本發(fā)明屬于獸用疫苗領(lǐng)域，具體涉及一種核苷酸序列、表達(dá)的蛋白、含有該核苷酸序列的毒株，以及其制備的疫苗組合物和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,prrsv)引起的以母豬發(fā)熱、流產(chǎn)，斷奶前、后的仔豬死亡率升高，不同年齡豬呼吸障礙等為臨床特征的疾病。該病最早發(fā)現(xiàn)于美國(guó)的北卡羅來(lái)納州(1987年)，此后相繼在加拿大(1998年)、德國(guó)(1990年)、英國(guó)(1991年)發(fā)現(xiàn)此病。1992年國(guó)際獸醫(yī)局(oie)將此病命名為豬繁殖與呼吸綜合征(prrs)。我國(guó)于1996年也報(bào)道了此病的流行，2006年更是爆發(fā)了變異的prrsv引起的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近一年來(lái)，多地區(qū)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，有新的prrsv流行，與以往的流行株相比，其基因序列發(fā)生較大改變。而現(xiàn)有的減毒活疫苗在臨床上的預(yù)防效果不甚理想，滅活疫苗雖然也較早研制出來(lái)，其不存在散毒和毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)，但對(duì)于以細(xì)胞免疫為主的新的prrsv預(yù)防效果不是很理想，因此，需要研發(fā)出針對(duì)我國(guó)最新流行的毒株的疫苗組合物，以有效防止我國(guó)prrsv相關(guān)疾病的流行。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明涉及一種核苷酸序列，所述核苷酸序列實(shí)質(zhì)上編碼序列表seqidno.2所示的gp5蛋白。本發(fā)明還涉及一種重組載體，所述重組載體能表達(dá)本發(fā)明所述的核苷酸序列編碼的gp5蛋白。本發(fā)明還涉及一種轉(zhuǎn)化子，所述轉(zhuǎn)化子包含有導(dǎo)入的本發(fā)明所述的重組載體。本發(fā)明還涉及一種gp5蛋白，所述gp5蛋白序列包括如序列表seqidno.2所示的gp5蛋白或其功能性變異體。本發(fā)明還涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒毒株，所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒毒株為豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株，保藏號(hào)為cctccno.v201540。本發(fā)明還涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物包括免疫量的本發(fā)明所述的gp5蛋白或其功能性變異體以及藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明還涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物包括免疫量的本發(fā)明所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株或其培養(yǎng)物的滅活全病毒抗原以及藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明還涉及一種制備所述疫苗組合物的方法，所述制備方法包括：(1)克隆本發(fā)明所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒gp5蛋白基因；(2)轉(zhuǎn)化重組所述步驟(1)中克隆的gp5蛋白基因；(3)表達(dá)所述重組的豬繁殖與呼吸綜合征病毒gp5蛋白；(4)將所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒gp5蛋白抗原與佐劑按比例混合，乳化。本發(fā)明還涉及一種制備所述疫苗組合物的方法，所述制備方法包括增殖培養(yǎng)所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株，滅活，加入佐劑，攪拌均勻。本發(fā)明還涉及本發(fā)明所述的疫苗組合物在制備預(yù)防和治療豬繁殖與呼吸綜合征的藥物中的應(yīng)用。發(fā)明優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明采用目前豬繁殖與呼吸綜合征病毒流行毒株或其主要免疫原性蛋白，制備疫苗組合物。