專利名稱：來源于小麥的多效基因相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種來源于小麥的多效基因相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
矮化、半矮化植株的作用，不僅提高了作物耐肥、抗倒伏的作用，更重要的是降低了莖桿同化，將更多的光合作用產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到穗部，從而提高了收獲指數(shù)，顯著地增加了作物產(chǎn)量。發(fā)生于上世紀(jì)五、六十年代的農(nóng)業(yè)綠色革命，正是由于小麥、水稻半矮桿品種的廣泛推廣以及相應(yīng)栽培技術(shù)的采用，使得小麥、水稻產(chǎn)量有了大幅度的提高。迄今為止，已經(jīng)鑒定并且統(tǒng)一編號的小麥降桿基因一共有21個，但目前生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用并推廣的矮桿基因僅有Rhtl、Rht2、Rht8和Rht9，而其它大部分矮桿基因并未有效的應(yīng)用于小麥的育種生產(chǎn)。小麥矮源的單一化嚴(yán)重的制約著小麥的育種生產(chǎn)，因此挖掘、研究小麥中其它重要的矮桿基因?qū)τ谔岣咝←湹漠a(chǎn)量具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種來源于小麥的多效基因相關(guān)蛋白。該蛋白質(zhì)與小麥的株高、穗發(fā)芽、株型、抽穗期及結(jié)實性相關(guān)。本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)，名稱為Rht-Blc (Rht3)，來源于小麥，是如下a)或b)的蛋白質(zhì)a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)將序列表中序列3的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與如下任一性狀相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)小麥的株高、穗發(fā)芽抗性、株型、抽穗期及結(jié)實性。序列表中的序列3由651個氨基酸組成，。為了使上述(a)中的蛋白便于純化，可在由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表I所示的標(biāo)簽。表I標(biāo)簽的序列
標(biāo)簽殘基序列
Poly-Arg5-6(通常為 5 個)RRRRR
Poly-His2-10(通常為 6個)HHHHHH
FLAG8DYKDDDDK
Strep-tagll8WSHPQFEK
c-myc10EQKLISEEDL上述(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表I所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。上述蛋白質(zhì)的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述蛋白質(zhì)的編碼基因具體可為如下I)或2)或3)的基因I)其核苷酸序列是序列表中序列I或序列2所示的DNA分子；2)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼Rht-Blc的DNA分子；、3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼Rht-Blc的DNA分子。序列表中的序列I由3892個脫氧核糖核苷酸組成，是小麥的Rht-Blc的基因組基因，序列表中的序列2由1956個脫氧核糖核苷酸組成，是小麥的Rht-Blc的cDNA基因。所述嚴(yán)格條件可為如下50°C，在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5M Na3PO4和ImMEDTA的混合溶液中雜交，在50°C，2XSSC，0. I % SDS中漂洗；還可為50°C，在7% SDS、0. 5MNa3POjP ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，I X SSC，0. I % SDS中漂洗；還可為50°C，在7% SDS,0. 5M Na3PO4和 ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，0. 5X SSC, 0. 1% SDS 中漂洗；還可為50°C，在 7% SDS,0. 5M Na3POjP ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，0. I X SSC,0. 1% SDS中漂洗；還可為50°C，在7% SDS,0. 5M Na3POjP ImM EDTA的混合溶液中雜交，在65°C，0. I XSSC,0. 1% SDS中漂洗；也可為在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在65C下雜交，然后用 2 XSSC,0. 1% SDS 和 I X SSC, 0. 1% SDS 各洗膜一次。