本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及fkbp5基因的突變。
背景技術(shù)：
：paget骨病是一種局限性骨組織異常重構(gòu)的慢性代謝性骨病，主要累及年齡長于55歲的老年人(1)。paget骨病的流行特點具有顯著的地域差異性，在英國、澳大利亞及北美等一些地區(qū)具有較高發(fā)病率，是僅次于骨質(zhì)疏松的第二大骨病，然而在非洲、亞洲地區(qū)卻極為少見(2)。paget骨病病因仍不清楚，普遍認(rèn)為遺傳因素在其發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。paget骨病易感基因主要包括：sqstm1、tnfrsf11a、tnfrsf11b、optn、vcp、csf1以及dcstamp等(3-6)。其中，sqstm1基因突變被認(rèn)為是paget骨病的致病基因突變，迄今為止已發(fā)現(xiàn)28個不同的sqstm1突變存在于約1/3的pdb家系和9％的散發(fā)型pdb患者中(7)。破骨細(xì)胞功能異常是paget骨病最主要的病理改變?；颊卟∽儾课黄乒羌?xì)胞數(shù)目增多、體積增大、細(xì)胞核數(shù)量增多(8)。患者外周血來源的單核細(xì)胞對破骨細(xì)胞誘導(dǎo)因子rankl及1,25-(oh)2維生素d3敏感性增加，說明paget骨病患者體內(nèi)破骨細(xì)胞分化及功能異常(9)。破骨細(xì)胞由骨髓內(nèi)單核/巨噬細(xì)胞經(jīng)由rankl因子誘導(dǎo)分化而來，其分化過程中主要活化的信號通路包括nf-κb、akt信號通路(10)。因此，異常的nf-κb、akt信號通路調(diào)控可能參與paget骨病發(fā)生。fkbp5基因位于第6號染色體上，包括12個外顯子，基因全長154999bp。fkbp5蛋白(fk506結(jié)合蛋白51，fkbp5)是一種具有多種生物學(xué)功能的免疫親和素，屬于fkbp家族中的大分子免疫親和素，該家族因為能夠與免疫抑制劑fk506結(jié)合而得名。fkbp5蛋白共有三個結(jié)構(gòu)域，包括n-末端的fk1、fk2(fkbp12樣結(jié)構(gòu)域，fk)結(jié)構(gòu)域以及c-末端的tpr(tetratricopeptiderepeat)結(jié)構(gòu)域。其中，fk1結(jié)構(gòu)能夠與fk506等免疫抑制劑結(jié)合，并且具有肽輔酰胺異構(gòu)酶活性(ppiase)。fk2結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)與fk1類似，但是不具備免疫抑制藥物結(jié)合能力以及ppiase活性。位于c-末端的trp結(jié)構(gòu)能夠與hsp90蛋白結(jié)合，與之構(gòu)成類固醇激素受體復(fù)合物的重要伴侶分子，調(diào)控類固醇激素受體活性。fkbp5蛋白生物學(xué)功能復(fù)雜多樣，其在類固醇激素受體調(diào)節(jié)、壓力相關(guān)精神疾病發(fā)生、癌癥發(fā)生與放化療敏感性、自噬等生理及病理過程中均發(fā)揮重要作用。信號通路調(diào)控方面，fkbp5作為ikkα重要的伴侶分子，參與iκb磷酸化及降解過程，從而增加nf-κb信號通路活性(11)；在akt信號通路中，fkbp5作為橋聯(lián)蛋白參與akt與phlpp(ph域和富亮氨酸重復(fù)蛋白磷酸酶)之間的相互作用，促進(jìn)phlpp對aktser473位點的去磷酸化作用，從而降低akt磷酸化水平(12)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本申請發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，fkbp5基因的突變與paget骨病的發(fā)病相關(guān)?；诖搜芯?，本申請的目的是提供一種新的與paget骨病相關(guān)的基因突變，以用于檢測paget骨病。在第一個方面，本發(fā)明提供核酸片段，所述核酸片段包含對應(yīng)于seqidno.1的第163位的核苷酸，且包含seqidno.1所示的核苷酸序列中的至少10個連續(xù)核苷酸，其中第163位的核苷酸是c；或者所述核酸片段包含對應(yīng)于seqidno.2的第479位的核苷酸，且包含seqidno.2所示的核苷酸序列中的至少10個連續(xù)核苷酸，其中第479位的核苷酸是c；或者所述核酸片段包含對應(yīng)于seqidno.3的第1001位的核苷酸，且包含seqidno.3所示的核苷酸序列中的至少10個連續(xù)核苷酸，其中第1001位的核苷酸是c；或者所述核酸片段為上述核酸片段的反向互補序列。優(yōu)選地，所述核酸片段的長度可以是10-100、101-200、201-500或501-1000個核苷酸。優(yōu)選地，所述核酸片段的長度是10-20、21-30、31-40、41-50、51-60、61-100或101-300個核苷酸。所述突變位點可以位于所述核酸片段的任何位置。優(yōu)選地，所述核酸片段是seqidno.1所示的序列。優(yōu)選地，所述核酸片段是seqidno.2所示的序列。優(yōu)選地，所述核酸片段是seqidno.3所示的序列。優(yōu)選地，所述核酸片段可以是seqidno.7或8所示的序列。本發(fā)明的第二個方面是提供用于檢測和/或分析本發(fā)明的單堿基突變的引物或試劑盒，所述引物能夠擴增單堿基突變，所述單堿基對應(yīng)于seqidno.1的第163位或seqidno.2的第479位或seqidno.3的第1001位；所述試劑盒包含所述引物。優(yōu)選地，所述引物序列如seqidno.5和seqidno.6所示；所述試劑盒包含序列為seqidno.5和seqidno.6的引物。本發(fā)明的第三個方面是提供本發(fā)明的核酸片段在制備檢測fkbp5基因突變的制劑中的應(yīng)用；或者本發(fā)明的核酸片段用作檢測fkbp5基因突變的檢驗標(biāo)志物的應(yīng)用。本發(fā)明的第四個方面是提供fkbp5蛋白或其片段或變異體，所述蛋白序列為seqidno.4所示的序列；所述片段或變異體包含對應(yīng)于seqidno.4的第55位的亮氨酸，并且包含seqidno.4所示的氨基酸序列的至少10個連續(xù)氨基酸，如10-20、21-50或51-100個氨基酸。本發(fā)明的第五個方面是提供分析核酸的方法，所述方法包括分析待測樣品中的包含對應(yīng)于seqidno.1的序列的核酸中對應(yīng)于第163位的核苷酸或分析待測樣品中的包含對應(yīng)于seqidno.2的序列的核酸中對應(yīng)于第479位的核苷酸或分析待測樣品中的包含對應(yīng)于seqidno.3的序列的核酸中對應(yīng)于第1001位的核苷酸。在一種實施方式中，所述方法可以是限制性片段長度多態(tài)性分析(rflp)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本
