本發(fā)明屬于基因治療領(lǐng)域，涉及基因靶標(biāo)及其抑制劑的應(yīng)用，具體涉及l(fā)ncrnaccat1及其小分子抑制劑在肝細(xì)胞癌治療方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：肝細(xì)胞癌是全世界最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，每年約有60萬(wàn)患者被診斷出患有肝細(xì)胞癌。目前，對(duì)于肝細(xì)胞癌的治療主要是手術(shù)切除、肝臟移植、放化療等，但僅有20％的患者能夠被治療。我國(guó)肝細(xì)胞癌年死亡率占腫瘤死亡率的第2位。肝細(xì)胞癌的病因及發(fā)病機(jī)制尚未確定，因此，尋找新的肝細(xì)胞癌的治療靶點(diǎn)和藥物是研究重點(diǎn)。非編碼rna是指不編碼蛋白質(zhì)的rna，其中包括rrna、trna、snrna、snorna、mirna及長(zhǎng)鏈非編碼rna(lncrna)。lncrna是一類(lèi)長(zhǎng)度大于200堿基的rna分子，由于缺少有效的開(kāi)放式閱讀框不編碼蛋白，但具備復(fù)雜的生物學(xué)功能并在各種生物過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，如染色質(zhì)修飾、x染色體的失活、參與基因轉(zhuǎn)錄、翻譯以及到蛋白活動(dòng)調(diào)控等，其變異和調(diào)節(jié)能夠?qū)е掳[瘤在內(nèi)的多重疾病。異常表達(dá)的lncrna可通過(guò)不同途徑和不同作用機(jī)制參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移的各個(gè)階段，是腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵因素。近年來(lái)研究表明異常表達(dá)的lncrna通過(guò)多重途徑參與了腫瘤細(xì)胞的凋亡、増殖、侵襲與轉(zhuǎn)移等調(diào)控，與肝癌等腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移具有密切的關(guān)系。其中，lncrnaccat1是最早在結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)的lncrna。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于提供lncrnaccat1及其小分子抑制劑在肝細(xì)胞癌治療方面的應(yīng)用。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明上述目的技術(shù)方案如下：lncrnaccat1作為藥物靶標(biāo)在制備治療肝癌藥物方面的應(yīng)用。lncrnaccat1抑制劑在制備治療肝癌藥物方面的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述抑制劑為具有如下結(jié)構(gòu)通式的吡咯并嘧啶酯類(lèi)小分子化合物：其中，r為烷基。優(yōu)選地，所述抑制劑選自如下結(jié)構(gòu)的化合物：一種藥物組合物，含有上述任一所述的抑制劑。上述藥物組合物在制備治療肝癌藥物方面的應(yīng)用。本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，吡咯并嘧啶酯ⅰ、吡咯并嘧啶酯ⅱ和吡咯并嘧啶酯ⅲ可以顯著抑制肝癌hep3b細(xì)胞中l(wèi)ncrnaccat1的表達(dá)，從而顯著抑制肝癌hep3b細(xì)胞的體外增殖和體內(nèi)成瘤能力。吡咯并嘧啶酯ⅰ、吡咯并嘧啶酯ⅱ和吡咯并嘧啶酯ⅲ及其他lncrnaccat1的抑制劑可以用于開(kāi)發(fā)制備成治療肝癌的藥物。附圖說(shuō)明圖1為各組hep3b細(xì)胞lncrnaccat1相對(duì)表達(dá)水平；圖2為各組hep3b細(xì)胞相對(duì)增殖活力(％)；圖3為各組體內(nèi)抑瘤率(％)；圖4為各組移植瘤lncrnaccat1相對(duì)表達(dá)水平。具體實(shí)施方式下面就結(jié)合實(shí)施例具體介紹本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性?xún)?nèi)容，由于篇幅原因，實(shí)驗(yàn)過(guò)程的描述無(wú)法做到非常詳細(xì)，凡是實(shí)驗(yàn)中未詳細(xì)描述的部分均為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)操作。一、實(shí)驗(yàn)材料人肝癌細(xì)胞系hep3b細(xì)胞為本公司長(zhǎng)期凍存。