本發(fā)明涉及生物技術和醫(yī)學領域，具體地說，是一種長鏈非編碼rna——lnc-smad3，其在調(diào)控調(diào)節(jié)性t細胞的分化發(fā)育、成熟和功能中的應用。

背景技術：

哺乳動物基因組可轉錄多種長非編碼rna(longnoncodingrna，lncrna)，然而其中僅有少數(shù)lncrna的序列和功能被明確。近年來，lncrna在生命生理過程以及疾病進程中的作用不斷受到關注，但是關于lncrna與免疫系統(tǒng)之間的研究并不多，尤其是lncrna與調(diào)節(jié)性t細胞的分化發(fā)育、成熟以及其維持的免疫穩(wěn)態(tài)之間的報道幾乎空白。

調(diào)節(jié)性t細胞是免疫穩(wěn)態(tài)中重要的調(diào)控細胞，它可以從初始狀cd4⁺t細胞分化發(fā)育而來。調(diào)節(jié)性t細胞可以通過抑制效應性t細胞的活化和增殖，負向調(diào)控過激的免疫應答，控制炎癥反應。而另一方面，調(diào)節(jié)性t細胞分泌的細胞因子il-10、轉化因子tgf-β等又參與腫瘤微環(huán)境的形成，與腫瘤轉移有著一定的關聯(lián)。調(diào)節(jié)性t細胞的分化發(fā)育、成熟和功能狀態(tài)決定了免疫應答的走向和強度，在機體免疫穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

眾多的轉錄因子和細胞因子等在調(diào)節(jié)性t細胞的分化成熟中發(fā)揮著重要作用，如foxp3、il-2以及tgf-β等，也確定了很多調(diào)節(jié)性t細胞功能相關的膜表面受體，如cd25/ctla-4/gitr等。但是，目前為止沒有報道過參與調(diào)控調(diào)節(jié)性t細胞分化成熟和功能的特異性長鏈非編碼rna，因此尚不清楚長鏈非編碼rna對調(diào)節(jié)性t細胞免疫功能調(diào)控的作用機制。

許多臨床疾病都是由于調(diào)節(jié)性t細胞的發(fā)育和功能異常導致的。如小鼠會因為調(diào)節(jié)性t細胞功能缺陷而引發(fā)自身免疫性炎癥性疾病，scurfy病。相應的在人類中，調(diào)節(jié)性t細胞關鍵分子foxp3的基因突變則會引發(fā)先天性免疫缺陷綜合征，ipex病。在自身免疫性疾病的臨床治療中，小劑量il-2輸注可以使得調(diào)節(jié)性t細胞在體內(nèi)擴增，達到抑制機體過度免疫應答的效應。然而調(diào)節(jié)性t細胞的體外轉化和擴增在臨床應用中尚不成熟。調(diào)節(jié)性t細胞在眾多免疫相關疾病如感染，炎癥，自身免疫性疾病，腫瘤的發(fā)生發(fā)展和干預治療中發(fā)揮著重要作用，然而調(diào)節(jié)性t細胞分化成熟和功能調(diào)控機制的缺乏使得調(diào)節(jié)性t細胞在臨床上的轉化應用仍十分有限。因此，從調(diào)節(jié)性t細胞中尋找新型調(diào)控分子有助于實現(xiàn)對調(diào)節(jié)性t細胞的分化成熟和功能調(diào)控，及其所介導的免疫穩(wěn)態(tài)維持的調(diào)控，并進一步可用于免疫相關疾病的干預治療。為方便臨床和科研應用，本領域中迫切需要研究和開發(fā)出可調(diào)控調(diào)節(jié)性t細胞的分化發(fā)育、成熟和功能的特異性分子。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種調(diào)控調(diào)節(jié)性t細胞的分化發(fā)育和/或其成熟狀態(tài)和/或其功能的物質(zhì)：lnc-smad3及其雜交或同源序列、其表達產(chǎn)物、或它們的抑制劑或增效劑。本發(fā)明的另一目的在于提供以上物質(zhì)在調(diào)控調(diào)節(jié)性t細胞的分化發(fā)育、成熟狀態(tài)和/或功能中的應用以及相應的藥物和試劑盒。