該疫苗組合物具有良好的免疫原性，接種豬只后，能夠刺激機(jī)體快速地產(chǎn)生免疫力，產(chǎn)生較高的中和抗體水平；且能夠有效地保護(hù)流行毒株的攻擊，可以有效地保護(hù)豬群抵抗 豬繁殖與呼吸綜合征病毒流行毒株的感染，提高豬群的生產(chǎn)力。序列表中序列1為豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株gp5蛋白核苷酸序列；序列2為豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株gp5蛋白氨基酸序列；序列3為豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株gp2蛋白核苷酸序列；序列4為豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株nsp2基因核苷酸序列。具體實(shí)施方式以下，對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明。本發(fā)明的豬繁殖與呼吸綜合征病毒株具有良好的免疫原性，顯示出顯著的免疫特性，其針對(duì)現(xiàn)有流行野毒株。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒株為豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,strainhnjz15)或其培養(yǎng)物，所述hnjz15株生物保藏號(hào)為：cctccno.v201540，保藏單位為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國(guó)武漢·武漢大學(xué)，保藏時(shí)間為2015年9月21日?！芭囵B(yǎng)物”是病毒的不同代次傳代培養(yǎng)物，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉不同代次之間其基因序列僅可能會(huì)發(fā)生微小的變異。本發(fā)明的豬繁殖與呼吸綜合征病毒株，其具有序列表seqno.1所示核苷酸序列編碼的gp5蛋白。優(yōu)選地，本發(fā)明所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒株具有序列表seqno.3所示核苷酸序列編碼的gp2蛋白。優(yōu)選地，本發(fā)明所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒株具有序列表seqno.4所示核苷酸序列編碼的nsp2基因。本發(fā)明涉及一種核苷酸序列，所述核苷酸序列實(shí)質(zhì)上編碼序列表seqidno.2所示的gp5蛋白?！昂塑账嵝蛄小痹诒旧暾?qǐng)中是指一種dna序列，其能夠被轉(zhuǎn)錄 得到相應(yīng)的rna序列。prrsv是正鏈rna病毒，其基因的編碼序列為dna，其能夠被轉(zhuǎn)錄成正鏈rna,該正鏈rna與病毒本身的基因組中的序列相同?！皩?shí)質(zhì)上編碼”指其編碼的蛋白可以通過(guò)添加、刪除、替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基同時(shí)保持其功能和免疫原性。本發(fā)明的豬繁殖與呼吸綜合征病毒gp5基因還可以應(yīng)用于表達(dá)載體、活載體、核酸疫苗、診斷試劑開(kāi)發(fā)以及其他預(yù)防和/或治療豬繁殖與呼吸綜合征病毒相關(guān)藥物開(kāi)發(fā)。本發(fā)明涉及一種重組載體，所述重組載體能表達(dá)本發(fā)明所述的核苷酸序列編碼的gp5蛋白。本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)化子，所述轉(zhuǎn)化子包含有導(dǎo)入的本發(fā)明所述的重組載體。本發(fā)明涉及一種gp5蛋白，所述gp5蛋白序列包括如序列表seqidno.2所示的gp5蛋白或其功能性變異體?！肮δ苄宰儺愺w”指組成蛋白的氨基酸殘基可以通過(guò)添加、刪除、替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基同時(shí)保持其功能和免疫原性。本發(fā)明涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物包括免疫量的本發(fā)明所述的gp5蛋白或其功能性變異體以及藥學(xué)上可接受的載體。“疫苗組合物”指含有豬繁殖與呼吸綜合征病毒免疫原性的藥物組合物。該藥物組合物可誘發(fā)、刺激或增強(qiáng)豬只針對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的免疫反應(yīng)。疫苗組合物包括免疫量的豬繁殖與呼吸綜合征病毒株的減毒活疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗或合成肽疫苗，以及藥學(xué)上可接受的載體?！