發(fā)明內(nèi)容設(shè)計實驗以分析對應(yīng)于seqidno.1的序列的核酸中的第163位的核苷酸或?qū)?yīng)于seqidno.2的序列的核酸中的第479位的核苷酸是否為c或?qū)?yīng)于seqidno.3的序列的核酸中的第1001位的核苷酸是否為c。在另一種實施方式中，所述方法可以是測序法，包括分離并測定來自基因組dna或rna的核酸序列，分析其中包含對應(yīng)于seqidno.1的序列的核酸中的對應(yīng)于第163位的核苷酸或包含對應(yīng)于seqidno.2的序列的核酸中的對應(yīng)于第479位的核苷酸或包含對應(yīng)于seqidno.3的序列的核酸中的對應(yīng)于第1001位的核苷酸是否為c。測序法可以是本領(lǐng)域已知的任何可用的測序方法。測序引物可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的常識進(jìn)行設(shè)計，如在待檢測位點的上下游適當(dāng)位置處設(shè)計引物，以擴展包含該待測位點的片段，從而判斷該位點的核苷酸。也可以采用本發(fā)明的寡核苷酸作為引物序列。在另一種實施方式中，所述方法是利用探針雜交的方法，特異性地鑒定檢測樣品中包含對應(yīng)于seqidno.1的序列的核酸中的對應(yīng)于第163位的核苷酸或包含對應(yīng)于seqidno.2的序列的核酸中對應(yīng)于第479位的核苷酸或包含對應(yīng)于seqidno.3的序列的核酸中對應(yīng)于第1001位的核苷酸是否為c；所述方法中采用的探針是本發(fā)明的寡核苷酸。例如，從待測樣品中分離出核酸，在允許探針與核酸中可能存在的特異性靶序列雜交的條件下使探針與核酸接觸；可被檢測的雜交可以通過使用由可檢測的試劑標(biāo)記過的探針來實現(xiàn)；例如，用放射性同位素、熒光染料或能催化形成可檢測產(chǎn)物的酶來標(biāo)記探針。標(biāo)記探針、用標(biāo)記探針檢測樣品中是否存在靶序列的方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。本發(fā)明中，所述樣品可以是任何包含核酸的樣品，如血液；優(yōu)選所述樣品來自于人。所述核酸可以是dna或rna，優(yōu)選為基因組dna。本發(fā)明的分析核酸的方法可以以dna或rna為目標(biāo)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可知，當(dāng)以dna為檢測目標(biāo)物時，分析待測樣品中的包含對應(yīng)于seqidno.3的序列的核酸中對應(yīng)于第1001位的核苷酸，所使用的探針或引物根據(jù)seqidno.3的序列設(shè)計；當(dāng)以rna為檢測目標(biāo)物時，分析待測樣品中的包含對應(yīng)于seqidno.2的序列的核酸中對應(yīng)于第479位的核苷酸，所使用的探針或引物根據(jù)seqidno.2的序列設(shè)計。本發(fā)明提供了包含新的單堿基突變的fkbp5基因和其編碼序列，該基因在對應(yīng)于seqidno.1的第163位核苷酸由g突變?yōu)閏(163g>c)，從而引起其編碼的氨基酸由纈氨酸突變?yōu)榱涟彼?，即對?yīng)于seqidno.4的第55位的亮氨酸。該突變的fkbp5蛋白增高了aktser473磷酸化水平，增加了破骨細(xì)胞能力，導(dǎo)致paget骨病的形成。由于paget骨病為遲發(fā)病，通常累及年齡長于55歲者，因而本發(fā)明為paget骨病的提前診斷提供了新的標(biāo)志物，具有很強的臨床指導(dǎo)意義。附圖說明圖1：家族聚集性paget骨病病例家系圖；其中圓代表女性，方框代表男性；圖2：fkbp5基因突變位點測序圖；a：顯示野生型fkbp5基因cdna第160-168位堿基序列。b：顯示突變型fkbp5基因cdna第160-168位堿基序列，圖中箭頭所示為突變位點堿基，測序峰圖顯示該突變?yōu)殡s合子突變；圖3：fkbp5真核表達(dá)載體圖譜；圖4：轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的hek293細(xì)胞的相對熒光素酶活性；圖5：nf-κb核轉(zhuǎn)位水平檢測結(jié)果；圖6：aktser473位點磷酸化水平檢測；其中，a所示為hek293細(xì)胞轉(zhuǎn)染野生型與突變型fkbp5后，與轉(zhuǎn)染空載體的對照組相比fkbp5蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯增高，證明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，fkbp5過表達(dá)；b為各組akt磷酸化檢測wb顯影條帶圖；c為wb條帶灰度值paktser473與總akt比值，顯示aktser473位點磷酸化程度。野生組低于突變組與對照組，突變組與對照組之間無顯著差異；圖7：fkbp5v55l敲入小鼠打靶及構(gòu)建策略簡圖；圖8：小鼠破骨細(xì)胞trap染色圖；圖9：小鼠破骨細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計圖；圖10：陷窩吸收實驗結(jié)果圖；其中，a：顯示野生組與突變組小鼠破骨細(xì)胞在牛骨切片上形成的吸收陷窩，圖中藍(lán)染部分即為破骨細(xì)胞骨吸收陷窩；b：兩組細(xì)胞形成的陷窩在低倍鏡(40×)視野下拍照，圖片中吸收陷窩面積使用imageproplus軟件進(jìn)行計算；所得每組每視野下平均吸收面積作圖，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析；圖11：小鼠股骨micro-ct檢測骨參數(shù)分析結(jié)果；圖12：小鼠股骨micro-ct檢測2d平面圖；圖13：小鼠股骨遠(yuǎn)端micro-ct檢測3d重構(gòu)圖；圖14：小鼠測序鑒定序列圖，其中，與其cdna序列第163位點相對應(yīng)的位置：野生鼠測序峰圖顯示堿基為g，雜合鼠為g/c雙峰重疊，而純合突變鼠峰圖為堿基c；圖15：瓊脂糖凝膠鑒定小鼠基因型結(jié)果圖。具體實施方式下面結(jié)合具體實施方式說明本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容不限于此。在以下實施例中，如無特別說明，所使用的試劑的儀器都是本領(lǐng)域常規(guī)試劑和儀器，可以從商購?fù)緩将@得；所使用的方法為本領(lǐng)域常規(guī)方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述和實驗?zāi)康模梢院翢o疑問地知道如何進(jìn)行所述實驗并實現(xiàn)實驗?zāi)康?。如無其它說明，本發(fā)明的“核酸片段”由核苷酸或其類似物組成，可以是dna、rna或其類似物的片段；可以是單鏈或雙鏈；可以是天然的(如基因組的)或合成的。本發(fā)明中，“突變”指在檢測的基因，即fkbp5基因中存在與野生型fkbp5基因序列不同的核苷酸位點?！巴蛔兾稽c”指堿基發(fā)生突變的位置。在本發(fā)明中，所述突變位點是對應(yīng)于seqidno.1所示序列的第163位或seqidno.2所示序列中的第479位或seqidno.3所示序列中的第1001位。本
發(fā)明內(nèi)容涉及fkbp5基因的非同義突變。由于該突變位點位于基因的編碼序列中，因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可知，所述突變位點既可以在基因組dna中表現(xiàn)，也可以在編碼序列(即cds)中表現(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)待檢測樣品，可以在基因組dna或mrna水平上對該突變位點進(jìn)行檢測。本申請中，seqidno.1是具有上述突變的fkbp5的cds序列，其中第163位涉及該突變(g>c)；seqidno.2是具有所述突變位點的fkbp5的mrna序列，其中第479位是本發(fā)明涉及的突變位點；seqidno.3是具有所述突變位點的fkbp5基因所在的基因組的部分序列，其中第1001位是本發(fā)明涉及的突變位點。本領(lǐng)域技術(shù)人員可知，在本文中，對應(yīng)于seqidno.1的第163位位點、對應(yīng)于seqidno.2的第479位位點和對應(yīng)于seqidno.3的第1001位位點同義互用。本發(fā)明中，核苷酸和氨基酸的縮寫采用本領(lǐng)域公知的縮寫方式。本發(fā)明的內(nèi)容是基于fkbp5基因的新的單堿基突變位點。所述突變位點是位于fkbp5基因的編碼區(qū)內(nèi)，對應(yīng)于seqidno.1的第163位，該位點由野生型的g突變?yōu)閏；由該突變的fkbp5基因編碼的蛋白的第55位由纈氨酸突變?yōu)榱涟彼?v55l)。