本發(fā)明從小鼠smad3的基因位點附近篩選出了由初始狀cd4⁺t細胞特異性表達的長鏈非編碼rna(longnoncodingrna，lncrna)分子lnc-smad3(loc102639582，geneid:102639582，genbankaccessionnumber:ky652933，seqidno:1)，并明確其精確的序列。初始狀cd4⁺t細胞在極化劑作用下分化發(fā)育為調(diào)節(jié)性t細胞的過程中，lnc-smad3的表達水平呈現(xiàn)不斷下降的趨勢。在調(diào)節(jié)性t細胞分化發(fā)育的過程中，過表達lnc-smad3后結果發(fā)現(xiàn)：調(diào)節(jié)性t細胞的分化發(fā)育受阻，功能性表面受體的表達顯著降低，如cd25、ctla-4和gitr。同時，調(diào)節(jié)性t細胞分泌的il-10也在過表達lnc-smad3后顯著下降。在調(diào)節(jié)性t細胞功能上，過表達lnc-smad3的調(diào)節(jié)性t細胞與對照組相比，抑制效應性t細胞增殖的能力減弱，表現(xiàn)為效應性t細胞的數(shù)量與對照組相比減少。實驗證實了調(diào)節(jié)性t細胞分化發(fā)育過程中，lnc-smad3的減少對于調(diào)節(jié)性t細胞的成熟和功能是必需的。

本發(fā)明中進一步提供了長鏈非編碼rnalnc-smad3有效抑制調(diào)節(jié)性t細胞成熟和功能的新用途。lnc-smad3表達量的檢測可應用于免疫相關疾病中免疫功能的檢測，對疾病的診斷治療和預后等給出提示或指導信息。針對lnc-smad3表達量的調(diào)控，包括干擾抑制表達和高表達等一切影響lnc-smad3量的干預手段，可應用于免疫相關疾病的治療。本發(fā)明可以輔助完成調(diào)控調(diào)節(jié)性t細胞的分化發(fā)育、成熟和免疫抑制功能，通過實現(xiàn)對免疫應答的正向或負向的調(diào)控，發(fā)揮抑制自身免疫性疾病進展或抗腫瘤逃逸轉移的效果，從而達到治療疾病的目的。在此基礎上，完成了本發(fā)明。

本發(fā)明的第一方面，提供選自下組的rna序列或其表達產(chǎn)物、或其抑制劑或增效劑在調(diào)控調(diào)節(jié)性t細胞的分化發(fā)育、成熟狀態(tài)和/或功能中的應用：

(a)seqidno:1所示的長非編碼rna；

(b)在嚴格條件下與(a)限定的序列雜交的序列；

(c)與(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的rna序列；和

(d)(a)或(b)中序列在非小鼠哺乳動物中的同源序列。

本發(fā)明的第二方面，提供選自下組的序列或其表達產(chǎn)物、或其抑制劑或增效劑在制備調(diào)控調(diào)節(jié)性t細胞的分化發(fā)育、成熟狀態(tài)和/或功能的藥物或試劑盒中的應用：

