一種具有降尿酸功效的柴魚蛋白水解物制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種具有降尿酸功效的柴魚蛋白水解物制備方法。其主要制備步驟包括：原料熱處理、限制性酶解、膜分離-陰離子交換層析-凝膠過濾層析分離、濃縮、噴霧干燥得到具有降尿酸功效的柴魚蛋白水解物。氨基酸分析顯示酶解物肽段一級(jí)氨基酸序列中含四種氨基酸：組氨酸、精氨酸、賴氨酸及蘇氨酸，該四種氨基酸質(zhì)量含量總和約占酶解物總氨基酸含量的70%。經(jīng)MALDI-TOF-MS質(zhì)譜確定其主要肽功效組分的分子量均小于700Da。經(jīng)體外降尿酸實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明具有顯著抑制尿酸生成的作用，抑制率達(dá)到50%以上；經(jīng)氧嗪酸鉀造模的高尿酸血癥大鼠動(dòng)物驗(yàn)證表明，可顯著降低大鼠血清尿酸以及血清肌酐水平，表現(xiàn)出較好的腎臟保護(hù)功效。
【專利說明】一種具有降尿酸功效的柴魚蛋白水解物制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種蛋白水解物的制備方法，具體涉及一種具有降尿酸功效的柴魚蛋 白水解物制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 高尿酸血癥是人體的一種代謝疾病，隨著現(xiàn)代社會(huì)的發(fā)展，高血尿酸已經(jīng)成為繼 高血壓、高血脂和高血糖之后的第四個(gè)重要危險(xiǎn)因素。高血尿酸值是引發(fā)痛風(fēng)癥的直接原 因，其過程是體內(nèi)嘌呤代謝紊亂以及排泄異常導(dǎo)致人體血液中尿酸值升高，最終尿酸在人 體的關(guān)節(jié)等處形成結(jié)晶，從而引起炎癥反應(yīng)，并最終導(dǎo)致痛風(fēng)的發(fā)生。正常人體血清尿酸水 平，成年男性為208-428 ymol/L，成年女性為155-357 μπιοΙ/L。
[0003] 高尿酸血癥的發(fā)病機(jī)制主要有： (1)尿酸生成過多。人體中尿酸的來源分為內(nèi)源性尿酸以及外源性尿酸。內(nèi)源性尿酸 主要是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分解代謝產(chǎn)生的嘌呤類化合物經(jīng)特定的酶作用產(chǎn)生的。外源性尿酸主 要是食物中的嘌呤類化合物經(jīng)過人體消化吸收以及特定酶的催化作用后產(chǎn)生的。影響尿酸 生成的酶主要有兩類，一類是促進(jìn)尿酸生成的酶，包括：磷酸核糖焦磷酸合成酶（PRPP)、腺 嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(APRT)以及黃嘌呤氧化酶（XOD);另一類是抑制尿酸合成的酶：次黃 嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT)。原發(fā)性痛風(fēng)和繼發(fā)性痛風(fēng)的發(fā)生部分原因是某些 因素使以上這些酶的活性改變，從而使尿酸生成增多而形成的。
[0004] (2)尿酸排泄減少。大部分痛風(fēng)的發(fā)生都是因?yàn)槟蛩崤判箿p少而導(dǎo)致的。研究發(fā) 現(xiàn)，近曲小管對(duì)尿酸鹽的主動(dòng)分泌和重吸收需要尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的參與，當(dāng)編碼該蛋白的 基因發(fā)生變異，導(dǎo)致排泄的尿酸減少，就會(huì)發(fā)生原發(fā)性痛風(fēng)。繼發(fā)性痛風(fēng)主要由于腎臟相關(guān) 疾病導(dǎo)致腎小球?yàn)V出的尿酸減少或者重吸收增加，從而產(chǎn)生高尿酸血癥。