擴增上述任一所述基因全長或其任意片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述引物對具體可以擴增序列表中序列I所示的DNA分子的一對引物對，其中的一條引物序列為5，-ATG CCG TCT ACA ACT ACT ACG CTG-3’另一條引物序列為5，-AGTCCGGCC CGT GCT TAT TTT G-3’(該引物用來擴增Rht-Blc基因的基因組DNA)。所述引物對具體可以擴增序列表中序列2所示的DNA分子的一個片段的一對引物對，其中的一條引物序列為，5’-ATG AAG CGC GAG TAC CAG GA-3’，另一條引物序列為5，-TCA CGG CGC GGC CAG GCG CCA TGC-3’(該引物用來擴增 Rht-Blc 基因的 cDNA 序列)。含有所述基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或重組病毒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?？捎矛F(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pR0KII、pBin438、PCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391_Xa 或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用所述基因構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子(如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動子、玉米的泛素啟動子(Ubiquitin))、組成型啟動子或組織特異表達(dá)啟動子(如種子特異表達(dá)的啟動子)，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、抗生素的標(biāo)記基因(如賦予對卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptll基因,賦予對除草劑膦絲菌素抗性的bar基因,賦予對抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對methatrexate抗性的dhfr基因,賦予對草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等(如抗除莠劑基因)、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。 含有Rht-Blc基因的重組載體具體可為由35s啟動子啟動Rht-Blc轉(zhuǎn)錄的重組表達(dá)載體p35s Rht-Blco p35s Rht-BIc是在pCambial300中插入35s啟動子和序列I的第1-3892位核苷酸所示的Rht-Blc基因得到的由35s啟動子啟動Rht-Blc基因轉(zhuǎn)錄的重組表達(dá)載體。含有Rht-Blc 基因的重組載體具體還可為 pRht-Blc =Rht-Blc 0pRht-Blc =Rht-Blc是在pCambial300中插入序列表中序列4的第1-4213位核苷酸序列所示的Rht-Blc基因的啟動子和序列I的第1-3892位核苷酸所示的Rht-Blc基因得到的重組表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體中，Rht-Blc基因由Rht-Blc啟動子啟動轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將Rht-Blc基因?qū)肽康闹参镏?，得到具有如下至少一種性狀的轉(zhuǎn)基因植物1)株高低于所述目的植物；2)抽穗開花遲于所述目的植物3)分蘗角度大于所述目的植物；4)穗發(fā)芽抗性高于所述目的植物。其中，Rht-Blc基因可通過含有Rht-Blc基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物中，所述重組表達(dá)載體中，啟動Rht-Blc基因轉(zhuǎn)錄的啟動子為35s啟動子、或如下a)或b)的啟動子a)其核苷酸序列是序列表中序列4所示的DNA分子；b)其核苷酸序列是序列表中序列4第1-4213位所示的DNA分子。含有Rht-Blc基因的重組表達(dá)載體具體可為上述p35s :Rht-Blc或pRht_Blc Rht-Blc0所述目的植物具體可為雙子葉植物或單子葉植物，所述單子葉植物具體可為水稻。所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述基因轉(zhuǎn)化目的植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述基因可先進(jìn)行如下修飾，再導(dǎo)入宿主中，以達(dá)到更好的表達(dá)效果I)根據(jù)實際需要進(jìn)行修飾和優(yōu)化，以使基因高效表達(dá)；例如，可根據(jù)受體植物所偏愛的密碼子，在保持本發(fā)明所述核苷酸序列編碼的氨基酸的同時改變其密碼子以符合植物偏愛性；優(yōu)化過程中，最好能使優(yōu)化后的編碼序列中保持一定的GC含量，以最好地實現(xiàn)植物中導(dǎo)入基因的高水平表達(dá)，其中GC含量可為35 %,優(yōu)選為多于45 %,更優(yōu)選為多于50%，最優(yōu)選多于約60% ；2)修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻譯有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列進(jìn)行修飾；3)與各種植物表達(dá)的啟動子連接，以利于其在植物中的表達(dá)；所述啟動子可包括組成型、誘導(dǎo)型、時序調(diào)節(jié)、發(fā)育調(diào)節(jié)、化學(xué)調(diào)節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動子；啟動子的選擇將隨著表達(dá)時間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種；例如組織或器官的特異性表達(dá)啟動子，根據(jù)需要受體在發(fā)育的什么時期而定；盡管證明了來源于雙子葉植物的許多啟動子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動子用于雙子葉植物中的表達(dá)，單子葉植物的啟動子用于單子葉植物中的表達(dá)；4)與適合的轉(zhuǎn)錄終止子連接，也可以提高本發(fā)明基因的表達(dá)效率；例如來源于CaMV的tml，來源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發(fā)明基因進(jìn)行連接；5)引入增強子序列，如內(nèi)含子序列(例如來源于Adhl和bronzel)和病毒前導(dǎo)序 列(例如來源于TMV，MCMV和AMV)；在實際操作中，也可以將本發(fā)明基因進(jìn)行細(xì)胞靶向定位。可利用本領(lǐng)域現(xiàn)有的技術(shù)實現(xiàn)。例如，將來源于靶向細(xì)胞器的靶基因序列與本發(fā)明基因序列融合，再導(dǎo)入植物細(xì)胞中，就可定位了。本發(fā)明的另外一個目的是提供一種輔助檢測小麥中是否攜帶Rht-Blc基因的方 法。本發(fā)明所提供的輔助檢測小麥中是否攜帶Rht-Blc基因的方法，是以待測小麥的基因組DNA為模板，用引物進(jìn)行PCR擴增，如得到489bp的擴增片段，則待測小麥為不攜帶Rht-Blc基因的候選小麥；如得到2515bp的擴增片段，則待測小麥為攜帶Rht-Blc基因的候選小麥；所述引物為核苷酸序列分別是序列表中序列6和7的兩個單鏈DNA。另外，名稱為CAAS-TRM-6B的轉(zhuǎn)座子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。其中，CAAS-TRIM-6B的轉(zhuǎn)座子是如下a)或b)的DNA分子a)其核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子；b)與a)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有轉(zhuǎn)座子活性的DNA分子。Rht-Blc基因啟動子是如下a)或b)的DNA分子a)其核苷酸序列是序列表中序列4所示的DNA分子；b)與a)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有啟動子活性的DNA分子。本發(fā)明輔助檢測小麥中是否攜帶Rht-Blc基因的方法準(zhǔn)確、可靠，可用于檢測小麥發(fā)育早期的Rht-Blc多效基因所控制性狀，對培育半矮桿、耐穗發(fā)芽、高產(chǎn)的小麥具有重要指導(dǎo)作用，從而優(yōu)化雜交組合，加快育種速度，降低育種成本，具有操作簡單，成本低廉，周期短等優(yōu)點，非常適于推廣應(yīng)用，對小麥的遺傳育種有重要的意義。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)大拇指矮所攜帶的Rht-Blc基因是位于小麥4BS染色體短臂上的赤霉素不敏感的完全顯性基因，主要影響小麥的株高、穗發(fā)芽、株型、結(jié)實性及抽穗期。正是由于Rht-Blc基因的這種極強的多效性，該基因在小麥的育種生產(chǎn)中具有重要的意義。


圖I為Rht-Blc近等基因系的表型觀察；圖I中，c為20株的株高平均值土標(biāo)準(zhǔn)差；d為20株的穗發(fā)芽的平均值土標(biāo)準(zhǔn)差；e為20株的分蘗角度的平均值土標(biāo)準(zhǔn)差；

f為20株的抽穗期的平均值土標(biāo)準(zhǔn)差；圖2為Rht-Blc基因的克隆及基因結(jié)構(gòu)分析；圖3為Rht-Blc基因功能的驗證；其中，pRht-Blc =Rht-Blc和p35s =Rht-Blc分別表示轉(zhuǎn)入相應(yīng)載體的植株圖4為a -amylase含量測定以及酵母雙雜交實驗結(jié)果；