實施例1：人fkbp5基因突變位點的獲得從濟南市第三人民醫(yī)院得一例中國漢族人群家族聚集性paget骨病病例，家系圖譜見圖1，家族成員均知情同意本研究。家系中共有3位患者，分別為ⅱ3、ⅱ6、ⅱ11。根據(jù)患者骨骼系統(tǒng)影像學(xué)檢查結(jié)果、血清學(xué)檢查結(jié)果、臨床癥狀及體征可以明確診斷為paget骨病。抽取患者及其他家系成員的外周血全血，使用qiagen全血小量dna提取試劑盒提取基因組dna，進(jìn)行基因突變檢測分析。1、paget骨病易感基因測序分析針對已知的paget易感基因，包括sqstm1、tnfrsf11a、tnfrsf11b、optn、vcp、csf1以及dcstamp，設(shè)計引物，使用sanger測序分析所有家系成員中這些基因的外顯子區(qū)域，并與已鑒定的與paget骨病相關(guān)的snp進(jìn)行比較。這些基因的測序引物見后面。sanger測序分析結(jié)果顯示，全部檢測到的snp位點中均無位于外顯子的非同義突變，排除這些snp致病的可能，該家系不存在已知的paget骨病易感基因突變，這提示可能存在新的基因突變參與paget骨病發(fā)生。檢測到的snp位點見表1。表1：家系中檢測到的paget骨病易感基因snp位點注：snp定位于外顯子；snp定位于5’-utr；§:snp定位于剪切位點。2、外顯子組測序分析選取全部三位患者(ⅱ3、ⅱ6、ⅱ11)及患者的正常兄妹(ⅱ4、ⅱ8)的dna為樣本，進(jìn)行外顯子組測序分析。外顯子組測序由北京博萊明創(chuàng)公司完成。該公司所使用的外顯子富集試劑盒為美國agilenttechnologies公司的agilentsure-selecthumanallexonkit，測序平臺為illuminahiseq2000測序平臺。外顯子組測序所檢測到的所有單核苷酸變異(snv)，按照下列條件篩選候選paget骨病致病基因突變：a)不存在于已知的snp數(shù)據(jù)庫中，即non-dbsnp；b)存在于所有三位患者基因組dna當(dāng)中；c)不存在于正常對照的基因組dna當(dāng)中；d)存在于基因外顯子序列中的非同義單核苷酸突變。根據(jù)上述篩選條件所得單核苷酸突變，進(jìn)一步在exomeaggregationconsortium(exac)數(shù)據(jù)庫中檢索，并使用polyphen-2預(yù)測突變功能。排除已知的以及功能預(yù)測結(jié)果為良性的突變。snp注釋結(jié)果顯示：5例測序樣本共得到245982個單核苷酸變異(snv)，其中，不存在于已知的snp數(shù)據(jù)庫中的snv(non-dbsnpsnv)共有82676個，同時存在于三位患者當(dāng)中且不存在于兩位對照當(dāng)中的non-dbsnpsnv，共有193個。最終，排除所有同義突變以及基因編碼區(qū)之外的non-dbsnpsnv，共得到5個位于不同基因的non-dbsnpsnv與疾病共分離，包括fkbp5(c.163g>c)、acbd4(c.4g>t)、myo7b(c.772a>t)、akna(c.4196a>g)、ccl4l1(c.197g>c)，見表2。表2：家系中與疾病共分離的五個基因突變在exac數(shù)據(jù)庫中檢索上述5個基因突變，其中三個突變存在于該數(shù)據(jù)庫中，包括：acbd4(c.4g>t)、myo7b(c.772a>t)及ccl4l1(c.197g>c)。fkbp5(c.163g>c)及akna(c.4196a>g)未見報道。ployphen-2預(yù)測結(jié)果顯示：fkbp5(c.163g>c)基因突變極有可能影響蛋白功能(probablydamaging：0.992)；而akna(c.4196a>g)基因突變則極有可能為良性突變，不影響蛋白功能(benign：0.080)。fkbp5基因位于6p21.31，位于一個pdb易感位點(pdb1)內(nèi)，發(fā)現(xiàn)的163g>c突變位于fkbp5基因第4外顯子內(nèi)。其編碼的fkbp5蛋白屬于免疫親和素家族的一員，生物學(xué)功能與破骨細(xì)胞分化發(fā)育緊密相關(guān)。fkbp5參與多種生物學(xué)過程，包括調(diào)節(jié)類固醇激素受體活化，促進(jìn)微管系統(tǒng)穩(wěn)定，促進(jìn)nf-κb信號通路活化，抑制akt磷酸化等。其中，nf-κb以及akt信號通路均參與調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化發(fā)育。破骨細(xì)胞異?；罨莗db重要的病理改變，因此fkbp5突變可能為pdb發(fā)病的致病基因突變。實施例2：fkbp5基因突變驗證為在家系中驗證該基因突變以及確認(rèn)該突變是否為漢族人群中未經(jīng)報道過的snp位點，對所有家系成員以及200例正常對照的fkbp5基因第4外顯子包含突變位點的基因序列進(jìn)行測序分析。1、含突變位點163g>c的片段pcr以所有家系成員以及200名正常對照的基因組dna為模板，擴增包含有fkbp5c.163g>c基因突變位點的基因片段。擴增引物片段為：上游5’-attaaaccaatgaacaggat-3’(seqidno.5)；下游5’-cacaactcaaaaaaataccc-3’(seqidno.6)；產(chǎn)物長度：446bp。pcr擴增體系如下：takaraextaqhs(5u/μl)0.1μl10×extaq緩沖液2μldntp混合物(每種2.5mm)2μldna100ng引物(上下游引物混合物，各10μm，)2μlddh2o補充到20μl充分混勻后，按照以下pcr循環(huán)條件，擴增目的片段：反應(yīng)結(jié)束后，將pcr產(chǎn)物取出，4℃冰箱保存，準(zhǔn)備純化。2、pcr產(chǎn)物純化1)向96孔pcr反應(yīng)板內(nèi)的20μlpcr產(chǎn)物中依次加入5μl5mnacl溶液以及25μl22％peg8000，封膜，充分混勻后瞬時離心，4℃靜置大于30min；2)設(shè)置低溫高速離心機，在4℃條件下，以2900×g離心力離心96孔pcr反應(yīng)板內(nèi)的混合物30分鐘；3)棄掉板內(nèi)上清液，將96孔板倒置，以小于180×g的離心力瞬時離心96孔板，去除板內(nèi)殘余液體；4)向板孔內(nèi)加入80μl70％乙醇溶液，封膜；5)在4℃條件下，以2900×g離心力離心96孔板15min；6)棄掉上清，以小于180×g離心力扣板離心，棄掉板內(nèi)殘留液體；7)重復(fù)步驟4-6，再次洗滌沉淀；8)96孔板室溫干燥15min，放置在4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?、純化產(chǎn)物測序pcr將純化的pcr產(chǎn)物取出，每孔加入5μl雙蒸水溶解dna，作為測序pcr模板。測序pcr所用試劑盒是terminatorv3.1cycle測序試劑盒，反應(yīng)體系如下：5×測序緩沖液1.16μlbigdye0.25μl測序引物(seqidno.5)(50μm)0.0625μldna模板1.5μlddh2o2.8275μl測序pcr反應(yīng)條件：4、測序pcr產(chǎn)物純化1)向測序pcr產(chǎn)物中依次加入7.5μl125μmedta溶液、7.5μl3mnaac溶液以及50μl無水乙醇，充分混勻后室溫靜置15分鐘；2)設(shè)置低溫高速離心機，4℃條件下，以2900×g離心力離心30分鐘；3)棄掉板內(nèi)上清，以小于180×g離心力扣板離心，去除板內(nèi)殘留液體；4)每孔加入80μl70％乙醇，封膜；5)4℃條件下，以2900×g離心力離心15分鐘；6)棄掉上清，以小于180×g離心力扣板離心，去掉殘留液體；7)重復(fù)步驟4-6，再洗滌dna沉淀一次；8)96孔板揭膜，在室溫放置15分鐘，干燥板內(nèi)dna；9)每孔加入7μl甲酰胺，震板混勻，封膜；瞬時離心后，將板放入9700pcr儀，95℃變性5分鐘，4℃放置大于2分鐘；將板取出，準(zhǔn)備測序。