[0005] 目前我國用于治療高尿酸血癥的藥物主要有： (1)抑制尿酸生成的藥物。主要是指黃嘌呤氧化酶抑制劑，如：別嘌呤醇 (Allopurinol )、奧西噪呤（Oxypurinol )、非布索坦（Fexbuxostat)、Y-700 以及 KT-651 等。
[0006] (2)促進(jìn)尿酸排泄的藥物。主要包括丙磺舒、苯磺唑酮和苯溴馬隆。
[0007] (3)促進(jìn)尿酸分解的藥物。主要包括拉布立酶（ELITEK, Rasburicase)以及 PEG-uricase〇
[0008] 但是以上藥物都有較強(qiáng)的副作用和過敏反應(yīng)，對(duì)人體臟器有一定的毒害損傷作 用，且價(jià)格比較昂貴，因此亟需尋找高效低毒的功效成分，對(duì)于高尿酸血癥的預(yù)防和治療具 有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義。
[0009] 有研究表明從某些植物提取的天然產(chǎn)物有一定降尿酸功效。徐娜研究芹菜籽中黃 酮物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)木樨草素能有效抑制黃嘌呤氧化酶的活性，具有顯著的降尿酸功效。王海東采 用氧嗪酸鉀灌胃誘導(dǎo)小鼠高尿酸血癥模型研究金錢草水提物對(duì)其降尿酸效果，發(fā)現(xiàn)金錢草 水提物高中低劑量具有降低小鼠血清尿酸的效果。夏道宗等人通過給高尿酸血癥小鼠喂食 青梅醇提物研究其降尿酸效果，結(jié)果表明青梅醇提物在中、高劑量能降低高尿酸血癥小鼠 的血清尿酸水平，抑制其肝臟黃嘌呤氧化酶的活性，具有較好的降尿酸功效。但是目前市場(chǎng) 上以天然植物提取物為功效成分的保健食品或藥品并不多見，且安全性有待研究。
[0010] 富含生物活性的蛋白水解物近些年成為世界范圍的研究熱點(diǎn)，其具有易吸收、活 性好、制備簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。生物活性肽分為內(nèi)源性活性肽以及外源性活性肽，內(nèi)源性活性肽是 指生物體內(nèi)存在的活性肽，外源性活性肽是指從動(dòng)植物體蛋白經(jīng)化學(xué)或酶法水解生產(chǎn)的具 有活性的肽段。研究發(fā)現(xiàn)，一些肽類物質(zhì)對(duì)于降低尿酸值、預(yù)防和輔助治療痛風(fēng)具有重要貢 獻(xiàn)，例如臨床上，還原型谷胱甘肽（GSH)可用于輔助治療痛風(fēng)性腎病。近年來，研究發(fā)現(xiàn)一 些食源性生物活性肽也具有降低尿酸的作用。張銳等報(bào)道酪蛋白磷酸肽結(jié)合鈣粉對(duì)高尿酸 血癥大鼠血清尿酸水平有顯著干預(yù)效果，其機(jī)制可能是降低了肝臟黃嘌呤氧化酶、血清和 肝臟中腺苷脫氨酶活性。盡管如此，目前對(duì)于生物活性肽改善痛風(fēng)癥候群的作用機(jī)制尚不 清楚。
[0011] 柴魚，屬鱸形總目、金槍魚亞目，因其魚體形態(tài)像炮彈又俗稱為炸彈魚，是重要的 海洋洄游魚類，主要產(chǎn)于太平洋、印度洋和大西洋，我國東海、南海的捕撈量大。柴魚肉可鮮 食，但我國主要把其加工成柴魚罐頭出口，其附加值不高。相比其他海洋魚類，柴魚蛋白質(zhì) 含量高、脂肪含量低，目前尚未深度開發(fā)利用。本發(fā)明利用柴魚為原料，利用限制性酶解作 為技術(shù)手段，集成不同分離技術(shù)，篩選出具有顯著降尿酸功效的蛋白酶解物，對(duì)于開發(fā)以天 然降尿酸功效因子為核心成分的保健食品甚至藥品具有重要的參考價(jià)值。
[0012]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明的首要目的是利用柴魚鮮肉制備具有降尿酸活性的柴魚蛋白水解物的方 法。
[0014] 本發(fā)明技術(shù)方案如下。