(a)seqidno:1所示的長非編碼rna；

(b)在嚴格條件下與(a)限定的序列雜交的序列；

(c)與(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的rna序列；和

(d)(a)或(b)中序列在非小鼠哺乳動物中的同源序列。

在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述rna序列是seqidno:1所示的長非編碼rna。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述調(diào)節(jié)性t細胞來源于哺乳動物，優(yōu)選小鼠、人、大鼠、犬、猴、猩猩、豬、馬、?；蜓?，更優(yōu)選小鼠。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述分化發(fā)育選自：關鍵轉錄因子foxp3的表達；所述成熟狀態(tài)選自：細胞表面淋巴細胞歸巢受體cd44/cd62l的表達、抑制性受體cd25/clta4/gitr的表達、免疫抑制性細胞因子il-10的產(chǎn)生；所述功能選自：抑制效應性t細胞的增殖和活化、負向調(diào)控免疫應答、抑制炎癥、維持免疫穩(wěn)態(tài)。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述序列或其表達產(chǎn)物、或其增效劑抑制調(diào)節(jié)性t細胞的分化發(fā)育、成熟和/或抑制其功能，優(yōu)選與未接觸所述序列或其表達產(chǎn)物的抑制劑的對照調(diào)節(jié)性t細胞或其前體初始狀cd4⁺t細胞相比，減少調(diào)節(jié)性t細胞表達的標志性分子和功能分子(如關鍵轉錄因子foxp3、抑制性受體cd25/clta4/gitr)、減弱il-10分泌、使調(diào)節(jié)性t細胞抑制效應性t細胞增殖和活化的能力降低。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述序列或其表達產(chǎn)物的抑制劑促進調(diào)節(jié)性t細胞的分化發(fā)育和/或成熟和/或促進其功能，優(yōu)選與未接觸所述序列或其表達產(chǎn)物的抑制劑的對照調(diào)節(jié)性t細胞或其前體初始狀cd4⁺t細胞相比，增加調(diào)節(jié)性t細胞表達的標志性分子和功能分子(如關鍵轉錄因子foxp3、抑制性受體cd25/clta4/gitr)、增強il-10分泌、使調(diào)節(jié)性t細胞抑制效應性t細胞增殖和活化的能力提高。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述序列或其表達產(chǎn)物、或其增效劑選自：包含所述序列的表達載體、所述序列的外源性表達產(chǎn)物、促使所述序列高表達的試劑；所述序列或其表達產(chǎn)物的抑制劑選自：針對所述序列的rnai、反義寡核苷酸、用于阻礙或降低所述序列表達和/或其功能的特異性抑制劑和/或分子化合物等試劑。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述序列或其表達產(chǎn)物、或其抑制劑或增效劑進一步用于調(diào)控機體免疫穩(wěn)態(tài)、防治自身免疫性疾病、免疫干預方案選擇和/或預后評估。

在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述自身免疫性疾病為結腸炎。

本發(fā)明的第三方面，提供一種調(diào)控調(diào)節(jié)性t細胞的分化發(fā)育、成熟狀態(tài)和/或功能的藥物或試劑盒，其包含：

i)有效量的選自下組的序列或其表達產(chǎn)物、或其抑制劑或增效劑：

(a)seqidno:1所示的長非編碼rna；

(b)在嚴格條件下與(a)限定的序列雜交的序列；

(c)與(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的rna序列；和

(d)(a)或(b)中序列在非小鼠哺乳動物中的同源序列；

ii)藥學或免疫學上可結合的載體或輔料。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述藥物或試劑盒還包含：未成熟或成熟、經(jīng)或未經(jīng)極化的調(diào)節(jié)性t細胞和/或其前體初始狀cd4⁺t細胞；調(diào)節(jié)性t細胞極化劑。

本發(fā)明的第四方面，提供一種調(diào)控調(diào)節(jié)性t細胞的分化發(fā)育、成熟狀態(tài)和/或其功能的方法、或誘導前體初始狀cd4⁺t細胞成功分化發(fā)育成調(diào)節(jié)性t細胞、或誘導產(chǎn)生所需成熟狀態(tài)和/或功能的調(diào)節(jié)性t細胞的方法，所述方法包括使選自下組的序列或其表達產(chǎn)物、或其抑制劑或增效劑接觸調(diào)節(jié)性t細胞和/或其前體cd4⁺t細胞的步驟：

(a)seqidno:1所示的長非編碼rna；

(b)在嚴格條件下與(a)限定的序列雜交的序列；

(c)與(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的rna序列；和

(d)(a)或(b)中序列在非小鼠哺乳動物中的同源序列；

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述方法還包括：

在所述接觸步驟之前、之時或之后，使所述調(diào)節(jié)性t細胞和/或其前體初始狀cd4⁺t細胞與調(diào)節(jié)性t細胞極化劑接觸；優(yōu)選的所述極化劑為轉化因子tgf-β。

本文中提供的所有數(shù)值范圍旨在清楚地包括落在范圍端點之間的所有數(shù)值及它們之間的數(shù)值范圍?？蓪Ρ景l(fā)明提到的特征或實施例提到的特征進行組合。本說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。

如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……構成”、“基本上由……構成”、和“由……構成”；“主要由……構成”、“基本上由……構成”和“由……構成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，術語“表達”在描述lnc-smad3是指其rna水平。

lnc-smad3及其雜交和同源序列

如本文所用，術語“l(fā)nc-smad3”是指(a)由初始狀cd4⁺t細胞特異性表達的長鏈非編碼rna分子(lncrna)，其序列如seqidno:1所示；(b)在嚴格條件下與(a)限定的序列雜交的序列；(c)與(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的rna序列；和(d)(a)或(b)中序列在非小鼠哺乳動物中的同源序列。

