本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種伯氏瘧原蟲配子體重組蛋白(rpgmp22)及其制備方法和在瘧疾傳播阻斷過程中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

瘧疾是瘧原蟲經(jīng)媒介按蚊傳播的一種嚴(yán)重威脅人類健康的感染性寄生蟲疾病，最新who全球瘧疾報告指出，僅2015年全球仍有約429000人死于瘧疾。在瘧疾的高密度流行區(qū)，目前可用的抗瘧疾方法已經(jīng)不足以阻斷瘧疾傳播，耐藥蚊蟲與瘧原蟲的增加與流行更加增大了控制瘧疾的難度。因此，國際瘧疾消除專家委員會(malera)認(rèn)為控制瘧疾傳播的關(guān)鍵措施是研發(fā)新的控制方法，有效地阻斷瘧疾的傳播，而疫苗無疑是完成這項工作的最佳武器。瘧疾疫苗主要分三大類：紅前期疫苗、紅內(nèi)期疫苗以及傳播阻斷疫苗(tbvs)；其中：紅前期疫苗與紅內(nèi)期疫苗可降低瘧疾的感染率與臨床發(fā)病率，但兩者的候選抗原均暴露于人體免疫系統(tǒng)，受到人體免疫壓力等因素的影響，候選抗原存在廣泛的基因多態(tài)性，傳播阻斷疫苗不僅可以阻斷瘧疾流行的傳播，且其候選抗原主要表達(dá)于蚊蟲階段瘧原蟲表面，不受脊椎動物免疫系統(tǒng)選擇壓力的影響，顯示出較低的多態(tài)水平，不會出現(xiàn)抗原變異，更有利于疫苗的免疫效果。因此,tbvs被認(rèn)為是加速瘧疾控制和最終根除瘧疾的新策略。

tbvs的效應(yīng)機制是以蚊階段瘧原蟲表達(dá)的特異性蟲體表面蛋白作為抗原刺激機體產(chǎn)生抗蚊階段瘧原蟲表面蛋白的特異性抗體。當(dāng)蚊吸入被免疫的人血后，抗蚊階段瘧原蟲表面蛋白的特異性抗體與蚊中腸內(nèi)發(fā)育的瘧原蟲發(fā)生特異性結(jié)合，進(jìn)而阻斷蚊體內(nèi)瘧原蟲的進(jìn)一步發(fā)育。因此，tbvs可以阻斷按蚊將瘧原蟲從一個宿主傳播至另一個宿主。

tbvs候選抗原主要表達(dá)于瘧原蟲的有性生殖階段，即配子體至動合子發(fā)育階段。目前，研究發(fā)現(xiàn)的tbvs候選抗原非常有限，如p230、p48/45、p25和p28。但這幾種瘧原蟲有性階段疫苗候選抗原誘導(dǎo)的特異性抗體尚不能達(dá)到令人滿意的傳播阻斷效果。因此，瘧疾防控的重點策略是迫切需要篩選并增加新型瘧原蟲有性階段候選抗原，并制備重組蛋白，為后續(xù)開發(fā)高效、安全的tbv疫苗提供有效靶點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述問題，本發(fā)明目的在于提供一種伯氏瘧原蟲配子體重組蛋白(rpgmp22)及其制備方法和在瘧疾傳播阻斷中的應(yīng)用。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的具體方案如下。

本發(fā)明提供的伯氏瘧原蟲配子體重組蛋白(rpgmp22)的氨基酸序列為seqidno：1；或與序列seqidno.1限定的氨基酸序列同源性在95-100％編碼相同功能蛋白質(zhì)的氨基酸序列；或seqidno.1所示的氨基酸序列經(jīng)增加、缺失或替換一個或多個氨基酸且具有同等活性的衍生的蛋白。所述的合成用于編碼伯氏瘧原蟲配子體重組蛋白具有200個氨基酸，其位于pgmp22全長蛋白的第19-218位氨基酸殘基位置，其氨基酸序列為seqidno.1：ser-his-lys-asn-ile-ile-gln-ile-asn-tyr-lys-ile-asn-ser-tyr-ser-ala-asn-asn-asp-asn-ile-gln-trp-asn-ser-ile-gly-ala-phe-val-leu-asp-lys-asn-gln-ile-tyr-asn-thr-ser-asn-val-tyr-ile-asn-glu-lys-asn-lys-leu-ile-lys-lys-leu-lys-glu-gln-asn-phe-asp-tyr-val-leu-phe-gln-leu-cys-tyr-lys-ser-val-pro-gln-asn-cys-ile-gln-thr-tyr-ile-asp-arg-lys-lys-ile-gln-asn-pro-glu-asn-phe-ile-leu-leu-ile-gly-leu-asp-asn-asn-tyr-met-pro-tyr-val-leu-asn-tyr-arg-thr-tyr-asp-lys-val-asn-asp-lys-asn-ile-lys-val-phe-tyr-asp-leu-phe-ala-ile-lys-val-leu-ser-val-ser-leu-pro-ile-asn-ile-asn-lys-ile-gln-thr-asp-asp-asn-ile-asn-lys-asn-lys-tyr-lys-gly-asn-glu-asn-gly-lys-asn-lys-asp-glu-pro-lys-ser-phe-leu-arg-lys-tyr-trp-ile-tyr-ile-ala-ile-phe-leu-leu-ser-leu-ser-phe-ser-lys-his-leu-thr-glu-asn-thr-gln-gln-thr-gly-asp-ser。

