本發(fā)明涉及了基因工程和醫(yī)藥領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及酵母表達重組sea-gpi融合蛋白的制備及其在抗腫瘤中的應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明涉及優(yōu)化的適合酵母表達的sea-gpi融合蛋白的編碼序列，以及高效生產(chǎn)sea-gpi融合蛋白的方法。本發(fā)明還涉及含有sea-gpi融合蛋白的藥物組合物。
背景技術(shù)：
：腫瘤已經(jīng)成為當(dāng)前威脅人類生命健康安全的重要疾病。在我國，惡性腫瘤的死亡率已經(jīng)位居所有疾病的榜首。針對腫瘤的發(fā)病機制、各種診療方法的研究一直是腫瘤研究的熱點。近年來，關(guān)于腫瘤生物治療的措施和手段有了諸多新改進，開辟了很多新途徑，取得了很多令人矚目的成果。2013年底science雜志將腫瘤的生物治療成果列為當(dāng)年度十大科技進展之一，更是掀起了腫瘤生物治療的新熱潮。當(dāng)前研究認(rèn)為腫瘤細(xì)胞逃逸免疫監(jiān)視的機制包括：1)mhc分子的下調(diào)或丟失；2)抗原傳遞通路的變化導(dǎo)致無法將腫瘤特異性抗原遞呈給t細(xì)胞；3)激活宿主免疫應(yīng)答必需的共刺激分子或黏附分子的缺失；4)腫瘤局部的細(xì)胞因子缺乏或腫瘤細(xì)胞分泌抑制性因子；5)腫瘤抗原丟失或抗原調(diào)變等。因此提高機體免疫細(xì)胞識別腫瘤特異性抗原的能力、更有效地激發(fā)機體抗腫瘤免疫應(yīng)答的效力與強度成為腫瘤生物治療研究的主要研究方向。超抗原(superantigen，sag)是指一組由細(xì)菌或病毒編碼的具有免疫刺激作用的蛋白分子。超抗原不需要抗原提呈細(xì)胞(antigenpresentingcell，apc)的加工，直接以完整的蛋白質(zhì)分子形式與apc膜上的主要組織相容性復(fù)合體(majorhistocompatibilitycomplex，mhc)ⅱ類分子抗原肽結(jié)合槽外側(cè)區(qū)結(jié)合，導(dǎo)致帶有特異性vβ節(jié)段t細(xì)胞大量活化增殖。超抗原只需極低濃度即可活化大量的淋巴細(xì)胞克隆，其活化t細(xì)胞的效力是普通抗原的數(shù)千倍以上，可強烈激發(fā)細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(cytotoxiclymphocyte，ctls)細(xì)胞毒活性和一系列細(xì)胞因子的產(chǎn)生，是迄今為止已知的t細(xì)胞的最強的有絲分裂原，是一種強大的t細(xì)胞激活劑。葡萄球菌腸毒素a蛋白(staphylococcalenterotoxina，sea)是目前研究最為廣泛的超抗原家族(sea、seb、sec、sed、see等)成員之一，近年來已被廣泛應(yīng)用于腫瘤、炎癥、自身免疫性疾病的研究和治療中。有研究認(rèn)為，制備重組的sea錨定蛋白，可以便捷地將sea固定到多種腫瘤細(xì)胞上制備sea錨定修飾的腫瘤瘤苗，借助超抗原sea強烈的激發(fā)抗腫瘤作用，可有效激 活機體免疫系統(tǒng)對該腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，提高機體對該腫瘤的抑瘤效率，而且能夠減低直接使用sea基因載體轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞帶來的副作用，有望成為腫瘤生物治療的新型制劑。目前國內(nèi)外針對sea錨定修飾瘤苗已經(jīng)進行了一些研究，部分研究涉及將超抗原sea序列與一些錨定序列進行融合。然而，目前開發(fā)的構(gòu)建sea錨定蛋白的真核表達體系，存在明顯的缺點，例如制備純化sea融合蛋白的周期長、得率低，成本大，操作程序復(fù)雜，不利于工程化開發(fā)和臨床應(yīng)用推廣。此外，也有研究涉及通過原核表達體系制備sea錨定蛋白，例如使用pet-28a原核載體在大腸桿菌中表達了sea錨定蛋白，但是原核載體表達sea錨定蛋白的效率低下。此外，采用原核載體構(gòu)建sea錨定蛋白的技術(shù)體系，因為原核表達體系的固有缺陷，導(dǎo)致蛋白表達產(chǎn)物生物活性低，且產(chǎn)生的融合蛋白難以正確地進行蛋白折疊修飾。綜上所述，當(dāng)前利用sea的抗腫瘤效應(yīng)構(gòu)建sea錨定蛋白修飾的瘤苗細(xì)胞可提高機體抗腫瘤效應(yīng)已經(jīng)得到了諸多科學(xué)實驗的驗證，但因為表達體系和工藝等的限制，如何克服原核載體表達能力與產(chǎn)物活性差、真核載體制備困難的缺陷，設(shè)計構(gòu)建具有良好生物學(xué)效應(yīng)、產(chǎn)量高、制備更高效、易于開發(fā)應(yīng)用的sea相關(guān)融合蛋白成為研究者面臨的難題。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的高效、簡便、低成本地制備高活性sea錨定蛋白的方法以及相關(guān)的抗腫瘤藥物。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的就是提供一種高效表達和生產(chǎn)sea-gpi融合蛋白的方法。本發(fā)明的另一目的是提供相應(yīng)的編碼序列、載體、宿主細(xì)胞以及表達和純化的工藝。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種編碼sea-gpi融合蛋白的核苷酸序列，所述的核苷酸序列編碼sea-gpi融合蛋白的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列編碼seqidno:2所示的氨基酸序列或式i所示結(jié)構(gòu)的sea-gpi融合蛋白，而且所述核苷酸序列的sea-gpi融合蛋白編碼區(qū)與seqidno:1所示核苷酸序列有≥95％相同性。在另一優(yōu)選例中，所述核苷酸序列的sea-gpi融合蛋白編碼區(qū)與seqidno:1所示核苷酸序列有≥98％相同性。在另一優(yōu)選例中，所述核苷酸序列的sea-gpi融合蛋白編碼區(qū)與seqidno:1所示核苷酸序列有≥99％相同性。在另一優(yōu)選例中，所述核苷酸序列的sea-gpi融合蛋白編碼區(qū)與seqidno:1所示核苷酸序列有100％相同性。