在本發(fā)明中，“嚴格條件”是指：(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×ssc,0.1％sds,60℃；或(2)雜交時加有變性劑,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上,更好是95％以上時才發(fā)生雜交。

本發(fā)明的rna全長序列或其片段通?？梢杂胮cr擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次pcr擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。

藥物或試劑盒

本發(fā)明還提供了一種藥物或試劑盒，其用于調(diào)控調(diào)節(jié)性t細胞的分化發(fā)育和/或成熟狀態(tài)和/或功能，和/或進一步用于對機體免疫應答的調(diào)控、防止免疫相關疾病、免疫治療方案選擇和/或預后評估。所述藥物或試劑盒包含有效量的本發(fā)明的選自下組的序列或其表達產(chǎn)物、或其抑制劑或促效劑以及藥學上或免疫學上可接受的載體或輔料。

所述“藥學上或免疫學上可接受的”的成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態(tài)反應)的，即有合理的效益/風險比的物質(zhì)。所述“有效量”是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。

所述“藥學上或免疫學上可接受的載體”指用于治療劑或疫苗給藥的載體，包括各種賦形劑、稀釋劑和佐劑。該術語指這樣一些藥劑或疫苗載體：它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在remington'spharmaceuticalsciences(mackpub.co.，n.j.1991)中可找到關于藥學上可接受的賦形劑的充分討論。

這類載體包括(但并不限于)：鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。通常藥物/疫苗制劑應與給藥方式相匹配，例如，本發(fā)明的組合物可以用生理鹽水或含有葡萄糖和其它輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備，以制得針劑形式。所述組合物宜在無菌條件下制造。本發(fā)明的制劑還可制成緩釋制劑。

可根據(jù)防治、預后的原理和方法，按照需要在本發(fā)明的藥物和試劑盒中配備試劑或試劑組。例如，本發(fā)明的藥物或試劑盒中可進一步包含：未成熟或成熟、經(jīng)或未經(jīng)極化的調(diào)節(jié)性t細胞和/或其前體初始狀cd4⁺t細胞；以及調(diào)節(jié)性t細胞的極化劑。

此外，本發(fā)明的試劑盒還可根據(jù)需要包括：容器、對照物(包括陽性或陰性對照)、使用說明書、緩沖劑等，本領域技術人員可根據(jù)具體情況對其進行選擇。

本發(fā)明優(yōu)點在于：

1、證明了lnc-smad3的水平降低對于調(diào)節(jié)性t細胞的正常分化成熟和功能是必需的，對其進行過表達后能夠實現(xiàn)對調(diào)節(jié)性t細胞成熟和功能的調(diào)控，以及對調(diào)節(jié)性t細胞介導的相關免疫應答的調(diào)控；

2、為免疫相關性疾病的診斷治療和預后提供了簡便而有效的工具和方法；

3、本發(fā)明可應用于調(diào)控調(diào)節(jié)性t細胞的分化發(fā)育和/或成熟狀態(tài)和/或功能，和/或進一步用于調(diào)控機體免疫穩(wěn)態(tài)、防治結腸炎等自身免疫性疾病、免疫干預方案選擇和/或預后評估，具有廣泛的應用前景。

附圖說明

圖1：lnc-smad3在各類免疫細胞中的表達量的qrt-pcr檢測。圖中，一個點代表一個樣品重復。

圖2：lnc-smad3在初始狀cd4⁺t細胞向成熟調(diào)節(jié)性t細胞分化成熟過程中表達量的qrt-pcr檢測。圖中所示結果為平均值±標準差(n＝3)。

圖3：qrt-pcr檢測初始狀cd4⁺t細胞分化來的調(diào)節(jié)性t細胞中l(wèi)nc-smad3的rna水平，從而證實lnc-smad3慢病毒(lenti-lnc-smad3)的過表達效率；結果顯示為平均值±標準差(n＝3)。