皽p毒活疫苗”指的是以毒力已經(jīng)減弱但仍可在宿主體內(nèi)或細(xì)胞上復(fù)制的病毒制備的疫苗。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“減毒”用于指以使病原喪失致病性、但保持免疫原性的方式對(duì)基因進(jìn)行突變來(lái)人工降低病原體毒性。通常，通過(guò)uv輻射、化學(xué)處理或體外連續(xù)高階繼代培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)減毒。人工的基因改變，例如將已知序列中的特定核苷酸缺失以使 毒力減弱?！皽缁钜呙纭保卜Q作失活疫苗，指的是用作抗原以產(chǎn)生免疫力的滅活病毒的混懸液。滅活疫苗的例子包括全病毒滅活疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可以很容易地產(chǎn)生滅活疫苗。例如，通過(guò)用甲醛溶液處理病毒可獲得全病毒滅活疫苗。裂解型疫苗可在用醚處理后由病毒包膜制備得到。“亞單位疫苗”指的是利用基因工程方法將病原體的保護(hù)性抗原基因克隆到原核或真核表達(dá)系統(tǒng)中，使其高效表達(dá)而制成的疫苗。它比全病毒疫苗引起副反應(yīng)的可能性小?！昂铣呻囊呙纭敝傅氖且环N僅含免疫決定簇組分的小肽,即用人工方法按天然蛋白質(zhì)的氨基酸順序合成保護(hù)性短肽,與載體連接后加佐劑所制成的疫苗。本發(fā)明涉及的豬繁殖與呼吸綜合征病毒gp5蛋白，其有利地激發(fā)動(dòng)物中的保護(hù)性反應(yīng)。具體地，本發(fā)明實(shí)施方式的蛋白序列包含與其功能衍生物基本相同的氨基酸序列。“基本上相同”可以理解為本發(fā)明的蛋白優(yōu)選地具有這樣的氨基酸序列，其與seqno.2中所示的序列的部分或全部具有至少70％同源性，或具有至少75％同源性，或具有至少80％同源性，或具有至少85％同源性，或具有至少90％同源性，或具有至少95％同源性，或具有至少98％同源性?！巴葱浴边€包括與參比序列相同或類似，同時(shí)提供任何氨基酸的簡(jiǎn)單替換/修飾?？梢杂胋last-p(基本局部排比檢索工具)，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的程序進(jìn)行該方面的同源性檢索。對(duì)于相應(yīng)的核酸序列，同源性涉及在本領(lǐng)域中已知的blastx和blastn程序。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明所述疫苗組合物包括免疫量的本發(fā)明所述的gp5蛋白，其具有seqno.2所示的氨基酸序列，以及藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的gp5蛋白可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)任何已知的方法制備，例如可以通過(guò)重組表達(dá)gp5基因制備gp5蛋白，表達(dá)系統(tǒng)可以使用任何已 知的表達(dá)系統(tǒng)，例如：真核表達(dá)系統(tǒng)、原核表達(dá)系統(tǒng)?；蛘咧苯雍铣蒰p5蛋白序列。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明所述的疫苗組合物包括≥25μg/ml的gp5蛋白抗原或其功能性變異體。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明所述的疫苗組合物包括≥25μg/ml的豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株或其培養(yǎng)物的gp5蛋白抗原，其具有seqno.2所示的氨基酸序列。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述疫苗組合物包括25～100μg/ml的gp5蛋白抗原或其功能性變異體。優(yōu)選地，所述疫苗組合物包括豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株或其培養(yǎng)物的25～100μg/劑量gp5蛋白抗原，其具有seqno.2所示的氨基酸序列。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述疫苗組合物包括豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株或其培養(yǎng)物的滅活全病毒抗原，所述hnjz15株或其培養(yǎng)物的滅活全病毒抗原含量為滅活前≥106.0tcid50/ml。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式；所述hnjz15株或其培養(yǎng)物的滅活全病毒抗原含量為滅活前106.0～108.0tcid50/ml。