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例I、Rht-Blc近等基因系的構(gòu)建及表型分析首先我們用偃展一號(河南地方品種，以下稱為NIL-Rht-Bla表不)作為輪回親本，大拇指矮作為供體親本回交7代，構(gòu)建得到矮桿基因Rht-Blc的近等基因系(以NIL-Rht-Blc表示)，然后將其種植于長日照地區(qū)-河北，與短日照地區(qū)-云南，分別進(jìn)行田間表型的觀察，調(diào)查其株高、分蘗角度、抽穗期、穗發(fā)芽、籽粒飽滿度等性狀(圖1，A為NIL-Rht-Bla, B為NIL-Rht-Blc)。田間調(diào)查結(jié)果表明構(gòu)建得到的矮桿基因的近等基因系NIL-Rht-Blc平均株高僅為30cm，要明顯低于NIL-Rht-Bla的株高(圖la、c)。收獲后觀察籽粒也存在有較為明顯的差異，NIL-Rht-Blc的籽粒偏干癟，而NIL-Rht-Bla的籽粒要飽滿的多(圖lb)。同樣NIL-Rht-Blc在河北與云南的穗發(fā)芽率分別為13. 7%和17.8%，要明顯低于NIL-Rht-Bla在這兩地的穗發(fā)芽率(64. 7%和66. 7% )(圖Id);在比較分蘗角度的時候發(fā)現(xiàn)NIL-Rht-Blc的植株明顯呈現(xiàn)匍匐狀，分蘗角度明顯大于NIL-Rht-Bla的植株(圖Ie)。NIL-Rht-Bla與NIL-Rht-Blc植株的抽穗期也具有明顯差異，在長日照地區(qū)河北NIL-Rht-Blc要比NIL-Rht-Bla晚5天左右，而在短日照地區(qū)云南差異更加明顯，要晚10天左右(圖If)。在Rht-Blc重組自交系(RIL-Rht-Blc)與豫麥18的F2分離群體中也發(fā)現(xiàn)，較矮植株的都伴隨有抵抗穗發(fā)芽、干癟的籽粒、株型匍匐以及抽穗期較晚。以上這些結(jié)果都證實這些性狀都是由同一個矮桿基因Rht-Blc (Rht3)所控制。其中，穗發(fā)芽率按照如下方法測定采用脫拉種子直接發(fā)芽試驗法，每品種各重復(fù)隨機取混脫種子50粒，置培養(yǎng)皿中直接進(jìn)行發(fā)芽試驗，每天對每品種的各重復(fù)逐粒發(fā)芽檢查，直到一周，計算其發(fā)芽率。分蘗角度按照如下方法測定分蘗角度是在收獲期時調(diào)查20株，最大角度的測量方法是在植株中軸距地面20厘米高處，以不同方向量取中軸與外圍分蘗的水平距離3次，算平均值，再求出寬/高比值，并用反正切函數(shù)將其轉(zhuǎn)換成該株的分蘗最大夾角。
實施例2、小麥蛋白Rht-Blc及其編碼基因Rht-Blc的獲得一、小麥中Rht-Blc基因組DNA序列的獲得首先設(shè)計跨越起始密碼子和終止密碼子擴增基因全長的引物=Rht-Blcp5，-ATGCCG TCT ACA ACT ACT ACG CTG-3，與 5，-AGT CCG GCC CGT GCT TAT TTT G-3，。以中國春(Rht-Bla)、農(nóng)林10號(Rht-Blb)、大拇指矮(Rht-Blc)基因組DNA為模板，用引物Rht-Blcp進(jìn)行PCR擴增，PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果顯示中國春與農(nóng)林10號中都得到了預(yù)期的2Kb擴增片段，而在大拇指矮中得到一個比中國春與農(nóng)林10號明顯大2Kb左右的新的擴增片段(圖2中a)。將該片段克隆測 序獲得大拇指矮中Rht-Blc基因的基因組DNA序列，由3892bp組成(序列I)。二、小麥中Rht-Blc cDNA序列的獲得 同時也設(shè)計引物Rht-Blc-eDNAp(5’-ATG AAG CGC GAG TAC CAG GA-3，與5，-TCACGG CGC GGC CAG GCG CCA TGC-3’)，擴增中國春(Rht-Bla)、農(nóng)林 10 號(Rht-Blb)、大拇指矮(Rht-Blc)的總mRNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，凝膠電泳圖如圖2中a。將擴增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序，獲得大拇指矮中Rht-Blc基因的eDNA序列，由1956個核苷酸組成，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，編碼序列表中序列3的蛋白質(zhì)。三、小麥中Rht-Blc基因啟動子序列的獲得我們設(shè)計引物擴增基因的啟動子Rht-Bp(5’ -GCG GCG CTT TTC CTG CTT TGTC-3’％5’-GAT CTC GCC TCT CGC CTC CCT ACC-3，)。以中國春(Rht-Bla)、農(nóng)林 10 號(Rht-Blb)、大拇指矮(Rht-Blc)基因組DNA為模板，用引物Rht-Bp進(jìn)行PCR擴增，PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，凝膠電泳圖如圖2中b檢測結(jié)果顯示中國春與農(nóng)林10號以及大拇指矮中都得到了預(yù)期的擴增片段4kb，將該片段克隆測序獲得小麥中Rht-Blc基因的啟動子DNA序列，其核苷酸序列如序列表中序列4所示，由4213個核苷酸組成。四、小麥中Rht-Blc基因組DNA與cDNA序列的比較將上述一、二中所得到的序列進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明Rht-Blc基因全長為3892bp,包含 2 個外顯子和 I 個內(nèi)含子，Exonl = I 147bp ；Intronl = 148 2083bp ；Exon2 = 2084 3892bp ;其開放讀碼框為1956bp，編碼651個氨基酸，理論分子量為68. OkD，等電點pi值為4. 94。序列比較同時還發(fā)現(xiàn)，Rht-Blc基因組DNA序列是在Rht-Bla基因組DNA序列的ATG后147bp處插入2026個核苷酸(圖2中c)。