本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明公開了一種用于檢測肺部曲霉菌感染——煙曲霉菌的熒光定量pcr試劑盒。

背景技術(shù)：

真菌屬于真核生物，廣泛分布于自然界，絕大多數(shù)對人類有利，少數(shù)可感染人類導致嚴重疾病。近35年來，隨著實體器官及造血干細胞移植(hematopoieticstemcelltransplantation，hsct)等技術(shù)的廣泛開展、廣譜抗生素和免疫抑制劑的大量應用、導管介入及留置技術(shù)的廣泛開展及人類免疫缺陷病毒(hiv)在全球的持續(xù)蔓延，侵襲性真菌感染(invasivefungalinfection，ifi)的發(fā)病率及死亡率在全球范圍內(nèi)急劇上升，嚴重威脅人類健康。流行病學研究顯示，以白假絲酵母菌為主的酵母樣真菌與以煙曲霉為主的絲狀真菌是ifi最常見的致病真菌；器官移植受者真菌感染的發(fā)病率為20％-40％，獲得性免疫缺陷綜合征(aids)患者并發(fā)真菌感染的可能性高達90％；在中國ifi已成為院內(nèi)感染第2位的重要組成。

臨床上ifl起病隱匿、預后兇險，診斷主要依賴于實驗室真菌學檢查；早期、正確的診斷對治療結(jié)果及預后非常重要；在免疫缺陷患者中，曲霉菌感染的發(fā)病率高達50％，其中煙曲酶感染占曲霉菌感染的近80％。曲霉菌感染，特別是侵襲性曲霉病預后很差，由于該病臨床表現(xiàn)無特異性，致使診斷較為困難，約30％的病例是在尸檢時才能確診的。而漏診率高的主要原因是目前的ifi，尤其是煙曲霉等絲狀真菌的實驗室診斷水平遠不能滿足臨床需求。而早期診斷曲霉菌感染是提高患者生存和改善患者預后的關(guān)鍵，因此，如何改善ifi的實驗室診斷技術(shù)水平是當前國內(nèi)外真菌病研究領(lǐng)域的熱點和迫切需要解決的問題。發(fā)展早期快速診斷曲霉菌感染的新方法已經(jīng)刻不容緩。

目前，臨床上常規(guī)檢查法主要有鏡檢、培養(yǎng)、組織病理學診斷、影像學檢查以及血清學檢查等。但是，這些方法都存在一定的缺陷和局限性：鏡檢和培養(yǎng)是真菌常規(guī)檢查的基本方法，但陽性率低，耗時長；組織病理學檢查是為侵 入性操作，不宜取材，病人也較痛苦，而且需要免疫組化方法來進一步驗證；影像學檢查雖然較方便，但是缺乏特異性；血清學檢查雖然快速簡便，但其敏感性、特異性以及假陽性在早期診斷、病情監(jiān)測方面仍然有很大缺陷，而且還無法鑒定曲霉菌的種類。

因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種能夠準確定量和定性檢測曲霉菌——煙曲霉菌的方法。本發(fā)明擬借助熒光定量pcr技術(shù)，通過構(gòu)造特異性熒光探針，建立一種檢測并鑒定煙曲霉菌的熒光定量pcr診斷試劑盒，并且具有同樣高的敏感性和特異性，本檢測試劑盒適合于檢測病人痰液的侵襲性煙曲霉感染，可用于臨床對侵襲性煙曲霉感染的輔助評價，抗真菌藥物的療效觀察及預后，并利于侵襲性煙曲霉菌的早期診斷和針對性治療。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)存各種曲霉菌檢測技術(shù)的缺陷和局限性，本發(fā)明提供了一種適用于煙曲霉菌taqman熒光定量pcr檢測試劑盒。