本發(fā)明還提供編碼上述伯氏瘧原蟲配子體重組蛋白的基因，由含編碼上述重組蛋白的基因?qū)Φ闹亟M表達(dá)載體也屬于本發(fā)明的范圍，所述的重組表達(dá)載體由含有瘧疾傳播阻斷的重組蛋白的基因原核表達(dá)載體組成，所述的原核載體為pet-32a表達(dá)載體。

所述的編碼該重組蛋白的核苷酸為600bp，其序列為seqidno：2：tcacataaaaatataattcaaataaattataaaataaattcctactcagctaataatgataatatacaatggaatagtattggagcatttgtattagataaaaaccaaatatataacacgtccaacgtttatataaatgaaaaaaataaactcataaaaaaactaaaagaacagaattttgattatgttttatttcaattgtgctataaatctgttccccaaaattgtatacaaacatatattgatagaaagaaaatacaaaatccagaaaattttattttattaataggtttagataataattatatgccatatgtgctaaactatcgaacctatgataaagtcaatgataaaaatataaaagtattttatgatttatttgcaatcaaggttttatcagtttctttaccaattaatattaataaaatacaaactgatgacaacattaataaaaataagtataaaggaaatgaaaatgggaaaaataaagatgagcccaaatcatttctgaggaaatactggatttatatagctatatttttattgtcgctatctttttcaaaacaccttactgaaaatacacaacagacaggtgattca。

優(yōu)選的，所述的重組表達(dá)載體為大腸桿菌dh-5α表達(dá)菌株。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了上述重組蛋白的制備方法，所述方法包括引物的設(shè)計、目的基因的擴增、重組表達(dá)載體的構(gòu)建、重組蛋白的表達(dá)和純化。

所述的伯氏瘧原蟲配子體重組蛋白pgmp22在制備瘧疾傳播阻斷疫苗中的應(yīng)用。

本發(fā)明的顯著效果。

本發(fā)明旨在通過生物信息學(xué)的分析和分子生物學(xué)的實驗驗證，提供一種新型的具有傳播阻斷效應(yīng)的重組蛋白，以進(jìn)一步提高瘧疾傳播阻斷效果。

本發(fā)明所述的重組蛋白是通過對伯氏瘧原蟲進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測出配子體表達(dá)的一種表面蛋白，設(shè)計全長片段，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)、純化，并進(jìn)行動物免疫，獲得免疫血清，驗證其傳播阻斷效應(yīng)。為進(jìn)一步確定其功能,我們還制備了相應(yīng)的抗體和基因敲除及基因恢復(fù)蟲株,通過功能實驗,明確其傳播阻斷效果。本發(fā)明所利用的基因恢復(fù)技術(shù)，其原理是利用敲除蟲株的基因組與pcr擴增的目的基因及雙側(cè)同源臂的片段發(fā)生同源重組，對預(yù)先敲除的基因進(jìn)行基因恢復(fù)達(dá)到使基因組完整的目的。

應(yīng)該明確的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開的seqidno.1氨基酸序列，在不影響其蛋白生物活性的前提下，對于其實施取代、缺少和/或增加一個或多個氨基酸，蛋白質(zhì)序列比對同源性在95％以上，所得到所述蛋白的突變體序列。因此，本發(fā)明還包括對seqidno.1所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺少和/或增加一個或多個氨基酸得到高同源性且具有生物活性和相同功能的衍生蛋白。本發(fā)明還提供了一種基因打靶技術(shù)敲除伯氏瘧原蟲配子體蛋白(pgmp22)后獲得蟲株δpgmp22。由含上述重組蛋白目的基因兩側(cè)同源臂的重組打靶載體也屬于本發(fā)明的范圍，該重組打靶載體分別插入目的基因兩側(cè)同源臂，含有hdhfr耐藥基因用來篩選陽性克隆蟲株。該打靶載體為pl0034表達(dá)載體。本發(fā)明還提供了一種含有上述重組打靶載體的大腸桿菌tg1菌株。