cDNA序列比較發(fā)現(xiàn)Rht-Blc在DELLA區(qū)存在有90bp的插入，這90bp正好與2026-bp的插入的3’端的90bp序列相一致。Rht-Bla(Rht-Blb)均是是無內(nèi)含子的基因，但是由于2026-bp序列的插入，使得基因結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，Rht-Blc基因包含有兩個外顯子與一個內(nèi)含子。在內(nèi)含子與外顯子銜接處得序列也完全符合"GT-AG"規(guī)律，同時在轉(zhuǎn)錄水平90-bp核苷酸序列的插入也導(dǎo)致了在Rht-Blc基因翻譯蛋白質(zhì)時在DELLA區(qū)域存在有30個氨基酸的插入(圖2中d)。五、一個新的TRMs轉(zhuǎn)座子的認(rèn)定2026bp的插入序列與其插入位點附近的5bp的核苷酸AG(位于插入序列5’端)GTG (位于插入序列 3，端)組成一個完整的 intact Terminal repeat retro-transposonsinminiature (TRIMs)0這個轉(zhuǎn)座子序列長度為2031bp (序列表中的序列5)，其中包含兩個503bp的terminal direct repeats (TDRs),而且這兩個TDRs之間非常的保守，沒有任何的喊基差異。此外在兩個TDRs之間的序列不編碼任何蛋白，而在中間序列的兩端具有22bp (CGA ACC TTG TGG CTC TGA ATA C)的 primer binding site (PBS)，以及 15bp (ITT CCCCCC TTA ATC)的 polypurine tract (PPT),而且在序列的兩端具有 5bp (AGGTG)的 targetsite duplications (TSD),而這5bp的序列是在TRIMs轉(zhuǎn)座到這一位置后形成的,這一序列具備有TRIMs元件的基本結(jié)構(gòu),可以認(rèn)定這一插入序列是一個TRIMs元件(圖2中e)。比對小麥重復(fù)序列數(shù)據(jù)庫 TREP Rel ease 10 (theTriticeae Repeat Sequence Database http //wheat, pw. usda. gov/ITMI/Repeats/)結(jié)果顯示，與已知的重復(fù)序列沒有任何相似性,據(jù)此我們認(rèn)為這是一個新的TRMs。為了進(jìn)一步研究這個新的TRMs的起源，我們比對中國春測序數(shù)據(jù)庫(http //www. cerealsdb. uk. net/search_reads. htm.)經(jīng)過電子拼接序列，我們得到了包含有插入序列在內(nèi)的大約5Kb的序列，根據(jù)這一 5Kb的序列我們設(shè)計了一對擴增2026bp序列的引物pTRIMs(5> -CCG GAC AAA TGG AGG AGA-3，與 5，-CGC GCA TCA TCC CGA GTAT-3，)。為了將這一序列在小麥基因組上進(jìn)行定位，我們首先用這一標(biāo)記對小麥的AA基因組(T. urartu)AABB基因組(Langdon)DD基因組(粗山羊草Ae. tauchii)進(jìn)行了擴增,PCR擴增結(jié)果顯示只有在Longdon材料中能夠擴增出目標(biāo)片段，這一結(jié)果也說明這一插入序列位于小麥的B基因組(圖2中f,A為T. urartu,AB為Langdon,D為粗山羊草Ae. tauchii,CS為中國春，HlO為旱選10號，L14為魯麥14)。為了更加詳細(xì)的對其定位我們擴增了旱選10號與魯麥14 (DH作圖群體的親本)，在魯麥14中擴增得到預(yù)期的片段2878bp，而在旱選10號中擴增片段大約為800bp，測序結(jié)果顯示，旱選10號比魯麥14缺失2026bp，恰好與在大拇指矮中插入的片段序列相一致。這種插入/缺失的的多樣性標(biāo)記用來擴增旱選10號X魯麥14的DH群體的150個株系，結(jié)合這一群體的作圖數(shù)據(jù)，利用Mapmaker3. 0軟件將這一插入序列定位于小麥6B染色體的SSR標(biāo)記Wmc341與Wmcl82之間，遺傳距離分別為
7.9和7. 5cM (圖2中g(shù))。據(jù)此，我們將這一插入序列命名為CAAS-TRM-6B(序列表中的序列5)。為了檢測CAAS-TRM-6B在小麥基因組中的分布，我們檢測了一套多樣性非常豐富的材料，檢測結(jié)果表明僅有7份材料在小麥的6B染色體上檢測到了 CAAS-TRM-6B，包括中國春、魯麥14、臺中23、晉麥2148、大粒半芒、Sunstar、溫麥6號、和尚麥、白殼光頭。而其它的大部分材料在小麥的6B染色體上沒有檢測到含有CAAS-TRM-6B。包括大拇指矮、Langdon、96S-226、紅花麥、紅冬麥、中農(nóng)28、96S-223、成都光頭、AM3、旱選10號、偃展I號、小白芒、品旱328、京紅5號、內(nèi)鄉(xiāng)188、阿勃、白蒲、新克旱9號、歐柔、早穗30、長貢方形麥、內(nèi)麥11、康定小麥、寧春13、W7984、紅蜷芒、小口紅、白麥子、白花麥、0pata85、GIAVA、望水白、六月黃、卡捷姆F71、豫麥18、鄭引4號、上林小麥、木宗卓嘎、矮孟牛、阿特拉斯66、半截芒、換果香、藏冬4號、洋麥、農(nóng)大311、白油麥、火球、抗銹10號、咸農(nóng)39、寧春4號。這說明轉(zhuǎn)座子CAAS-TRIM-6B已經(jīng)從6B染色體轉(zhuǎn)移到小麥基因組的其它位置，比如在大拇指矮中就是從小麥的6B染色體轉(zhuǎn)移到小麥的4B染色體上的。