spf級(jí)4周齡雄性裸鼠購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。吡咯并嘧啶酯ⅰ、ⅱ、ⅲ由本公司合成部按照文獻(xiàn)方法合成，結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁確證。用dmso溶解制成1mg/ml的母液，根據(jù)需要稀釋至不同濃度。胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程和材料研究所，dmem培養(yǎng)基購(gòu)自gibco公司。二、實(shí)驗(yàn)方法1、細(xì)胞培養(yǎng)和分組復(fù)蘇培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞系hep3b細(xì)胞。以含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基(含雙抗)常規(guī)培養(yǎng)于37℃、5％co2和相對(duì)濕度95％的恒溫培養(yǎng)箱中。細(xì)胞經(jīng)過(guò)消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前用臺(tái)盼藍(lán)拒染法確保所用細(xì)胞拒染率在95％以上。給藥組分組和給藥濃度如下：吡咯并嘧啶酯ⅰ組：培養(yǎng)液中含終濃度為5μm、20μm的吡咯并嘧啶酯??；吡咯并嘧啶酯ⅱ組：培養(yǎng)液中含終濃度為5μm、20μm的吡咯并嘧啶酯ⅱ；吡咯并嘧啶酯ⅲ組：培養(yǎng)液中含終濃度為5μm、20μm的吡咯并嘧啶酯ⅲ。2、rna提取和rt-pcr檢測(cè)ccat1相對(duì)表達(dá)水平將hep3b細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后加入6孔板，細(xì)胞密度為2.5×105/ml，細(xì)胞貼壁后，加入吡咯并嘧啶酯5μm、20μm培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞，測(cè)定ccat1相對(duì)表達(dá)水平。另設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組不添加吡咯并嘧啶酯。使用trizol試劑(invitrogen公司)提取總rna。使用primescriptrt試劑盒(takara公司)在標(biāo)準(zhǔn)條件下的隨機(jī)引物，將總rna(500ng)反轉(zhuǎn)錄為10μl的最終體積。ccat1表達(dá)水平的檢測(cè)按照stbrpremixextaq(takara公司)的使用說(shuō)明進(jìn)行。通過(guò)2-δδct方法，根據(jù)內(nèi)參gapdh含量計(jì)算ccat1的相對(duì)表達(dá)水平。lncrnaccat1和gapdh的rt-pcr引物如下：ccat1上游引物：5’-ccaattgaaccgagccttgt-3’；ccat1下游引物：5’-tcgtgagcgttttcgcaatg-3’；gapdh上游引物：5’-tcctctgacttcaacagcgacac-3’；gapdh下游引物：5’-tctctcttcctcttgtgctcttgc-3’。3、吡咯并嘧啶酯體外對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響將hep3b細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后加入96孔板，細(xì)胞密度為1×106/ml，每孔100μl，細(xì)胞貼壁后，加入吡咯并嘧啶酯5μm、20μm培養(yǎng)48h向各孔中分別加入10μlcck-8試劑，振蕩細(xì)胞板后繼續(xù)培養(yǎng)1h，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值a(測(cè)定波長(zhǎng)450nm，參比波長(zhǎng)655nm)，計(jì)算各組增殖抑制率，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。對(duì)照組不添加吡咯并嘧啶酯。增殖抑制率(％)＝(1-a給藥組/a對(duì)照組)×100％。4、吡咯并嘧啶酯體內(nèi)對(duì)肝細(xì)胞癌移植瘤的影響40只裸鼠飼養(yǎng)于spf環(huán)境下，隨機(jī)分為吡咯并嘧啶酯ⅰ組、吡咯并嘧啶酯ⅱ組、吡咯并嘧啶酯ⅲ組和正常對(duì)照組，每組10只。適應(yīng)性馴養(yǎng)1周后，在裸鼠腋窩皮下接種0.1ml的hep3b細(xì)胞懸液(含5×106個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞)。