作為本發(fā)明的一種更優(yōu)選實(shí)施方式，所述hnjz15株或其培養(yǎng)物的滅活全病毒抗原含量為滅活前107.0tcid50/ml。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述藥學(xué)上可接受的載體包括佐劑、助懸劑、表面活性劑、滅活劑或防腐劑；其中，所述佐劑選自白油、德雷克油，以及其他動(dòng)物油、植物油或礦物油；或氫氧化鋁、磷酸鋁及其它金屬鹽；或montanidetmgel、卡波姆、角鯊?fù)榛蚪酋徬?、isa206佐劑、皂苷、油包水乳劑、水包油乳劑、水包油包水乳劑。本發(fā)明的疫苗組合物可使用本領(lǐng)域公知技術(shù)來(lái)調(diào)配，優(yōu)選與藥學(xué)上可接受的載體一起調(diào)配。例如，油可有助于穩(wěn)定調(diào)配物，且另外充當(dāng)疫苗佐劑。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述藥學(xué)上可接受的載體包括佐劑，所述佐劑包括油佐劑，其選自白油、角鯊?fù)榛蚪酋徬?、德雷克? (drakeoil)，以及其他動(dòng)物油、植物油或礦物油。上述油佐劑既可以是天然來(lái)源，也可以是經(jīng)過(guò)人工合成獲得的。本發(fā)明中，所述疫苗組合物為水包油乳液、油包水乳液或雙重乳液，所述雙重乳液通常表現(xiàn)為水包油包水乳液。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述藥學(xué)上可接受的載體還包括助懸劑、表面活性劑、抗原滅活劑或防腐劑。所述助懸劑可包括，例如，硬脂酸鋁，以及所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
可用的其他助懸劑。所述表面活性劑可包括，例如，脫水山犁醇單油酸酯(tween系列)，司本(span)，以及所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
可用的其他表面活性劑。所述抗原滅活劑包括(但不限于)，例如福爾馬林、β－丙內(nèi)酯等等。所述防腐劑包括，例如硫柳汞。上述物質(zhì)的使用方法及用量均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知?；谟妥魟?huì)對(duì)動(dòng)物體帶來(lái)一定的副反應(yīng)，還可以選擇本領(lǐng)域的其它佐劑，包括氫氧化鋁、磷酸鋁及其它金屬鹽，來(lái)制備混懸液，減少免疫刺激?？蓪⒏鶕?jù)本發(fā)明的疫苗組合物制備成口服劑型或非口服劑型。優(yōu)選的是可通過(guò)皮內(nèi)、肌肉、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或硬腦膜外途徑給予的非口服劑型。本發(fā)明涉及一種制備本發(fā)明所述疫苗組合物的方法，所述制備方法包括：(1)克隆權(quán)利要求1所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒gp5蛋白基因；(2)轉(zhuǎn)化重組所述步驟(1)中克隆的gp5蛋白基因；(3)表達(dá)所述重組的豬繁殖與呼吸綜合征病毒gp5蛋白；(4)將所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒gp5蛋白抗原與佐劑按比例混合，乳化。本發(fā)明還涉及一種制備所述疫苗組合物的方法，所述制備方法包括增殖培養(yǎng)所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株，滅活，加入佐劑，攪拌均勻。本發(fā)明涉及本發(fā)明所述的疫苗組合物在制備預(yù)防和治療豬繁殖與呼吸綜合征的藥物中的應(yīng)用?！氨Ｗo(hù)性反應(yīng)”意為在動(dòng)物中預(yù)防豬繁殖與呼吸綜合征病毒相關(guān)疾病或由豬繁殖與呼吸綜合征病毒導(dǎo)致的感染的發(fā)作或減輕存在的 這樣的疾病的嚴(yán)重性?！邦A(yù)防”指通過(guò)給予根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染或推遲疾病發(fā)作的所有行為?！爸委煛敝竿ㄟ^(guò)給予根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物使豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染引起的癥狀減輕或好轉(zhuǎn)的所有行為。“豬繁殖與呼吸綜合征”指天然的prrsv感染豬后引起的一系列生理和病理的癥狀。