5、測序分析將準(zhǔn)備好的測序dna產(chǎn)物放入abiprism310型全自動dna測序儀，進(jìn)行測序。測序結(jié)果通過sequencher5.0軟件比對。通過對家系成員以及200例正常對照進(jìn)行fkbp5c.163g>c基因突變驗證，證實三位患者均為c.163g>c雜合子突變，并且發(fā)現(xiàn)家系中有5位患者的后代(ⅲ3、ⅲ13、ⅲ15、ⅲ17、ⅳ2)攜帶有該基因突變，其基因型全部為gc雜合子(圖2)。200例正常對照人群中并未檢出該基因突變。實施例3：fkbp5基因突變對nf-κb、akt信號通路影響1、構(gòu)建表達(dá)野生型及突變型fkbp5蛋白的真核表達(dá)載體pcdna3.1載體購自invitrogen(carlsbad,ca,usa)公司。通過設(shè)計引物，在fkbp5基因cds序列的5’端引入bamhi酶切位點，3’端引入ecori酶切位點。引物序列如下：上游5’-ggatccatgactactgatgaaggtg-3’；下游5’-gaattctcatacgtggccctcaggtt-3’。使用該引物，以野生型或突變型fkbp5基因cds序列為模板擴增目的片段。使用通用型dna純化回收試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)，回收并純化pcr產(chǎn)物。純化的pcr產(chǎn)物連接至pmd18-t(takara,tokyo,japan)連接載體上，經(jīng)轉(zhuǎn)化、涂板篩選、菌落pcr鑒定連接有野生型或突變型fkbp5基因cds序列的陽性克隆。擴增陽性pmd18-t載體并測序，序列正確的質(zhì)粒使用bamhi和ecori(fermentas,thermofisherscientific,waltham,ma,usa)限制性內(nèi)切酶酶切，并回收包含有野生型或突變型fkbp5基因cds序列的酶切產(chǎn)物。將所得酶切產(chǎn)物與事先使用bamhi和ecori限制性內(nèi)切酶酶切為線性的pcdna3.1載體進(jìn)行連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、涂板篩選、菌落pcr鑒定成功連接野生型或突變型fkbp5基因cds序列的pcdna3.1載體的陽性菌落。擴增陽性菌，提取質(zhì)粒，即為實驗所需能夠表達(dá)野生型或突變型fkbp5蛋白的真核表達(dá)載體。真核表達(dá)載體的圖譜如圖3所示。2、熒光素酶報告基因檢測將野生型pcdna3.1-fkbp5質(zhì)粒、突變型pcdna3.1-fkbp5質(zhì)粒、pcdna3.1質(zhì)粒(空載體對照，購自invitrogen)分別與pgl4.32[luc2p/nf-κb-re/hygro]質(zhì)粒(購自promega(madison,wi,usa))和prl-tk質(zhì)粒(購自promega(madison,wi,usa))共轉(zhuǎn)染到hek293細(xì)胞(購自美國atcc細(xì)胞庫(manassas,va,usa))內(nèi)，獲得野生型組、突變型組和空載體對照組細(xì)胞，通過檢測各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的熒光素酶活性(luciferaseassay)反應(yīng)nf-κb的轉(zhuǎn)錄啟動活性。hek293細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及熒光素酶報告基因檢測方法：將hek293細(xì)胞密度調(diào)整至2×105細(xì)胞/ml，接種到96孔全白酶標(biāo)板中，每孔100μl細(xì)胞懸液，共接種9孔。野生型組(pcdna3.1-fkbp5(v55))、突變型組(pcdna3.1-fkbp5(l55))以及對照組(pcdna3.1)各設(shè)置3個復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)24小時后棄掉板內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加opti-mem轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基75μl。將質(zhì)粒以及l(fā)ipofectamine2000(invitrogen,carlsbad,ca,usa)轉(zhuǎn)染試劑按照以下稀釋比稀釋(每孔用量)：將稀釋后的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫孵育10min后加入相應(yīng)的孔內(nèi)，放入孵箱培養(yǎng)4小時。轉(zhuǎn)染4小時后換液，用dmem完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24小時。轉(zhuǎn)染24小時后，向96孔板內(nèi)加入tnf-α因子活化hek293細(xì)胞，終濃度20ng/ml?；罨?小時候，裂解細(xì)胞并檢測胞內(nèi)熒光強度。使用dual-glo熒光素酶分析系統(tǒng)試劑盒檢測熒光素酶活性，該試劑盒購自promega(madison,wi,usa)。簡要操作步驟如下：將熒光素酶緩沖液全部加入到熒光素酶底物中，顛倒混勻，配制成熒光素酶試劑。計算stop&glo試劑用量，并將終止試劑和glo試劑以1:100稀釋比稀釋配制所需stop&glo試劑。每孔加入75μl熒光素酶試劑，室溫孵育10min。使用enspiretm多模式板閱讀儀讀取并記錄螢火蟲熒光強度。繼續(xù)向每孔中加入stop&glo試劑75μl，混勻后室溫孵育10min。使用enspiretm多模式板閱讀儀讀取并記錄海腎熒光強度。將所測螢火蟲熒光值與海腎熒光值相比較，即為每一實驗組的相對熒光素酶活性，反應(yīng)各組nf-κb轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄啟動活性。熒光素酶活性分析顯示，野生型組、突變型組及空載體對照組hek293細(xì)胞的相對熒光素酶活性分別為：野生型組10.52±0.83，突變型組11.20±0.78，空載體對照組8.79±0.67。其中野生組與突變組之間相對熒光素酶活性無統(tǒng)計學(xué)差異，p＝0.3624；野生組與突變組相對熒光素酶活性均高于對照組(野生組vs對照組：10.52±0.83vs8.79±0.67，p＝0.0479；突變組vs對照組：11.20±0.78vs8.79±0.67，p＝0.0152；圖5)。說明轉(zhuǎn)染fkbp5后，nf-κb轉(zhuǎn)錄啟動活性增高。但是，v55l突變不影響fkbp5蛋白對nf-κb轉(zhuǎn)錄啟動活性的調(diào)控作用。3、nf-κb核轉(zhuǎn)位檢測將野生型pcdna3.1-fkbp5質(zhì)粒、突變型pcdna3.1-fkbp5質(zhì)粒、pcdna3.1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到hek293細(xì)胞內(nèi)，通過蛋白免疫印跡實驗檢測各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活化前后胞核與胞質(zhì)蛋白中p65的量以及胞質(zhì)蛋白中iκb的量，反應(yīng)nf-κb核轉(zhuǎn)位水平。結(jié)果如圖5所示。圖中所示對照組為不加刺激的對照組，tnf-α組為實驗組。cyt代表胞漿蛋白樣品，nuc代表胞核蛋白樣品，h3指組氨酸-h3。由圖可見，胞漿內(nèi)iκb在細(xì)胞活化后降解。