在另一優(yōu)選例中，該編碼sea-gpi融合蛋白的核苷酸序列如seqidno:1所示。在本發(fā)明的第二方面，提供了含有一種表達載體，它含有本發(fā)明第一方面中所述的核苷酸序列。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞含有第二方面中所述的表達載體或者基因組中整合有本發(fā)明第一方面中所述的sea-gpi融合蛋白的編碼序列。在另一優(yōu)選例中，所述宿主細(xì)胞是通過轉(zhuǎn)入本發(fā)明第二方面中所述的表達載體或第一方面中所述的核苷酸序列并經(jīng)同源重組而形成的，從而在基因組或染色體中整合有sea-gpi融合蛋白的編碼序列。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞是畢赤酵母(pichiapastoris)。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞是畢赤酵母(pichiapastoris)gs115菌株。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種生產(chǎn)sea-gpi融合蛋白的方法，它包括以下步驟：(a)在適合表達條件下，培養(yǎng)本發(fā)明第三方面中所述的宿主細(xì)胞，從而表達sea-gpi融合蛋白，其中所述的宿主細(xì)胞是畢赤酵母；(b)分離純化出步驟(a)中所表達的sea-gpi融合蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的畢赤酵母工程細(xì)胞包括快速利用甲醇型和慢速利用甲醇型。在另一優(yōu)選例中，所述的畢赤酵母宿主細(xì)胞的基因組中整合有2-30拷貝的sea-gpi融合蛋白的編碼序列。在本發(fā)明的第五方面，提供了一種sea-gpi融合蛋白，所述的sea-gpi融合蛋白具有式i結(jié)構(gòu)：a-b-c(i)式中，a為sea元件，其序列如seqidno.:2中第1-233位；b為無或連接肽；c為gpi元件，其序列如seqidno.:2中第234-276位；各“-”為肽鍵；并且，所述sea-gpi融合蛋白是酵母表達的重組蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的sea-gpi融合蛋白的糖基化的蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的sea-gpi融合蛋白是糖基化的分子量為約56kd的蛋白。在本發(fā)明的第六方面，提供了一種藥物組合物，它含有本發(fā)明第五方面中所述的sea-gpi融合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物是疫苗組合物或瘤苗組合物。在本發(fā)明的第七方面，提供了本發(fā)明第五方面所述的sea-gpi融合蛋白的用途，它被用于制備預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物為疫苗組合物或瘤苗組合物。在本發(fā)明的第八方面，提供了一種預(yù)防和/或治療腫瘤的方法，所述方法包括步驟：給需要的對象施用本發(fā)明第五方面中所述的sea-gpi融合蛋白，或含所述sea-gpi融合蛋白的藥物組合物。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說明圖1顯示了本發(fā)明中優(yōu)化的sea-gpi融合基因的核苷酸序列，其中第1-699位為sea序列(去除了sea其自身信號肽序列)；下劃線部分(第700-828位)為gpi序列(來自人胎盤堿性磷酸酶的錨定序列，共129堿基)。該優(yōu)化的融合基因序列共828堿基。圖2顯示了原始的sea基因序列，其中下劃線部分為sea信號肽序列的編碼序列(第1-72位)。圖3顯示了對應(yīng)于sea-gpi融合蛋白的原始的gpi錨定肽基因序列。圖4顯示了優(yōu)化的酵母表達的sea-gpi融合基因序列與原始融合基因序列比對，其中下劃線為被改變的堿基。圖5顯示了優(yōu)化的酵母表達的sea-gpi融合基因表達蛋白序列與原始融合基因表達蛋白序列比對。結(jié)果表明，優(yōu)化的融合基因編碼的氨基酸序列(seqidno.:2)與未優(yōu)化的原始基因序列所編碼的蛋白序列無差異，是完全相同。圖6顯示了sea-gpi融合基因酵母表達載體的構(gòu)建圖。圖7顯示了sea-gpi融合基因的gs115酵母高表達菌株篩選。各泳道如下：1:分子量標(biāo)準(zhǔn)品(從下至上分別為：25、30、40、55、70、100、130和170kd)；2：菌株1；3：菌株2；4：菌株3；5：菌株4；6：菌株57：菌株6；8：對照上清。圖8顯示了westernblot方法鑒定gs115/6菌株上清中高表達的sea-gpi融合蛋白。各泳道如下：1.gpi；；2.對照；3.sea-gpi；4.sea；5.對照；6.sea-gpi。圖9顯示了sea-gpi融合蛋白的純化。各泳道如下：1:分子量標(biāo)準(zhǔn)品(從下至上分別為：25、30、40、55、70、100、130和170kd)；2：發(fā)酵上清:3：濃縮上清；4：硫酸銨沉淀蛋白；5：s柱純化峰；6：q柱純化峰；7：分子篩純化峰。圖10顯示了westernblot方法鑒定制備的sea-gpi融合蛋白，其中用抗sea抗體和抗gpi抗體分別檢測蛋白。圖11顯示了hplc分析制備的sea-gpi融合蛋白純度。圖12顯示了本發(fā)明sea-gpi融合蛋白的錨定ct26細(xì)胞能力的檢測結(jié)果。圖13顯示了sea-gpi/ct26瘤苗刺激小鼠t細(xì)胞增殖。其中，曲線包括：1.pbs；2.sea/ct26；3.sea-tm/ct26；4.sea-gpi(g)/ct26；5.sea-gpi(e)/ct26；6.lps。圖14顯示了sea-gpi/ct26瘤苗刺激小鼠t細(xì)胞分泌細(xì)胞因子增多。圖15顯示了sea-gpi/ct26錨定修飾瘤苗接種的荷瘤小鼠的生存曲線。圖16顯示了sea-gpi/ct26錨定修飾瘤苗的荷瘤小鼠的荷瘤體積。圖17顯示了sea-gpi錨定ct26瘤苗的荷瘤小鼠的nk活性。圖18顯示了sea-gpi錨定ct26瘤苗的荷瘤小鼠的ctl活性。