以上這些實驗結(jié)果說明CAAS-TRM-6B在小麥基因組中是非常活躍的，并且這種轉(zhuǎn)座子的跳躍具有隨機性。實施例3Rht_Blc基因功能的驗證為了驗證我們所得到的基因序列的正確性，我們根據(jù)Rht-Blc基因組序列中2026個核苷酸的插入片段設(shè)計引物Rht-BlcM(5’-ATG CCG TCT ACA ACT ACT ACG CTG_3’5’_TAGTGC ACG GTG TCC GTG GCG A_3’)，該引物可直接用于特異的檢測Rht-Blc基因。當(dāng)含有Rht-Blc基因時，擴增片段為2515bp，否則擴增片段為489bp。在這里我們將引物Rht-BlcM用于檢測實施例I中構(gòu)建的矮桿基因的近等基因系(以NIL-Rht-Blc表示)，以及RIL-Rht-Blc的F2分離群體。檢測結(jié)果都表明所有矮桿植株都含有Rht-Blc基因，相反在高桿材料中則檢測不到Rht-Blc基因(圖3中a，Rht-Blc為矮桿植株，Rht-bla為高桿植株)。這一檢測結(jié)果說明了 Rht-Blc基因與株高、穗發(fā)芽、分蘗角度、抽穗期以及結(jié)實性直接關(guān)聯(lián)。為了進(jìn)一步證實Rht-Blc基因的在植物中功能，我們構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻，具體表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化過程如下其中，pCambial300-35s按照如下方法構(gòu)建根據(jù)35s啟動子引物序列設(shè)計引物F 5’ -CCG GAA TTC ATG GTG GAG CAC GAC ACT CTC GTC T-3’(下劃線序列為 EcoRI 為酶切位點)和 R :5’ -CGG GGT ACC CTG TCC TCT CCA AAT GAA ATG A-3’ (下劃線序列為 KpnI酶切位點)，從質(zhì)粒pCambial300擴增35s啟動子，將該35s啟動子插入pCambial300的限 制性內(nèi)切酶EcoRI和KpnI識別位點得到pCambial300-35s。35s啟動子表達(dá)載體p35s =Rht-Blc的構(gòu)建具體根據(jù)Rht-Blc的cDNA序列設(shè)計引物 F:5’ -CGG GGT ACC ATG AAG CGC GAG TAC CAG-3’(下劃線序列為 KpnI 酶切位點)和 R :5’ -CTA GTC TAG ATC ACG GCG CGG CCA GGC G-3’ (下劃線序列為 XbaI 酶切位點)，擴增得到Rht-Blc的基因組DNA的ORF (具有序列I的第1-3892位核苷酸序列)，經(jīng)KpnI/XbaI雙酶切后，通過T4 DNA連接酶將基因插入到pCambial300_35s載體的KpnI和XbaI位點得到重組載體p35s :Rht-Blc。自身啟動子表達(dá)載體pRht-Blc =Rht-Blc的構(gòu)建具體根據(jù)Rht-Blc基因的啟動子區(qū)域序列設(shè)計引物 F :5’ -GCA TCA ATT GGC GGC GCT TTT CCT GCT TTG TC-3’(下劃線序列為 MfeI 位點)和 R :5’ -GGC GGT ACC GAT CTC GCC TCT CGC CTC CCT ACC-3’ (下劃線序列為KpnI酶切位點)，擴增得到Rht-Blc的啟動子(具有序列表中序列4的第1-4213位核苷酸序列)，經(jīng)Mfel/Kpnl雙酶切后，通過T4連接酶將啟動子插入到p35s =Rht-Blc的MfeI和KpnI位點以替換35s啟動子，得到重組載體pRht-Blc :Rht_Blc。表達(dá)載體構(gòu)建完成后，經(jīng)過酶切與測序驗證其正確性后，取IiU構(gòu)建好的表達(dá)載體質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)入20 ill EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，然后用ImlYEB液體培養(yǎng)基28 0C 250rpm恢復(fù)培養(yǎng)3h，取10 菌液涂布于YEB抗性平板上(卡那霉素50mg/L，利福平Rif50mg/L)，于28°C培養(yǎng)2 3天。提取農(nóng)桿菌的質(zhì)粒進(jìn)行目標(biāo)基因的PCR檢測，陽性菌液保存于_70°C超低溫冰箱中備用。將陽性菌液擴大培養(yǎng)，然后侵染水稻品種日本晴(高桿且直立)的愈傷組織，用潮霉素抗性篩選愈傷，并進(jìn)一步培養(yǎng)分化成幼苗，然后移栽大田。pRht-Blc =Rht-Blc轉(zhuǎn)基因植株的檢測實施例3中所設(shè)計的特異檢測Rht-Blc基的引物:Rht-BlcM(5，-ATG CCG TCT ACA ACT ACT ACG CTG-3，與 5，-TAG TGC ACG GTGTCCGTG GCG A-3’ )可以用來檢測pRht-Blc :Rht_Blc是否轉(zhuǎn)入日本晴，如轉(zhuǎn)入則有擴增，如無轉(zhuǎn)入則沒有擴增片段。p35s :Rht-Blc 轉(zhuǎn)基因植株的檢測所用引物為 5’ -ACA GCA CCA GAC GCT CAC03’與5’-!76 GTA TTC AGA GCC ACA AGG-3’)，所擴增片段大小為606bp。