一種ε-聚賴氨酸耐受型高產(chǎn)菌株的育種方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物育種領(lǐng)域，涉及一種基因組改組篩選ε -聚賴氨酸耐受型高產(chǎn)菌株的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]ε -聚賴氨酸(ε -poly-l-lysine，ε -PL)是一種由賴氨酸單體中的α-羧基和ε -氨基連接而成的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物。與化學(xué)合成的α-聚賴氨酸(a-poly-l-lysine，a-PL)，ε-PL具有更廣的抗菌譜、生物相容性好以及無(wú)毒無(wú)害等優(yōu)點(diǎn)。作為食品防腐劑已在日本、美國(guó)、韓國(guó)以及中國(guó)獲準(zhǔn)使用，需求量日增。另外作為基因載體，細(xì)胞培養(yǎng)材料，抑制小腸中胰脂肪酶的活性，阻礙膳食中脂肪的吸收，減少肥胖等醫(yī)藥和生物技術(shù)領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。
[0003]然而根據(jù)目前的文獻(xiàn)報(bào)道，生產(chǎn)ε-PL的菌株生產(chǎn)能力較低。一般認(rèn)為ε-PL的大量積累會(huì)抑制生產(chǎn)菌株的生長(zhǎng)，因此出于自我保護(hù)的機(jī)制，生產(chǎn)菌株可以通過(guò)分泌ε -PL降解酶，抑制ε-PL合成途徑中關(guān)鍵酶的活性，來(lái)限制ε-PL的產(chǎn)量。為此研宄人員通過(guò)選育S-2-氨乙基-L-半胱氨酸抗性菌株、細(xì)胞固定化、ε -PL的原位分離等方法來(lái)減少ε -PL對(duì)菌體生長(zhǎng)和ε-PL合成的影響，提高產(chǎn)量。本專利的不同之處在于通過(guò)選育ε-PL耐受型菌株的方式，來(lái)達(dá)到提高生產(chǎn)菌株ε-PL產(chǎn)量的目的。
[0004]菌株的突變體可以通過(guò)經(jīng)典的化學(xué)誘變獲得，但是此方法通常需要消耗大量的時(shí)間和精力?；蚬こ谭椒m然能夠定向地改變菌株，但前題是必須要清楚相關(guān)菌株的遺傳背景?；蚪M改組技術(shù)利用原生質(zhì)體遞進(jìn)式融合進(jìn)行菌種選育，無(wú)需了解菌株的遺傳背景。
[0005]鑒于上述說(shuō)明，本發(fā)明的目的在于提供一種高效的鏈霉菌ε -PL基因組改組的方法，以獲得ε-PL耐受型高產(chǎn)菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]實(shí)現(xiàn)上述目的的基因組改組技術(shù)方案如下:
[0007]I)構(gòu)建耐受0.48-0.60 g/L ε -PL,產(chǎn)量在1.9-2.lg/L的突變株文庫(kù)；
[0008]2)將突變體文庫(kù)中的菌株4-5株菌制備原生質(zhì)體；
[0009]3)將上述2)獲得的原生質(zhì)體進(jìn)行4-5輪融合，以及原生質(zhì)體再生；
[0010]4)將上述1)、3)中的菌株通過(guò)搖瓶發(fā)酵，測(cè)定ε -PL產(chǎn)量。
[0011]上述出發(fā)菌株為小白鏈霉菌或灰褐鏈霉菌。
[0012]上述步驟I)中，突變體文庫(kù)的構(gòu)建，采用硫酸二乙酯(DES)誘變處理的方式，包括在濃度為1-5X 18個(gè)/mL的鏈霉菌孢子溶液中，加入體積比終濃度為1.0-2.0%的DES，28-35°C，處理20-40min，加入NaS2O3終止反應(yīng)，稀釋涂布于含有ε -PL濃度為0.48-0.60g/L平板上，30°C培養(yǎng)7-9d，選取生長(zhǎng)較好的菌株進(jìn)行種子培養(yǎng)和發(fā)酵后測(cè)定ε -PL產(chǎn)量，選取產(chǎn)量高的菌株10-20株。
[0013]上述步驟2)中，原生質(zhì)體制備，包括將步驟I)中的高產(chǎn)菌株4-5株進(jìn)行種子培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)入含已滅菌玻璃珠的搖瓶中，200rpm，20_30min，將菌體進(jìn)行打散，4500rpm離心5min，棄上清液，無(wú)菌水洗滌菌體后，用高滲液洗滌并重懸菌體。加入終濃度為3-7mg/mL的溶菌酶，28-35°C水浴30-150min，至原生質(zhì)體形成率在90%以上時(shí)收集菌體。
