本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及氨基酸轉(zhuǎn)運基因osaap1在低氮下促進水稻生長的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

植物通過吸收土壤中的氨、硝酸根、氨基酸、可溶性肽等來獲得氮素；氮的吸收和轉(zhuǎn)運主要依靠銨根運輸?shù)鞍祝╝mt）、硝酸根運輸?shù)鞍祝╪rt）、氨基酸運輸?shù)鞍祝╝at）、肽運輸?shù)鞍祝╬tr）等運輸?shù)鞍讈硗瓿桑╳illiamsl,millera.transportersresponsiblefortheuptakeandpartitioningofnitrogenoussolutes.annurevplantbiolandplantmolbiol,2001,52:659-688.）。銨通過植物amt吸收后再通過谷氨酰胺合成酶（gs）和谷氨酸合酶（gogat）合成谷氨酰胺和谷氨酸，后者再進一步形成其它氨基酸（sonoday,ikedaa,saikis,etal.feedbackregulationoftheammoniumtransportergenefamilyamt1byglutamineinrice.plantcellphysiol,2003,44:1396-1402.）。植物可通過高親和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（hats）的nrt2和低親和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（lats）的nrt1吸收環(huán)境中的硝酸鹽，由硝酸還原酶（nr）和亞硝酸還原酶（nir）還原形成銨，再進一步形成氨基酸（paungfoo-lonhiennec,lonhiennetg,rentschd,etal.plantscanuseproteinasanitrogensourcewithoutassistancefromotherorganisms.pnas,2008,105:4524-4529.）。

在高等植物中，aat是一類跨膜蛋白，將氨基酸從胞外運至胞內(nèi)，同時還在氨基酸遠距離運輸、病原反應(yīng)和非生物脅迫等方面發(fā)揮著重要作用（tegederm.transportersforaminoacidsinplantcells:somefunctionsandmanyunknowns.curropinplantbiol,2012,15:1-7.）。aat基因被分為兩個超家族：apc（氨基酸、多胺和膽堿轉(zhuǎn)運）超家族和aaap（氨基酸/生長素透性酶）超家族。apc超家族分為三個亞家族：cats（陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白）家族、acts（氨基酸/膽堿轉(zhuǎn)運蛋白）家族和phss（多胺、h+協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白）家族。aaap超家族分為六個亞家族：aaps（氨基酸透性酶）家族、lhts（賴氨酸和組氨酸轉(zhuǎn)運蛋白）家族、prots（脯氨酸轉(zhuǎn)運蛋白）家族、gats（γ-氨基酸丁酸，gaba）家族、auxs（生長素轉(zhuǎn)運蛋白）家族和ants（芳香族和中性氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白）家族（fischerwn,andreb,rentschd,etal.aminoacidtransportinplants.trendsplantsci,1998,3:188-195.）。

水稻基因組中共找到85個aat家族成員（zhaoh,mah,yul,etal.genome-widesurveyandexpressionanalysisofaminoacidtransportergenefamilyinrice(oryzasatival.).plosone,2012,7:e49210.）。研究發(fā)現(xiàn)osaat5、osaat7、osaat24、osaat49和osaat60的t-dna插入突變體的稻米產(chǎn)量及植物體干重均下降，證明aat對水稻的氮素積累及碳氮分配有著重要作用（luy,songz,luk,etal.molecularcharacterization,expressionandfunctionalanalysisoftheaminoacidtransportergenefamily(osaats)inrice.actaphysiolplant,2012,34:1943-1962.）。研究發(fā)現(xiàn)超量表達osaap6會增加水稻籽粒中儲藏性蛋白和氨基酸含量，從而改善稻米營養(yǎng)和風味（pengb,kongh,liy,etal.osaap6functionsasanimportantregulatorofgrainproteincontentandnutritionalqualityinrice.natcommun,2014,5:doi:10.1038.）。氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白對水稻等各種植物體的氨基酸吸收、轉(zhuǎn)運和儲藏具有重要的作用。關(guān)于水稻aat家族成員研究的報道很少，目前水稻氨基酸轉(zhuǎn)運家族osaap1基因?qū)λ镜纳L發(fā)育目前未有任何研究。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)osaap1基因在低氮下對水稻生物量影響有較為重要的作用，可應(yīng)用于植物氮利用效率提高，減少化肥使用和水稻株型改良。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供氨基酸轉(zhuǎn)運基因osaap1在低氮下促進水稻生長的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