這些癥狀包括，但不限于，發(fā)熱、嗜睡、食欲不振、倦怠、呼吸困難、咳嗽、母豬繁殖障礙、仔豬生長(zhǎng)緩慢等。下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“頭份”是指每頭豬注射的疫苗量。本發(fā)明中所述的“tcid50”(50％tissuecultureinfectivedose)是指半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量，是表示病毒感染力的一種表示方式。mem液體培養(yǎng)基(液)用購(gòu)自美國(guó)lifetechnologies公司的mem干粉培養(yǎng)基按照其說(shuō)明書配制。本發(fā)明的dmem培養(yǎng)基參照gb/t18641-2002附錄a配制方法配制。本發(fā)明中所述的“pbs”是指磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffersaline)的英文縮寫，本發(fā)明中使用的是0.01mm的ph7.4的pbs，按《分子克隆》第三版所述配制。實(shí)施例1病毒的采集分離從來(lái)自河南的疑似豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的樣本中分離，無(wú)菌采集豬扁桃體淋巴組織，以1∶10(體積比)加入dmem培養(yǎng)液，研磨，制備組織懸液，經(jīng)3次反復(fù)凍融后，12000r/min離心15min， 收集上清液，再經(jīng)0.22μm濾膜濾器過(guò)濾，在pam細(xì)胞上傳代，37℃培養(yǎng)1h，換加含2％犢牛血清的dmem培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)5日。收獲含毒培養(yǎng)液，經(jīng)2次凍融后，收毒，換加含2％犢牛血清的dmem培養(yǎng)液。采用豬繁殖與呼吸綜合征病毒pcr檢測(cè)試劑盒(北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司)檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒，結(jié)果為陽(yáng)性；對(duì)分離的病毒利用pcr試劑盒進(jìn)行外源病毒的檢測(cè)，進(jìn)行豬偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒、豬瘟病毒的檢測(cè)(豬偽狂犬病病毒rt-pcr檢測(cè)試劑盒、豬細(xì)小病毒pcr檢測(cè)試劑盒、豬瘟病毒rt-pcr檢測(cè)試劑盒均為北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司產(chǎn)品)，pcr檢測(cè)結(jié)果表明均為陰性，表明毒種純凈。將分離到的豬繁殖與呼吸綜合征病毒命名為豬繁殖與呼吸綜合征病毒株hnjz15株，提交保藏。實(shí)施例2分離病毒的遺傳特性通過(guò)基因分析來(lái)確定實(shí)施例1中分離的病毒的遺傳特性。利用在pam細(xì)胞上分離的豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組做模板，反轉(zhuǎn)錄成cdna，使用表1所示的引物進(jìn)行pcr。分別使用primerpremier5.0來(lái)設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增gp5、gp2、nsp2基因的引物序列。pcr擴(kuò)增體系如下：模板cdna1μl，primerstarhsdnapolymerase(2.5u/μl)0.5μl，5×primestartmbuffer10μl，上下游引物各1μl(10pmol/μl)，dntpmix(2.5mmeach)4μl，并用ddh2o將體積補(bǔ)足50μl。進(jìn)行兩步pcr反應(yīng)：在98℃2min；98℃10s，55℃1min，72℃1mim/kb，30cycles；72℃5min。通過(guò)在含有溴化乙錠的1％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析所得的pcr產(chǎn)物。pcr產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定。豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株gp5核苷酸序列如seqno.1所示，gp2核苷酸序列如seqno.3所示，nsp2核苷酸序列如seqno.4所示。