專(zhuān)利名稱(chēng)：一種培育轉(zhuǎn)基因小麥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域中一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法及其應(yīng)用，特別涉及一種培育轉(zhuǎn)基因小麥的方法及其應(yīng)用。直量拉水小麥?zhǔn)亲钪匾募Z食作物之一，是人類(lèi)食物和營(yíng)養(yǎng)的基本來(lái)源。
背景技術(shù)：
目前全世界小麥播種面積約2 .沈億公頃，總產(chǎn)量約5 . 5億噸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)單、快速、實(shí)用的培育轉(zhuǎn)基因小麥的方法，利用該方法培育轉(zhuǎn)基因小麥不需經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)和植株再生的過(guò)程。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因小麥的方法，是通過(guò)農(nóng)桿菌的介導(dǎo)將外源基因?qū)胄←溕L(zhǎng)點(diǎn)，通過(guò)非組培遺傳轉(zhuǎn)化方法得到轉(zhuǎn)基因小麥。生長(zhǎng)點(diǎn)可為根尖生長(zhǎng)點(diǎn)、莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)，優(yōu)選為莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)。所述遺傳轉(zhuǎn)化的外植體為小麥種子23 — 27 “ C萌發(fā)48 — 72小時(shí)得到的莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)。攜帶有外源基因的農(nóng)桿菌需先在80 — 120卿乙酞丁香酮中培養(yǎng)1 一 3小時(shí)，再在0 . 03 — 0 . 05 MPa真空度下，感染外植體8 一 12分鐘。然后將被感染的外植體轉(zhuǎn)入合適培養(yǎng)基中，如 MS培養(yǎng)基，在22 — 250C、14 一 16 / 10 — 8小時(shí)光周期下共培養(yǎng)2 — 4天得到轉(zhuǎn)基因小麥幼苗。本發(fā)明的方法與其它培育轉(zhuǎn)基因小麥方法的顯著區(qū)別在于采用小麥生長(zhǎng)點(diǎn)作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的外植體，而不是未成熟胚或胚性愈傷組織或懸浮細(xì)胞，不需經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)和植株再生的過(guò)程，從根本上克服了由于小麥基因型對(duì)轉(zhuǎn)化后形成可育再生植株的限制。本發(fā)明通過(guò)對(duì)局部人工損傷的小麥生長(zhǎng)點(diǎn)采用真空滲入技術(shù)進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了表達(dá)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因小麥，生長(zhǎng)點(diǎn)轉(zhuǎn)化率達(dá)到60 — 70 %，成苗率平均90 %，T。代種子卡那霉素抗性陽(yáng)性率為16 — 21 %，T，代幼苗報(bào)告基因表達(dá)陽(yáng)性率占所測(cè)植株的81 %。尤為重要的是克服了小麥遺傳轉(zhuǎn)化的瓶頸問(wèn)題一基因型的限制。本發(fā)明所試材料的品種包括小麥金花、小麥京411、小麥4071，均獲得上述效果。 本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化效率高、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、不依賴(lài)于受體的基因型。本發(fā)明的方法可以培育出各種高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和/或抗逆性強(qiáng)的小麥新種質(zhì)非組培遺傳轉(zhuǎn)化方法可應(yīng)用到其它受基因型限制大難以獲得轉(zhuǎn)基因植株的單子葉農(nóng)作物中，可以培育高產(chǎn)、抗逆、優(yōu)質(zhì)的新型農(nóng)作物。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、轉(zhuǎn)基因小麥的培育 1、小麥外植體的處理
(1 )將金花、京411和京4071三種小麥品種的小麥種子用10 %的次氯酸消毒 5分鐘，再用70 %的乙醇處理10分鐘，然后用無(wú)菌水沖洗3次。在一無(wú)菌大平皿中墊三層以無(wú)菌水浸濕的紗布，將經(jīng)消毒處理的小麥種子置于平皿中25 〃 C黑暗中萌發(fā)48小時(shí)，得到待轉(zhuǎn)化的小麥萌發(fā)種子。( 2 )在無(wú)菌條件下用解剖針將待轉(zhuǎn)化的小麥萌發(fā)種子胚芽鞘劃開(kāi)，盡量暴露其生長(zhǎng)點(diǎn)，以便于外源基因的導(dǎo)入。2、轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌的培養(yǎng)