本發(fā)明以水稻的氨基酸轉(zhuǎn)運基因osaap1為對象，從水稻中花11中克隆了osaap1的cdna序列。通過構(gòu)建osaap1基因的超表達載體，采用農(nóng)桿菌eha105介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將超表達載體導入正常粳稻品種中花11中，得到osaap1基因的超表達植株，在低氮（氮濃度1mm以下）培養(yǎng)下，超表達植株的根長、根數(shù)、株高、分蘗數(shù)等與對照野生型中花11相比顯著提高。同時構(gòu)建了osaap1基因的干擾載體，將干擾載體導入中花11中，得到osaap1基因的干擾植株，在低氮培養(yǎng)下，其根長、根數(shù)、株高、分蘗數(shù)等與中花11相比顯著降低。這些結(jié)果表明，通過提高osaap1基因表達，可以促進水稻生長，增加生物量和產(chǎn)量；osaap1基因在水稻耐受低肥或貧瘠土壤適應(yīng)性方面有應(yīng)用價值，另外在減少農(nóng)田化肥使用量、減輕環(huán)境負面影響上也具有重要應(yīng)用；還可以通過分子育種應(yīng)用于水稻品種改良中。

基于本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的osaap1基因的功能，其可用于低氮條件下促進水稻生長、提高水稻生物量、產(chǎn)量。具體可通過基因工程實現(xiàn)，即超表達提高osaap1基因的表達，使水稻根長、根數(shù)、株高、分蘗數(shù)等增加，達到提高水稻生物量、產(chǎn)量的目的。所述的osaap1基因編碼的osaap1蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示；所述的osaap1基因的cdna序列優(yōu)選如seqidno.2所示。

應(yīng)該理解為，在不影響osaap1蛋白活性的前提下（即不在蛋白的活性中心），本領(lǐng)域技術(shù)人員可對seqidno.1所示的氨基酸序列進行各種取代、添加和/或缺失一個或幾個氨基酸獲得具有同等功能的氨基酸序列。因此，osaap1蛋白還包括seqidno.1所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個或幾個氨基酸獲得的具有同等活性的蛋白質(zhì)。此外，應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達的密碼子。

本發(fā)明的優(yōu)點和效果：

（1）本發(fā)明克隆的osaap1基因提高表達后可以在低氮下使水稻根長、根數(shù)、株高、分蘗數(shù)增加，說明osaap1基因?qū)μ岣咚旧锪俊a(chǎn)量有較明顯作用，因此，通過基因工程技術(shù)提高osaap1基因的表達能夠提高植物生物量、產(chǎn)量。這不僅有助于通過減少氮肥使用培育高產(chǎn)水稻，還可以通過分子育種進行植物的品種改良。

（2）osaap1基因的成功克隆，進一步證實了氨基酸轉(zhuǎn)運家族在氮吸收過程中的重要作用，對闡明氨基酸轉(zhuǎn)運家族的生物學功能有重要的意義，另外對進一步了解植物氮代謝途徑，提高氮吸收效率有極大的推動作用。

（3）盡管目前已克隆到了一些氮營養(yǎng)途徑中影響植物生長的基因，但對植物生長發(fā)育的分子機制仍不清楚。而本發(fā)明克隆的osaap1基因能夠提高水稻的生物量，對確定植物增產(chǎn)的關(guān)鍵因素有極大的推動作用。

附圖說明

圖1是低氮（0.5mm硝酸銨）培養(yǎng)下對照中花11、osaap1基因超表達植株3個株系和osaap1基因干擾植株3個株系的整株表型圖。

圖2是對照中花11（wt）、osaap1基因超表達植株3個株系（oe1-3）和osaap1基因干擾植株3個株系（ri1-3）在不同氮水平培養(yǎng)條件下根長的統(tǒng)計柱狀圖，數(shù)據(jù)采用spss軟件進行變量分析（anova），使用duncan’s在0.05水平上進行差異顯著性分析，同一種濃度培養(yǎng)的水稻指標在此濃度下均與對照相比，具有差異顯著的表為*。低氮濃度為硝酸銨0.5mm，中氮濃度為硝酸銨2mm，高氮濃度為硝酸銨8mm。

圖3是對照中花11（wt）、osaap1基因超表達植株3個株系（oe1-3）和osaap1基因干擾植株3個株系（ri1-3）在不同氮水平培養(yǎng)條件下根數(shù)的統(tǒng)計柱狀圖，數(shù)據(jù)采用spss軟件進行變量分析（anova），使用duncan’s在0.05水平上進行差異顯著性分析，同一種濃度培養(yǎng)的水稻指標在此濃度下均與對照相比，具有差異顯著的表為*。低氮濃度為硝酸銨0.5mm，中氮濃度為硝酸銨2mm，高氮濃度為硝酸銨8mm。

圖4是對照中花11（wt）、osaap1基因超表達植株3個株系（oe1-3）和osaap1基因干擾植株3個株系（ri1-3）在不同氮水平培養(yǎng)條件下株高的統(tǒng)計柱狀圖，數(shù)據(jù)采用spss軟件進行變量分析（anova），使用duncan’s在0.05水平上進行差異顯著性分析，同一種濃度培養(yǎng)的水稻指標在此濃度下均與對照相比，具有差異顯著的表為*。低氮濃度為硝酸銨0.5mm，中氮濃度為硝酸銨2mm，高氮濃度為硝酸銨8mm。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步詳細的說明，但本發(fā)明的實施方式不限于此。若未特別指明，下述實施例所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段；所用的實驗方法均為常規(guī)方法，并可按照已描述的重組技術(shù)（參見分子克隆，實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約）完成；所用的材料、試劑等，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1osaap1基因超表達植株的構(gòu)建