具體實施方式本發(fā)明人通過深入而廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)sea錨定蛋白用常規(guī)技術(shù)無法有效地在酵母中表達，其主要原因之一是天然基因序列未經(jīng)合理的優(yōu)化。本發(fā)明人對基因編碼序列進行了針對性優(yōu)化設(shè)計，將優(yōu)化后的sea-gpi融合蛋白的編碼序列(seqidno:1)轉(zhuǎn)入合適的宿主畢赤酵母(p.pastoris)，從而實現(xiàn)了sea-gpi融合蛋白的高水平分泌表達，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。具體地，本發(fā)明人設(shè)計并經(jīng)篩選獲得了優(yōu)化的sea-gpi融合基因，將其導(dǎo)入酵母表達載體ppic9k，篩選高表達gs115酵母菌株，建立酵母高效發(fā)酵表達體系，大量純化制備sea-gpi融合蛋白，并且檢定其抗腫瘤學(xué)效應(yīng)。在本發(fā)明的生產(chǎn)工藝中，因為sea-gpi融合蛋白的表達水平高，可大幅度提高產(chǎn)品得率，從而獲得表達量高、提純方便、得率高、正確折疊且活性高的sea-gpi融合蛋白，因而大幅降低了生產(chǎn)sea錨定蛋白的生產(chǎn)成本，非常適合大規(guī)模生產(chǎn)。seasea基因的全長序列為774bp，其中的1-72位堿基為信號肽序列，共編碼257個氨基酸(如seqidno.:3和4所示)。作為超抗原，sea具有兩個顯著特點：一是在表達mhcⅱ類分子的抗原提呈細(xì)胞的輔助下，sea可不經(jīng)過抗原加工或蛋白酶解過程而被直接提呈給t細(xì)胞，產(chǎn)生免疫學(xué)效應(yīng)；二是針對sea的抗原提呈沒有mhc種屬限制性，人類細(xì)胞可將sea有效提呈給小鼠t淋巴細(xì)胞，反之亦然。barrera等用分別轉(zhuǎn)染了hla-dr、dq和dpα和β基因的鼠纖維母細(xì)胞作為抗原提呈細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)人t淋巴細(xì)胞受sea刺激所產(chǎn)生的增殖反應(yīng)無mhcⅱ類分子種型差異；lando等發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了hla-dr4和cd80的中國倉鼠卵巢細(xì)胞(chinesehamsterovary，cho)可以作為抗原提呈細(xì)胞，有效提呈sea，誘生強烈的t細(xì)胞增殖。sea抗腫瘤作用機制主要有兩種效應(yīng)，一是sag依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(superantigendependentcellmediatedcytotoxicity，sdcc)，sag可以激活cd8+t細(xì)胞 和cd4+輔助性(helper)t細(xì)胞，后者經(jīng)tcr-vβ-超抗原mhcⅱ類分子與mhcⅰ類分子陽性的腫瘤細(xì)胞相互偶聯(lián)后產(chǎn)生強烈的抑瘤作用，而前者具有直接殺傷表達mhcⅰ類分子的腫瘤細(xì)胞的功能。研究表明，t細(xì)胞被超抗原活化后，可對自身激活的hla-dr+的郎格罕氏細(xì)胞(langerhans'cells，lc)產(chǎn)生溶解作用，而對hla-dr-的lc不起作用，表明sdcc能選擇性地消除表達mhcⅱ類分子的靶細(xì)胞；同時，已被超抗原激活的hla-dr+的自身t細(xì)胞也能成為sdcc的靶細(xì)胞而被消滅，對免疫應(yīng)答形成一種免疫反饋調(diào)節(jié)。二是細(xì)胞因子參與的抑瘤作用，被sea激活的t細(xì)胞可釋放多種細(xì)胞因子，例如tnf-α、tnf-β、ifn-γ、il-2等，直接或間接地殺傷腫瘤細(xì)胞，并參與sdcc效應(yīng)，共同發(fā)揮殺瘤作用。已有諸多研究證實sea表達在腫瘤細(xì)胞膜表面可以有效激發(fā)機體針對腫瘤抗原的特異性免疫應(yīng)答，產(chǎn)生腫瘤特異性ctl，分泌抗腫瘤因子il-2等。gpigpi錨定蛋白是指一類通過其羧基端的gpi結(jié)構(gòu)錨定于細(xì)胞膜表面的一類蛋白。在本發(fā)明中，優(yōu)選的gpi元件來自人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞膜表面的人胎盤堿性磷酸酶1(humanplacentalalkalinephosphatase1，hplap-1)和人紅細(xì)胞膜表面的補體衰變加速因子(decay-acceleratingfactor，daf)。gpi錨定蛋白包括多肽部分、gpi部分，多膚的c末端氨基酸連接于gpi上，c末端氨基酸的α羧基與gpi膽胺氨基相結(jié)合，膽胺連接于甘露糖和葡萄糖胺上，葡萄糖胺連于磷脂酞肌醇(phosphatidylinositol，pi)上，pi通過其磷酸基團連于細(xì)胞膜脂質(zhì)外層。gpi的核心結(jié)構(gòu)屬于高度保守序列，主要由線性排列的glycan組成：(蛋白)-膽胺(ethn)-甘露糖(man)-甘露糖-甘露糖-葡萄糖胺(glcn)-磷脂酰肌醇(pl)-(細(xì)胞膜)。gpi錨定蛋白可以與多種新生蛋白羧基末端序列連接。在本發(fā)明中，將目的蛋白sea的優(yōu)化編碼序列和gpi錨定信號肽編碼序列融合重組，構(gòu)建高表達的融合基因并純化表達產(chǎn)物。在本發(fā)明中，未優(yōu)化的gpi元件的序列如seqidno.:5所示，其編碼的氨基酸序列如seqidno.:6所示。sea-gpi融合蛋白如本文所用，術(shù)語“sea-gpi融合蛋白”指sea元件與gpi元件構(gòu)成的融合蛋白。在sea-gpi融合蛋白中，sea元件與gpi元件之間可以含有或不含有連接肽或柔性接頭。此外，所述融合蛋白可以含有或不含有起始的met；可以含有或不含有信號肽。在本發(fā)明中，通過基因工程重組技術(shù)將糖基化磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinosi-tol，gpi)與目的蛋白sea融合表達，制備的目的蛋白能夠 憑借gpi錨定到多種細(xì)胞膜上。本發(fā)明的sea-gpi融合蛋白，在適宜的溫度與電解質(zhì)環(huán)境下與靶細(xì)胞共同孵育時，sea-gpi融合蛋白可錨著與細(xì)胞表面并顯示其抗腫瘤的生物學(xué)活性。