本發(fā)明的第一方面，提供了一種煙曲霉菌pcr檢測試劑盒，所述的試劑盒包括：

如seqidno.:1(正向ctcgagcgtatggggctt)和seqidno.:2(反向gaaggrgccagctttcaaat)所示的煙曲霉菌引物對。

且所述的試劑盒還包括：如seqidno.:3(cgccagccgacacccaactttatttttcta)所示的煙曲霉菌特異性檢測探針。

在另一優(yōu)選例中，所述的特異性檢測探針上的一端標記有熒光發(fā)生基團，另一端標記有熒光淬滅基團。

在另一優(yōu)選例中，所述的特異性檢測探針的5’端標記fam熒光基團，且檢測探針的3’端標記tamara熒光淬滅基團。

在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括陽性對照組；優(yōu)選地，所述的陽性對照質(zhì)粒為含有如seqidno:4所示的陽性對照序列的質(zhì)粒(gcgtccggtcctcgagcgtatggggctttgtcacctgctctgtangcccggccggcgccagccgacacccaactttatttttctaangttgacctcggatcangtagggatacccgctgaacttaagcatatcaataagcggaggaaaagaaaccaacagggattgcctcagtaacggcgagtgaagcggcaagagctcaaatttg aaagctggccccttcggggtccgcgttgtaattt)。

在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括陰性對照試劑；優(yōu)選地，所述的陰性對照組為空白pcr擴增體系。

在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有試劑a，且所述的試劑a為樣本液化試劑，用于液化生物樣本。

在另一優(yōu)選例中，所述的試劑a選自下組：naoh水溶液(優(yōu)選為1mnaoh水溶液)、saccomannno液(每50ml固定液中含有50％乙醇48ml，2％聚乙二醇1ml，0.3％利福平1ml；0.005％二硫蘇糖醇dtt液等體積混合)、n-乙酸-l-半胱氨酸(優(yōu)選為0.5％n-乙酸-l-半胱氨酸)、枸櫞酸鈉溶液(優(yōu)選為1.45％枸櫞酸鈉溶液)、氫氧化鈉溶液(優(yōu)選為2％氫氧化鈉溶液)，或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有試劑b，且所述的試劑b為洗滌試劑，用于洗滌液化后的生物樣品中的沉淀。

在另一優(yōu)選例中，所述的試劑b為1xtris-edtabuffer——三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(tris-hcl)和乙二胺四乙酸(edta)緩沖洗液。

在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有試劑c，且所述的試劑c為曲霉消化酶(市場購得，例如蝸牛酶snailase(華藍化學公司))。

在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還含有dna抽提，且所述抽提dna試劑盒為市場夠得，例如qiaampdnaminikit(qiagen公司)。

在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還含有任選的pcr檢測相關(guān)試劑，如mastermix、蒸餾水等。

在另一優(yōu)選例中，所述的pcr檢測相關(guān)試劑為taqmangemmmastermix。

在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中包括第一容器，且所述的第一容器中包含液相的反應體系，所述的反應體系包括特異性引物對，且所述的特異性引物的濃度為2.5-8um/ul，優(yōu)選為3-5um/ul。

在另一優(yōu)選例中，所述的第一容器中還包括特異性檢測探針，且所述的特異性檢測探針的濃度為0.5-5um/ul，優(yōu)選為1-2um/ul。

在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還含有任選的選自下組的試劑：mastermix、蒸餾水，或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒是肺部煙曲霉菌感染檢測試劑盒。

本發(fā)明的第二方面，提供了一種煙曲霉菌檢測方法，所述的方法包括步驟：在反應體系中進行擴增，所述的反應體系中含有擴增煙曲霉菌的特異性引物對，所 述引物對包括：

正向引物：序列如seqidno:1所示；和

反向引物：序列如seqidno:2所示。

在另一優(yōu)選例中，所述的pcr擴增反應條件如下：95℃10分鐘；95℃15秒，60℃60秒。

在另一優(yōu)選例中，所述的pcr擴增反應進行40個循環(huán)。

在另一優(yōu)選例中，在所述擴增步驟之前，還包括步驟：對待測樣本進行處理，從而提取樣本中的核酸模板。

在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括步驟：用如seqidno.:3所示的煙曲霉菌特異性檢測探針檢測擴增產(chǎn)物。