[0015] 一種具有降尿酸功效的柴魚蛋白水解物制備方法，包括以下步驟： (1) 原料熱處理：新鮮柴魚，去頭、內(nèi)臟、尾以及脊骨后，獲取純肌肉組織，于絞肉機(jī)絞 碎至糜狀，得到柴魚肉糜，加水蒸煮，后冷卻室溫，得到蒸煮后的柴魚肉糜； (2) 限制性酶解：將蒸煮后的柴魚肉糜調(diào)節(jié)pH值至6. 5-8. 5,按柴魚肉糜蛋白質(zhì)量 0. 5%-2. 0%加入蛋白酶，于50-55°C水浴振蕩反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后將水解液置于沸水中保溫 10-20 min滅酶，離心分離，取上清液，得柴魚蛋白水解上清液； (3) 采用膜分離-陰離子交換層析-凝膠過濾層析，三步法分離柴魚蛋白水解物： 第一步：將柴魚蛋白水解上清液過超濾膜，取透過液，將透過液于60-65°C蒸發(fā)濃縮20-45 min ;第二步：利用DEAE-52纖維素陰離子交換柱進(jìn)行分離，收集洗脫液，洗脫液于60-65°C 蒸發(fā)濃縮20-45 min后；第三步：利用Sephadex G-15凝膠色譜柱進(jìn)一步分離，收集洗脫 液，得到柴魚蛋白水解分離液； (4) 濃縮、噴霧干燥：將柴魚蛋白水解分離液真空濃縮后，噴霧干燥，得到具有降尿酸 功效的柴魚蛋白水解物。
[0016] 上述方法中，步驟（1)中，柴魚肉糜1:5-1:8 (w/w)加水于80-KKTC下蒸煮 10-30 min〇
[0017] 上述方法中，步驟（1)中，所述柴魚肉糜蛋白質(zhì)質(zhì)量百分比含量為249Γ28% (w/ w)o
[0018] 上述方法中，步驟（2)中，所用蛋白酶為木瓜蛋白酶，酶活力8. OXlO5 U/g，酶解時(shí) 間為 6. 0-12. 0 h。
[0019] 上述方法中，步驟（3)中，第一步分離所用超濾膜的膜通量為0-10 kDa;第二 步DEAE-52纖維素陰離子交換柱分離時(shí)以0-0. 3 mo 1/L的NaCl溶液為洗脫劑；第三步 S印hadex G-15凝膠色譜柱分離時(shí)以超純水為洗脫劑。
[0020] 上述方法中，步驟（4)中，所述具有降尿酸功效的柴魚蛋白水解物的肽段一級(jí)氨基 酸序列中主要含四種氨基酸：組氨酸為41. 84% (w/w)、精氨酸為10. 67% (w/w)、賴氨酸為 8. 45% (w/w)及蘇氨酸為8. 53% (w/w)，該四種氨基酸質(zhì)量含量總和約占酶解物總氨基酸含 量的70% (w/w);經(jīng)MALDI-T0F-MS質(zhì)譜確定其主要肽功效組分的分子量均小于700 Da。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于： (1)本發(fā)明利用酶法限制性水解與膜分離、色譜分離方法結(jié)合，制備的柴魚蛋白水解物 具有功效顯著、純度高、魚腥味淡等優(yōu)點(diǎn)。
[0022] (2)本發(fā)明所得酶解物具有特殊的肽鏈氨基酸組成比例及獨(dú)特的分子量分布。具 體而言，該酶解物肽段一級(jí)氨基酸序列中主要含四種氨基酸：組氨酸（41. 84%，w/w)、精氨 酸（10. 67%，w/w)、賴氨酸（8. 45%，w/w)及蘇氨酸（8. 53%，w/w)，該四種氨基酸質(zhì)量含量總和 約占酶解物總氨基酸含量的70% (w/w)。經(jīng)MALDI-T0F-MS質(zhì)譜確定其主要肽功效組分的分 子量均小于700 Da。
[0023] (3)經(jīng)體外黃嘌呤氧化酶抑制實(shí)驗(yàn)以及大鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明抑制尿酸生成 作用顯著，黃嘌呤氧化酶活性抑制率達(dá)到50%以上，并且能明顯降低大鼠血清尿酸值以及 肌酐水平，具有顯著的降尿酸功效以及保護(hù)腎臟功能。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1實(shí)施例對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制作用效果。
[0025] 圖2為實(shí)施例對(duì)高尿酸血癥大鼠血清尿酸的影響。
[0026] 圖3為實(shí)施例對(duì)高尿酸血癥大鼠血清肌酐的影響。