序列優(yōu)化在本發(fā)明中，提供了優(yōu)化的、特別適合在酵母細(xì)胞中表達的sea-gpi融合蛋白的編碼序列。sea的天然核苷酸序列是已知的(如seqidno:3所示)，其編碼蛋白的氨基酸序列如seqidno:4所示。gpi的天然核苷酸序列是已知的(如seqidno:5所示)，其編碼蛋白的氨基酸序列如seqidno:6所示。本發(fā)明人先根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性，在不改變其氨基酸序列的前提下對sea和gpi的dna序列進行了優(yōu)化。然而，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，僅依據(jù)密碼子偏愛性而獲得的優(yōu)化序列并不適合在畢赤酵母中表達。因此，本發(fā)明人還根據(jù)其他因素進行了針對性的二次優(yōu)化，其中包括消除不利于表達的二級結(jié)構(gòu)(如發(fā)夾結(jié)構(gòu))，改變基因中a+t組成、改變g+c含量、改變mrna5'及3'非翻譯區(qū)(utr)、和/或改變mrna的二級結(jié)構(gòu)及翻譯起始密碼子的aug旁側(cè)序列等。經(jīng)過測試和篩選，在眾多修飾序列中獲得了一個特別優(yōu)化的sea-gpi融合蛋白編碼序列。此優(yōu)化的sea-gpi融合蛋白的核苷酸序列如seqidno:1所示，與未優(yōu)化的基于sea和gpi原始序列的編碼序列的同源性較低，僅約30％(見圖3)。無論是本發(fā)明優(yōu)化的sea-gpi編碼序列，還是未優(yōu)化的編碼序列，或是僅依據(jù)密碼子偏愛性進行部分優(yōu)化的編碼序列，它們編碼的氨基酸序列是相同，即seqidno.:2所示的sea-gpi融合蛋白。本發(fā)明的優(yōu)化的sea-gpi融合蛋白的編碼序列可用常規(guī)方法獲得，例如通過全基因合成。工程菌的制備和發(fā)酵生產(chǎn)本發(fā)明的發(fā)明點主要在于改構(gòu)的sea-gpi融合蛋白的優(yōu)化基因。至于將改構(gòu)的sea-gpi融合蛋白優(yōu)化基因插入質(zhì)粒、轉(zhuǎn)化畢赤酵母、工程菌的篩選、工程菌的發(fā)酵、以及產(chǎn)物的分離等技術(shù)基本上按本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法進行(例如sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件)。通常，可在優(yōu)化基因的5'端與3'端分別引進特異性酶切位點，用分子克隆的常規(guī)方法，將優(yōu)化基因克隆入表達載體(如ppic9、ppic9k等)。然后，轉(zhuǎn)化、整合入 p.pastoris宿主細(xì)胞染色體。利用常規(guī)方法(如g418抗性或southern印跡法)選出高拷貝轉(zhuǎn)化株，搖瓶表達選出高表達工程細(xì)胞。工程細(xì)胞可以是快速利用甲醇型(mut+)或慢速利用甲醇型(muts)。整合入畢赤酵母染色體(或基因組)中的sea-gpi融合蛋白編碼序列的拷貝數(shù)沒有特別限制，可以為1-50個或更高，通常為2-30個。在獲得工程細(xì)胞后，便可在適合的條件下培養(yǎng)工程細(xì)胞。凡適合于畢赤酵母生長、表達的培養(yǎng)基都可用于本發(fā)明。例如，合適的培養(yǎng)基包括(但并不限于)以下培養(yǎng)基：ypd平板酵母提取物1％蛋白胨2％葡萄糖2％瓊脂1％bmgy培養(yǎng)液酵母提取物1％蛋白胨2％磷酸鉀緩沖液，ph6.0100mmynb1.34％生物素(4×10-5)％甘油1％bmmy培養(yǎng)液酵母提取物1％蛋白胨2％磷酸鉀緩沖液，ph6.0100mmynb1.34％生物素(4×10-5)％甲醇0.5％此外，對于大規(guī)模生產(chǎn)sea-gpi融合蛋白，可選擇無機鹽培養(yǎng)基，也可在無機鹽培養(yǎng)基基礎(chǔ)上進行一定更改，但所含離子成份宜與無機鹽培養(yǎng)基相似。在本發(fā)明中，可采用常規(guī)的發(fā)酵條件。代表性的條件包括(但并不限于)：(a)就溫度而言，sea-gpi融合蛋白的發(fā)酵及誘導(dǎo)溫度保持在28-30℃。(b)就誘導(dǎo)期的ph值而言，誘導(dǎo)期ph控制在3-9；(c)就溶氧(do)而言，do控制在20-90％。溶氧的維持可以用氧氣/空氣混合氣體的通入來解決。(d)就補料而言，補料種類宜包括甘油、甲醇、葡萄糖等碳源，可單獨補料或混合補料。(e)就誘導(dǎo)期甲醇濃度而言，常規(guī)誘導(dǎo)濃度都可用于本發(fā)明，通常甲醇濃度控制在0.5-5％。(f)就誘導(dǎo)時間而言，沒有特別限制，通常為12-160小時，較佳地為24-120小時。如果表達的sea-gpi融合蛋白存在于培液上清，則發(fā)酵樣品先以離心、過濾等方式去除細(xì)胞，獲得含目的蛋白質(zhì)sea-gpi融合蛋白的發(fā)酵清液。如果表達的sea-gpi融合蛋白存在于細(xì)胞內(nèi)，則發(fā)酵樣品先經(jīng)破壁、離心、過濾等方式去除細(xì)胞碎片，獲得含目的蛋白質(zhì)的濾液。含目的蛋白質(zhì)的發(fā)酵清液或濾液可通過鹽析、超濾等方法進行初步純化后再進行層析純化，也可直接進行層析純化。層析技術(shù)包括陽離子交換層析、陰離子交換層析、凝膠過濾層析、疏水層析、親和層析等技術(shù)。常用的層析方法包括：1.陰離子交換層析：陰離子交換層析介質(zhì)包括(但不限于)：q-sepharose、deae-sepharose。如果發(fā)酵樣品的鹽濃度較高，影響與離子交換介質(zhì)的結(jié)合，則在進行離子交換層析前需降低鹽濃度。樣品可以用稀釋、超濾、透析、凝膠過濾層析等手段進行平衡緩沖液的更換，直至與對應(yīng)的離子交換柱平衡液系統(tǒng)相似，然后上樣，進行鹽濃度或ph的梯度洗脫。2.疏水層析：疏水層析介質(zhì)包括(但不限于)：phenyl-sepharose、butyl-sepharose、octyle-sepharose。樣品通過添加nacl、(nh4)2so4等方式提高鹽濃度，然后上樣，通過降低鹽濃度方法洗脫。通過疏水層析除去疏水性有較大差異的雜蛋白。3.凝膠過濾層析疏水層析介質(zhì)包括(但不限于)：sephacryl、superdex、sephadex類。通過凝膠過濾層析更換緩沖體系，或進一步精純。