本發(fā)明首次用分子生物學(xué)方式篩選伯氏瘧原蟲配子體蛋白(plasmodiumbergheigametocytemembraneprotein22，pgmp22，pbanka_030590)。并確定瘧原蟲有性生殖階段表達(dá)的pgmp22的基因結(jié)構(gòu)特點。pgmp22是分子量為25812da的保守膜蛋白，存在一個信號肽及兩個低度復(fù)雜區(qū)，與其他瘧原蟲株高度同源。隨后，應(yīng)用原核表達(dá)系統(tǒng)成功地表達(dá)并純化了可溶性的重組蛋白rpgmp22，經(jīng)動物免疫，收獲免疫血清。利用該血清對pgmp22進(jìn)行定位，為進(jìn)一步功能的研究提供新的理論與實驗依據(jù)。然后，利用基因打靶技術(shù)敲除pgmp22，獲得pgmp22基因敲除型瘧原蟲株δpgmp22，并對δpgmp22進(jìn)行了詳細(xì)的表型與生物學(xué)功能研究，明確pgmp22基因?qū)Ο懺x生活史的影響；并利用雙交叉同源重組對δpgmp22基因敲除蟲株進(jìn)行了基因恢復(fù)，研究恢復(fù)后的蟲株與wt和敲除蟲株在表型和生物學(xué)功能上的異同；以及利用前期制備的重組蛋白rpgmp22獲得的免疫血清，鑒定pgmp22的生物學(xué)功能和傳播阻斷效應(yīng)，為瘧疾疫苗的研制開發(fā)打下基礎(chǔ)。

本發(fā)明所利用的基因打靶技術(shù)，其原理是利用活細(xì)胞基因組dna可與外源性dna的同源序列發(fā)生同源重組，對預(yù)先選擇的基因進(jìn)行定點修飾以達(dá)到改變基因組中某一特定基因的目的。該技術(shù)的優(yōu)點是能將外源基因引入到瘧原蟲基因組dna的特定片段上，并靶向敲除目的基因，而靶向引入的基因隨基因組dna的復(fù)制而穩(wěn)定復(fù)制，因此可在活體內(nèi)對某一特定基因的功能進(jìn)行研究，并可在體內(nèi)分析瘧原蟲相應(yīng)蛋白的功能。因鼠瘧整個生命周期的實驗程序均可以進(jìn)行人工操作，具有明顯的易用性。鼠瘧的基因組與人瘧的基因組約有80％的同源性，所以通過敲除鼠瘧中的靶基因、明確其生物學(xué)功能來推斷相應(yīng)的靶基因在人瘧中的生物學(xué)作用也被廣泛應(yīng)用。

附圖說明

圖1為對pgmp22蛋白同一物種序列比對的alignment結(jié)果示意圖。

圖2為對pgmp22蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測的結(jié)果示意圖。

圖3為對pgmp22蛋白進(jìn)行b細(xì)胞表位預(yù)測的結(jié)果示意圖。

圖4為sds-page電泳檢測重組蛋白rpgmp22的表達(dá)和純化結(jié)果。

圖5為elisa檢測重組蛋白rpgmp22免疫小鼠所得抗血清的抗體滴度水平。

圖6為westernblot檢測抗血清中抗體的特異性，鑒定pgmp22的定位階段。

圖7為ifa檢測抗血清中抗體識別天然抗原的能力，鑒定pgmp22的定位階段。

圖8為基因敲除及恢復(fù)載體構(gòu)建模式圖。

圖9為pcr鑒定基因敲除及恢復(fù)基因型的結(jié)果。

圖10為基因敲除及恢復(fù)后表型的鑒定。

圖11為重組蛋白rpgmp22免疫小鼠后的體內(nèi)傳播阻斷效應(yīng)。

具體實施方式

以下所述是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明限定范圍的前提下，還可以做出若干改進(jìn)，這些改進(jìn)也為本發(fā)明的保護范圍。

一、試驗材料。

1.1菌株及質(zhì)粒：大腸桿菌dh5α，m15和tg1(購自北京鼎國昌盛公司)，大腸桿菌escherichiacolirosetta-gamib(de3)(購自杭州豐?？萍加邢薰?，原核表達(dá)載體pet32a和打靶載體pl0034(購自clontech公司)。

1.2蟲株：伯氏瘧原蟲(p.berghei)(ankastrain2.34)，獲贈于日本愛媛大學(xué)。

1.3動物：清潔級balb/c小鼠購自北京維通利華公司。

1.4引物合成服務(wù)由深圳華大科技有限公司提供。

1.5主要試劑和儀器。

主要試劑：胰蛋白胨、酵母提取物購自oxoid公司，氯化鈉購自dm公司，基因組提取試劑盒購自takara公司，質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司，dna聚合酶和ligationhigh連接酶購自toyobo公司，限制性內(nèi)切酶購自neb公司，ni-nta為novagen公司產(chǎn)品，最小截留分子量為3500da的透析袋購自millipore公司產(chǎn)品，hrp標(biāo)記的二抗購自北京鼎國昌盛公司，鼠源alexa-488熒光二抗購自invitrogen公司，乙胺嘧啶購自sigma公司，5-氟胞嘧啶購自sigma公司，bca定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

主要儀器有：水平電泳儀和垂直電泳儀(上海天能科技有限公司)，酶聯(lián)儀(thermo，multiskanmk3)，高速離心機(hitachi,cr22gⅲ)。