同時，經(jīng)tnf-α活化后，可見p65在胞質(zhì)蛋白內(nèi)總量下降，在胞核蛋白內(nèi)總量上升，說明p65蛋白由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到了胞核。三組之間iκb降解程度以及p65核轉(zhuǎn)位水平無明顯差異，說明fkbp5對nf-κb核轉(zhuǎn)位水平并無明顯調(diào)控作用，同時fkbp5v55l突變不影響fkbp5對nf-κb核轉(zhuǎn)位的調(diào)控作用?？梢钥闯?，經(jīng)tnf-α活化后，野生型組與突變型組hek293細(xì)胞中，p65核轉(zhuǎn)位水平及iκb降解水平無明顯差異(圖5)，說明該突變不影響nf-κb核轉(zhuǎn)位水平。4、aktser473磷酸化水平檢測將野生型pcdna3.1-fkbp5質(zhì)粒、突變型pcdna3.1-fkbp5質(zhì)粒、pcdna3.1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到hek293細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞血清饑餓24小時，使用脂多糖(lps)刺激活化。提取活化后細(xì)胞的總蛋白，經(jīng)蛋白免疫印跡實驗檢測細(xì)胞內(nèi)aktser473位點磷酸化水平，研究野生型及突變型fkbp5對akt磷酸化的調(diào)節(jié)作用有無差異。結(jié)果顯示，野生型組或突變型組hek293細(xì)胞，其fkbp5表達(dá)水平明顯上升，證明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，目的蛋白質(zhì)fkbp5過表達(dá)(圖6.a)。野生型組hek293細(xì)胞在經(jīng)過lps活化后，其aktser473位點磷酸化水平低于空載體對照組，p＝0.0412，說明fkbp5過表達(dá)后降低aktser473位點磷酸化水平；野生型組與突變型組相比，野生型組aktser473位點磷酸化水平低于突變型組，p＝0.0075，證實v55l突變體fkbp5蛋白增高aktser473位點磷酸化(圖6.b、c)。實施例4：fkbp5基因突變對小鼠破骨細(xì)胞影響及表型研究1、fkbp5c.163g>c點突變c57bl/6小鼠構(gòu)建及鑒定點突變小鼠構(gòu)建策略：a.es打靶載體設(shè)計和構(gòu)建。由賽業(yè)生物科技有限公司構(gòu)建含有引入了c.163g>c點突變的同源臂序列、loxp位點以及新霉素篩選標(biāo)簽(neocassette)的es打靶載體。b.打靶載體電轉(zhuǎn)es細(xì)胞、篩選陽性克隆。將構(gòu)建好的打靶載體電轉(zhuǎn)至c57bl/6es細(xì)胞(賽業(yè)生物科技有限公司)內(nèi)，利用新霉素抗性篩選陽性細(xì)胞并通過pcr擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳、sanger測序以及southernblot等鑒定陽性電轉(zhuǎn)克隆。c.es顯微注射。將陽性es細(xì)胞顯微注射到囊胚中，然后將顯微注射后的囊胚回送到代孕鼠(c57bl/6小鼠，來源于賽業(yè)生物科技有限公司，鼠齡9-10周)輸卵管或者子宮中，最終獲得嵌合體小鼠。d.f1代小鼠繁殖。將得到的嵌合體小鼠和cre小鼠(來自賽業(yè)生物科技有限公司，鼠齡8-9周)進(jìn)行交配繁殖，并進(jìn)行基因型鑒定，其中帶有目的基因點突變且已成功敲除新霉素抗性的f1代雜合子小鼠即為實驗所需fkbp5v55l點突變雜合子小鼠。小鼠打靶及構(gòu)建策略見圖7所示。對f1代雜合子小鼠后代進(jìn)行分析。小鼠基因型鑒定：通過sanger測序和pcr產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定小鼠基因型。sanger測序法引物序列：上游：5’-cctcgaggcatgcgataatctagct-3’下游：5’-ggcaaatggcttctttctgtcatg-3’測序方法同前文所述人fkbp5基因測序方法。測序鑒定的圖譜如圖14所示。pcr產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳法引物序列：上游：5’-tgtgtacctttgcctgctcatga-3’下游：5’-ccagagcaaggcaaaaggatcact-3’如圖15所示，使用該引物擴增的pcr產(chǎn)物，不同基因型小鼠所得產(chǎn)物長度不同。野生鼠：195bp；雜合鼠：195bp、320bp；純合鼠：320bp。因此，根據(jù)pcr產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可以判定小鼠基因型。如圖所示，第13/14/19泳道樣本來自野生小鼠，第2/3/5/6/7/8/9/12/17/18/20/22泳道樣本來自雜合小鼠，而第4/10/11/15/16/21泳道樣本來自純合突變鼠。根據(jù)多重鑒定結(jié)果，獲得雜合鼠和純合鼠，對這些小鼠進(jìn)行后續(xù)試驗。2、小鼠破骨細(xì)胞分化及功能研究分離培養(yǎng)fkbp5v55l小鼠及同窩fkbp5wt野生鼠骨髓來源的單核/巨噬細(xì)胞系細(xì)胞(bonemarrow-derivedmonocyte/macrophagecells,bmm)：脫頸處死7-8周大小實驗小鼠，游離其股骨和脛骨。剪去股骨和脛骨兩端軟骨，露出骨髓腔。使用2ml無菌注射器將骨髓細(xì)胞吹至一個15ml離心管內(nèi)，離心收集骨髓細(xì)胞。向骨髓細(xì)胞沉淀中加入1mlα-mem(invitrogen)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并加入3倍體積紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞。離心，收集細(xì)胞。使用α-mem完全培養(yǎng)基(含10％fbs)將細(xì)胞密度調(diào)整為1×107/10ml并接種到100mm平皿內(nèi)，每皿接種10ml細(xì)胞懸液。培養(yǎng)基中加入終濃度為5ng/ml的m-csf因子，接種好的細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12-16小時后，收集平皿內(nèi)未貼壁的懸浮細(xì)胞。收集得到的懸浮細(xì)胞用α-mem完全培養(yǎng)基重新懸起并計數(shù)，按照1.5×105個/孔的細(xì)胞密度接種到48孔板內(nèi)，每孔接種體積為0.25ml。培養(yǎng)基中加入終濃度為30ng/ml的m-csf因子，繼續(xù)培養(yǎng)3d。換液，棄掉懸浮細(xì)胞，所得貼壁細(xì)胞即為小鼠骨髓來源單核/巨噬細(xì)胞(bmm)。小鼠bmm誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化及trap染色鑒定：48孔板中單核/巨噬細(xì)胞繼續(xù)加m-csf及rankl因子誘導(dǎo)分化。每孔加入含有m-csf(30ng/ml)以及不同濃度的rankl(0、30ng/ml、70ng/ml、150ng/ml)因子的α-mem完全培養(yǎng)基250μl，培養(yǎng)6-7天。使用抗酒石酸酸性磷酸酶染色試劑盒(貨號：387a，sigma-aldrich,st.louis,mo,usa)進(jìn)行trap染色。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒所附說明書進(jìn)行。破骨細(xì)胞鑒定方法：胞核≥3個，trap染色陽性的多核巨細(xì)胞為破骨細(xì)胞。