經(jīng)過上述純化可得到sea-gpi融合蛋白純品，純化得率通常為20％以上，純度 95％以上，純品得率約2-5mg/l培液，遠(yuǎn)高于未優(yōu)化的編碼序列(提高至少10倍)和部分優(yōu)化的編碼序列(提高至少2-5倍)。此外，對于本發(fā)明畢赤酵母高水平表達的sea-gpi融合蛋白，由于其折疊正確，因此不需復(fù)性。組合物和施用方法本發(fā)明還提供了一種組合物，它含有：(i)本發(fā)明的重組的sea-gpi融合蛋白或由其自組裝的sea-gpi融合蛋白，以及(ii)藥學(xué)上或免疫學(xué)上可接受的賦形劑或佐劑。本發(fā)明中，術(shù)語“含有”表示各種成分可一起應(yīng)用于或存在于本發(fā)明的組合物中。因此，術(shù)語“主要由...組成”和“由...組成”包含在術(shù)語“含有”中。本發(fā)明的組合物包括藥物組合物和疫苗組合物。本發(fā)明的組合物可以是僅含有sea-gpi融合蛋白，也可以含有其他抗腫瘤的刺激免疫的蛋白，如hcd80-gpi融合蛋白。本發(fā)明的藥物組合物或疫苗組合物可制備成各種常規(guī)劑型，其中包括(但并不限于)：注射劑、粒劑、片劑、丸劑、栓劑、膠囊、懸浮液、噴霧劑等。(i)藥物組合物本發(fā)明的藥物組合物包含(或含有)治療有效量的本發(fā)明sea-gpi融合蛋白。本文所用的術(shù)語“治療有效量”指治療劑治療、緩解或預(yù)防目標(biāo)疾病或狀況的量，或是表現(xiàn)出可檢測的治療或預(yù)防效果的量。該效果可通過例如抗原水平來檢測。治療效果也包括生理性癥狀的減少。對于某一對象的精確有效量取決于該對象的體型和健康狀況、病癥的性質(zhì)和程度、以及選擇給予的治療劑和/或治療劑的組合。因此，預(yù)先指定準(zhǔn)確的有效量是沒用的。然而，對于某給定的狀況而言，可以用常規(guī)實驗來確定該有效量。為了本發(fā)明的目的，有效的劑量為給予個體約0.001毫克/千克至1000毫克/千克，較佳地約0.01毫克/千克至100毫克/千克體重的sea-gpi融合蛋白。藥物組合物還可含有藥學(xué)上可接受的載體。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑(例如多肽或其它治療劑)給藥的載體。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體：它們本身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對接受該組合物的個體有害的抗體，且給藥后沒有過分的毒性。合適的載體可以是大的、代謝緩慢的大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸(polylacticacid)、聚乙醇酸等。這些載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在remington'spharmaceuticalsciences(mackpub.co.，n.j.1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的充分討論。組合物中藥學(xué)上可接受的載體可包括液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如潤濕劑或乳化劑、ph緩沖物質(zhì)等。通常， 可將組合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液、液體賦形劑的的固體形式。脂質(zhì)體也包括在藥學(xué)上可接受的載體的定義中。(ii)疫苗組合物本發(fā)明的疫苗(組合物)可以是預(yù)防性的(即預(yù)防感染)或治療性的(即在感染后治療疾病)。這些疫苗包含免疫性抗原(包括本發(fā)明重組的sea-gpi融合蛋白)，并且通常與“藥學(xué)上可接受的載體”組合，這些載體包括本身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對接受該組合物的個體有害的抗體的任何載體。合適的載體通常是大的、代謝緩慢的大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂質(zhì)凝集物(如油滴或脂質(zhì)體)等。這些載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。另外，這些載體可起免疫刺激劑(“佐劑”)作用。另外，抗原也可以和細(xì)菌類毒素(如白喉、破傷風(fēng)、霍亂、幽門螺桿菌等病原體的類毒素)偶聯(lián)。增強免疫組合物效果的優(yōu)選佐劑包括但不限于：(1)鋁鹽(alum)，如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等；(2)水包油型乳劑配方，例如，(a)mf59(參見wo90/14837)，(b)saf，和(c)ribitm佐劑系統(tǒng)(ras)(ribiimmunochem，hamilton，mt)，(3)皂素佐劑；(4)freund完全佐劑(cfa)和freund不完全佐劑(ifa)；(5)細(xì)胞因子，如白介素(如il-1、il-2、il-4、il-5、il-6、il-7、il-12等)、干擾素(如γ干擾素)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(m-cfs)、腫瘤壞死因子(tnf)等；(6)細(xì)菌adp-核糖基化毒素(如霍亂毒素ct，百日咳毒素pt或大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素lt)的脫毒變異體，參見例如wo93/13302和wo92/19265；以及(7)作為免疫刺激劑來增強組合物效果的其它物質(zhì)。包括免疫原性組合物在內(nèi)的疫苗組合物(例如，可包括抗原、藥學(xué)上可接受的載體以及佐劑)，通常含有稀釋劑，如水，鹽水，甘油，乙醇等。另外，輔助性物質(zhì)，如潤濕劑或乳化劑、ph緩沖物質(zhì)等可存在于這類運載體中。更具體地，包括免疫原性組合物在內(nèi)的疫苗，包含免疫學(xué)有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的組分?！懊庖邔W(xué)有效量”指以單劑或連續(xù)劑一部分給予個體的量對治療或預(yù)防是有效的。