圖4：qrt-pcr檢測初始狀cd4⁺t細胞分化來的調(diào)節(jié)性t細胞中foxp3的rna水平，從而證實在利用lnc-smad3慢病毒增加了lnc-smad3的表達后，調(diào)節(jié)性t細胞的關鍵轉錄因子的表達受到明顯抑制；結果顯示為平均值±標準差(n＝3)。

圖5：流式檢測初始狀cd4⁺t細胞分化來的調(diào)節(jié)性t細胞中foxp3的蛋白水平，從而證實在利用lnc-smad3慢病毒增加了lnc-smad3的表達后，初始狀cd4⁺t細胞往調(diào)節(jié)性t細胞的分化發(fā)育受阻礙。

圖6：流式檢測調(diào)節(jié)性t細胞表面受體的表達，證實在利用lnc-smad3慢病毒增加了lnc-smad3的表達后，調(diào)節(jié)性t細胞功能相關的表面受體的表達受到明顯抑制；結果顯示為平均值±標準差(n＝3)。

圖7.elisa檢測在利用lnc-smad3慢病毒增加了lnc-smad3的表達后，調(diào)節(jié)性t細胞分泌的il-10的水平降低；結果顯示為平均值±標準差(n＝3)。

圖8.調(diào)節(jié)性t細胞抑制實驗檢測調(diào)節(jié)性t細胞在過表達lnc-smad3后抑制效應性t細胞增殖的能力；結果顯示為平均值±標準差(n＝3)。

以上圖中，lenti-ctr＝對照。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。本領域技術人員可對本發(fā)明做出適當?shù)男薷摹⒆儎?，這些修改和變動都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，可采用本領域中的常規(guī)方法，例如參考《分子克隆實驗指南》(第三版，紐約，冷泉港實驗室出版社，newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)或按照供應商所建議的條件。dna的測序方法為本領域常規(guī)的方法，也可由商業(yè)公司提供測試。

除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。

實施例1.初始狀cd4⁺t細胞分化成調(diào)節(jié)性t細胞的培養(yǎng)過程

根據(jù)文獻記載在體外使小鼠來源的初始狀cd4⁺t細胞分化培養(yǎng)成調(diào)節(jié)性t細胞(roychoudhuri,r.etal.bach2represseseffectorprogramstostabilizet(reg)-mediatedimmunehomeostasis.nature498,506-510(2013).)。

利用初始狀cd4⁺t細胞分離試劑盒(stemcell)從小鼠脾臟細胞中分離出初始狀cd4⁺t細胞。將分選得到的初始狀cd4⁺t細胞培養(yǎng)于37℃的細胞培養(yǎng)箱中[24孔板，1×10⁶個細胞/孔，1ml/孔rpmi-1640(paa)細胞培養(yǎng)液，其中含10％(v/v)fcs(paa)，外加anti-cd3(1μg/ml)，anti-cd28mabs(1μg/ml)，anti-ifn-γ(10μg/ml)，anti–il-4(10μg/ml)，il-2(5ng/ml)以及重組人tgf-β(10ng/ml)]。培養(yǎng)置第三天時，初始狀cd4⁺t細胞分化成成熟的調(diào)節(jié)性t細胞。

實施例2：lnc-smad3及其基因組附近基因的定量實時pcr(qrt-pcr)檢測

取實施例1中利用試劑盒分選得到的初始狀cd4⁺t細胞(圖1)或往調(diào)節(jié)性t細胞分化培養(yǎng)的各個時間點的細胞(圖2)，采用trizol(invitrogen公司)提取其中的rna樣品。qrt-pcr使用sybrrt-pcr試劑盒(takara公司，sybrgreenrealtimepcrmastermixcode：qpk-201)，并在lightcycler(roche公司)實時定量pcr儀上進行操作。