如有擴增片段說明該植株有目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)入，無擴增片段則認(rèn)為該基因沒有目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)入。同時設(shè)轉(zhuǎn)入 pCambial300-Rht-Blc (將 pRht-Blc =Rht-Blc 中的 Rht-Blc 的基因組 DNA 去除得到的重組載體)的轉(zhuǎn)基因日本晴對照，轉(zhuǎn)入pCambial300-35s的轉(zhuǎn)基因日本晴對照。經(jīng)過PCR檢測，共檢測到72株轉(zhuǎn)pRht-Blc =Rht-Blc的TO代的植株，其平均株高為8. 6±0. 8cm,降桿幅度為80.9% ;檢測到27株轉(zhuǎn)p35s =Rht-Blc的TO代植株，其平均株高為4. 6±0. 4cm,其降桿幅度為89. 8 %。25株日本晴(Nipponbare)的平均株高為45± I. 2011。25株轉(zhuǎn)口0&1111^31300-358的1'0代的植株上的平均株高為43. 5±1. Icm ;25株轉(zhuǎn)pCambial300-Rht-Blc (將 pRht-Blc :Rht_Blc 中的 Rht-Blc 的基因組 DNA)去除得到的重組載體)的TO代的植株的平均株高為44. 5 ±2. Icm0同時觀察到p35s :Rht_Blc和pRht-Blc Rht-Blc的轉(zhuǎn)基因植株明顯要比空對照日本晴匍匐(圖3中c)。同時田間調(diào)查抽穗期還可以看出p35s =Rht-Blc和pRht-Blc =Rht-Blc轉(zhuǎn)基因植株的抽穗期要比日本晴以及對照的晚10天以上。田間調(diào)查結(jié)果都證實了 Rht-Blc基因具有降低株高、延遲抽穗開花、增大分蘗角度的作用。RT-PCR分析結(jié)果說明這些轉(zhuǎn)基因植株都是單拷貝基因，而且在轉(zhuǎn)錄水平具有相同的表達(dá)量，這一結(jié)果說明這些TO代植株的表型是由于插入片段所引起的(圖3中b)。 RT-PCR 分析所用引物為 Actin 引物為:5，-TGT GCC CCG TGC TGTTCT TAT G-3，與 5，-CCCTTG GCC CAG TTG TTA CCC-3’。檢測 Rht-Blc 表達(dá)量所用引物為 5’-ATC TGG GGC GGC TGCTGC TCC TG-3，與 5，-GTG TGC CAC CCC AGC GTC AGG CAG-3，。實施例4大拇指矮種子中a-amylase含量的測定由于糊粉層a -amylase的含量直接影響種子的發(fā)芽程度，所以我們對Rht-Bla與Rht-Blc種子的a-amylase的含量進(jìn)行了測定。具體方法為小麥種子去皮后，去掉有胚的一半，把無胚的一半用I. 5% NaClO表面滅菌30分鐘，再用滅菌水清洗種子三次后，放在含有0. 2%淀粉，2%瓊脂粉，IOmM醋酸鈉和2mM CaCl2, pH值為5. 3的平板上培養(yǎng)，其中加入IuM GA3，以不加GA3的作為陽性對照。當(dāng)平板在30°C黑暗中放置大約60-72h后，取出置于碘蒸汽中檢測a-淀粉酶活性。所用材料為中國春(Rht-Bla)與大拇指矮(Rht-Blc)，檢測結(jié)果如圖4中a所示在不含有GA3的平板中Rht-Bla與Rht-Blc均沒有a -amylase的釋放，而在含有I U M GA3的平板中觀察到Rht-Bla有明顯的較大白斑出現(xiàn)，說明Rht-Bla在外加GA3的條件下有較多的a -amylase的釋放,而Rht-Blc幾乎看不到白斑的出現(xiàn),說明Rht-Blc僅釋放微量的a -amylase。這一結(jié)果說明Rht-Blc種子中a -amylase含量要明顯低于Rht-Bla，從而Rht-Blc表現(xiàn)出較強的抵抗穗發(fā)芽的能力。實施例5酵母雙雜交實驗驗證GIDl與DELLA蛋白的相互作用 根據(jù)已有的研究報道，GA的受體-GIDl在GA3存在的時候與DELLA蛋白是相互作用的，從而引起DELLA蛋白的降解。為了研究Rht-Blc與GIDl在小麥中的相互作用情況，我們根據(jù)clontech公司的實驗操作流程，將TaGIDl利用NdeI與EcoRI酶切位點連接到pGADI7載體，同樣利用NdeI與EcoRI酶切位點將Rht-Bla與Rht-Blc連接到pGBKI7載體。然后將攜帶有Rht-Bla與Rht-Blc及TaGIDl的共轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞中，最后在-Leu-Trp-Ade-His缺陷型培養(yǎng)基上觀察酵母的生長情況。酵母雙雜交結(jié)果如圖4b :在缺乏GA3的培養(yǎng)基上Rht-Bla-TaGIDl與Rht-Blc-TaGIDl都沒有觀察到菌斑的生長，說明在缺乏GA3的情況下Rht-Bla-TaGIDl 與 Rht-Blc-TaGIDl 都沒有相互作用；而在外加 GA3 的-Leu-Trp-Ade-His的缺陷型培養(yǎng)基上Rht-Bla-TaGIDl出現(xiàn)明顯的陽性克隆，說明Rht-Bla-TaGIDl在GA3存在的時候是發(fā)生相互作用的，而在同樣條件的培養(yǎng)基上Rht-Blc-TaGIDl看不到任何陽性克隆，說明Rht-Blc-TaGIDl即使是在GA3存在的時候也不會發(fā)生相互作用，然后我們采用濾紙染色的方法驗證了這一結(jié)果。