該用量可根據(jù)所治療個體的健康狀況和生理狀況、所治療個體的類別(如人)、個體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需的保護程度、疫苗的配制、治療醫(yī)師對醫(yī)療狀況的評估、及其它的相關(guān)因素而定。預(yù)計該用量將在相對較寬的范圍內(nèi)，可通過常規(guī)實驗來確定。通常，可將疫苗組合物或免疫原性組合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液、液體賦形劑的固體形式。該制劑還可乳化或包封在脂質(zhì)體中，以增強佐劑效果。(iii)給藥途徑和劑量一旦配成本發(fā)明的組合物，可將其直接給予對象。待治療的對象可以是哺乳動物，尤其是人。當(dāng)用作疫苗時，可用已知的方法將本發(fā)明的sea-gpi融合蛋白直接施用于個體。通常采用與常規(guī)疫苗相同的施用途徑和/或模擬病原體感染路徑施用這些疫苗。給予本發(fā)明藥物組合物或疫苗組合物的途徑包括(但并不限于)：肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、肺內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)鼻、經(jīng)口服或其它腸胃外給藥途徑。如果需要，可以組合給藥途徑，或根據(jù)疾病情況進行調(diào)節(jié)。疫苗組合物可以單劑量或多劑量給予，且可以包括給予加強劑量以引發(fā)和/或維持免疫力。應(yīng)以“有效量”給予sea-gpi融合蛋白，即sea-gpi融合蛋白的量在所選用的給藥路徑中足以引發(fā)免疫應(yīng)答，能有效促使保護宿主產(chǎn)生針對腫瘤的免疫應(yīng)答。在各疫苗劑份中所選用的sea-gpi融合蛋白的量，是按可引發(fā)免疫保護性應(yīng)答而無明顯的副作用的量而定。通常，在感染宿主細(xì)胞后，各劑的疫苗足以含有約1μg-1000mg，較佳地為1μg-100mg，更佳地10μg-50mgsea-gpi融合蛋白?？捎冒ㄓ^察對象中的抗體滴定度和其它反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)研究方法來確定具體疫苗的最佳用量?？赏ㄟ^監(jiān)控疫苗提供的免疫力水平來確定是否需要增強劑量。在評估了血清中的抗體滴定度后，可能需要選用增強劑量免疫接種。施用佐劑和/或免疫刺激劑就可提高對本發(fā)明的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。優(yōu)選方法是從腸胃外(皮下或肌內(nèi))途徑通過注射給予免疫原性組合物。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于：(1)優(yōu)化后的sea-gpi融合蛋白基因非常適合畢赤酵母表達，具有高表達、高穩(wěn)定、高分泌的特點。(2)含有優(yōu)化的sea-gpi融合蛋白基因的畢赤酵母具有高密度生長的特性，非常適于大規(guī)模高密度的發(fā)酵生產(chǎn)。由于表達水平高，因此得率大幅度提高，成本低。(3)與原核表達相比，畢赤酵母的表達的sea-gpi融合蛋白具有更高的活性。(4)外源基因被整合在畢赤酵母的染色體上，不易丟失。(5)本發(fā)明的sea-gpi融合蛋白不依賴于細(xì)胞自身生長增殖等性狀和可轉(zhuǎn)染性，可以用于各種類型和組織器官來源的靶細(xì)胞；(6)本發(fā)明的sea-gpi融合蛋白允許多種蛋白有序地錨定在細(xì)胞表面，適合于多重免疫分子膜表面修飾瘤苗的制備；(7)本發(fā)明的sea-gpi融合蛋白可以方便地錨定在腫瘤細(xì)胞上，便捷地制備地制備經(jīng)免疫分子表面修飾的自體腫瘤細(xì)胞的瘤苗，具有較大的臨床應(yīng)用潛力。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按 照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克隆實驗指南(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)；或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。實施例1.sea-gpi融合蛋白畢赤酵母表達系統(tǒng)的構(gòu)建1.目的基因的獲得優(yōu)化序列：根據(jù)天然sea和gpi的氨基酸序列，本發(fā)明人先根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性，在不改變其氨基酸序列的前提下對sea和gpi的dna序列進行了優(yōu)化。然而，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，僅依據(jù)密碼子偏愛性而獲得的優(yōu)化序列并不適合在畢赤酵母中表達。為此，本發(fā)明人根據(jù)其他因素進行了針對性的二次優(yōu)化，其中包括消除不利于表達的二級結(jié)構(gòu)(如發(fā)夾結(jié)構(gòu))，改變基因中a+t組成、改變g+c含量、改變mrna5'及3'非翻譯區(qū)(utr)、和/或改變mrna的二級結(jié)構(gòu)。一種最優(yōu)化的目的基因的核苷酸序列如seqidno:1所示。該基因編碼sea-gpi融合蛋白的氨基酸序列如seqidno:2所示。人工全合成該優(yōu)化基因(seqidno:1)，并在其5'端與3'端分別引入酶切位點。seqidno.:1與對照序列1的相似性僅為約30％。對照序列1：基于野生型的sea基因(seqidno:3)和野生型gpi基因(seqidno.:5)得出的核苷酸序列(seqidno.:7中第73-900位)，其編碼相同的sea-gpi融合蛋白。對照序列2：僅根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性原則進行優(yōu)化所產(chǎn)生的核苷酸序列(seqidno:8中第73-900位)，編碼相同的sea-gpi融合蛋白。對照序列2與對照序列1的相似性為約67％。全合成對照序列，并在兩端引入酶切位點。2.表達質(zhì)粒的構(gòu)建及高表達工程細(xì)胞的獲得用全合成方法獲得優(yōu)化的sea-gpi融合蛋白基因，按照該優(yōu)化合成的序列，設(shè)計并合成pcr引物(見表1)。