lnc-smad3的qrt-pcr檢測用的定量引物為：

5'-aggccaacgatccaggttta-3'(上游，seqidno:2)；

5'-acatgtctggaggcaatgga-3'(下游，seqidno:3)。

作為無變化對照的lnc-smad3基因組附近基因iqchqrt-pcr檢測用的定量引物為：

5'-tgggcatgttaacaatcggtg-3'(上游，seqidno:4)；

5'-tcttcctcctctttgctctgt-3'(下游，seqidno:5)。

反轉錄反應參數(shù)：42℃20分鐘，99℃5分鐘。

qrt-pcr反應參數(shù)：95℃15秒，57℃10秒，68℃2秒讀板，72℃30秒，40循環(huán)。

rna的相對定量使用2-δδct法計算(以gapdh為內(nèi)參)。

gapdhqrt-pcr檢測用的定量引物為：

5'-aggtcggtgtgaacggatttg-3'(上游，seqidno:6)；

5'-tgtagaccatgtagttgaggtca-3'(下游，seqidno:7)。

測試結果如圖1和圖2所示。

圖1中的數(shù)據(jù)顯示：lnc-smad3僅在初始狀cd4⁺t細胞中高表達，而在其它免疫細胞亞群中不表達或表達量很低。

cd8⁺t細胞是采用抗cd8磁珠(miltenyibiotech)從小鼠脾臟細胞中分離而出；b細胞是采用抗b220磁珠(miltenyibiotech)從小鼠脾臟細胞中分離而出；樹突狀細胞是利用小鼠骨髓細胞外加100ng/ml小鼠gm-csf和10ng/ml小鼠il-4細胞因子(r&dsystems，minneapolis,mn)培養(yǎng)七天而獲得；巨噬細胞是往小鼠腹腔注射肉湯，三天后抽取腹水而獲得。

圖2中的數(shù)據(jù)顯示：lnc-smad3在初始狀cd4⁺t細胞分化為調(diào)節(jié)性t細胞的過程中(第0天～第3天)表達量顯著下調(diào)，在調(diào)節(jié)性t細胞分化成熟時(第3天)達到最低值，低于初始狀cd4⁺t細胞(第0天)中表達量的10％。而作為無關對照的其它基因iqch的表達量在cd4⁺t細胞分化為調(diào)節(jié)性t細胞的過程沒有明顯變化。

以上結果表明：

lnc-smad3僅在初始狀cd4⁺t細胞中特異性表達，其在初始狀cd4⁺t細胞中的表達水平可區(qū)別于其它免疫細胞。

并且，lnc-smad3在初始狀cd4⁺t細胞往調(diào)節(jié)性t細胞的分化發(fā)育過程中呈現(xiàn)出下降的趨勢，lnc-smad3在調(diào)節(jié)性t細胞中的表達水平與所述細胞的成熟狀態(tài)負相關，可用于確定調(diào)節(jié)性t細胞的成熟狀態(tài)，并可進一步用于確定與調(diào)節(jié)性t細胞成熟狀態(tài)相對應的免疫功能。

實施例3：lnc-smad3的定量實時pcr(qrt-pcr)檢測

用小鼠cd4⁺t細胞的cdna為模板，設計引物分別pcr擴增出小鼠lnc-smad3序列；將擴增片段引入pcdh-cmv-mcs-ef1-puroegfp載體中，利用lentivectors表達體系(systembiosciences)構建表達lnc-smad3的慢病毒(lenti-lnc-smad3)。

在初始狀cd4⁺t細胞分化發(fā)育為調(diào)節(jié)性t細胞的過程中，用表達lnc-smad3的慢病毒及其對照載體(lenti-ctr)感染細胞(moi＝100)。第三天收細胞采用trizol(invitrogen公司)提取其中的rna樣品。qrt-pcr使用sybrrt-pcr試劑盒(takara公司，sybrgreenrealtimepcrmastermixcode：qpk-201)，并在lightcycler(roche公司)實時定量pcr儀上進行操作。

lnc-smad3的qrt-pcr檢測用的定量引物為：

5'-aggccaacgatccaggttta-3'(上游，seqidno:2)；

5'-acatgtctggaggcaatgga-3'(下游，seqidno:3)。

反轉錄反應參數(shù)：42℃20分鐘，99℃5分鐘。

qrt-pcr反應參數(shù)：95℃15秒，57℃10秒，68℃2秒讀板，72℃30秒，40循環(huán)。

rna的相對定量使用2-δδct法計算(以gapdh為內(nèi)參)。

gapdhqrt-pcr檢測用的定量引物為：

5'-aggtcggtgtgaacggatttg-3'(上游，seqidno:6)；

5'-tgtagaccatgtagttgaggtca-3'(下游，seqidno:7)。

測試結果如圖3所示。

實施例4：foxp3的定量實時pcr(qrt-pcr)檢測

在初始狀cd4⁺t細胞分化發(fā)育為調(diào)節(jié)性t細胞的過程中，用表達lnc-smad3的慢病毒及其對照載體(lenti-ctr)感染細胞(moi＝100)。第三天收細胞采用trizol(invitrogen公司)提取其中的rna樣品。qrt-pcr使用sybrrt-pcr試劑盒(takara公司，sybrgreenrealtimepcrmastermixcode：qpk-201)，并在lightcycler(roche公司)實時定量pcr儀上進行操作。