在另一優(yōu)選例中，所述的pcr信號收集如下：第二階段60℃時，收集fam信號。

在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括：用rox作為參比熒光。

在另一優(yōu)選例中，所述的特異性檢測探針的5’端標記fam熒光發(fā)光基團，檢測探針的3’端標記tamara熒光淬滅基團。

在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括：在樣品檢測的同時，之前或之后，進行陽性對照實驗和陰性對照實驗。

在另一優(yōu)選例中，所述的方法包括以下步驟：

(a)提供一煙曲霉菌dna模板；

(b)配制pcr反應體系，所述的pcr反應體系含有seqidno:1和seqidno:2所示的引物對和如seqidno:3所示的探針序列；

(c)進行pcr擴增反應；

(d)測試體系的熒光值，從而判斷樣本中煙曲霉菌的拷貝數(shù)和/或判斷樣本內(nèi)是否存在煙曲霉菌。

在另一優(yōu)選例中，所述的組織樣本包括痰液和肺泡灌洗液。

在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括步驟：在檢測之前，對所述的組織樣本進行處理，得到組織樣本中煙曲霉菌的dna模板。

在另一優(yōu)選例中，所述的處理包括步驟：

1)對組織樣本進行液化；

2)對液化的組織樣本進行洗滌，得到洗滌后的沉淀；

3)對所述沉淀進行消化(優(yōu)選地，使用煙曲霉菌特異性消化酶)，從而裂解霉 菌；

4)對所述的樣本進行dna抽提，從而得到煙曲霉菌的dna模板。

在另一優(yōu)選例中，所述的檢測方法是非診斷且非治療性的。

在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括：按照以下質(zhì)控標準，判斷檢測結(jié)果為陽性或陰性：

(1)陰性對照的ct值等于40；

(2)陽性對照的ct值小于等于35，且熒光信號存在對數(shù)增長曲線；

(3)當(1)和(2)條件滿足時，被檢樣品ct值小于35并有對數(shù)增長曲線，則判斷被檢樣品為陽性結(jié)果；

(4)被檢樣品ct值等于35時，有對數(shù)增長曲線，則判斷被檢樣品為陽性結(jié)果；若無對數(shù)增長曲線，則判斷被檢樣品為陰性結(jié)果；

(5)被檢樣品ct值大于35時，如無對數(shù)增長曲線則為陰性；如有較好的對數(shù)增長曲線，則增加樣本量并重新進行二次擴增和檢測，若二次檢測結(jié)果同前，則判斷被檢樣品為陽性結(jié)果；否則，判斷被檢樣品為陰性結(jié)果。