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做詳細(xì)的說明。

實施例1。

瘧疾傳播阻斷疫苗候選抗原pgmp22確定及其重組蛋白的制備。

1.利用分子生物信息學(xué)技術(shù)，鑒定并預(yù)測pgmp22的結(jié)構(gòu)特點和功能。

pgmp22(pbanka_030590)基因在瘧原蟲數(shù)據(jù)庫中被描述為“保守的瘧原蟲蛋白，功能未知”。bioedit分析顯示，pgmp22蛋白在瘧原蟲物種中相對保守見圖1，圖中可見氨基酸殘基完全同源的為黑色陰影，同源性大于50％的為灰色陰影。smart分析顯示，pgmp22蛋白含有一個信號肽及兩個低度復(fù)雜區(qū)，為表達(dá)全長蛋白，我們避開信號肽選取b細(xì)胞表位富集區(qū)獲得全長片段，即從n端起得第19到218個氨基酸殘基，共計200個氨基酸殘基作為本發(fā)明所設(shè)計的rpgmp22的氨基酸序列，見圖2，圖中顯示該蛋白存在一個信號肽及兩個低度復(fù)雜區(qū)，第19-218位氨基酸是本發(fā)明表達(dá)的氨基酸序列。b細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果顯示，pgmp22全長蛋白含有7個b細(xì)胞表位，見圖3，我們用來表達(dá)蛋白的片段含有6.5個b細(xì)胞表位。

2.重組蛋白表達(dá)載體pet32a-pgmp22的構(gòu)建。

2.1瘧原蟲基因組dna的提取。

6-8周齡雌性balb/c小鼠腹腔注射200μl苯肼(6mg/ml)，三天后小鼠腹腔感染1×10⁷p.berghei感染的紅細(xì)胞，感染第四天開始檢測瘧疾血癥，當(dāng)瘧疾血癥達(dá)到30％左右時，肝素鈉抗凝取心臟血液，按照血液基因組dna提取試劑盒takaradnaextractionkit說明書來提取p.berghei瘧原蟲基因組dna；將提取后的dna測定濃度后，-20℃保存。

2.2引物設(shè)計合成。

利用primerpremier5軟件針對原核表達(dá)載體pet32a(+)設(shè)計引物，上下游引物5’端分別引入限制性內(nèi)切酶bamhi和noti酶切位點,引物序列如下。pgmp22-f(seqidno：3)：ctggatcctcacataaaaatataattcaaataaattat。pgmp22-r(seqidno：4)：cagcggccgctgaatcacctgtctgttgtgtattt。

2.3目的基因的pcr擴增。

將引物稀釋后以p.berghei基因組dna為模板，以pgmp22-f和pgmp22-r為引物擴增基因片段。

pcr反應(yīng)體系具體為：10μm引物pgmp22-f1.5μl、10μm引物pgmp22-r1.5μl、2mmdntps5μl、10×緩沖液5μl、25mm硫酸鎂3μl、基因組dna模板1μl、dna聚合酶1μl、超純水補充至50μl。

pcr反應(yīng)程序如下:98℃2min—98℃10sec，56℃30sec，68℃1min，35個循環(huán)—68℃5min。

2.4pcr產(chǎn)物的回收。

將上述pcr擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下目的基因片段，按照dna純化試劑盒操作說明進(jìn)行pcr產(chǎn)物的回收。

2.5pet32a-pgmp22載體的構(gòu)建。

將所得的回收產(chǎn)物克隆入pmd18-t載體后，轉(zhuǎn)化宿主菌dh-5α，采用菌體pcr方法鑒定陽性克隆，挑取陽性克隆并提取質(zhì)粒后，送華大基因公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果經(jīng)ncbi數(shù)據(jù)庫中的blast工具進(jìn)行比對。測序結(jié)果正確的質(zhì)粒及pet32a載體用限制性核酸內(nèi)切酶bamhi和noti進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，條件為37℃反應(yīng)2h，將酶切后的dna片段及載體回收并純化。

酶切反應(yīng)體系具體為：pcr產(chǎn)物35μl、bamhi1μl、noti1μl、10x酶切緩沖液5μl、超純水8μl。

pet32a載體酶切體系：pet32a20μl、bamhi1μl、noti1μl、10x酶切緩沖液5μl、超純水23μl。

用ligationhigh連接酶連接回收后的片段及pet32a載體，16℃連接1h，連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌tg1中，采用菌體pcr方法鑒定陽性克隆，并挑取陽性克隆提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定后保存菌種。

連接體系如下：pcr產(chǎn)物bamhi、noti雙酶切回收片段9μl、pet32a質(zhì)粒bamhi、noti雙酶切產(chǎn)物1μl、ligationhigh10μl。

3.蛋白表達(dá)、純化與鑒定。

挑取經(jīng)酶切鑒定正確的陽性菌落，37℃搖菌過夜，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至原核表達(dá)菌株escherichiacolirosetta-gamib(de3)中；取轉(zhuǎn)化成功的菌液按1:100的比例轉(zhuǎn)接到新鮮的lb培養(yǎng)基，37℃搖菌2h后測定菌液的od值；當(dāng)od值達(dá)到0.6-0.8后，加入iptg至終濃度1.0mm，20℃誘導(dǎo)8h；10000rpm離心10min收菌；菌體加入1×ni-nta結(jié)合緩沖液重懸并進(jìn)行超聲裂解菌體(超聲2s，間隔3s，全程時間30min，冰上進(jìn)行)，4℃條件下，12000r/min離心5min，取上清液樣品，加至5ml50％鎳氨三乙酸瓊脂糖柱ni-ntahis·bindsuperflow中純化蛋白；將純化后的蛋白放入透析袋中，并在含咪唑的pbs緩沖液中進(jìn)行梯度透析，4℃條件下進(jìn)行，最終的產(chǎn)品溶于純的pbs緩沖液中；10％的聚丙烯酰胺凝膠電泳證明純化成功(目標(biāo)蛋白rpgmp22的分子量約為22kda)，見圖4，其中，泳道m(xù)為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(蛋白marker)；泳道rpgmp22為純化后重組蛋白，蛋白分子量為22kda，所得蛋白大小與預(yù)期相符。