[0027] 圖4為實(shí)施例3MALDI-T0F-MS -級(jí)質(zhì)譜圖。

【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于 此。
[0029] 實(shí)施例1 (1)原料熱處理：新鮮柴魚，去頭、內(nèi)臟、尾以及脊骨后，獲取純肌肉組織，于絞肉機(jī)絞 碎至糜狀，取柴魚肉糜100 g，按比例l:5(w/w)加水于80°C下蒸煮10 min，后冷卻室溫。
[0030] (2) 限制性酶解：將蒸煮后的柴魚肉糜調(diào)節(jié)pH值至6. 5,按柴魚肉糜蛋白質(zhì)量 (柴魚蛋白質(zhì)含量26%，w/w)加入木瓜蛋白酶(酶活力8. OX IO5 U/g，加酶量為占柴魚蛋白 質(zhì)量0. 5%)，于50°C水浴振蕩反應(yīng)6. 0 h。反應(yīng)結(jié)束后將水解液置于沸水中保溫10 min滅 酶，離心分離，取上清液，得柴魚蛋白水解上清液。
[0031] (3) "膜分離-陰離子交換層析-凝膠過濾層析"三步法分離柴魚蛋白水解物： 第一步：將柴魚蛋白水解上清液過膜通量為10 kDa的超濾膜，取透過液，將透過液于60°C 蒸發(fā)濃縮20 min;第二步：利用DEAE-52纖維素陰離子交換柱進(jìn)行分離，以0.3 mol/L的 NaCl溶液為洗脫劑，收集洗脫液，洗脫液于60°C蒸發(fā)濃縮20 min后；第三步：利用S印hadex G-15凝膠色譜柱進(jìn)一步分離，以超純水為洗脫劑，收集洗脫液，得到柴魚蛋白水解分離液。
[0032] (4)濃縮、噴霧干燥：將柴魚蛋白水解分離液真空濃縮后，噴霧干燥，得到具有降 尿酸功效的柴魚蛋白水解物1。
[0033] 實(shí)施例2 (1)原料熱處理：新鮮柴魚，去頭、內(nèi)臟、尾以及脊骨后，獲取純肌肉組織，于絞肉機(jī)絞 碎至糜狀，取柴魚肉糜100 g，按比例1:8 (w/w)加水于KKTC下蒸煮30 min，后冷卻室溫。
[0034] (2) 限制性酶解：將蒸煮后的柴魚肉糜調(diào)節(jié)pH值至8. 5,按柴魚肉糜蛋白質(zhì)量 (柴魚蛋白質(zhì)含量為24%，w/w)加入木瓜蛋白酶(酶活力8. OX IO5 U/g，加酶量為占柴魚蛋白 質(zhì)量2. 0%)，于50-55°C水浴振蕩反應(yīng)12. 0 h。反應(yīng)結(jié)束后將水解液置于沸水中保溫15 min 滅酶，離心分離，取上清液，得柴魚蛋白水解上清液。
[0035] (3) "膜分離-陰離子交換層析-凝膠過濾層析"三步法分離柴魚蛋白水解物：第 一步：將柴魚蛋白水解上清液過膜通量為5 kDa的超濾膜，取透過液，將透過液于63°C蒸發(fā) 濃縮30 min ;第二步：利用DEAE-52纖維素陰離子交換柱進(jìn)行分離，以0. 2 mol/L的NaCl溶 液為洗脫劑，收集洗脫液，洗脫液于63°C蒸發(fā)濃縮30 min后；第三步：利用S印hadex G-15 凝膠色譜柱進(jìn)一步分離，以超純水為洗脫劑，收集洗脫液，得到柴魚蛋白水解分離液。
[0036] (4)濃縮、噴霧干燥：將柴魚蛋白水解分離液真空濃縮后，噴霧干燥，得到具有降 尿酸功效的柴魚蛋白水解物2。
[0037] 實(shí)施例3 (1)原料熱處理：新鮮柴魚，去頭、內(nèi)臟、尾以及脊骨后，獲取純肌肉組織，于絞肉機(jī)絞 碎至糜狀，取柴魚肉糜100 g，按比例1:6 (w/w)加水于90°C下蒸煮15 min,后冷卻室溫。
[0038] (2) 限制性酶解：將蒸煮后的柴魚肉糜調(diào)節(jié)pH值至6.8,按柴魚肉糜蛋白質(zhì)量 (柴魚蛋白質(zhì)含量為28%，w/w)加入木瓜蛋白酶(酶活力8. OX IO5 U/g，加酶量為占柴魚蛋白 質(zhì)量1.0%),于50°C水浴振蕩反應(yīng)8.0 h。反應(yīng)結(jié)束后將水解液置于沸水中保溫20 min滅 酶，離心分離，取上清液，得柴魚蛋白水解上清液。