在另一優(yōu)選例中，所述的ct值是通過以下定量標準值確定的：

ct值為33-36≈10-100個菌/ml

ct值為30-32≈100-1000個菌/ml

ct值為27-29≈1000-10000個菌/ml

ct值為24-26≈10000-100000個菌/ml

ct值為21-23≈100000-1000000個菌/ml。

在另一優(yōu)選例中，檢測結(jié)果的ct值是通過以下方法確定：

在另一優(yōu)選例中，所述的樣本包括組織樣本、體液樣本。

本發(fā)明的第二方面，提供了一種擴增曲霉菌的特異性引物對，其特征在于，所述引物對包括：

正向引物：序列如seqidno:1所示；和

反向引物：序列如seqidno:2所示。

在另一優(yōu)選例中，所述的霉菌選自下組：煙曲霉菌，或黃曲霉菌。

本發(fā)明的第三方面，提供了一種擴增煙曲霉菌的引物探針組合，所述的引物對包括：

正向引物：序列如seqidno:1所示；和

反向引物：序列如seqidno:2所示；

且所述的探針包括：序列如seqidno.:3所示的煙曲霉菌特異性檢測探針。

應理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1為試劑盒檢測樣品的pcr擴增曲線，圖中橫坐標pcr循環(huán)數(shù)cycles，縱坐標為擴增反應的熒光值fluorescence(drn)。圖1a為熒光定量pcr檢測的煙曲霉(紅色或深綠色(灰度下))和曲霉菌陽性對照(綠色或淺綠色(灰度下))基因擴增曲線。1b為痰液樣本和陽性對照的熒光定量pcr檢測的煙曲霉樣本(紅色)、煙曲霉陽性對照(深紅色)和煙曲霉陰性對照(藍色)的基因擴增曲線。

圖2為黃曲霉菌的pcr擴增曲線，圖中橫坐標pcr循環(huán)數(shù)cycles，縱坐標為擴增反應的熒光值fluorescence(drn)。熒光定量pcr檢測的黃曲霉樣本(綠色)或黃曲霉陽性對照(藍色))以及陰性對照(紅色)的基因擴增曲線。

具體實施方式

本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，通過篩選了大批量痰液樣本，篩選出一對能夠高效擴增檢測煙曲霉菌的引物對，此外，本發(fā)明人還通過進一步對煙曲霉菌探針進行了設(shè)計和篩選，并獲得了seqidno.:3所示的熒光探針，其與本發(fā)明引物對的組合能夠有效、準確地測定煙曲霉菌，且靈敏度和特異性極高，與臨床培養(yǎng)樣本吻合且高于臨床培養(yǎng)的靈敏度，能夠作為臨床上檢測煙曲霉菌的有效補充甚至是替代方法。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。

煙曲霉菌

曲霉菌以腐物寄生的形式廣泛存在于自然環(huán)境中，易在空氣、水、腐爛植物、低矮潮濕環(huán)境、寢具和一些食物中存在，為條件致病菌，可分為18個群、132個種和18個變種。引起人類感染的約20多種，以煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉等常見，煙曲霉為最常見，約占80％～90％。近年來，煙曲霉已成為臨床上僅次于白色念珠菌的一種重要的條件致病真菌，其某些成分或毒素可直接造成機體損害，或降低機體防御能力而有利于曲霉感染或擴散，致侵襲性 曲霉病(ia)，嚴重可危及生命。

近年來多項流行病學研究表明，侵襲性真菌感染(ifi)在免疫力低下患者中患病率及死亡率呈逐年上升趨勢。侵襲性真菌感染的早期診斷在臨床上十分重要，可降低患者相關(guān)死亡率，減少相關(guān)醫(yī)療費用。據(jù)文獻報道，平均每人每天經(jīng)呼吸道吸入數(shù)百個煙曲霉孢子，但絕大多數(shù)免疫力正常的人不會被感染。然而，對于臨床上免疫缺陷的個體，由于機體的免疫防護功能弱，煙曲霉孢子就可能導致嚴重的肺部感染。另一方面，雖然在一邊醫(yī)院里煙曲霉孢子的數(shù)量只占空氣中孢子的約0.3％，但煙曲霉引起的系統(tǒng)性感染占曲霉引起的系統(tǒng)性感染的90％，病死率也高達50％-95％。因此臨床迫切需求煙曲霉菌早期快速診斷的新技術(shù)。

侵襲性真菌感染臨床表現(xiàn)及現(xiàn)有輔助診斷手段常無特異性，病情易被原發(fā)病掩蓋，造成漏診、誤診而延誤治療。定量pcr檢測具有較高的敏感性和特異性，可以克服現(xiàn)有診斷手段的許多缺點，可監(jiān)測侵襲性真菌感染病情的發(fā)展，及時調(diào)整用藥。