trap染色結(jié)果顯示，當(dāng)rankl誘導(dǎo)濃度較低(30ng/ml)，野生鼠和純合突變鼠骨髓來源單核巨噬細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的數(shù)量較少，且兩組之間無顯著差異(野生組vs突變組：17.0±4.2vs33.5±14.8；p＝0.3468)；而當(dāng)rankl誘導(dǎo)濃度增高(70ng/ml、150ng/ml)后，兩組破骨細(xì)胞數(shù)目均明顯上升，且突變組所形成的破骨細(xì)胞數(shù)目顯著多于野生組(70ng/ml，野生組vs突變組：42.7±7.6vs72.2±13.2；p＝0.0284；150ng/ml，野生組vs突變組：55.7±22.1vs130.3±23.5；p＝0.0162)。trap染色結(jié)果圖及破骨細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計分別見圖8、9。陷窩吸收實驗：牛骨切片購自貴州醫(yī)科大學(xué)，規(guī)格為50μm厚、60*40mm大小正方形骨片。牛骨切片保存于含有100iu雙抗的pbs緩沖液中，4℃保存。切片在使用前需用超聲清洗三次。取實驗所需的牛骨切片，置于pbs緩沖液中，100hz/min頻率超聲三次，每次5分鐘。超聲清洗后的切片用75％酒精沖洗一遍，然后浸泡在75％酒精內(nèi)大于2小時。將切片取出，置于48孔板內(nèi)，開蓋照紫外滅菌，切片每一面照紫外1小時。種板前，將滅菌后的骨片置于48孔板內(nèi)，加入α-mem培養(yǎng)基，放到37℃培養(yǎng)箱內(nèi)2小時，飽和切片。分離培養(yǎng)fkbp5v55l小鼠及同窩fkbp5wt野生鼠bmm，并接種在牛骨切片上。加入含有rankl(100ng/ml)、m-csf(50ng/ml)的α-mem完全培養(yǎng)基，誘導(dǎo)細(xì)胞分化。每隔兩天換液，培養(yǎng)6-7天后進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色。染色步驟如下：將骨片置于2.5％戊二醛固定液固定7min，然后用0.25m氨水溶液超聲清洗骨片，超聲頻率100hz/min，每次5min，共清洗3次。清洗后的切片經(jīng)系列乙醇脫水(70％乙醇，5min；75％乙醇，5min；80％乙醇，5min；90％乙醇，5min；95％乙醇，5min；100％乙醇，5min；100％乙醇，10min)，自然晾干。1％甲苯胺藍(lán)染液室溫染色3－4min，蒸餾水清洗后光鏡下觀察骨片陷窩吸收情況并拍照。使用imageproplus軟件，計算陷窩吸收面積。統(tǒng)計10倍物鏡下每視野內(nèi)陷窩吸收面積。如圖10所示，牛骨切片骨陷窩形成實驗證實，每低倍鏡視野下(40×)突變鼠破骨細(xì)胞形成的吸收陷窩面積大于野生鼠破骨細(xì)胞形成的陷窩面積(野生組vs突變組：4.73±1.02vs8.29±0.66；p＝0.0071；圖10)。說明在體外實驗中，fkbp5v55l點突變小鼠破骨細(xì)胞骨吸收活性高于野生組。3、小鼠表型研究取10個月大fkbp5v55l小鼠及同窩fkbp5wt野生鼠股骨及脛骨并固定。固定后的標(biāo)本使用西門子inveonmicro-ct檢測儀掃描。掃描結(jié)果使用儀器自帶inveonacquisitionworkplace和inveonresearchworkplace平臺進(jìn)行成像及骨吸收參數(shù)分析。小鼠股骨micro-ct檢測骨小梁參數(shù)分析結(jié)果顯示，突變組小鼠股骨骨小梁吸收模式增強。分析參數(shù)包括：相對骨體積(bonevolum/totalvolum,bv/tv)、骨小梁數(shù)量(trabecularnumber,tb.n)、骨小梁厚度(trabecularthinckness,tb.th)、骨小梁分離度(trabecularspacing,tb.sp)、骨小梁模式因子(trabecularbonepatternfactor,tbpf)。其中突變組小鼠bv/tv、tb.n以及tb.th減少(野生鼠vs突變鼠：bv/tv：0.1401±0.0277vs0.08±0.0219,p＝0.0037；tb.n：3.4393±0.5322vs2.2073±0.3871，單位1/mm，p＝0.0020；tb.th：0.0406±0.0024vs0.0361±0.0036，單位mm，p＝0.0359)，同時tb.sp和tbpf增加(野生鼠vs突變鼠：tb.sp：0.2561±0.0479vs0.4279±0.0815，單位mm，p＝0.0018；tbpf：20.60±1.50vs25.50±2.61，單位1/mm，p＝0.0035)，見圖11。說明突變組小鼠股骨骨小梁吸收模式增強，該結(jié)果與破骨細(xì)胞體外分化及吸收能力檢測結(jié)果相符。然而，突變組與野生組小鼠之間股骨皮質(zhì)厚度無顯著差異，見圖11。股骨2d平面圖顯示，與野生小鼠相比較，突變小鼠的骨小梁較細(xì)、骨小梁之間空隙較多，與上述參數(shù)分析結(jié)果相呼應(yīng)(圖12)。股骨皮質(zhì)內(nèi)側(cè)未見明顯的吸收陷窩。股骨遠(yuǎn)端與脛骨連接處3d重構(gòu)圖顯示，部分突變小鼠股骨遠(yuǎn)端外側(cè)骨皮質(zhì)出現(xiàn)疑似吸收陷窩(箭頭所示)，野生組小鼠未見(圖13)。以上結(jié)果再次反映fkbp5突變小鼠骨吸收模式增強，fkbp5突變小鼠出現(xiàn)疑似paget樣表型。結(jié)論：paget骨病是一種以局部骨組織異常增生為特點的慢性骨代謝性疾病。其主要的病理改變?yōu)槠乒羌?xì)胞異常，包括病變部位破骨細(xì)胞數(shù)量增多，破骨細(xì)胞體積增大，細(xì)胞核數(shù)量增多，患者外周血單核細(xì)胞破骨細(xì)胞分化能力增強等。paget骨病致病原因包括遺傳因素和環(huán)境因素，其中遺傳致病因素在paget骨病發(fā)生中具有重要的作用。本發(fā)明中，通過對一個漢族paget骨病家系進(jìn)行基因分析，確認(rèn)了一個新的位于fkbp5基因的點突變(c.163g>c)與paget骨病發(fā)病相關(guān)。通過測序分析，明確了該突變?yōu)樾掳l(fā)現(xiàn)的單核苷酸突變，而不是單核苷酸多態(tài)性。同時突變功能預(yù)測分析顯示該突變極有可能影響fkbp5蛋白的功能。細(xì)胞實驗證實該突變顯著影響fkbp5對akt信號通路的調(diào)控作用，增加akt第473位絲氨酸磷酸化水平。動物實驗證實fkbp5v55l突變能夠增加小鼠bmm體外破骨細(xì)胞分化能力以及破骨細(xì)胞骨吸收能力。同時fkbp5v55l突變增加小鼠體內(nèi)破骨細(xì)胞活性，使之小梁骨吸收模式增加，并呈現(xiàn)paget樣骨病表型。綜上，本發(fā)明有力地證實了fkbp5v55l突變通過增加破骨細(xì)胞分化及骨吸收能力，參與paget骨病發(fā)病。因此，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的fkbp5基因突變稱為檢測paget骨病的一個新的標(biāo)志，為疾病的提前診斷和治療提供依據(jù)。附：sqstm1、tnfrsf11a、tnfrsf11b、optn、vcp、csf1以及dcstamp基因外顯子序列pcr擴增及測序用引物序列見下列表格。