實施例2。

免疫血清的制備及蛋白定位。

1.免疫血清的制備。

6-8周齡balb/c雌性小鼠10只，分2組，每組5只。第1組注射實施例1制備的重組蛋白，第2組為pbs對照組。用純化的重組蛋白(50μg/小鼠)與弗氏完全佐劑研磨為油包水狀乳劑，100μl/只皮下注射免疫小鼠。于第3周和第5周再分別給予兩次加強免疫，25μg重組蛋白與弗氏不完全佐劑研磨為油包水狀乳劑，100μl/小鼠皮下注射免疫小鼠。第三次免疫后10天收集小鼠血清，elisa檢測小鼠血清特異性抗體水平，與pbs免疫組相比抗體水平顯著升高(p<0.01)，抗體效價超過1:256000，見圖5，抗體滴度達(dá)到1:256000，證明重組蛋白具有較強抗原性。

2.pgmp22表達(dá)階段的確定。

2.1westernblot鑒定pgmp22的表達(dá)階段。

純化的配子體、合子和動合子用0.15％的皂角苷裂解去除紅細(xì)胞，純度可達(dá)到80％以上，用裂解液(1％tritonx-100,2％sds，pbs溶解，含蛋白酶抑制劑)進(jìn)行裂解30min。5×10⁷/泳道瘧原蟲用10％的sds-page電泳分離。電泳完畢后，4℃60v恒壓轉(zhuǎn)膜3h。以5％脫脂奶粉(tbs溶解)4℃封閉過夜。tbst(0.1mtbs，ph7.4，0.02％tween20)漂洗三次，每次5min。tbst稀釋抗rpgmp22鼠血清(1:500)與pvdf膜室溫結(jié)合3h。小鼠抗rpbhsp70蛋白血清(1:500)作為陽性對照。用tbst將pvdf膜洗滌三次，每次5min。再用tbst稀釋hrp標(biāo)記的山羊抗小鼠igg(1:5000)，孵育pvdf膜，室溫2h。tbst洗滌三次后用ecl發(fā)光方法在熒光圖像分析系統(tǒng)中檢測。結(jié)果顯示在配子體階段約22kda處有特異性條帶，即抗rpgmp22免疫血清可識別配子體階段表達(dá)的蛋白，見圖6，其中，泳道泳道gam為配子體抗原，泳道zyg為合子抗原，泳道ook為動合子抗原；hsp70為陽性對照用來定量蛋白的上樣量。在合子和動合子抗原泳道沒有特異性條帶，在配子體抗原泳道上22kda左右有特異性條帶，證明pgmp22主要在瘧原蟲配子體階段表達(dá)。

2.2ifa鑒定pgmp22的表達(dá)階段。

純化后的各階段瘧原蟲經(jīng)pbs洗一次后，4％多聚甲醛室溫固定20min，細(xì)胞經(jīng)/不經(jīng)0.1％tritonx-100進(jìn)行透膜10min。用50mm甘氨酸/pbs進(jìn)行漂洗后，細(xì)胞用含5％脫脂奶粉的pbs37℃封閉30min。加入1:500稀釋的抗rpgmp22免疫血清或抗pbs21單克隆抗體(陽性對照)，37℃孵育2h。隨后加入羊抗鼠alexa-488熒光二抗(1:500稀釋)，37℃孵育60min。dapi染色30min后經(jīng)抗淬滅封片劑goldantifadereagent封片，熒光顯微鏡觀察結(jié)果，adobephotoshop分析，結(jié)果顯示抗rpgmp22的免疫血清可識別雌雄配子體及雌雄配子細(xì)胞表面抗原，提示pgmp22主要表達(dá)于瘧原蟲的受精前后有性生殖階段表面，見圖7，主要包括的瘧原蟲階段有：雌、雄配子體及雌、雄配子；pbs21標(biāo)記的動合子用作陽性對照。bf為亮視野，fitc為綠色熒光，dapi為核染色，merge為fitc和dapi的合成圖像。在裂殖體、合子、未成熟動合子及成熟動合子階段沒有綠色熒光，在雌、雄配子體及雌、雄配子階段有綠色熒光。證明pgmp22主要在瘧原蟲受精前后有性階段表達(dá)。