表1pcr引物序列實(shí)施例3病毒的致病性試驗(yàn)將43日齡豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體陰性仔豬10頭隨機(jī)分成2組，5頭/組，第1組為試驗(yàn)組，第2組為對(duì)照組，試驗(yàn)組滴鼻接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株(攻毒劑量為105.0tcid50/頭)，對(duì)照組接種dmem培養(yǎng)基。病毒接種后，每日測(cè)定仔豬體溫，觀察臨床情況，具體結(jié)果見(jiàn)表2。表2豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株對(duì)仔豬的致病性結(jié)果顯示，豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株對(duì)仔豬可導(dǎo)致發(fā)病，有明顯臨床癥狀，剖檢有明顯肺病變。實(shí)施例4豬繁殖與呼吸綜合征病毒滅活苗的制備將實(shí)施例1中分離到的豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株培養(yǎng)物接種于pam細(xì)胞，按照病毒培養(yǎng)液量的1％(v/v)接入形成單層的pam細(xì)胞培養(yǎng)物中，置37℃培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到80％時(shí)，收獲含毒細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)2次凍融后，收毒，測(cè)定毒價(jià)。加入10％(v/v)甲醛溶液使甲醛的終濃度為0.2％(v/v)，37℃滅活18小時(shí)，每4小時(shí)攪拌1次，每次攪拌10min，滅活后病毒液用ph7.4的pbs液稀釋至表3所示的病毒含量，然后與206佐劑(法國(guó)seppic公司產(chǎn)品)按照體積比50:50混合，在30℃條件下120轉(zhuǎn)/分鐘攪拌15分鐘。具體配比見(jiàn)表3。表3豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株滅活苗的制備組別滅活前病毒含量(tcid50/ml)206佐劑含量(v/v％)疫苗1106.050疫苗2107.050疫苗3108.050實(shí)施例5滅活疫苗免疫原性試驗(yàn)將43日齡prrsv抗體陰性仔豬20頭隨機(jī)分成4組，5頭/組，3～5組為試驗(yàn)組，第6組為對(duì)照組，分別按照表4注射疫苗或dmem培養(yǎng)基。表4免疫原性試驗(yàn)動(dòng)物分組組別注射疫苗免疫劑量3疫苗12ml/頭4疫苗22ml/頭5疫苗32ml/頭6dmem培養(yǎng)基2ml/頭疫苗免疫后，每周參照gb/t18641-2002方法中的血清中和試驗(yàn)的方法測(cè)定滅活疫苗組的中和抗體效價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表5。表5豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株滅活苗免疫仔豬后的抗體水平表5結(jié)果顯示，豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株滅活苗免疫仔豬后，能產(chǎn)生較高的中和抗體，且隨免疫時(shí)間逐漸升高。免疫后28日攻毒，攻毒劑量為豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株病毒105.0tcid50/頭，觀察臨床癥狀見(jiàn)表6，攻毒后每日測(cè)定仔豬體溫見(jiàn)表7。表6豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株滅活疫苗免疫仔豬后的攻毒情況表7豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株滅活疫苗免疫仔豬攻毒后體溫變化天數(shù)3組4組5組6組攻毒后1天39.539.439.539.5攻毒后2天39.439.439.641.0攻毒后3天39.439.739.641.2攻毒后4天39.739.539.441.4攻毒后5天39.639.439.641.4攻毒后6天39.439.439.741.3攻毒后7天39.639.739.741.2表6和表7的結(jié)果顯示，豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株滅活疫苗免疫仔豬，能阻斷病毒感染(出現(xiàn)臨床癥狀)，為仔豬提供100％(5/5)保護(hù)，而對(duì)照仔豬攻毒后全部出現(xiàn)臨床癥狀，因此，豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株滅活疫苗具有很好的保護(hù)力。實(shí)施例6豬繁殖與呼吸綜合征病毒gp5蛋白的制備1.