(1 )將過(guò)夜培養(yǎng)的農(nóng)桿菌菌株LBA4404 / 3301，其中含CaMV 355啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的 ⑶S基因，Iml接種于IOOml含鏈霉素100 mg / L，卡那霉素50 mg / L和利福平50 mg / L的YEB培養(yǎng)基中，^OC，300 rpm振蕩培養(yǎng)至菌液濃度為0D6。。。. =0.7
ο
(2 )在轉(zhuǎn)化前向菌液中加入乙酞丁香酮至100卿，繼續(xù)在^oc，300 rPm振蕩培養(yǎng)2小時(shí)。將上述菌液分裝于50ml的無(wú)菌三角瓶中，每瓶20ml。3、轉(zhuǎn)化(1 )將步驟1的(2 )中的小麥生長(zhǎng)點(diǎn)浸入步驟2的(2 )中的菌液中，侵染20分鐘后，置于負(fù)壓條件下，真空度0 . 04 Mpa，滲透10分鐘。(2 )真空滲透處理后，倒除菌液，用無(wú)菌吸水紙將小麥外植體表面的菌液吸凈，轉(zhuǎn)入含梭節(jié)基青霉素的MS培養(yǎng)基中，22 — 250C ,16/8小時(shí)光周期下共培養(yǎng)3天。4、生長(zhǎng)點(diǎn)轉(zhuǎn)化后3天報(bào)告基因的瞬時(shí)表達(dá)及轉(zhuǎn)化率檢測(cè)
(1 )⑶S基因表達(dá)的組織化學(xué)檢測(cè)將轉(zhuǎn)化3天的小麥幼苗置于含1 %甲醛、 50mM pH 7 . 0的磷酸鈉緩沖液和0 . 05 % TritonX 一 100的固定液中，室溫下溫和搖動(dòng)30分鐘；倒掉固定液，再以50mM磷酸鈉緩沖液(pH 7 . 0 )洗3次；將幼苗轉(zhuǎn)入含 2 InMX 一 Glue，50InM 磷酸鈉緩沖液(pH 7 . 0 )和 0 . 05 % TritonX 一 100 的染色液中，37oC保溫8小時(shí)；之后轉(zhuǎn)移至75 %乙醇中脫色4小時(shí)，然后在解剖鏡下觀察。( 2 )報(bào)告基因表達(dá)結(jié)果小麥金花、小麥京411、小麥4071三種小麥品種轉(zhuǎn)化后均有⑶S基因表達(dá)的藍(lán)色顯色反應(yīng)。如表1所示，小麥金花、小麥京411和小麥4071 的表達(dá)率分別為61 . 3 %、64 . 3 %和65 . 8 %。5、生長(zhǎng)點(diǎn)轉(zhuǎn)化后的培育和成苗將共培養(yǎng)3天后的小麥幼苗移入以銼石為基質(zhì)的花盆中，在25 〃 C、60 %相對(duì)濕度、16 / 8小時(shí)光周期的培養(yǎng)室中培養(yǎng)3 — 4周后成苗，然后轉(zhuǎn)入自然光溫室中栽種，約90 %的苗正常結(jié)實(shí)。5、代種子的篩選以50 mg / L卡那霉素對(duì)T。代種子進(jìn)行篩選，經(jīng)4小時(shí)浸泡后置于平皿中25 〃 C黑暗中萌發(fā)48小時(shí)，結(jié)果如表2所示，小麥金花、小麥京411和小麥4071的表達(dá)率分別為61 . 3 64 . 3 %和65 . 8 %。7、T，代報(bào)告基因表達(dá)的檢測(cè)經(jīng)卡那霉素篩選后萌發(fā)的種子轉(zhuǎn)移到以侄石位為基質(zhì)的花盆中，在25 “ C、60 %相對(duì)濕度、16 / 8小時(shí)光周期的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。待長(zhǎng)出第三片葉時(shí)，取第一片葉按照步驟4的(1 )中的方法檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)，報(bào)告基因表達(dá)陽(yáng)性率占所測(cè)植株的81 % ( 22 / 27 λ
權(quán)利要求
1.一種培育轉(zhuǎn)基因小麥的方法，其特征在于所述生長(zhǎng)點(diǎn)為根尖生長(zhǎng)點(diǎn)或莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)ο
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述遺傳轉(zhuǎn)化的外植體為小麥種子23 一 27 〃 C萌發(fā)48 — 72小時(shí)得到的莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)。
全文摘要
一種培育轉(zhuǎn)基因小麥的方法,重點(diǎn)在生長(zhǎng)點(diǎn)為根尖生長(zhǎng)點(diǎn)或莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)。所述遺傳轉(zhuǎn)化的外植體為小麥種子23一27"C萌發(fā)48一72小時(shí)得到的莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102517323SQ201110426780
公開(kāi)日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月19日
發(fā)明者弓貴明 申請(qǐng)人:弓貴明