實施例3。

打靶載體的構(gòu)建與δpgmp22瘧原蟲的獲取。

1.基因敲除的打靶載體的構(gòu)建。

應(yīng)用雙交叉同源重組的方法靶向敲除pgmp22基因，成功構(gòu)建基因敲除的打靶載體。根據(jù)載體構(gòu)建流程圖所示，見圖8，pgmp22為目的基因，5’utr和3’utr為目的基因兩側(cè)同源臂，p1、p2及p3為設(shè)計的鑒定基因敲除基因型的引物。

首先，應(yīng)用pcr方法成功擴增出5’utr片段，擴增長度為877bp，上下游引物5’端分別引入限制性內(nèi)切酶hindⅲ和psti酶切位點；引物序列如下：pgmp22-5u-f(seqidno：5)：cccaagcttgccatgggttttgggccatgttatac；pgmp22-5u-r(seqidno：6):ggctgcagtttcccctacccttttatcgttaat；將5’utr及pl0034載體通過hindⅲ與psti雙酶切構(gòu)建出質(zhì)粒pl0034-pgmp22-5u。

隨后，成功擴增出3’utr片段，擴增長度為974bp，上下游引物5’端分別引入限制性內(nèi)切酶kpni和noti酶切位點。引物序列如下：pgmp22-3u-f(seqidno：7)：ggggtaccatttgaatgatccgtagatgttaag；pgmp22-3u-r(seqidno：8):attgcggccgcgaggtgcattattctttaacttatg；將3’utr及pl0034-pgmp22-5u通過kpni和noti雙酶切構(gòu)建出重組質(zhì)粒pl0034-pgmp22-5u-3u。

重組質(zhì)粒經(jīng)公司測序，測序結(jié)果與plasmodb瘧原蟲網(wǎng)站公布序列一致。

2.p.berghei裂殖體的培養(yǎng)與分離。

p.berghei感染苯肼處理過的balb/c小鼠，待感染率達(dá)5～10％，乙醚麻醉小鼠，心臟采血并將血液置于裂殖體培養(yǎng)基中(rpmi1640含20％(v/v)胎牛血清(fbs),50mg/l青霉素與鏈霉素,50ml培養(yǎng)基/0.5ml血液)，37℃100rpm培養(yǎng)16小時。培養(yǎng)物經(jīng)55％的nycodenz密度梯度離心分離，收集中間灰白層裂殖體，pbs清洗2次，取lμl經(jīng)giemsa染色，光鏡下計數(shù)裂殖體含量與純度。

3.基因敲除型瘧原蟲δpgmp22及基因恢復(fù)型瘧原蟲pgmp22-re的制備、篩選與鑒定。

pl0034-pgmp22-3u-5u打靶質(zhì)粒經(jīng)大量提取后，用hindⅲ和noti進(jìn)行酶切使質(zhì)粒完全線性化。將提純后的線性化質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入純化的裂殖體內(nèi)，并經(jīng)尾靜脈注射給小鼠。pgmp22基因?qū)⒈籶l0034載體內(nèi)的藥物壓力選擇標(biāo)記物基因hdhfr與yfcu等替代，即是通過同源重組雙交叉法，達(dá)到完全敲除pgmp22基因的目的。線性化質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染瘧原蟲24h后，給予小鼠乙胺嘧啶(0.07mg/ml)飲用水，進(jìn)行藥物篩選。第6天開始取尾靜脈血，制備薄血膜片，吉姆薩染色光學(xué)顯微鏡下觀察監(jiān)測外周血是否有瘧原蟲出現(xiàn)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)瘧原蟲后，取少量尾血進(jìn)行外周血pcr鑒定基因型，設(shè)計pcr鑒定引物如下：p1和p2擴增出的是野生型；引物p1和p3擴增出的是同源重組成功的序列。序列如下：

p1(seqidno：9)：gtgaaactcaaacaaaccacacatagatta。

p2(seqidno：10)：ttatcataggttcgatagtttagcacat。

p3(seqidno：11)：ctggtgctttgaggggtgag。

pcr鑒定含有重組瘧原蟲基因型出現(xiàn)后，在瘧疾血癥達(dá)到1-3％時，小鼠尾靜脈取血，用生理鹽水將小鼠血液稀釋，最終稀釋量為1個irbc/100μl。將稀釋的瘧原蟲經(jīng)尾靜脈注射給10只balb/c小鼠(100μl/只)進(jìn)行克隆。小鼠給予乙胺嘧啶水飲用，感染后的第6天開始監(jiān)測外周血是否有耐藥蟲株的出現(xiàn)，經(jīng)瘧原蟲感染后的小鼠尾血再次pcr進(jìn)行鑒定pcr鑒定結(jié)果顯示我們成功敲除pgmp22基因，見圖9，wt和ko分別為野生型瘧原蟲和敲除型瘧原蟲的基因組,其中，p1和p2擴增的是野生的基因型(1449bp)，p1和p3擴增的是重組成功的基因型(1180bp)。pcr結(jié)果顯示基因敲除成功。