均在上游引物引入ecori酶切位點，下游引物引入noti位點。以全合成的優(yōu)化或未優(yōu)化型的sea-gpi融合蛋白基因為模板，通過pcr擴增融合蛋白的編碼序列，用ecori和noti雙酶切后擴增產(chǎn)物后，插入相同酶酶切后的ppic9k質(zhì)粒(可購自invitrogen公司)，取酶切鑒定以及測序正確的構(gòu)建質(zhì)粒，獲得質(zhì)粒ppic9k-sea-gpi(optimal)。用類似方法，獲得質(zhì)粒ppic9k-sea-gpi-1(control1)、ppic9k-sea-gpi-2(control2)。按照invitrogen公司操作手冊，質(zhì)粒經(jīng)酚/氯仿抽提后濃縮至10ul.將80ul畢赤 酵母感受態(tài)細(xì)胞和10ul濃縮后的質(zhì)?；靹蚝蠹拥筋A(yù)冷的電擊杯中。電擊杯放置冰上5min，設(shè)置參數(shù)1500v/5ms電擊，結(jié)束后加入1ml1m山梨醇溶液至電擊杯中?；靹蚝笸坎贾羗d篩選平板上，置于28度培養(yǎng)箱培養(yǎng)3-5天。待酵母單克隆長出后，挑取一定數(shù)量的單克隆按照順序轉(zhuǎn)接到另一塊md篩選培養(yǎng)基上，置于28度培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天。從md平板上挑取單克隆，按照下列方法誘導(dǎo)，并用空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母km71(可購自invitrogen公司)作為胞內(nèi)表達的背景對照。1挑取單克隆，接種至50mlbmgy中，(250ml尖底離心管)，28度，250-300rpm，搖至od600＝2-6(對數(shù)生長，大約16-18小時)。2室溫1500-3000g離心5min，收集細(xì)胞，去除上清，用bmmy重懸細(xì)胞至用1/5-1/10原培養(yǎng)基體積的bmmy重懸細(xì)胞。3在25ml搖瓶中加入上述培養(yǎng)物10ml，加蓋四層滅菌紗布，放入搖床繼續(xù)生長。4每24小時，加甲醇至終濃度為0.5％以繼續(xù)誘導(dǎo)。5誘導(dǎo)72小時后，離心收集酵母細(xì)胞。儲存于-80度，直至開始檢測。6用westernblot方法來分析酵母細(xì)胞胞內(nèi)目的蛋白表達情況。誘導(dǎo)結(jié)束后，采用westernblot檢測目的蛋白的表達。不同優(yōu)化序列和天然序列的誘導(dǎo)篩選結(jié)果表明，seqidno:1序列的表達量最高。實施例2sea-gpi融合蛋白的發(fā)酵表達挑選實施例1中的不同畢赤酵母克隆，按invitrogen的畢赤酵母發(fā)酵手冊進行20升發(fā)酵罐的發(fā)酵。結(jié)果表明：在畢赤酵母中采用未優(yōu)化對照序列1(seqidno:7)時，sea-gpi融合蛋白表達量極低(為約0.02g/l發(fā)酵液)；采用對照序列2時(seqidno:8)時，表達量很低(為約0.05g/l發(fā)酵液)。與之相反，采用seqidno:1所示的優(yōu)化序列時，表達的sea-gpi融合蛋白表達量最高(為約0.30g/l發(fā)酵液)。實施例3sea-gpi融合蛋白的生產(chǎn)和鑒定1.酵母高表達菌株篩選表達將測序正確的酵母表達載體ppic9k-sea-gpi(optimal)導(dǎo)入畢赤酵母gs115菌株，經(jīng)md板營養(yǎng)篩選，和3mg/mlg418+抗性篩選得到含sea-gpi融合基因的高拷貝的酵母菌株篩選高表達菌株。如圖7的蛋白電泳所示：1為蛋白標(biāo)志，2-7為篩選的表達sea-gpi融合蛋白的gs115菌株上清，8為對照gs115菌株上清，可見2-7中6種gs115菌株與對照相比，在56kd處均有目的蛋白表達，其中的菌株4表達效果最佳，提示為sea-gpi 融合蛋白的高表達菌株。2.western印跡法鑒定使用常規(guī)的western印跡法檢定蛋白電泳篩選的篩選高表達菌株中的融合蛋白。結(jié)果如圖8所示。首先選擇用抗gpi的多抗檢定經(jīng)篩選的gs115菌株4上清中表達的融合蛋白，發(fā)現(xiàn)在gs115/4菌株上清中在56kd處有g(shù)pi成分；采用抗sea的多抗檢定經(jīng)篩選的gs115菌株4上清中表達的融合蛋白，發(fā)現(xiàn)在gs115/4菌株上清中在56kd處有sea成分，提示gs115菌株4表達上清中表達sea-gpi融合蛋白。構(gòu)建的ppic9k-sea-gpi酵母表達載體表達的sea-gpi產(chǎn)物分子量為56kd，原始的sea-gpi融合蛋白的分子量為34kd，這說明經(jīng)酵母表達載體表達的sea-gpi融合蛋白經(jīng)過了糖基化修飾，較之原核表達的融合蛋白可能具有更好的生物學(xué)活性，更接近于體內(nèi)蛋白的生物學(xué)狀態(tài)。實施例4sea-gpi融合蛋白的發(fā)酵與純化4.1gs115/sea-gpi菌株的大規(guī)模發(fā)酵工藝選擇經(jīng)篩選得到的高表達sea-gpi融合蛋白菌株進行大規(guī)模誘導(dǎo)發(fā)酵，選擇經(jīng)過篩選的gs115/sea-gpi，經(jīng)bbroun30l發(fā)酵罐高密度發(fā)酵，主要采用50％甘油作為補料，維持ph值在5.5，發(fā)酵72h后，od600值達到800以上，此時停止甘油補料，改以含有ptm1的1％甲醇誘導(dǎo)表達72h，od600值均達到1400以上，停止發(fā)酵，連續(xù)流離心機6000rpm×60min離心收集，發(fā)酵菌株的濕重均可以達到8000g以上，發(fā)酵上清可以收集到15l。4.2gs115/sea-gpi融合蛋白的純化制備對經(jīng)離心機收集的發(fā)酵上清予以超濾濃縮至1l(體積盡可能少，以不出現(xiàn)沉淀為限)，采用50％濃度硫酸銨沉淀上清中的蛋白質(zhì)，200mlpbs溶解蛋白沉淀后，先后以s柱、q柱層析和分子篩純化獲得sea-gpi融合蛋白。結(jié)果如圖9所示。采用lowery法測定純化產(chǎn)品的蛋白濃度，sea-gpi濃度達到0.39mg/ml，體積150ml。3種融合蛋白內(nèi)毒素含量均<0.03pg/μg蛋白。4.3.sea-gpi的檢定采用western印跡法驗證制備的融合蛋白的性質(zhì)，證實了融合蛋白制備正確。結(jié)果見圖10所示。