[0039] (3) "膜分離-陰離子交換層析-凝膠過濾層析"三步法分離柴魚蛋白水解物：第 一步：將柴魚蛋白水解上清液過膜通量為3 kDa的超濾膜，取透過液，將透過液于65°C蒸發(fā) 濃縮35 min ;第二步：利用DEAE-52纖維素陰離子交換柱進(jìn)行分離，以0. I mol/L的NaCl溶 液為洗脫劑，收集洗脫液，洗脫液于65°C蒸發(fā)濃縮35 min后；第三步：利用S印hadex G-15 凝膠色譜柱進(jìn)一步分離，以超純水為洗脫劑，收集洗脫液，得到柴魚蛋白水解分離液。
[0040] (4)濃縮、噴霧干燥：將柴魚蛋白水解分離液真空濃縮后，噴霧干燥，得到具有降 尿酸功效的柴魚蛋白水解物3。
[0041] 以下通過實(shí)驗(yàn)來證明實(shí)施例的降尿酸功效。
[0042] 一、體外黃嘌呤氧化酶抑制活性實(shí)驗(yàn)。通過黃嘌呤氧化酶抑制活性實(shí)驗(yàn)說明柴魚 蛋白水解物抑制尿酸生成作用。
[0043] 實(shí)驗(yàn)方法：配制0. I mol/1 pH 7. 5磷酸鹽緩沖液（PBS);配制0. 43 μ mol/mL的黃 嘌呤溶液；配制〇. 4U/mL黃嘌呤氧化酶溶液。將待測(cè)樣品稀釋或者配制成10 mg/mL，向96 孔酶標(biāo)板中，每孔加入50 μ L待測(cè)樣品以及50 μ L黃嘌呤氧化酶溶液，以10 μ g/mL的別 嘌呤醇為陽性對(duì)照。371：保溫15 1^11，加入200 1^黃嘌呤溶液，在29211111波長下每308 讀數(shù)一次，共讀數(shù)80次反應(yīng)40 min。得出吸光值后，計(jì)算樣品抑制率。
[0044] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：黃嘌呤氧化酶是促進(jìn)黃嘌呤轉(zhuǎn)化成為尿酸的關(guān)鍵酶，抑制黃嘌呤氧化 酶的活性可以抑制尿酸生成，降低血清尿酸含量。如果樣品對(duì)黃嘌呤氧化酶活性有抑制作 用，則說明樣品具有抑制尿酸生成的功效。
[0045] 三種柴魚蛋白水解物均表現(xiàn)出良好的黃嘌呤氧化酶抑制活性，雖然與藥物別嘌呤 醇相比，有效劑量不在一個(gè)數(shù)量級(jí)上，但是柴魚蛋白水解物是從食源性蛋白獲得，具有安全 無毒、無副作用等優(yōu)點(diǎn)，且對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制活性良好，可用于保健食品的生產(chǎn)。其中柴 魚蛋白水解物3表現(xiàn)出最優(yōu)的抑制率，柴魚蛋白水解物3與其它兩個(gè)水解物相比，主要差別 體現(xiàn)在其水解時(shí)間長，并通過通量為3000 Da超濾膜，分子量相比其它實(shí)施例小，說明水解 程度高，分子量小的柴魚蛋白水解物具有更優(yōu)的抑制尿酸生成活性（見圖1)。
[0046] 二、動(dòng)物試驗(yàn)。本發(fā)明實(shí)施例降尿酸功效動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法如下： (1)實(shí)驗(yàn)材料 動(dòng)物：SPF級(jí)SD大鼠108只，雄性，體重200±20(g)，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提 供(許可證號(hào)：SCXK (粵）2013-0020)。試劑：別嘌醇片(廣東彼迪藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)： 國藥準(zhǔn)字H44021368);氧嗪酸鉀（山東中科泰斗化學(xué)有限公司，批號(hào)：Batch No. 120901); 羧甲基纖維素鈉(上海賽璐珞廠，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：GB2760);尿酸、尿素氮（BUN)檢測(cè)試劑盒(南 京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號(hào)=20140306)。