實施例4。

敲除型瘧原蟲δpgmp22表型及功能分析。

6-8周齡的雌性balb/c小鼠，分成兩組，每組5只，苯肼處理小鼠后分別感染5×10⁶個δpgmp22或野生型瘧原蟲，于感染后的第三天giemsa開始計算配子體率與雌、雄配子體比率。同時尾靜脈取10μl血液置于40μl動合子培養(yǎng)液中，瘧原蟲在25℃下培養(yǎng)15min，10min內(nèi)用普通顯微鏡觀察配子出絲數(shù)。將培養(yǎng)物繼續(xù)在19-20℃下培養(yǎng)24h，用抗pbs21抗體與羊抗鼠alexa-488熒光二抗標(biāo)記培養(yǎng)物，在熒光顯微鏡下計數(shù)合子，未成熟動合子及成熟動合子數(shù)量。小鼠于感染后的第三天，用饑餓了12h的按蚊吸食血液30min，實驗組與對照組每組至少用50只按蚊，吸血后的按蚊于第24小時研磨，取1μl研磨液涂片，giemsa染色后計數(shù)合子，未成熟動合子及成熟動合子數(shù)量。并于第14天進(jìn)行解剖，計數(shù)蚊胃壁的卵囊數(shù)與蚊感染率。δpgmp22型瘧原蟲與野生型(wt)瘧原蟲相比，配子體率及雌、雄配子體比例無顯著差異；在含有等量雄性配子體的情況下，敲除株δpgmp22配子體出絲明顯減少89％(p<0.0001)；動合子數(shù)下降了97％(p<0.0001)。δpgmp22型瘧原蟲感染按蚊后，與野生型相比，其蚊胃內(nèi)動合子及卵囊形成完全被阻斷，蚊子感染率減少到0，差異具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義，見圖10。其中，圖10中a為配子體率，b為雌雄配子體比例，c為雄性配子體出絲數(shù)量，d為體外培養(yǎng)合子、未成熟動合子及成熟動合子數(shù)量，e為24小時蚊胃內(nèi)合子、未成熟動合子及成熟動合子數(shù)量，f為蚊胃內(nèi)壁卵囊數(shù)量。結(jié)果顯示基因敲除之后配子體率及雌雄配子體比例不變，雄性配子體出絲及動合子形成數(shù)量顯著下降，蚊胃內(nèi)動合子和卵囊形成完全被阻斷?；蚯贸懺x與野生型瘧原蟲相比，卵囊數(shù)量及蚊蟲感染率，見表1。結(jié)果顯示基因敲除后卵囊數(shù)量顯著下降，蚊蟲感染率也明顯下降。

實施例5。

基因恢復(fù)蟲株pgmp22-re的制備、篩選與鑒定。

敲除株δpgmp22感染小鼠后，感染率達(dá)到5-10％時，取尾血提取血液基因組，pgmp22-5u-f(seqidno：5)及pgmp22-3u-r(seqidno：8)擴增re-fragment。提取敲除株δpgmp22成熟裂殖體，將re-fragment用hindⅲ和noti進(jìn)行酶切使片段完全線性化。將提純后的線性化質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入純化的裂殖體內(nèi)，并經(jīng)尾靜脈注射給小鼠。線性化片段電轉(zhuǎn)染瘧原蟲48h后，給予小鼠5-氟胞嘧啶飲用水，進(jìn)行藥物篩選。第6天開始取尾靜脈血，制備薄血膜片，吉姆薩染色光學(xué)顯微鏡下觀察監(jiān)測外周血是否有瘧原蟲出現(xiàn)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)瘧原蟲后，取少量尾血進(jìn)行外周血pcr鑒定基因型，設(shè)計pcr鑒定引物如下：p1(seqidno：9)和p2(seqidno：10)擴增的是恢復(fù)成功的基因型；引物p1(seqidno：9)和p3(seqidno：11)擴增出敲除的基因序列，見圖8。

pcr鑒定含有恢復(fù)成功瘧原蟲基因型出現(xiàn)后，在瘧疾血癥達(dá)到1-3％時，小鼠尾靜脈取血，用生理鹽水將小鼠血液稀釋，最終稀釋量為1個irbc/100μl。將稀釋的瘧原蟲經(jīng)尾靜脈注射給10只balb/c小鼠(100μl/只)進(jìn)行克隆。小鼠給予5-氟胞嘧啶水飲用，感染后的第6天開始監(jiān)測外周血是否有耐藥蟲株的出現(xiàn)，經(jīng)瘧原蟲感染后的小鼠尾血再次pcr進(jìn)行鑒定pcr鑒定結(jié)果顯示我們成功恢復(fù)pgmp22基因，見圖9，re為恢復(fù)型瘧原蟲的基因組,其中，p1和p2擴增的是野生的基因型(1449bp)，p1和p3擴增的是重組成功的基因型(1180bp)。pcr結(jié)果顯示基因恢復(fù)成功。