foxp3的qrt-pcr檢測用的定量引物為：

5'-cccatccccaggagtcttg-3'(上游，seqidno:8)；

5'-accatgactaggggcactgta-3'(下游，seqidno:9)。

反轉錄反應參數(shù)：42℃20分鐘，99℃5分鐘。

qrt-pcr反應參數(shù)：95℃15秒，57℃10秒，68℃2秒讀板，72℃30秒，40循環(huán)。

rna的相對定量使用2-δδct法計算(以gapdh為內(nèi)參)。

gapdhqrt-pcr檢測用的定量引物為：

5'-aggtcggtgtgaacggatttg-3'(上游，seqidno:6)；

5'-tgtagaccatgtagttgaggtca-3'(下游，seqidno:7)。

測試結果如圖4所示。

實施例5：調(diào)節(jié)性t細胞內(nèi)foxp3的流式檢測

在初始狀cd4⁺t細胞分化發(fā)育為調(diào)節(jié)性t細胞的過程中，用表達lnc-smad3的慢病毒及其對照載體(lenti-ctr)感染細胞(moi＝100)。第三天收細胞，并采用流式細胞術檢測細胞胞內(nèi)foxp3的蛋白水平。

所用細胞流式抗體標記是cytofix/cytoperm試劑盒(ebioscience)，按照其標準操作流程進行。流式細胞檢測用的是facslsrii流式細胞儀，軟件為facsiva(bdbiosciences)。具體步驟可參見本實驗室之前發(fā)表的論文(liu,j.等rhbdd3controlsautoimmunitybysuppressingtheproductionofil-6bydendriticcellsviak27-linkedubiquitinationoftheregulatornemo.natureimmunology.2014；15:612-622.)

實驗結果如圖5所示。結果顯示：過表達lnc-smad3后調(diào)節(jié)性t細胞的關鍵性轉錄因子foxp3的表達有明顯的降低，說明調(diào)節(jié)性t細胞的分化發(fā)育受到阻礙。

實施例6：調(diào)節(jié)性t細胞表面抑制性受體cd25/ctla-4/gitr的流式檢測

在初始狀cd4⁺t細胞分化發(fā)育為調(diào)節(jié)性t細胞的過程中，用表達lnc-smad3的慢病毒及其對照載體(lenti-ctr)感染細胞(moi＝100)。第三天收細胞，并采用流式細胞術檢測細胞表面抑制性受體cd25/ctla-4/gitr的水平。檢測方法同實施例5。

實驗結果如圖6所示。結果顯示：過表達lnc-smad3后調(diào)節(jié)性t細胞的表面抑制性受體cd25/ctla-4/gitr的水平均有明顯的降低，說明調(diào)節(jié)性t細胞的成熟受到阻礙。

實施例7：調(diào)節(jié)性t細胞分泌il-10的功能檢測

在初始狀cd4⁺t細胞分化發(fā)育為調(diào)節(jié)性t細胞的過程中，用表達lnc-smad3的慢病毒及其對照載體(lenti-ctr)感染細胞(moi＝100)。第三天收細胞培養(yǎng)上清，采用elisa(r&d公司)檢測il-10，具體步驟參照elisa試劑盒說明書。

實驗結果如圖7所示。該結果顯示：lnc-smad3過表達后調(diào)節(jié)性t細胞分泌il-10的能力明顯下降。

由于分泌il-10以及表達抑制性受體cd25/ctla-4/gitr是調(diào)節(jié)性t細胞成熟并具有免疫抑制功能的顯著特征，因此上述結果表明lnc-smad3參與抑制調(diào)節(jié)性t細胞的成熟和功能。