[0047] (2)實(shí)驗(yàn)方法 動(dòng)物分組與造模：1〇8只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（12只）和造模組（96只)，造模組大 鼠胃灌胃氧嗪酸鉀一周（每天一次)，利用3%戊巴比妥鈉（30 mg ^kg4)腹腔注射麻醉，眼 眶后靜脈叢采血（〇. 5 ml)，以4°C、3000rpm、離心15min，取上層血清測(cè)定尿酸含量；正常對(duì) 照組大鼠灌胃給予等容積的溶媒。將尿酸含量高于110 ymol 的大鼠確定為造模成 功。將造模成功的大鼠按尿酸含量隨機(jī)分為模型對(duì)照組(等容積溶媒)、柴魚蛋白水解物1 (150mg · kg_〇、柴魚蛋白水解物2 (150mg · kg_〇、柴魚蛋白水解物（150mg · kg_〇和別嘌醇 組（25mg · kf1)，每組大鼠12只，灌胃給藥(給藥容積10ml/kg)，模型大鼠給予等容積的蒸 餾水。上述樣品處理7d、14d時(shí)，于末次給藥50min，3%戊巴比妥鈉（30mg · kg_〇腹腔注射 麻醉后，眼眶后靜脈叢取血（0. 5ml)，測(cè)定血清尿酸含量；樣品處理第21d時(shí)，3%戊巴比妥鈉 麻醉后腹主動(dòng)脈取血5ml，除測(cè)定血清尿酸含量外，同時(shí)測(cè)定血清肌酐含量。
[0048] 血清尿酸測(cè)定：采用鎢酸法并嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作和測(cè)定。
[0049] 血清肌酐測(cè)定：采用苦味酸法測(cè)定血清肌酐含量，具體操作嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn) 行測(cè)定。
[0050] 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)均以（土s )表示，采用spssie. 0統(tǒng)計(jì)軟件處理。
[0051] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：氧嗪酸鉀是一種尿酸酶抑制劑，可抑制尿酸分解，提高大鼠體內(nèi)的尿酸 水平，誘導(dǎo)大鼠造成高尿酸血癥。從圖2得知，模型組大鼠的血清尿酸水平約為正常組的3 倍，證實(shí)造模成功。由大鼠血清尿酸測(cè)定結(jié)果得知，服食柴魚蛋白水解物1、柴魚蛋白水解 物2以及柴魚蛋白水解物3大鼠的血清尿酸值在第7以及21天對(duì)比于模型組大鼠以及給 藥前大鼠的血清尿酸值具有明顯下降，盡管效果不如藥物別嘌呤醇，但柴魚蛋白水解物確 實(shí)起到了降低血清尿酸的作用。其中柴魚蛋白水解物3效果最佳，且給藥21天里沒有出現(xiàn) 明顯的反彈，能有效控制大鼠血清尿酸水平。
[0052] 由圖3可知，柴魚蛋白水解物均有一定降低血清肌酐的效果，但沒有明顯的差異。 血清肌酐值是反應(yīng)腎功能的指標(biāo)之一，該值升高意味著腎功能的損害。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果說 明柴魚蛋白水解物具有一定保護(hù)腎臟的作用。
[0053] 三、結(jié)構(gòu)鑒定。
[0054] 對(duì)降尿酸功效最優(yōu)的實(shí)施例3采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 (MALDI-T0F-MS)測(cè)定其分子量，并結(jié)合氨基酸分析推測(cè)其結(jié)構(gòu)。結(jié)果如圖4以及表1所示。
[0055] 由圖4可以看出柴魚蛋白水解物3在分子量為378. 83處有很高的吸收峰，說明柴 魚蛋白水解物3主要含有分子量為378. 83的物質(zhì)。