可用于本發(fā)明的煙曲霉基因來源于真菌類，曲霉菌屬，所檢樣本來源于人的組織樣本和體液樣本，包括痰液或者肺泡灌洗液。

在本領(lǐng)域中，多種曲霉菌，如煙曲霉菌、黃曲霉菌等的基因具有較高的同源性，然而，采用本發(fā)明的方法(引物對+探針)可以很好地區(qū)別不同霉菌的感染情況。

引物和探針

如本文所用，術(shù)語“擴增煙曲霉菌的引物”、“本發(fā)明引物”是指這樣的引物(對)，其擴增出的擴增產(chǎn)物具有煙曲霉菌的互補鏈序列。

經(jīng)過大量引物(對)的篩選，本發(fā)明人發(fā)明，如seqidno.:1和seqidno.:2所示的引物對能夠高效地擴增出煙曲霉菌的基因序列，且所擴增出的產(chǎn)物條帶清晰無彌散。

本發(fā)明中，所使用的煙曲霉菌擴增特異性引物對所針對的目標序列為多種曲霉菌屬種，包括曲霉屬，及其附屬四個種類如下：煙曲霉，黃曲霉，黑曲霉和土曲霉，并用熒光探針對每個種屬進行特異性區(qū)分。

本發(fā)明人設(shè)計并最終篩選獲得了高特異性、高敏感性的特異性針對煙曲霉菌的分子探針，其序列如seqidno.:3所示，本發(fā)明探針由兩端分別共價標 記有熒光染料和淬滅劑的單鏈核酸分子組成。優(yōu)選地，所述檢測探針的5’端標記fam熒光基團，且檢測探針的3’端標記tamara熒光淬滅基團。

將seqidno.:1-2所示的引物以及seqidno.:3所示的探針應用于煙曲霉菌的基因檢測，可以發(fā)現(xiàn)，而本發(fā)明引物和探針組合則能夠高靈敏地、高特異性地檢測出煙曲霉菌的結(jié)果。

試劑盒

一種煙曲霉菌taqman熒光定量pcr檢測試劑盒，所述的試劑盒含有容器，以及分別位于容器內(nèi)的：

曲霉菌通用引物一對，所述的引物對如seqidno.:1(正向ctcgagcgtatggggctt)和seqidno.:2(反向gaaggrgccagctttcaaat)所示；

和煙曲霉菌特異性檢測探針，煙曲霉菌特異性探針序列如seqidno.:3(cgccagccgacacccaactttatttttcta)所示。所述的特異性檢測探針上的一端標記有熒光發(fā)生基團，另一端標記有熒光淬滅基團。所述檢測探針的5’端標記fam熒光基團，且檢測探針的3’端標記tamara熒光淬滅基團。

所述的試劑盒中還可以含有其他組分，例如進行樣本處理、dna模板提取的試劑組合。優(yōu)選地，所述的試劑盒還含有試劑a，為樣本液化試劑；在另一優(yōu)選例中，所述的試劑a選自下組：naoh水溶液(優(yōu)選為1mnaoh水溶液)、saccomannno液(每50ml固定液中含有50％乙醇48ml，2％聚乙二醇1ml，0.3％利福平1ml；0.005％二硫蘇糖醇dtt液等體積混合)、n-乙酸-l-半胱氨酸(優(yōu)選為0.5％n-乙酸-l-半胱氨酸)、枸櫞酸鈉溶液(優(yōu)選為1.45％枸櫞酸鈉溶液)、氫氧化鈉溶液(優(yōu)選為2％氫氧化鈉溶液)，或其組合。

所述的試劑盒還含有試劑b，為洗滌試劑，用于洗滌液化后的生物樣品中的沉淀；在另一優(yōu)選例中，所述的試劑b為1xtris-edtabuffer——三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(tris-hcl)和乙二胺四乙酸(edta)緩沖洗液。

