小麥TaSPL3基因的SNP分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及作物分子生物學(xué)和分子育種領(lǐng)域，更具體地，涉及小麥TaSPL3基因的 SNP分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 小麥作為一種重要的糧食作物，全世界有35%-40%的以小麥為主要糧食。同時 作為三大谷物之一，產(chǎn)量幾乎全做食用，是世界上總產(chǎn)量僅次于玉米的糧食作物。隨著水 稻、玉米等在內(nèi)的多種植物全基因組測序的完成，人類開始進(jìn)入功能基因的時代。利用物種 已知功能的目標(biāo)基因進(jìn)行序列比對和分析，利用高保守序列對研宄物種進(jìn)行引物設(shè)計和同 源序列克隆，是發(fā)現(xiàn)新基因的常用方法之一。
[0003]SPL(squamosapromoterbindingprotein-like)是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子， 在調(diào)控植物生長和生殖階段轉(zhuǎn)變、花和果實發(fā)育、光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及植株形態(tài)建成等多種發(fā)育 過程中發(fā)揮重要作用。SPL含有一個由80個氨基酸殘基組成的高度保守的SBP結(jié)構(gòu)域，以 此同下游靶基因啟動子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控靶基因的表達(dá)。大多數(shù)SPL均具有miR156/157識 別位點，miR156/157可以通過靶mRNA剪切或翻譯抑制來調(diào)控SPL的表達(dá)。
[0004] 目前，在水稻中，對SPL基因有了比較詳盡的認(rèn)識。小麥作為人類重要的糧食作 物，但是關(guān)于SPL基因家族在小麥中結(jié)構(gòu)和功能分析還是知之甚少，對該基因在小麥的生 物功能和分子基礎(chǔ)尚不清楚，若該基因在小麥的生長發(fā)育過程中具有重要的調(diào)控功能，那 么該基因的SNP分子標(biāo)記在小麥遺傳育種領(lǐng)域、種質(zhì)資源鑒定等方面都將發(fā)揮重要的作 用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供小麥TaSPL3基因的SNP分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
[0006] 利用水稻SPL基因保守的SBP結(jié)構(gòu)域和小麥二倍體AA、DD基因草圖測序結(jié)果， 先在二倍體中克隆SPL基因，利用二倍體與六倍體的同源性，然后以普通小麥中國春葉片 cDNA為模板利用PCR方法擴(kuò)增得到在A、B、D同源染色體上的基因序列，分別如SEQ ID NO. 1-3所示，該基因命名為TaSPL3。該基因定位于第六染色體同源群上。
[0007] 本發(fā)明提供了用于克隆小麥TaSPL3基因的引物組合，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4-5 所示。
[0008] 相應(yīng)地，本發(fā)明提供了小麥TaSPL3基因的克隆方法，利用SEQ ID NO. 4-5所示的 特異性引物組合，以小麥葉cDNA為模板，PCR擴(kuò)增得到小麥TaSPL3基因。
[0009] 小麥TaSPL3基因的SNP分子標(biāo)記，通過以下任一對引物擴(kuò)增得到：
[0010] (1) SPL3A-F-primer CGGCAGCGGCAGCGGCAA S P L 3 A-R-p r i m e r CCTATCAGTGTTTTTGACGG ；
[0011] (2) SPL3B-F-pr imer ATTCTTCTGGCGGCAGTG S P L 3 B - R-p r i m e r CAACTTTACCCAACTCAGGG ；
[0012] (3) SPL3D-F-pr imer TCCATTCTTCTGGCGGTAG SPL3D-R-pr imer AACTTTACCCAGCTCGGTG。
[0013] 本發(fā)明所述小麥TaSPL3基因位于小麥第六同源群上，其在小麥6A同源染色體的 序列如SEQ ID NO. 1所示，其在小麥6B同源染色體的序列如SEQ ID N0. 2所示，其在小麥 6D同源染色體的序列如SEQ ID N0. 3所示。
[0014] 本發(fā)明提供了檢測小麥TaSPL3基因的方法，采用上述任一個SNP分子標(biāo)記，PCR檢 測待測植物基因組樣品。若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶長1. 3kb，則待測植物中存在小麥TaSPL3基 因。
[0015] 本發(fā)明提供的上述方法中，檢測小麥TaSPL3A基因的SNP分子標(biāo)記通過以下引物 擴(kuò)增得到：
[0016] SPL3A-F-primer CGGCAGCGGCAGCGGCAA
[0017] SPL3A-R-primer CCTATCAGTGTTTTTGACGG。
[0018] 檢測小麥TaSPL3B基因的SNP分子標(biāo)記通過以下引物擴(kuò)增得到：
[0019] SPL3B-F-primer ATTCTTCTGGCGGCAGTG
[0020] SPL3B-R-primer CAACTTTACCCAACTCAGGGo