圖10是sea-gpi融合蛋白的western印跡法檢定(分別采用抗gpi抗體和抗sea抗體檢測融合蛋白)。然后，采用c-18柱，行反相層析測定制備sea-gpi融合蛋白的純度，結(jié)果如圖11所示?？梢妔ea-gpi融合蛋白的純度在99％以上。上述結(jié)果表明，本發(fā)明制備了符合進行生物學(xué)功能檢測和體內(nèi)實驗的sea-gpi融合蛋白。建立的酵母表達制備sea-gpi融合蛋白體系能夠應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于原核表達等其他方式。實施例5sea-gpi融合蛋白錨定腫瘤細(xì)胞的能力在本實施例中，使用sea-gpi錨定ct26瘤苗細(xì)胞，選擇1×106個ct26細(xì)胞/ml，選擇制備的sea-gpi融合蛋白與ct26細(xì)胞共同孵育0h、4h、8h，行流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果如圖12所示。sea-gpi迅速錨定ct26細(xì)胞，錨定率達到98.3％；4h后檢測發(fā)現(xiàn)sea-gpi錨定ct26細(xì)胞率達到90.7％；經(jīng)過8h后，sea-gpi仍然能夠錨定84.6％的ct26細(xì)胞(見圖12)。這表明，本發(fā)明的sea-gpi融合蛋白具有優(yōu)良的錨定能力。實施例6sea-gpi融合蛋白體外抗腫瘤效應(yīng)在本實施例中，以絲裂霉素滅活(終濃度為100ug/ml，37℃，5％co2孵育1h)ct26/sea-gpi制備減毒滅活的腫瘤瘤苗。行ct26/sea-gpi瘤苗的體外效應(yīng)檢定：選擇瘤苗細(xì)胞為刺激細(xì)胞，增殖細(xì)胞為小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，2種細(xì)胞按1∶4、1∶20、1∶100比例培養(yǎng)，對照組不加刺激細(xì)胞。置24孔板中常規(guī)培養(yǎng)3后，[3h]攝入法檢測反應(yīng)強度，elisa檢測上清液中il-2、tnf-α和ifn-γ的含量。結(jié)果如圖13所示，酵母表達的sea-gpi修飾的ct26瘤苗細(xì)胞能夠有效激發(fā)小鼠脾細(xì)胞具有很好的活化作用。sea-gpi錨定修飾后的ct26瘤苗細(xì)胞能夠有效激發(fā)小鼠脾臟t細(xì)胞的大量增殖，而且酵母表達的sea-gpi(sea-gpi(g))的效能與真核載體表達的sea-gpi相同。此外，如圖14所示，能分泌大量的sea-gpi雙重修飾瘤苗能刺激小鼠脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子il-2、tnf-α和ifn-γ因子等，而且酵母表達的sea-gpi(sea-gpi(g))的效能與真核載體表達的sea-gpi相同。實施例7.sea-gpi融合蛋白體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)選擇sea-gpi(22ug/ml)錨定小鼠ct26細(xì)胞經(jīng)絲裂霉素滅活制備ct26/sea-gpi瘤苗，1×106個瘤苗細(xì)胞/100ul，注射入c57小鼠右后肢背部皮下，觀察荷瘤小鼠生存率，分析荷瘤小鼠腫瘤生長情況。結(jié)果如圖15和圖16所示，經(jīng)sea-gpi錨定修飾的荷瘤小鼠體積最小，腫瘤生長受到顯著抑制，荷瘤小鼠生存期最長；且酵母表達的sea-gpi融合蛋白的抑瘤效果與真核表達的sea-gpi融合蛋白的抑瘤效果相同無差異。實施例8.sea-gpi融合蛋白體內(nèi)抗腫瘤機制研究荷瘤小鼠脾細(xì)胞的ctl活性檢測：荷瘤25天，取各實驗組(未處理組、pbs對照組、ct26/sea-tm瘤苗組、ct26/sea-gpi(g)瘤苗組、ct26/sea-gpi(e)瘤苗組)3只小鼠，制備脾細(xì)胞，與ct26細(xì)胞共孵育7d，誘導(dǎo)ctl產(chǎn)生，ldh法測定其ctl活性。荷瘤小鼠nk細(xì)胞的活性檢測：采用ldh法測定，靶細(xì)胞為yac細(xì)胞，取各實驗組(未處理組、pbs對照組、ct26/sea-tm瘤苗組、ct26/sea-gpi(g)瘤苗組、ct26/sea-gpi(e)瘤苗組)3只小鼠，制備脾細(xì)胞，與靶細(xì)胞共孵育，測定其nk活性。結(jié)果如圖17和圖18所示，sea-gpi修飾的ct26瘤苗能夠能高效激發(fā)荷瘤小鼠體內(nèi)nk、ctl活性，且酵母表達的sea-gpi融合蛋白的抑瘤效果與真核表達的sea-gpi融合蛋白的效果相同。討論酵母表達系統(tǒng)結(jié)合了原核和真核蛋白表達系統(tǒng)的優(yōu)點，既是真核蛋白質(zhì)表達和分析的有力工具，擁有轉(zhuǎn)錄后加工修飾功能；又是大規(guī)模生產(chǎn)重組真核蛋白的最佳模式，適合于穩(wěn)定表達有功能的外源蛋白質(zhì)。與昆蟲表達系統(tǒng)和哺乳動物表達系統(tǒng)相比，酵母表達系統(tǒng)操作簡單，成本低廉，可大規(guī)模進行發(fā)酵，是最理想的重組真核蛋白質(zhì)生產(chǎn)制備工具。較之原核表達體系，酵母表達系統(tǒng)表達能力強，具有蛋白質(zhì)折疊、和糖鏈修飾功能，可以有效保證目的蛋白的生物學(xué)活性；而且能分泌目的基因產(chǎn)物導(dǎo)培養(yǎng)液中，有利于純化等。在本發(fā)明中，構(gòu)建了特別適合酵母表達的優(yōu)化的sea-gpi融合基因和相應(yīng)表達載體，得到了高表達sea-gpi融合蛋白的gs115菌株，并且建立了大規(guī)模酵母發(fā)酵純化制備體系，制備了大量的適合生物學(xué)功能應(yīng)用的sea-gpi融合蛋白。試驗結(jié)果表明，檢定sea-gpi融合蛋白可以有效錨定在在腫瘤細(xì)胞上，體內(nèi)外效應(yīng)和機制研究證明sea-gpi融合蛋白修飾的ct26瘤苗具有優(yōu)良的抗腫瘤效應(yīng)。本發(fā)明的酵母表達的sea-gpi融合蛋白具有優(yōu)良的生物學(xué)活性，其活性顯著高于原核表達的sea-tm融合蛋白。本發(fā)明開發(fā)的優(yōu)化的酵母體系的大規(guī)模制備工藝，有助于融合蛋白的臨床應(yīng)用，具有開發(fā)和大規(guī)模應(yīng)用前景。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。當(dāng)前第1頁12