所述的試劑盒還含有試劑c，為針對煙曲霉菌的消化酶，從公司購得，例如蝸牛酶snailase(華藍化學公司)。

所述的試劑盒還含有dna抽提試劑盒，為qiagen公司夠得，貨號為51306；

所述的試劑盒還含有陽性對照質(zhì)粒；

所述的試劑盒還含有陰性對照試劑；

所述試劑盒還含有任選的pcr檢測相關(guān)試劑，如mastermix、蒸餾水等。

所述的pcr檢測相關(guān)試劑可自商業(yè)購買來源獲得，如taqmangemmmastermix。

本發(fā)明試劑盒中探針和引物的濃度沒有特別限制，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)所需的擴增效率進行決定。優(yōu)選地，本發(fā)明煙曲霉菌基因特異性引物的濃度為2.5-8um/ul，優(yōu)選為3-5um/ul，例如4.5um/ul，本發(fā)明煙曲霉菌基因特異性探針的濃度為0.5-5um/ul，優(yōu)選為1-2um/ul。

檢測方法

本發(fā)明提供了一種檢測樣本中煙曲霉菌的方法，包括方法如下：

(i)標本提?。?/p>

1.痰液液化：取200ul痰液，至1.5ml離心管中，加入4倍體積的試劑a，振蕩30秒，室溫放置20分鐘；(balf則先離心再添加試劑a)

2.12000rpm，離心5分鐘，棄上清，沉淀用600ul試劑b充分懸浮，12000rpm，離心5分鐘，棄上清，留沉淀；(如沉淀較多，建議重復洗滌一次)

3.沉淀加50ul試劑c，充分懸浮，振蕩15秒；

4.將離心管置于水浴鍋，37℃，60分鐘；

5.隨后，遵循qiagen公司dna抽提試劑盒步驟進行dna提取；

6.取1ul上清做為pcr模板；

(ii)pcr反應液配制：

1.試劑配制及加樣；

將試劑盒中的試劑進行室溫解凍。試劑配制前，將所有試劑振蕩后短暫離心。配制如下：

2混勻，離心pcr96孔板或八聯(lián)管，2000rpm，15秒，使所加試劑聚 集到管底；

(iii)pcr擴增：

在另一優(yōu)選例中，所述的測定為定量和定性測定。

在另一優(yōu)選例中，所述的pcr擴增反應條件如下：

95℃10分鐘；95℃15秒，60℃60秒，40個循環(huán)。

在另一優(yōu)選例中，所述的pcr信號收集如下：

第二階段60℃時收集fam，參比熒光為rox。

在另一優(yōu)選例中，所述的檢測包括診斷性檢測和非診斷性檢測。

在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明提供了所述試劑盒的用途，用于診斷或非診斷性檢測樣品中煙曲霉菌的表達情況。

本發(fā)明還提供了一種檢測樣本中煙曲霉菌的拷貝數(shù)和/或判斷個體內(nèi)煙曲霉菌是否為陽性的方法，包括：

質(zhì)控標準：

1.陰性對照的ct值均應等于40。

2.陽性對照的ct值應小于等于35，并有較好的對數(shù)增長曲線。否則，此次實驗視為無效。

熒光定量pcr擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段(基線期)，熒光信號指數(shù)擴增階段(對數(shù)期)和平臺期。在基線期，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化；而在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，因此，若擴增曲線上存在比較明顯的對數(shù)期(即有較好的對數(shù)增長曲線)，則可以輔助判斷樣本經(jīng)過了有效的煙曲霉菌樣本dna擴增。

結(jié)果判斷

1.被檢樣品ct值小于35并有對數(shù)增長曲線的，為陽性結(jié)果。

2.被檢樣品ct值等于35時，有對數(shù)增長曲線的為陽性，無對數(shù)增長曲線的為陰性。

3.被檢樣品ct值大于35時，如無對數(shù)增長曲線則為陰性；如有較好的對數(shù)增長曲線，建議加大樣本量重做。重做結(jié)果同前，則判為陽性，否則為陰性。