[0021] 檢測小麥TaSPL3D基因的SNP分子標(biāo)記通過以下引物擴(kuò)增得到：
[0022] SPL3D-F-primer TCCATTCTTCTGGCGGTAG
[0023] SPL3D-R-primer AACTTTACCCAGCTCGGTG。
[0024] 相應(yīng)地，本發(fā)明的上述SNP分子標(biāo)記在檢測小麥TaSPL3基因或小麥種質(zhì)資源鑒定 中的應(yīng)用屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0025] 本發(fā)明的上述SNP分子標(biāo)記在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0026] 本發(fā)明的上述SNP分子標(biāo)記在小麥分子輔助育種中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍。
[0027] 本發(fā)明還提供了 miR156靶位點突變的小麥TaSPL3基因，小麥TaSPL3基因突變后 的miR156靶位點的核苷酸序列為CAU GCA CUG UCG CUC UUG UCU，如SEQ ID N0. 12所示。
[0028] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種使小麥TaSPL3A基因的miR156靶位點突變的方法， 包括以下步驟：
[0029] (1)以SPL3A-0E-F和m3A-R為引物，SPL3A的PCR產(chǎn)物為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回 收PCR產(chǎn)物；
[0030] (2)以m3A-F和SPL3A-0E-R為引物，SPL3A的PCR產(chǎn)物為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回 收PCR產(chǎn)物；
[0031] (3)將前述兩次PCR的產(chǎn)物回收后等量混勻，以此為模板，以SPL3A-0E-F和 SPL3A-0E-R為引物，再進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物即為miRl56靶位點突變的小麥TaSPL3基因；所 述 m3A-F、m3A-R 和 SPL3A-0E-F、SPL3A-0E-R 的核苷酸序列分別如 SEQ ID N0. 13-16 所示；
[0032] 所述SPL3A的PCR產(chǎn)物是以SEQ ID NO. 6-7的序列為引物PCR擴(kuò)增小麥基因組 cDNA得到的。
[0033] 本發(fā)明提供了 miRl56靶位點突變的小麥TaSPL3A基因或TaSPL3B基因或TaSPL3D 基因在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，所述的miR156靶位點突變后的序列如SEQ ID NO. 12所 不〇
[0034] 本發(fā)明提供了 miRl56靶位點突變的小麥TaSPL3A基因或TaSPL3B基因或TaSPL3D 基因在促進(jìn)植物生長中的應(yīng)用。
[0035] 具體地，本發(fā)明提供了 miR156靶位點突變的小麥TaSPL3基因在促進(jìn)植物早花或 葉片增大或增加植物生物量中的應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明提供了 miR156靶位點突變的小麥 TaSPL3基因在促進(jìn)轉(zhuǎn)基因擬南芥開花提前，葉片增大，生物量增加，植株的鮮重增加中的應(yīng) 用。
[0036] 總之，本發(fā)明提供的小麥TaSPL3基因的SNP分子標(biāo)記在小麥遺傳育種、種質(zhì)改良 等方面具有重要作用。
【附圖說明】
[0037] 圖1為TaSPL3基因在小麥染色體中定位圖，1-7分別表示N6A-T6B，N6A-T6D， N6B-T6A，N6B-T6D，N6D-T6A，N6D-T6B, CS 是中國春對照。
[0038] 圖2為本發(fā)明的SNP分子標(biāo)記檢測TaSPL3基因的電泳圖，其中1為SPL3A引物對 檢測TaSPL3A，2為SPL3B引物對檢測TaSPL3B，3為SPL3D引物對檢測TaSPL3D。
[0039] 圖3為TaSPL3A基因的轉(zhuǎn)錄激活圖。PBD是指載體里有可以與其他基因結(jié)合的 結(jié)構(gòu)域，PBD-TaSPL3A指將TaSPL3A基因的編碼序列與帶有結(jié)合結(jié)構(gòu)域的載體相連接），1 為-Trp，即缺色氨酸的SD固體缺素培養(yǎng)基，2為-Trp/-His，即缺色氨酸和組氨酸的SD固體 缺素培養(yǎng)基、3為-Trp/-His/-Ade，即缺色氨酸、組氨酸和腺嘌呤的SD固體缺素培養(yǎng)基。
[0040] 圖4為小麥TaSPL3的miR156靶位點突變圖，圖中*表示該處的堿基有變化。
[0041] 圖5為擬南芥野生型、轉(zhuǎn)1&5?13基因的擬南芥、轉(zhuǎn)11^156靶位點突變的1 &5?13基 因的擬南芥的植株在20d、30d的生長情況圖，1表示擬南芥野生型Col-0, 2表示轉(zhuǎn)miR156 靶位點突變的TaSPL3A過表達(dá)擬南芥植株。
[0042] 圖6為擬南芥野生型Col-0、轉(zhuǎn)miR156靶位點突變的TaSPL3A過表達(dá)的擬南芥的 植株鮮重比較圖，從左到右依次為L1-L4,表示4個不同的重復(fù)組。