[0014]上述步驟3)中，將懸浮于高滲緩沖液中的原生質(zhì)體平均分成兩份，一份至于70-80 °C水浴中40_60min，另外一份用距離15w，254nm紫外燈于15cm處照射原生質(zhì)體80-100min，使兩份原生質(zhì)體失去活性，之后將其等體積混合，加入質(zhì)量體積比濃度為30-50%的PEG 6000，28-37°C水浴10-30min，進(jìn)行原生質(zhì)體融合，將融合子置于含有ε -聚賴氨酸的液體再生培養(yǎng)基中，30_35°C培養(yǎng)7-9d后，涂布含有l(wèi)g/L ε -PL的平板，選取生長(zhǎng)較好的菌株進(jìn)行種子培養(yǎng)和發(fā)酵后測(cè)定ε -PL產(chǎn)量，選取產(chǎn)量高的菌株，重復(fù)原生質(zhì)體制備，進(jìn)行下一輪的融合，同時(shí)將再生培養(yǎng)基中ε -PL濃度升至2g/L。依此類推，共進(jìn)行了 4-5輪，平板中ε-PL濃度提高至6g/L。其中原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基為103g/L蔗糖，15g/L葡萄糖，3g/L 酵母粉，4g/L 蛋白胨，10g/L MgCl2.6Η20，0.4g/L CaCl2.7Η20，0.25g/L KH2PO4,體積比濃度為0.2%的微量元素溶液，以及體積比濃度為1%的TES緩沖液。
[0015]上述步驟4)中，用接種環(huán)將鏈霉菌的孢子置于含有40mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，30°C，200rpm，培養(yǎng)24h后轉(zhuǎn)接3mL至含有40mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，30°C，200rpm培養(yǎng)72h，采用甲基橙法測(cè)定發(fā)酵液中ε-PL產(chǎn)量。其中種子培養(yǎng)基為50g/L葡萄糖，5g/L酵母膏，10g/L(NH4)2SO4,1.72g/L K2HPO4.2Η20，0.8g/L KH2PO4,0.5g/L MgSO4.7Η20，0.04g/L ZnSO4.7Η20，0.03g/L FeSO4.7H20，pH6.8。發(fā)酵培養(yǎng)基為 60g/L 甘油，lOg/L 牛肉浸膏，lOg/L (NH4) 2S04，4g/L KH2PO4,0.8g/L MgSO4.7H20，0.05g/L FeSO4.7H20，pH6.8。
[0016]實(shí)施例1
[0017]I)構(gòu)建突變菌株文庫(kù):在1-5X 18個(gè)/mL的鏈霉菌孢子溶液中加入體積比濃度為2.0%的DES在30°C下處理30min，涂布含有0.48g/L ε -PL的平板，培養(yǎng)7_9d，選取孢子形成速度較快、顏色較深、孢子層較厚、背面顏色較深的菌株進(jìn)行編號(hào)和初篩，并將產(chǎn)量高的10-20株菌進(jìn)行復(fù)篩，選擇產(chǎn)量最高者進(jìn)行下一輪的DES誘變，同時(shí)將ε -PL濃度升至0.54g/L?依此類推，共進(jìn)行了三輪化學(xué)誘變，ε-PL濃度提高至0.60g/L。獲得產(chǎn)量較親本提高的10株菌進(jìn)行復(fù)篩，選取ε-PL產(chǎn)量最高的4株菌，作為原生質(zhì)體融合出發(fā)菌株。
[0018]2)原生質(zhì)體制備、融合及再生:采用7mg/L溶菌酶，在34°C條件下處理I)獲得的菌株120min，其原生質(zhì)體的制備率達(dá)到97.6%。將上述4株菌的原生質(zhì)體混合后，均分成兩份，一份在70°C下處理50min，另一份在15w，254nm紫外燈15cm處照射90min，之后將二者混合，在質(zhì)量體積比濃度為40%的PEG6000，37°C水浴15min，進(jìn)行原生質(zhì)體融合，將融合子在含有l(wèi)g/L ε -PL的液體再生培養(yǎng)基中再生7-9d后，涂布平板，進(jìn)行初篩和復(fù)篩，選取產(chǎn)量較高的菌株，進(jìn)行下一輪的原生質(zhì)體制備、融合及再生，同時(shí)將ε-PL濃度升至2g/L。依此類推，共進(jìn)行了 4輪，ε -PL濃度提高至6g/L，最終得到的高產(chǎn)菌株。