定量標準參考值：(因臨床痰標本無法精確定量以及因細胞壁破壁效率導致煙曲霉dna提取產(chǎn)量差異，以下數(shù)據(jù)僅為參考值)：

1.ct值為33-36≈10-100個菌/ml

2.ct值為30-32≈100-1000個菌/ml

3.ct值為27-29≈1000-10000個菌/ml

4.ct值為24-26≈10000-100000個菌/ml

5.ct值為21-23≈100000-1000000個菌/ml

可用于本發(fā)明的樣本包括組織樣本、體液樣本。

在另一優(yōu)選例中，所述的組織樣本包括痰液和肺泡灌洗液。

本發(fā)明的有益效果

(1)本發(fā)明就熒光定量pcr儀檢測煙曲霉菌的特點，設(shè)計并篩選了引物和探針的組合后發(fā)現(xiàn)，當采用本發(fā)明引物和探針能夠高效、高特異性地擴增出煙曲霉菌基因，擴增產(chǎn)物清晰，且其檢測獲得的熒光信號準確無干擾，將其應用于臨床的診斷后，與現(xiàn)有技術(shù)的吻合度更高，且價格低廉、可重復性高，使病理檢測的準確性得到加強，并能大大降低醫(yī)療成本和費用，減少醫(yī)療資源的浪費。

(2)本發(fā)明的方法可以快速(3-4小時即可得到結(jié)果)、靈敏和高特異性的檢測煙曲霉菌。具體地，所述的試劑盒含有檢測樣本液化試劑、煙曲霉消化酶、dna提取試劑以及檢測煙曲霉的特異性引物和探針，可用于熒光定量pcr的方法檢測肺侵襲性煙曲霉菌。

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實施例1樣本的收集和信息分析

本研究樣品為2015年4月至9月期間，中山醫(yī)院收集所得病人痰液樣本或者肺泡灌洗液樣本，低溫4度保存。所有樣品收集經(jīng)過個人同意，并根據(jù)醫(yī)院的倫理委員會批準協(xié)議，病理培養(yǎng)結(jié)果經(jīng)兩名以上病理醫(yī)師確認。所有病例均為臨床疑似曲霉菌送檢樣本，患者臨床資料包括發(fā)病年齡、性別、住院床號、住院號等?？偣?7例樣品。

實施例2標本抽提

1.痰液液化：取200ul痰液，至1.5ml離心管中，加入5倍體積的試劑a，振蕩30秒，室溫放置20分鐘。(balf則先離心再添加試劑a)

2.12000rpm，離心5分鐘，棄上清，沉淀用600ul試劑b充分懸浮，12000rpm， 離心5分鐘，棄上清，留沉淀。(如沉淀較多，建議重復洗滌一次)

3.沉淀加25ul試劑c，充分懸浮，振蕩15秒。(！)

4.將離心管置于水浴鍋，37℃，60分鐘。

5.隨后，遵循qiagen公司dna抽提試劑盒步驟進行dna抽提；

6.取1ul上清做為pcr模板。

實施例3熒光定量pcr檢測

配置4.5um/ul的煙曲霉基因pcr反應原液(各4.5um上游引物seqidno.:1和下游引物seqidno.:2、1um探針seqidno.:3)120ul，taqman酶反應原液180ul，陰性對照40ul，陽性對照40ul備用。

按照如下比例配置煙曲霉菌檢測反應液：并備用。

分別向加入了煙曲霉基因pcr反應液的反應孔加樣，加入1ul上清進行檢測，加入1ul陽性質(zhì)粒作為陽性對照，以及加入1ul雙蒸水作為ntc，完畢后檢查每個孔液體量是否均一。