【具體實施方式】
[0043] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0044] 若未特別指明，實施例中所用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售試劑，實施例中所用的技 術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0045] 實施例1小麥TaSPL3基因的克隆
[0046] 1、小麥葉片總RNA的提取
[0047] 中國春小麥（Triticum aestivum L.)葉片總 RNA 的提取，使用 Plant RNeasy Kit (Qiagen)〇
[0048] 2、TaSPL3基因cDNA第一片段的合成
[0049] 按照反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(TaKaRa)的操作說明進(jìn)行。
[0050] 3、從中國春小麥（Triticum aestivum L.)葉的cDNA中克隆TaSPL3的編碼區(qū)序 列；正向、反向引物序列如SEQ ID N0. 4-5所示。
[0051]PCR 程序：94°C，5min ;94°C，30s ;56°C，30s ;72°C，2min ;重復(fù) 35 次；72°C，10 分 鐘。
[0052] PCR 體系：
【主權(quán)項】
1. 小麥TaSPL3基因的SNP分子標(biāo)記，其特征在于，通過以下任一對引物擴(kuò)增得到： (1)SPL3A-F-primerCGGCAGCGGCAGCGGCAA SPL3A-R-primerCCTATCAGTGTTTTTGACGG； (2)SPL3B-F-primerATTCTTCTGGCGGCAGTG SPL3B-R-primerCAACTTTACCCAACTCAGGG； (3)SPL3D-F-primerTCCATTCTTCTGGCGGTAG SPL3D-R-primerAACTTTACCCAGCTCGGTG。
2. 如權(quán)利要求I所述的小麥TaSPL3基因的SNP分子標(biāo)記，其特征在于，所述小麥 TaSPL3基因位于小麥第六同源群上，其在小麥6A同源染色體的序列如SEQIDNO. 1所示， 其在小麥6B同源染色體的序列如SEQIDNO. 2所示，其在小麥6D同源染色體的序列如SEQ IDNO. 3 所示。
3. 檢測小麥TaSPL3基因的方法，其特征在于，采用權(quán)利要求1或2任一所述的SNP分 子標(biāo)記，PCR檢測待測植物基因組樣品。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶長I. 3kb，則待測植物 中存在小麥TaSPL3基因。
5. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，檢測小麥TaSPL3A基因的SNP分子標(biāo)記通過 以下引物擴(kuò)增得到： SPL3A-F-primerCGGCAGCGGCAGCGGCAA SPL3A-R-primerCCTATCAGTGTTTTTGACGG。
6. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，檢測小麥TaSPL3B基因的SNP分子標(biāo)記通過 以下引物擴(kuò)增得到： SPL3B-F-primerATTCTTCTGGCGGCAGTG SPL3B-R-primerCAACTTTACCCAACTCAGGG。
7. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，檢測小麥TaSPL3D基因的SNP分子標(biāo)記通過 以下引物擴(kuò)增得到： SPL3D-F-primerTCCATTCTTCTGGCGGTAG SPL3D-R-primerAACTTTACCCAGCTCGGTG。
8. 權(quán)利要求1或2所述的SNP分子標(biāo)記在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
9. 權(quán)利要求1或2所述的SNP分子標(biāo)記在小麥種質(zhì)資源鑒定中的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求1或2所述的SNP分子標(biāo)記在小麥分子輔助育種中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了小麥TaSPL3基因的SNP分子標(biāo)記及其應(yīng)用，屬于作物分子生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明的小麥TaSPL3基因的SNP分子標(biāo)記通過SEQ ID NO6-7或SEQ ID NO 8-9或SEQ ID NO 10-11任一對引物擴(kuò)增得到。本發(fā)明還提供了小麥TaSPL3基因的SNP分子標(biāo)記在小麥分子輔助育種、制備轉(zhuǎn)TaSPL3以及檢測小麥TaSPL3基因中的用途。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104789560
【申請?zhí)枴緾N201510142664
【發(fā)明人】毛龍, 李愛麗, 王炳南, 耿帥鋒, 馮楠
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2015年3月27日