[0019]3)搖瓶發(fā)酵ε -PL產(chǎn)量的測(cè)定:在上述步驟I)和2)中，用接種環(huán)將鏈霉菌的孢子置于含有40mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，30 °C，200rpm，培養(yǎng)24h后轉(zhuǎn)接3mL至含有40mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，30°C，200rpm培養(yǎng)72h，采用甲基橙法測(cè)定發(fā)酵液中ε -PL的含量。其中種子培養(yǎng)基為50g/L葡萄糖，5g/L酵母膏，10g/L (NH4)2SO4,1.72g/L K2HPO4.2Η20，0.8g/L KH2PO4,0.5g/L MgSO4.7H20，0.04g/L ZnSO4.7H20，0.03g/L FeSO4.7H20，pH6.8。發(fā)酵培養(yǎng)基為 60g/L 甘油，lOg/L 牛肉浸膏，1g (NH4) 2S04，4g/L KH2PO4,0.8g/L MgSO4.7H20，0.05g/L FeSO4.7Η20，ρΗ6.8。步驟 I)中 4 株出發(fā)菌株的 ε -PL 產(chǎn)量分別為 2.05g/L，2.02g/L，2.06g/L，1.98g/L;步驟2)中獲得菌株的最高產(chǎn)量為3.llg/L，為原始出發(fā)菌株的1.81倍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種ε -聚賴氨酸耐受型高產(chǎn)菌株的育種方法，其中，包括以下步驟: 步驟一、將產(chǎn)ε-聚賴氨酸的生產(chǎn)菌株經(jīng)過(guò)硫酸二乙酯誘變處理，得到耐受ε-聚賴氨酸0.48-0.60g/L，產(chǎn)量為1.9-2.lg/L的突變株文庫(kù)； 步驟二、將上述步驟一獲得的突變株采用溶菌酶處理，制備原生質(zhì)體； 步驟三、將上述步驟二中獲得的原生質(zhì)體采用PEG6000進(jìn)行4-5輪融合，在添加了ε-聚賴氨酸的液體再生培養(yǎng)基中再生原生質(zhì)體； 步驟四、通過(guò)搖瓶發(fā)酵測(cè)定重排菌株的ε -聚賴氨酸產(chǎn)量，獲得高產(chǎn)菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的育種方法，其中，耐受型菌株能夠耐受4_6g/L的ε-聚賴氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的育種方法，其中步驟一中，硫酸二乙酯的體積比濃度為1.0-2.0%，處理時(shí)間為20-40min，處理溫度為28-35°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的育種方法，其中，溶菌酶的濃度為3-7mg/mL，處理時(shí)間為30-150min,處理溫度為 28_35°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的育種方法，其中步驟四中原生質(zhì)體融合PEG的質(zhì)量體積比濃度為30-50%，作用時(shí)間為10-30min，作用溫度為28-37°C，液體再生培養(yǎng)基中ε -聚賴氨酸的濃度為l_6g/L。
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物育種領(lǐng)域，涉及一種基因組改組篩選ε-聚賴氨酸耐受型高產(chǎn)菌株的方法，其特征在于利用4-5輪遞進(jìn)式原生質(zhì)體融合的方法，在改組菌株再生培養(yǎng)基中，添加1-6g/L ε-聚賴氨酸，最終獲得能夠在高濃度下生長(zhǎng)，且產(chǎn)量提高的改組菌株。
【IPC分類】C12R1-465, C12N15-03
【公開(kāi)號(hào)】CN104789550
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510239323
【發(fā)明人】唐蕾, 周永鵬, 張建華, 張宏建, 毛忠貴
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年7月22日
【申請(qǐng)日】2015年5月11日