[0056] 氨基酸分析結(jié)果表明，實(shí)施例3中酶解物肽段一級(jí)氨基酸序列中主要含四種氨基 酸：組氨酸（41. 84%，w/w)、精氨酸（10. 67%，w/w)、賴氨酸（8. 45%，w/w)及蘇氨酸（8. 53%，w/ w)，該四種氨基酸質(zhì)量含量總和約占酶解物總氨基酸含量的70% (w/w)。經(jīng)MALDI-T0F-MS 質(zhì)譜確定其主要肽功效組分的分子量均小于700 Da。
[0057] 表1各氨基酸在柴魚蛋白水解物3中含量

【權(quán)利要求】
1. 一種具有降尿酸功效的柴魚蛋白水解物制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 原料熱處理：新鮮柴魚，去頭、內(nèi)臟、尾以及脊骨后，獲取純肌肉組織，于絞肉機(jī)絞碎 至糜狀，得到柴魚肉糜，加水蒸煮，后冷卻室溫，得到蒸煮后的柴魚肉糜； (2) 限制性酶解：將蒸煮后的柴魚肉糜調(diào)節(jié)pH值至6. 5-8. 5,按柴魚肉糜蛋白質(zhì)量 0. 5%-2. 0%加入蛋白酶，于50-55°C水浴振蕩反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后將水解液置于沸水中保溫 10-20 min滅酶，離心分離，取上清液，得柴魚蛋白水解上清液； (3) 采用膜分離-陰離子交換層析-凝膠過濾層析，三步法分離柴魚蛋白水解物：第一 步：將柴魚蛋白水解上清液過超濾膜，取透過液，將透過液于60-65°C蒸發(fā)濃縮20-45 min ; 第二步：利用DEAE-52纖維素陰離子交換柱進(jìn)行分離，收集洗脫液，洗脫液于60-65°C蒸發(fā) 濃縮20-45 min后；第三步：利用Sephadex G-15凝膠色譜柱進(jìn)一步分離，收集洗脫液，得 到柴魚蛋白水解分離液； (4) 濃縮、噴霧干燥：將柴魚蛋白水解分離液真空濃縮后，噴霧干燥，得到具有降尿酸功 效的柴魚蛋白水解物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)中，柴魚肉糜1:5-1:8 (w/w)加 水于 80-KKTC 下蒸煮 10-30 min。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟（1)中，所述柴魚肉糜蛋白質(zhì)質(zhì)量百分 比含量為24%?28%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟（2)中，所用蛋白酶為木瓜蛋白酶，酶 活力8.0父105。/^，酶解時(shí)間為6.0-12.0 11。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟（3)中，第一步分離所用超濾膜的膜通 量為0-10 kDa;第二步DEAE-52纖維素陰離子交換柱分離時(shí)以0-0. 3 mol/L的NaCl溶液 為洗脫劑；第三步Sephadex G-15凝膠色譜柱分離時(shí)以超純水為洗脫劑。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟（4)中，所述具有降尿酸功效的柴魚蛋 白水解物的肽段一級(jí)氨基酸序列中主要含四種氨基酸：組氨酸為41. 84% (w/w)、精氨酸為 10.67% (w/w)、賴氨酸為8.45% (w/w)及蘇氨酸為8.53% (w/w)，該四種氨基酸質(zhì)量含量總 和約占酶解物總氨基酸含量的70% (w/w);經(jīng)MALDI-TOF-MS質(zhì)譜確定其主要肽功效組分的 分子量均小于700 Da。
【文檔編號(hào)】A61P19/06GK104337836SQ201410520344
【公開日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2014年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月30日
【發(fā)明者】任嬌艷, 盧韻君, 賴婷, 劉鵬, 林澤華, 趙謀明 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)