豬繁殖與呼吸綜合征病毒gp5基因克隆載體的構(gòu)建在生長(zhǎng)良好的pam細(xì)胞上接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株或其不同代次的培養(yǎng)物，收獲病毒后用takara公司minibestviralrna/dnaextractionkitver.3.0試劑盒提取prrsv基因組rna，反轉(zhuǎn)錄為cdna，取1μlcdna作為模板，利用gp5特異性引物(下劃線為酶切位點(diǎn))：gp5-f(5’-3’):cgcggatccttggggaaatgcttgaccg(bamhi)gp5-r(5’-3’):cccaagcttctatggacgaccccattgttc(hindш)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，利用takara的高保真酶hsdnapolymerase，擴(kuò)增條件為：98℃2min；98℃10s，55℃1min，72℃1mim/kb，30cycles；72℃5min。pcr產(chǎn)物命名為gp5。其核苷酸序列見(jiàn)seqno.1，推導(dǎo)其氨基酸序列為seqno.2。pcr擴(kuò)增gp5基因后，膠回收目的片段后，用bamhi和hindш分別雙酶切膠回收產(chǎn)物和pfastbactmhta載體(購(gòu)自invitrogen公司， 貨號(hào)10584-027)，37℃反應(yīng)2h，膠回收酶切片段，將回收的gp5連接到pfastbactmhta載體上。酶切體系：10×fdgreenbuffer5μl，dna/載體1-2μg，fdbamhi2μl，fdhindш2μl，補(bǔ)ddh2o至50μl，37℃反應(yīng)1h。于1％瓊脂糖凝膠電泳回收載體和目的片段。建立10μl連接體系：10×t4dnaligasebuffer1μl，t4dnaligase1μl，載體酶切膠回收產(chǎn)物2μl，目的片段酶切膠回收產(chǎn)物6μl，于22℃連接1h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入dh5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行pcr鑒定和測(cè)序鑒定，鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒，命名為pfastbacht-gp5。2.重組bacmid的獲取及鑒定pfastbacht-gp5質(zhì)粒轉(zhuǎn)化dh10bac感受態(tài)細(xì)胞(invitrogen，貨號(hào)：10361-012)，pfastbacht-gp5和感受態(tài)細(xì)胞中的穿梭質(zhì)粒bacmid進(jìn)行轉(zhuǎn)座，用invitrogen的purelinktmhipureplasmiddnaminiprepkit提取獲得的重組質(zhì)粒，并用pucm13forward/pucm13reverse引物鑒定gp5的插入，陽(yáng)性重組穿梭質(zhì)粒bacmid命名為bacmid-gp5。3.轉(zhuǎn)染獲得重組桿狀病毒按照invitrogen公司bac-to-bachbmtoposecretedexpressionsystem的說(shuō)明書提供的方法進(jìn)行。6孔板每孔鋪8×105個(gè)sf9細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后按照cellfectinⅱ轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染：分別稀釋8μlcellfectinⅱ和1μgbacmid-gp5dna到100μlsf-900ⅱ培養(yǎng)基中，激烈振蕩混勻，混合稀釋后的dna與稀釋后的cellfectinⅱ(總體積～210μl),混合均勻室溫孵育15～30min，逐滴滴加到細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后72h待出現(xiàn)細(xì)胞病變后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，記為p0代重組病毒vbac-gp5。p0代重組病毒vbac-gp5以0.1moi感染sf9細(xì)胞，經(jīng)3代擴(kuò)大培養(yǎng)后，獲得的p3代vbac-gp5用于重組蛋白表達(dá)。4.重組桿狀病毒感染sf9細(xì)胞獲得重組蛋白將p3代重組桿狀病毒vbac-gp5接種sf9細(xì)胞。在500ml三角瓶中懸浮培養(yǎng)sf9細(xì)胞，至細(xì)胞密度達(dá)到7.0×105cell/ml后，按照5moi 的量接種病毒，感染后72h-96h，5000g離心10min，收集細(xì)胞沉淀。