提取水稻中花11的rna，并將其反轉(zhuǎn)錄成cdna，利用引物對：

f1：5'-agatctatggggatggagaggccgcaagag-3'（bglii），

r1：5'-cttaagtcatgaggagacgctgaatgg-3'（aflii）；

通過pcr擴增osaap1基因的cdna后，通過bglii和aflii酶切后連入pcambia-1301載體（pcambia-1301載體購自cambia公司），構(gòu)建出osaap1基因的超表達載體osaap1-p1301。采用農(nóng)桿菌eha105介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將超表達載體導入正常水稻品種中花11中。

將得到的所有轉(zhuǎn)基因小苗移栽于帶泥土的筐中，定期澆水，施肥，待小苗長高約10cm時，將50株水稻轉(zhuǎn)基因小苗浸泡于500ml蒸餾水制備的濃度為50mg/l的潮霉素溶液48小時，之后葉子為綠色并舒張、生長狀態(tài)良好的植株為陽性轉(zhuǎn)基因植株；而葉子枯黃并卷曲的植株為陰性植株，隨即死亡。陽性植株單株種植并收種，直至t2代鑒定出在上述潮霉素溶液中無任何葉子枯黃并卷曲的為純合的轉(zhuǎn)基因植株，即得到osaap1基因超表達植株。將超表達植株、中花11的種子在培養(yǎng)皿上用蒸餾水浸種3天并培養(yǎng)7天后，轉(zhuǎn)入水稻營養(yǎng)液培養(yǎng)，營養(yǎng)液配方參考國際水稻所配方，但將硝酸銨調(diào)成0.5mm（低氮）、2mm（中氮）和8mm（高氮），分別培養(yǎng)40天，觀察表型，統(tǒng)計根長、根數(shù)和株高。植株表型、根長、根數(shù)和株高的統(tǒng)計結(jié)果見圖1-4，可見在低氮培養(yǎng)下，osaap1基因超表達植株與對照中花11植株相比根長、根數(shù)和株高增加，并達到差異顯著。而在中氮時，超表達植株根長、根數(shù)和株高并沒有比對照顯著增加。在高氮時，超表達植株只有根數(shù)比對照增加達到顯著差異，而根長和株高沒有比對照顯著增加。后期，osaap1基因超表達植株的分蘗數(shù)、氨基酸含量及最后的產(chǎn)量也均顯著高于對照中花11。

實施例2osaap1基因干擾植株的構(gòu)建

提取水稻中花11的rna，并將其反轉(zhuǎn)錄成cdna，利用引物對：

f2：5'-ggtacctggggatggagaggccgcaa-3'（kpni），

r2：5'-ggatccttgcgcttgccatggacggggt-3'（bamhi）；

f3：5'-actagttggggatggagaggccgcaa-3'（spei），

r3：5'-gagctcttgcgcttgccatggacggggt-3'（saci）；

各自pcr擴增出osaap1基因的cdna片段，通過上述相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切后連入ptck303載體，構(gòu)建出osaap1基因的干擾表達載體osaap1-ptck303。采用農(nóng)桿菌eha105介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將干擾表達載體導入正常粳稻品種中花11中。

將得到的所有轉(zhuǎn)基因小苗移栽于帶泥土的筐中，定期澆水，施肥，待小苗長高約10cm時，將50株水稻轉(zhuǎn)基因小苗浸泡于500ml蒸餾水制備的濃度為50mg/l的潮霉素溶液48小時，之后葉子為綠色并舒張、生長狀態(tài)良好的植株為陽性轉(zhuǎn)基因植株；而葉子枯黃并卷曲的植株為陰性植株，隨即死亡。陽性植株單株種植并收種，直至t2代鑒定出在上述潮霉素溶液中無任何葉子枯黃并卷曲的為純合的轉(zhuǎn)基因植株，即得到osaap1基因干擾植株。將干擾植株、中花11的種子在培養(yǎng)皿上用蒸餾水浸種3天并培養(yǎng)7天后，轉(zhuǎn)入水稻營養(yǎng)液培養(yǎng)，營養(yǎng)液配方參考國際水稻所配方，但將硝酸銨調(diào)成0.5mm（低氮）、2mm（中氮）和8mm（高氮），分別培養(yǎng)40天，觀察表型，統(tǒng)計根長、根數(shù)和株高。植株表型、根長、根數(shù)和株高的統(tǒng)計結(jié)果見圖1-4，可見在低氮、中氮和高氮培養(yǎng)下，osaap1基因干擾植株與對照中花11植株相比根長、根數(shù)和株高均減少，并達到差異顯著。后期，osaap1基因干擾植株的分蘗數(shù)、氨基酸含量及最后的產(chǎn)量也均顯著低于對照中花11。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>武漢生物工程學院

<120>氨基酸轉(zhuǎn)運基因osaap1在低氮下促進水稻生長的應(yīng)用

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