實施例6。

基因恢復(fù)蟲株pgmp22-re表型及功能分析。

6-8周齡的雌性balb/c小鼠5只，苯肼處理小鼠后分別感染5×10⁶個pgmp22-re瘧原蟲，于感染后的第三天，用饑餓了12h的按蚊吸食血液30min，實驗組與對照組每組至少用50只按蚊，吸血后第14天進(jìn)行解剖，計數(shù)蚊胃壁的卵囊數(shù)與蚊感染率。pgmp22-re與δpgmp22型瘧原蟲相比，卵囊形成明顯增多，蚊子感染率恢復(fù)到92.2％，差異具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義，見圖10f為蚊胃內(nèi)壁卵囊數(shù)量。結(jié)果顯示敲除株δpgmp22進(jìn)行基因恢復(fù)之后，蚊胃壁卵囊形成數(shù)量及蚊蟲感染率機會恢復(fù)至野生型水平。基因恢復(fù)瘧原蟲卵囊數(shù)量及蚊蟲感染率，見表1，結(jié)果顯示恢復(fù)型瘧原蟲單個蚊胃壁卵囊形成平均數(shù)量與敲除型相比由0上升到93.7，蚊感染率也恢復(fù)到93.7％。

表1敲除株δpgmp22及恢復(fù)株pgmp22-re蚊胃壁卵囊形成數(shù)量及蚊蟲感染率。

由此可見，pgmp22對雄配子出絲、動合子的發(fā)育以及卵囊的形成均具有至關(guān)重要的作用。

實施例5。

抗rpgmp22抗體傳播阻斷效應(yīng)評價。

1.體內(nèi)傳播阻斷-體外培養(yǎng)實驗。

經(jīng)rpgmp22/pbs免疫的小鼠，于三次免疫后第十天，小鼠經(jīng)腹腔注射1×10⁶p.berghei感染的紅細(xì)胞，感染第3天開始隔天涂片觀察感染率，并于感染第3天觀察配子體率，尾靜脈采血檢測配子體出絲，培養(yǎng)后計數(shù)動合子形成情況。重組蛋白免疫小鼠與對照組小鼠相比，瘧原蟲血癥、配子體率及雌雄配子體比例沒有差異，雄性配子體出絲顯著下降65％(p＝0.002)，動合子形成數(shù)量顯著下降93.4％(p<0.001)。見圖11，其中a為瘧原蟲血癥，b為配子體率，c為雌雄配子體比例，d為雄性配子體出絲，e為體外培養(yǎng)動合子形成數(shù)量。

2.體內(nèi)傳播阻斷-直接膜伺實驗。

經(jīng)rpgmp22/pbs免疫的小鼠，于第三次免疫后第十天，小鼠經(jīng)腹腔注射1×10⁶p.berghei感染的紅細(xì)胞，感染第3天，用至少50只按蚊吸取小鼠血液30min，吸血后第24小時觀察蚊胃內(nèi)動合子形成數(shù)量，并于第14天檢查蚊胃壁上的卵囊形成數(shù)量，重組蛋白免疫小鼠與對照組小鼠相比，蚊胃內(nèi)動合子形成數(shù)量顯著下降96.1％(p<0.001)，蚊胃壁卵囊數(shù)量顯著下降97.4％(p<0.001)。見圖11，其中f為蚊胃內(nèi)動合子形成數(shù)量，g為蚊胃壁上的卵囊形成數(shù)量。卵囊數(shù)量及蚊蟲感染率，見表2，結(jié)果顯示對照組單個蚊胃壁卵囊形成平均數(shù)量與重組蛋白免疫組相比由107.5下降到2.8，蚊感染率也下降了84.1％。

表2：rpgmp22免疫小鼠蚊胃壁卵囊形成數(shù)量及蚊蟲感染率。

但實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改和替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。

序列表

<110>中國醫(yī)科大學(xué)

<120>一種伯氏瘧原蟲配子體重組蛋白（rpgmp22）及其制備方法和在瘧疾傳播阻斷中的應(yīng)用

<160>11

<210>1

<211>200

<212>prt

<213>人工合成

<400>1

serhislysasnileileglnileasntyrlysileasnsertyrseralaasnasnasp

15101520

asnileglntrpasnserileglyalaphevalleuasplysasnglniletyrasnthr

2125303540

serasnvaltyrileasnglulysasnlysleuilelyslysleulysgluglnasnphe

4145505560

asptyrvalleupheglnleucystyrlysservalproglnasncysileglnthrtyr

6165707580

ileasparglyslysileglnasnprogluasnpheileleuleuileglyleuaspasn

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asntyrmetprotyrvalleuasntyrargthrtyrasplysvalasnasplysasnile

101105110115120

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121125130135140

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181185190195200

<210>2

<211>600

<212>dna

<213>人工合成

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tcacataaaaatataattcaaataaattataaaataaattcctactcagctaataatgataatatacaat70

ggaatagtattggagcatttgtattagataaaaaccaaatatataacacgtccaacgtttatataaatga140

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<210>3

<211>38

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<213>人工合成

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<211>35

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<213>人工合成

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<211>35

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<213>人工合成

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<210>6

<211>33

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<213>人工合成

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<210>7

<211>33

<212>dna

<213>人工合成

<400>7

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<210>8

<211>36

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<213>人工合成

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<210>9

<211>30

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<213>人工合成

<400>9

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<210>10

<211>28

<212>dna

<213>人工合成

<400>10

ttatcataggttcgatagtttagcacat28

<210>11

<211>20

<212>dna

<213>人工合成

<400>11

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