實施例8：調(diào)節(jié)性t細胞抑制效應性t細胞增殖功能的檢測

5×10⁴cfse標記后的cd4⁺效應t細胞(來自cd45.1小鼠)與1×10⁴cd11c⁺dc共培養(yǎng)于96孔圓底板中。按照實例3-7處理的調(diào)節(jié)性t細胞以2.5×10⁴的細胞量加入體系中。給予anti-cd3(1μg/ml)刺激3天后，用流式細胞術通過檢測cd45.2⁺的t細胞數(shù)量，來分析t細胞的增殖情況，從而評估體系中調(diào)節(jié)性t細胞所發(fā)揮的抑制作用。

實驗結果如圖8所示。結果顯示：過表達lnc-smad3后調(diào)節(jié)性t細胞抑制效應性t細胞增殖的能力明顯減弱。

綜上所述，實施例3-8中的結果表明，在初始狀cd4⁺t細胞往調(diào)節(jié)性t細胞分化發(fā)育的過程中，lnc-smad3表達的下降是調(diào)節(jié)性t細胞正常分化、成熟和具備功能是必需的。對lnc-smad3進行過表達后能夠實現(xiàn)對調(diào)節(jié)性t細胞成熟和功能的調(diào)控，以及對調(diào)節(jié)性t細胞介導的相關免疫應答的調(diào)控。因此，lnc-smad3可用于免疫相關疾病的診斷、治療和預后評估。

以上已對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實施例進行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實施例，熟悉本領域的技術人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權利要求所限定的范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學

<120>一種新的長鏈非編碼rna即lnc-smad3、其序列、免疫效應及用途

<130>/

<160>9

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1260

<212>dna

<213>小鼠(musmusculus)

<400>1

cggcgcgtgcgcacaggacgggacgggagggcggagcgactgcgcagatcaggaaaattg60

tcacctctggcctcagggaaactgaggctctgagcagttaagaggccaacgatccaggtt120

tatgctatcagtgtctgagatacaattaagtcacctttttgggtgacatttcccttgact180

agtacctcaagattatgatccaggtggaccatccctccattgcctccagacatgtctatg240

acgctacctagggattgtgaagatttaccacctggtggaaaattaaaaaaaaagacttat300

tctgcaaattgaccaagcttaagagatacagcactgagaattcacccactacagagctgg360

taaccaggccttcagagtaagctgtgatgtatagccattctcctcagcagcctgtttgac420

tgagggatataggaatgactgcccttacccatgtttttgttcagatttatggttctaaat480

ctgatggaaaatctatcattggaccatttgattcttcctaaagaaaggccaaaccacctg540

tcaaacccacgagcaacacagcaatggctaagctgaagaagccaagttatatgtctagct600

cctctgtgggtggcaggatccagctgtggggagtccaaggttccttgtgttcttctggct660

tgactatgatatttccaatttggaggcacaaagaattgagaacttggggatccactgagg720

tctgaggcatggtggtaccagaagaaataaaggggccatcagcatgaagctggtctccca780

ttgacagcaccctgacttctccatcaggttctatcagcatgtctactgtgaggttggtga840

cgctgtctgcaggtgggtatgcttcaatcacgccacctggtcaggaaaccatggagtaga900

ggaaaagacacagtcaagggaatgctatgcttatagcaggaggaaatgctctgtgtttta960

gcaagggaacttagactatctcacacctgtcatatcctgggaaactttgggtgagtagtt1020

caacctttggcctccttttccttatttatagaatggaggcataatatctaccttgccaag1080

cttttgtgaagtttgagaaactgagtctatggtatttagcctggtacttggaacatggga1140

gggctcaatgaacagtaagtagtctttattatgatcataattacaaatattacaaatact1200

ttataaaagccatacttagaacaactcattacgttaataaagaatccaaggattgtggtc1260

<210>2

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<212>dna

<213>人工序列

<400>2

aggccaacgatccaggttta20

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<212>dna

<213>人工序列

<400>3

acatgtctggaggcaatgga20

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<212>dna

<213>人工序列

<400>4

tgggcatgttaacaatcggtg21

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列

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tcttcctcctctttgctctgt21

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<212>dna

<213>人工序列

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cccatccccaggagtcttg19

<210>9

<211>21

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<213>人工序列

<400>9

accatgactaggggcactgta21