當(dāng)腫瘤體積生長(zhǎng)至100mm3左右(約10d)的時(shí)候開(kāi)始分組腹腔給藥吡咯并嘧啶酯，給藥劑量為10mg/(kg·d)。正常對(duì)照組給與等體積的生理鹽水。連續(xù)給藥14天后，按如下公式計(jì)算抑瘤率(％)。抑瘤率(％)＝(1-負(fù)載外泌體組腫瘤體積/對(duì)照組腫瘤體積)×100％。5、測(cè)定移植瘤中ccat1相對(duì)表達(dá)水平液氮磨腫瘤組織提取rna，取100mg組織加入1mltrizol，提取總rna。使用primescriptrt試劑盒(takara公司)在標(biāo)準(zhǔn)條件下的隨機(jī)引物，將總rna(500ng)反轉(zhuǎn)錄為10μl的最終體積。ccat1表達(dá)水平的檢測(cè)按照stbrpremixextaq(takara公司)的使用說(shuō)明進(jìn)行。通過(guò)2-δδct方法，根據(jù)內(nèi)參gapdh含量計(jì)算ccat1的相對(duì)表達(dá)水平。lncrnaccat1和gapdh的rt-pcr引物如下：ccat1上游引物：5’-ccaattgaaccgagccttgt-3’；ccat1下游引物：5’-tcgtgagcgttttcgcaatg-3’；gapdh上游引物：5’-tcctctgacttcaacagcgacac-3’；gapdh下游引物：5’-tctctcttcctcttgtgctcttgc-3’。6、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用spss16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、吡咯并嘧啶酯對(duì)hep3b細(xì)胞中l(wèi)ncrnaccat1相對(duì)表達(dá)水平的影響與對(duì)照組相比，吡咯并嘧啶酯ⅰ、吡咯并嘧啶酯ⅱ和吡咯并嘧啶酯ⅲ給藥組hep3b細(xì)胞lncrnaccat1相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低(p＜0.05)，且高濃度組(20μm)比低濃度組(5μm)hep3b細(xì)胞lncrnaccat1相對(duì)表達(dá)水平降低更為顯著。表1和圖1為各組hep3b細(xì)胞lncrnaccat1相對(duì)表達(dá)水平比較。表1各組hep3b細(xì)胞lncrnaccat1相對(duì)表達(dá)水平2、吡咯并嘧啶酯體外對(duì)hep3b細(xì)胞增殖能力的影響與對(duì)照組相比，吡咯并嘧啶酯ⅰ、吡咯并嘧啶酯ⅱ和吡咯并嘧啶酯ⅲ給藥組hep3b細(xì)胞的增殖活力顯著降低(p＜0.05)，且高濃度組(20μm)比低濃度組(5μm)hep3b細(xì)胞增殖活力降低更為顯著。表2和圖2為各組hep3b細(xì)胞相對(duì)增殖活力比較。表2各組hep3b細(xì)胞相對(duì)增殖活力(％)3、吡咯并嘧啶酯體內(nèi)對(duì)肝細(xì)胞癌移植瘤的影響與對(duì)照組相比，吡咯并嘧啶酯ⅰ、吡咯并嘧啶酯ⅱ和吡咯并嘧啶酯ⅲ給藥組移植瘤體積明顯較小(p＜0.05)，吡咯并嘧啶酯ⅰ、吡咯并嘧啶酯ⅱ和吡咯并嘧啶酯ⅲ顯示出明顯的體內(nèi)抑瘤作用。表3和圖3為各組體內(nèi)抑瘤率(％)。表3各組體內(nèi)抑瘤率(％)吡咯并嘧啶酯ⅰ組吡咯并嘧啶酯ⅱ組吡咯并嘧啶酯ⅲ組抑瘤率(％)5257554、吡咯并嘧啶酯對(duì)移植瘤lncrnaccat1相對(duì)表達(dá)水平的影響與對(duì)照組相比，吡咯并嘧啶酯ⅰ、吡咯并嘧啶酯ⅱ和吡咯并嘧啶酯ⅲ給藥組移植瘤lncrnaccat1相對(duì)表達(dá)水平顯著降低(p＜0.05)。表4和圖4為各組移植瘤lncrnaccat1相對(duì)表達(dá)水平比較。表4各組移植瘤lncrnaccat1相對(duì)表達(dá)水平組別ccat1/gapdh吡咯并嘧啶酯ⅰ組0.56吡咯并嘧啶酯ⅱ組0.49吡咯并嘧啶酯ⅲ組0.61對(duì)照組1.15上述實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，吡咯并嘧啶酯ⅰ、吡咯并嘧啶酯ⅱ和吡咯并嘧啶酯?？梢燥@著抑制肝癌hep3b細(xì)胞中l(wèi)ncrnaccat1的表達(dá)，從而顯著抑制肝癌hep3b細(xì)胞的體外增殖和體內(nèi)成瘤能力。吡咯并嘧啶酯ⅰ、吡咯并嘧啶酯ⅱ和吡咯并嘧啶酯ⅲ及其他lncrnaccat1的抑制劑可以用于開(kāi)發(fā)制備成治療肝癌的藥物。上述實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明實(shí)質(zhì)性?xún)?nèi)容的體現(xiàn)，用于更好地解釋本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知曉，不應(yīng)將本發(fā)明的保護(hù)范圍局限于上述具體的實(shí)施例。當(dāng)前第1頁(yè)12