以上酵母雙雜交結(jié)果說明Rht-Blc基因由于在DELLA區(qū)域存 在有的30AA的插入，導(dǎo)致了 Rht-Blc與TaGIDl的相互作用消失，從而使得DELLA蛋白大量積累，抑制了植物體內(nèi)GA的合成，DELLA蛋白調(diào)節(jié)下游的基因表達(dá)，進(jìn)而引起多種表型的產(chǎn)生。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，是如下a)或b)的蛋白質(zhì) a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； b)將序列表中序列3的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與如下任一種性狀相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)小麥的株高、穗發(fā)芽抗性、株型、抽穗期及結(jié)實性。
2.權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述蛋白質(zhì)的編碼基因為如下I)或2)或3)的基因 1)其核苷酸序列是序列表中序列I或序列2所示的DNA分子； 2)與I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)的DNA分子； 3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)的DNA分子。
4.擴增權(quán)利要求2或3所述基因全長或其任意片段的引物對；含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或重組病毒。
5.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2或3所述基因?qū)肽康闹参镏?，得到具有如下至少一種性狀的轉(zhuǎn)基因植物1)株高低于所述目的植物；2)抽穗開花遲于所述目的植物3)分蘗角度大于所述目的植物；4)穗發(fā)芽抗性高于所述目的植物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2或3所述基因通過含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物中，所述重組表達(dá)載體中，啟動權(quán)利要求2或3所述基因轉(zhuǎn)錄的啟動子為35s啟動子、或如下a)或b)的啟動子a)其核苷酸序列是序列表中序列4所示的DNA分子；b)其核苷酸序列是序列表中序列4第1-4213位所示的DNA分子。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物具體可為水稻。
8.輔助檢測小麥中是否攜帶權(quán)利要求2或3所述基因的方法，是以待測小麥的基因組DNA為模板，用引物進(jìn)行PCR擴增，如得到489bp的擴增片段，則待測小麥為不攜帶權(quán)利要求2或3所述基因的候選小麥；如得到2515bp的擴增片段，則待測小麥為攜帶權(quán)利要求2或3所述基因的候選小麥；所述引物為核苷酸序列分別是序列表中序列6和7的兩個單鏈DNA。
9.一種DNA分子，是如下a)或b)的DNA分子 a)其核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子； b)與a)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有轉(zhuǎn)座子活性的DNA分子。
10.一種DNA分子，是如下a)或b)的DNA分子 a)其核苷酸序列是序列表中序列4所示的DNA分子； b)與a)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有啟動子活 性的DNA分子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種來源于小麥的多效基因相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。該來源于小麥的多效基因相關(guān)蛋白，是如下a)或b)的蛋白質(zhì)a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)將序列表中序列3的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與如下任一種性狀相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)小麥的株高、穗發(fā)芽、株型、抽穗期及結(jié)實性。該蛋白的編碼基因影響小麥的株高、穗發(fā)芽、株型、結(jié)實性及抽穗期。正是由于該基因的這種極強的多效性，該基因在小麥的育種生產(chǎn)中具有重要的意義。
文檔編號C12N15/113GK102731634SQ20111009338
公開日2012年10月17日 申請日期2011年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月14日
發(fā)明者孔秀英, 武晶, 賈繼增 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所