sqstm1引物：外顯子引物序列(5’-3’)外顯子11-fgcaatgaagagaggggtcag1-rttggtcaccactccagtcac外顯子22-fgagcactcaccttccaggag2-rcaaattgctgaccccttcat外顯子3-43-4-faaacagacacagggactgggaac3-4-rcctgacaaccatcacaaaagagaac外顯子55-fgatgtccgggttaaaggtca5-rggcaacaaatcctcaccagt外顯子66-fgtagtctccacaggccaagc6-ratgcacacgtgcagttaagg外顯子77-fttaaagtcacgctgggaacc7-rccttctgtttgtgtcgctga外顯子88-ftacagggaaagcaggtccac8-rctgccctaaatggcttcttgtnfrsf11a引物：外顯子引物序列(5’-3’)外顯子11-fgcggagaccggaccaagga1-ragtttccctccgcttgccct外顯子22-facctagttttatccagaaagag2-rgagtgacagacattaccacctg外顯子33-fgggtgcaatttttgttgctg3-racagaggccttggggatctaa外顯子44-fgaagtgcgaggaggaacttg4-rtgaagaacctaagccgagga外顯子55-fggttccataactcactgctggggtc5-rgaagttcctgtcacacatagggctg外顯子66-fgattcaaatgtccaagaaggcg6-racattattagttacccccaatccag外顯子77-fggtggggactgtcacttctgcta7-rgcttacaagtcatccgtttcctg外顯子88-fgggactgtagttaatcatgttg8-rtcaatatgtgactaggatggc外顯子99-faaagttccatagtcagttttccatc9-ragcttcctccttcctaaatggt外顯子1010-faaccttcctctcggcagaccct10-rggattgcttgagcccaggagttatnfrsf11b引物：外顯子引物序列(5’-3’)外顯子11-ftttttttcccctgctctcccag1-rccgggcacccgtcggctggcccagg外顯子22-fccactgtgttcctttctcctt2-rgctgcacattgacacgtacc外顯子33-fgttaagagggcatctgctgg3-ratgatactacaaaatcgtac外顯子44-fatccaattgttgagtaaatc4-raactaaacatacatgcagtct外顯子55-fgatgtgaacacttatctggg5-raataatgtcatttatatagtoptn引物：vcp引物：csf1引物：dcstamp引物：外顯子引物序列(5’-3’)外顯子11-ftcatttcaacagctctcttcatctt1-rtcttttctcttttgccctcactc外顯子22-fagaggttgattcatggtgatgtg2-ragggagactgtcggggtataggg外顯子33-fttttgtagtcagtctaccaccat3-rgataaaccatgagaagtacctgt外顯子44-faaagaagggatagagtaaaaaaa4-ratcagcattcaaatcacagagtt外顯子55-fgaagaccaacataacccacaaaa5-rgagcagggagaaaagagaccatt參考文獻(xiàn)：1.tiegs,r.d.(1997)paget'sdiseaseofbone:indicationsfortreatmentandg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acctgaagcttagagaatacaccaaagctgttgaatgctgtgacaaggcccttggactggacagtgccaatgagaaaggcttgtataggaggggtgaagcccagctgctcatgaacgagtttgagtcagccaagggtgactttgagaaagtgctggaagtaaacccccagaataaggctgcaagactgcagatctccatgtgccagaaaaaggccaaggagcacaacgagcgggaccgcaggatatacgccaacatgttcaagaagtttgcagagcaggatgccaaggaagaggccaataaagcaatgggcaagaagacttcagaaggggtcactaatgaaaaaggaacagacagtcaagcaatggaagaagagaaacctgagggccacgtatgacgccacgccaaggagggaagagtcccagtgaactcggcccctcctcaatgggctttcccccaactcaggacagaacagtgtttaatgtaaagtttgttatagtctatgtgattctggaagcaaatggcaaaaccagtagcttcccaaaaacagcccccctgctgctgcccggagggttcactgaggggtggcacgggaccactccaggtggaacaaacagaaatgactgtggtgtggagggagtgagccagcagcttaagtccagctcatttcagtttctatcaaccttcaagtatccaattcagggtccctggagatcatcctaacaatgtggggctgttaggttttacctttgaactttcatagcactgcagaaacctttaaaaaaaaaatgcttcatgaatttctcctttcctacagttgggtagggtaggggaaggaggataagcttttgttttttaaatgactgaagtgctataaatgtagtctgttgcatttttaaccaacagaacccacagtagaggggtctcatgtctccccagttccacagcagtgtcacagacgtgaaagccagaacctcagaggccacttgcttgctgacttagcctcctcccaaagtccccctcctcagccagcctccttgtgagagtggctttctaccacacacagcctgtccctgggggagtaattctgtcattcctaaaacacccttcagcaatgataatgagcagatgagagtttctggattagcttttcctattttcgatgaagttctgagatactgaaatgtgaaaagagcaatcagaattgtgctttttctcccctcctctattccttttagggaataatattcaatacacagtacttcctcccagcattgctactgctcagcttcttctttcattctaatccttgctattaagaatttaagacttgtgcttacaatatttttgacctggagtggatctatttacatagtcatttaggatccatgcagctttttttgtctttttaagattattggctcataagcatatgtatactggtttatggaactttatttacactcctctatcatgcaaaaaaattttgactttttagtactaagcttaatttttaaaaacaaaatctgtagggttgacaaataaatagttgctcttctacactaggggtttcacctgcaggtttgacacgcagttgctcgcttttcctgccctgtcaagcttctctgttctggcgtgagttgtgaaagagttgaagacagcttcccatgccggtacacagccagtagcctaaatctccagtacttgagctgaccattgaactagggcaagtcttaaatgtgtacatgtagttgaatttcagtccttacgggtaaacagattgagcatggctctctattccctcagcctaagaaacactcatgggaatgcatttggcaacccaaggaaccatttgcttaaacctggaacatctcacctttttaaatcctaaaaaacactggcagttatattttaaattagtttttatttttatgatggttttatcaaaagacttttattattagattgggacccccttcaaacctaaaaatcaagttatttccttttataatacttttcttccccatggaacaaatgggatcaatttgtgagttttttcctttaatgataactaaaatccctctaatttctcatttatgcttttgtcttttttatgaaatatttcttttaaaagccccagtctcacctacgaaatatgaagagcaaaagctgattttgcttacttgctaaactgttgggaaagctctgtagagcatggttccagtgaggccaagattgaaatttgatactaaaaaggccacctagctttttgcagataacaaacaagaaagctattccaagactcagatgatgccagctgtctcccacgtgtgtattatggttcaccagggggaactggcaaaagtgtgtgtggggaggggaagggtgtgtgagtggttctgagcaaataactacagggtgcccattaccactcaagaagacacttcacgtattcttgtatcaaattcaataatcttaaacaatttgtgtagaagtccacagacatctttcaaccaccttttaggctgcatatggattgccaagtcagcatatgaggaattaaagacattgtttttaaaaaaaaaaaatcatttagatgcacttttttgtgtgttctttaaataaatccaaaaaaaatgtgacttccaaaaaaaaaaaseqidno:3：(基因組序列)aaaataaatacactggattttacagtagttaaatactttactagaaaacaagttattcagtatcatatcaagcagtgcaatgatactcatgttttttacagatagactatgtttcaaataataggaaatgtaacctgttttaccaggaaattgggctttctgaaaataaacaagcagaatctagtcaggagctaatgtttttagcaaaggagggaaataaaattacacctttgaagctttgcttaagcttctttttgaatattttaaaagtccaccattctttctggtctaagtccgtgtgtatatggactagctcacaagcctgtgttagagagtttagtgtcgggcgcggtggctcatgcttgtaatcccagcactttgggaggctgaggcgggtggatcacgaggtcaggagttcgagaccagcctggccaacatggtgaaaccccatctctactaaaaatacaaaaattagctgagcacggaggcgcacgcctgtaatcccagctactcgggaggctgaggcaggagaattgcttcaacctgggaggcagaggttgcagtgagccgagatcgtgccattgcactccagcctgggcgacagggcaagactccgtctcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagagtttactgtcaaaatatagggcattaaaccaatgaacaggatttattggttaattctttgaaggaataaatagtgcgattagcaataaaagtagatataacataaaagacaagttggtaaaggacagttttctaacaatgagttattgtgaggaatgaagggaggcattagaaagaatggataatagtatatttgcatatctgcctggatgtcttgggatggactgtgtgacctttttattctctgattacaagtaaaaagtttgacctcctttttcttaatgtttgtcttttctagattgtcaaaagagtggggaatggtgaggaaacgccgatgattggagacaaagtttatctccattacaaaggaaaattgtcaaatggaaagaagtttgattccagtcatgatagaaatgaaccatttgtctttagtcttggcaaaggtaagagggtatttttttgagttgtgttttacttagctttattactatttgtaatatataggagcagaggattctatcctttctaaaagtaaagaaattttagagtagtagtactcaaagaatggtctgagaatccctagggctctctgagatctttttagggggtcccaaatgtcatttattttcataacaatactaagatattatttgccattttactgtattgacatttatttgcactgatggtacaaaagctgcagttgtaaaaaaactgctggttccttaacacaaatcaaggcagtggtaaccagctgttccagtagtcatggtattttccactgccactccttcactatttacataagggaaaaagctagtttcacgtaaaaatgtcctgataaagcagtaaaaattattagttttattgaaacccaatctttgagtttcacatcactttgatattctgtgacagaaagggaagcacgtgtagagcacttctgtcccccaaagtatgatggttgtctcaaggaaaagtacttgtgctcttgttttagttgagatctgaactaactgcatttatttcatgagataccatttttacttgaaagggcaaatctgattatgcagacttgattcagtatttggcaggtgtttttctgagaatgaatggagtaagtctgtcacttcaaggaaaaacaactgacaatgttttttgccattaagttttcaagtaaaaattatagtttaggagaactcctatttgccactgtgggcttatttgccactgtgggcttgacagcttccgaagacttttctgatgagattggtgggtattaatgaatgtggttttaaatatacaatgaaatgtgtccacatttggaagatctgtataactaagaatgaatattttctcseqidno.4mttdegaknneesptatvaeqgeditskkdrgvlkivkrvgngeetpmigdkvylhykgklsngkkfdsshdrnepfvfslgkgqvikawdigvatmkkgeichllckpeyaygsagslpkipsnatlffeielldfkgedlfedggiirrtkrkgegysnpnegatveihlegrcggrmfdcrdvaftvgegedhdipigidkalekmqreeqcilylgprygfgeagkpkfgiepnaeliyevtlksfekakeswemdtkekleqaaivkekgtvyfkggkymqaviqygkivswlemeyglsekeskasesfllaaflnlamcylklreytkaveccdkalgldsanekglyrrgeaqllmnefesakgdfekvlevnpqnkaarlqismcqkkakehnerdrriyanmfkkfaeqdakeeankamgkktsegvtnekgtdsqameeekpeghvseqidno.7attgtcaaaagagtggggaatggtgaggaaacgccgatgattggagacaaagtttatctccattacaaaggaaaattgtcaaatggaaagaagtttgattccagtcatgatagaaatgaaccatttgtctttagtcttggcaaaseqidno.8attaaaccaatgaacaggatttattggttaattctttgaaggaataaatagtgcgattagcaataaaagtagatataacataaaagacaagttggtaaaggacagttttctaacaatgagttattgtgaggaatgaagggaggcattagaaagaatggataatagtatatttgcatatctgcctggatgtcttgggatggactgtgtgacctttttattctctgattacaagtaaaaagtttgacctcctttttcttaatgtttgtcttttctagattgtcaaaagagtggggaatggtgaggaaacgccgatgattggagacaaagtttatctccattacaaaggaaaattgtcaaatggaaagaagtttgattccagtcatgatagaaatgaaccatttgtctttagtcttggcaaaggtaagagggtatttttttgagttgtg當(dāng)前第1頁12