按5-10ml/克菌體量加入bindbuffer(20mm磷酸鈉、500mm氯化鈉、20mm咪唑)重懸細(xì)胞沉淀，超聲裂解細(xì)胞，10000g，離心15min，上清按照ge公司his純化試劑盒(gehealthcare，貨號(hào)：28-4013-51)說(shuō)明書進(jìn)行。sds-page光密度法測(cè)定蛋白含量為200μg/ml。實(shí)施例7豬繁殖與呼吸綜合征病毒gp5亞單位疫苗的制備將實(shí)施例6制備的亞單位抗原，用pbs液(ph7.4)稀釋至表8的蛋白含量，與206佐劑(法國(guó)seppic公司產(chǎn)品)按照體積比50:50混合，在30℃條件下120轉(zhuǎn)/分鐘攪拌15分鐘。表8豬繁殖與呼吸綜合征病毒亞單位疫苗的制備組別蛋白含量(μg/ml)206佐劑含量(v/v％)疫苗42550疫苗510050實(shí)施例8豬繁殖與呼吸綜合征病毒gp5亞單位疫苗的免疫原性試驗(yàn)將43日齡prrsv抗體陰性仔豬15頭隨機(jī)分成3組，5頭/組，按照表9注射實(shí)施例6制備的疫苗，對(duì)照組接種dmem培養(yǎng)基2ml/頭。表9亞單位疫苗免疫原性試驗(yàn)動(dòng)物分組組別注射疫苗免疫劑量7疫苗42ml/頭8疫苗52ml/頭9dmem培養(yǎng)基2ml/頭免疫后28日攻毒，攻毒劑量為豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株病毒105.0tcid50/頭，觀察臨床癥狀見(jiàn)表10，攻毒后每日測(cè)定仔豬體溫見(jiàn)表11。表10豬繁殖與呼吸綜合征病毒亞單位疫苗免疫仔豬后的攻毒情況表11豬繁殖與呼吸綜合征病毒亞單位疫苗免疫仔豬攻毒后體溫變化天數(shù)7組8組9組攻毒后1天39.439.539.5攻毒后2天39.439.741.4攻毒后3天39.639.641.2攻毒后4天39.739.641.5攻毒后5天39.639.541.4攻毒后6天39.539.341.3攻毒后7天39.539.641.3表10和表11的結(jié)果顯示，豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株亞單位疫苗免疫仔豬，能阻斷病毒感染(出現(xiàn)臨床癥狀)，為仔豬提供100％(5/5)保護(hù)，而對(duì)照仔豬攻毒后全部出現(xiàn)臨床癥狀，因此，豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株亞單位疫苗具有很好的保護(hù)力。實(shí)施例9商品化疫苗對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株的免疫保護(hù)試驗(yàn)將43日齡prrsv抗體陰性仔豬20頭隨機(jī)分成4組，5頭/組，10～12組為試驗(yàn)組，第13組為對(duì)照組，分別按照表12注射疫苗或dmem培養(yǎng)基。商品化活疫苗由豬繁殖與呼吸綜合征病毒jxa1-r株制備，病毒含量為106.0tcid50/ml；商品化滅活疫苗由豬繁殖與呼吸綜合 征病毒nvdc-jxa1株制備，病毒含量為滅活前106.0tcid50/ml。表12商品化疫苗的免疫保護(hù)試驗(yàn)動(dòng)物分組組別注射疫苗免疫劑量10疫苗12ml/頭11商品化活疫苗2ml/頭12商品化滅活疫苗2ml/頭13dmem培養(yǎng)基2ml/頭免疫后28日攻毒，攻毒劑量為豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株病毒105.0tcid50/頭，觀察臨床癥狀見(jiàn)表13，攻毒后每日測(cè)定仔豬體溫。表13商品化疫苗免疫仔豬后的攻毒情況表13結(jié)果顯示，用現(xiàn)有的商品化豬繁殖與呼吸綜合征病毒活疫苗及滅活疫苗免疫仔豬，均不能完全阻斷病毒感染，只能提供部分保護(hù)作用，本發(fā)明的滅活疫苗能夠完全阻斷病毒感染，提供完全的保護(hù)作用，而對(duì)照組仔豬攻毒后全部出現(xiàn)臨床癥狀；進(jìn)一步通過(guò)剖檢發(fā)現(xiàn)，免疫商品化活疫苗和滅活疫苗組剖檢后依然存在不同程度的肺病變， 而本發(fā)明滅活疫苗免疫組未發(fā)現(xiàn)剖檢病變。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明做任何形式上的限制，雖然本發(fā)明已以優(yōu)選實(shí)施例揭露如上，然而并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)，當(dāng)可利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容作出些許更動(dòng)或修飾為等同變化的等效實(shí)施例，但凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12