（100mm/l咪唑，20mm/ltris，500mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其緩慢流過柱內(nèi)介質(zhì)并收集；加入3號洗脫液（200mm/l咪唑，20mm/ltris，500mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其緩慢流過柱內(nèi)介質(zhì)并收集；加入4號洗脫液（300mm/l咪唑，20mm/ltris，500mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其緩慢流過柱內(nèi)介質(zhì)并收集。將收集的洗脫液分別進(jìn)行sds-page分析，檢查蛋白的純化程度?？梢娛褂?號洗脫液洗脫可得到純度最高的tsp6（見圖3b），該蛋白分子量約為24.42kd。sds-page結(jié)果見圖3中的b圖。

在圖3中的b圖中，m：marker；1，bl21（de3）-pet30a-tsp6上清原樣；2，蛋白上樣過柱后流穿液；3，1號洗脫液；4，2號洗脫液；5，3號洗脫液；6，4號洗脫液（純化效果最好，純度最高）。

實(shí)施例五檢測細(xì)粒棘球蚴病的elisa試劑盒

檢測細(xì)粒棘球蚴病的elisa試劑盒包括以下組分：

1、包被抗原：以實(shí)施例4得到的純化的重組蛋白為包被抗原，用ph9.6的0.05m/l碳酸鹽緩沖液稀釋純化的重組蛋白至終濃度5μg/ml；

2、封閉液：5g脫脂奶粉溶于100mltbst中；

3、陰性對照：健康人血清，1:200稀釋；

4、酶標(biāo)二抗：過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人igg，1:10000稀釋；

5、tmb顯色液；

6、終止液：2mol/l濃硫酸。

實(shí)施例六細(xì)粒棘球絳蟲抗原tsp6的elisa檢測

以純化后的重組蛋白為抗原，對20份感染棘球蚴病人血清樣品和20份健康人血清樣品進(jìn)行間接elisa檢測。具體方法如下：

用ph9.6的0.05m/l碳酸鹽緩沖液稀釋純化的重組蛋白至終濃度5μg/ml，每孔200μl包被96孔酶標(biāo)板，4℃過夜；甩去孔中液體，以ph7.4的pbst洗板3次(5min/次)后每孔加入200μl封閉液（5g脫脂奶粉溶于100mltbst中），37℃封閉1小時。pbst洗板3次(5min/次)，每孔100μl分別加入細(xì)粒棘球蚴病患者和健康人血清（1∶200稀釋），37℃溫育1小時；pbst洗板3次，每孔100μl加入過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人igg（1：10000稀釋），37℃溫育1小時；pbst洗板3次，每孔100μl加入tmb顯色液，37℃避光反應(yīng)30分鐘，每孔50μl加入2mol/l濃硫酸終止反應(yīng)，測定吸光度（）值。以健康人血清的均值2倍加標(biāo)準(zhǔn)差為陽性判斷值。elisa檢測結(jié)果如表1所示，tsp6對細(xì)粒棘球蚴病患者血清的診斷敏感性為90%（18/20），對細(xì)粒棘球蚴病有較好的免疫診斷價值。

表1細(xì)粒棘球絳蟲tsp6elisa檢測結(jié)果

最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110>蘭州大學(xué)

<120>細(xì)粒棘球絳蟲tsp6重組蛋白及其可溶性表達(dá)方法和純化方法

<210>1

<211>916

<212>dna

<213>細(xì)粒棘球絳蟲tsp6核苷酸序列

<400>1

cggggacacattaggacgatcggagcgaccatggttctgacatgcggagagcagtgcctt60

cgaattctactcgttgtgtgcaatcttttcgtcttcttatttggatgtatatgcactgga120

tttgcggcgtacacgttggccaaagttagggaatacacgagcgatcaaggggctctcatc180

gttcctgcttttatcctcactttagtgctgttaatacttatcctcggctttctggggtgc240

tgtggcgcttggaaactcaattcatgctgtctcaaaacgtacgcgattattatcaccatt300

ctgatcataattgaagtcatctgcggaattctcattctcgtttaccacgacaagggtaaa360

gactttattgccaagttcttgaggcaatgcatcagagaggcggaagttcctggcaataca420

gacatggaagatatgatgagaaatctgcaagaaaagtttgagtgttgtggcgcagatgga480

ccctcagattggcagaacccaggcaattactgctccagacctgacaaccccatatcccag540

ttctcgtcattcttcaagcggggttgcgcggacgctatctacgaatacctgcgaagccat600

gcaatcgtggtaggagtgacagcaattgtgctttccatcgttgagatcggtgcagtcttc660

gccgcctgctgtttggccggcaagcggagtgcctaactacggtaaagagacgagcctcgt720

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