混勻，pcr96孔板或八聯(lián)管，室溫1000g離心1分鐘；使所加試劑聚集到管底。

放入定量pcr儀中(abi，7900htfast；abi，7500fast)做定量pcr。程序為：95℃10分鐘；后運行95℃15秒，60℃60秒，40個循環(huán)。煙曲霉基因選用fam標記的taqman探針進行檢測，選擇reporter為fam和quencher為tamara。收集數(shù)據(jù)，進行生物信息學分析。

實施例4結(jié)果判斷

◆質(zhì)控標準

陰性對照的ct值均應等于40。

陽性對照的ct值應小于等于35，并有較好的對數(shù)增長曲線。否則，此次實驗視為無效。

◆結(jié)果判斷

被檢樣品ct值小于35并有對數(shù)增長曲線的，為陽性結(jié)果。

被檢樣品ct值等于35時，有對數(shù)增長曲線的為陽性，無對數(shù)增長曲線的為陰性。

被檢樣品ct值大于35時，如無對數(shù)增長曲線則為陰性；如有較好的對數(shù)增長曲線，建議加大樣本量重做。重做結(jié)果同前，則判為陽性，否則為陰性。

定量標準參考值：(因臨床痰標本無法精確定量以及因細胞壁破壁效率導致煙曲霉dna提取產(chǎn)量差異，以下數(shù)據(jù)僅為參考值)：

ct值為33-36≈10-100個菌/ml

ct值為30-32≈100-1000個菌/ml

ct值為27-29≈1000-10000個菌/ml

ct值為24-26≈10000-100000個菌/ml

ct值為21-23≈100000-1000000個菌/ml

實施例5檢測結(jié)果統(tǒng)計分析

57例高度疑似曲霉菌感染病人的痰液樣本或者肺泡灌洗樣本，通過傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)的方法檢測發(fā)現(xiàn)，其中10例為曲霉感染，但是無法確定到種。

而通過熒光定量pcr檢測煙曲霉菌基因的方法發(fā)現(xiàn)，11例為煙曲霉菌。這11例檢測為陽性的病例與臨床癥狀高度匹配，其中10例與傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)法的結(jié)果符合，還有1例臨床已確診為曲霉菌感染，但是采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法測定的結(jié)果為陰性。這說明，本發(fā)明的檢測方法與臨床診斷結(jié)果有更好的符合度。

本發(fā)明的檢測方法，與臨床癥狀符合度為100％；與傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)法符合度為110％；其中醫(yī)院傳統(tǒng)培養(yǎng)法的煙曲霉陽性檢出率為17.5％，而熒光定量pcr檢測煙曲霉菌的陽性表達率為19.3％，接近文獻中報道的煙曲霉陽性檢測率20％。

如表2所示，我們還利用設(shè)計的黃曲霉引物對(與煙曲霉引物對一致)和特異性探針，檢測出3例黃曲霉感染，病例的臨床癥狀完全與相符，但用醫(yī)院目前的傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測得出的結(jié)果均為陰性。

表2：醫(yī)院傳統(tǒng)培養(yǎng)法以及熒光定量pcr檢測煙曲霉菌比較結(jié)果。

相比傳統(tǒng)的檢測方法而言，熒光定量pcr法快速(3-4小時即可得到結(jié)果)、靈敏、特異性高。

目前fda認可的ipfi檢測確診如下：合格痰液經(jīng)直接鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲，真菌培養(yǎng)2次陽性；支氣管肺泡灌洗液經(jīng)直接鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲，真菌培養(yǎng)陽性；合格痰液或支氣管肺泡灌洗液直接鏡檢或培養(yǎng)新生曲霉菌陽性；血液標本曲霉菌半乳甘露聚糖抗原(簡稱gm)(elisa)檢測連續(xù)2次陽性；血液標本真菌細胞壁成分1,3-β-d葡聚糖(g試驗)連續(xù)2次陽性；因此本發(fā)明的結(jié)果通過對比兩種方法，本發(fā)明可以作為快速、靈敏的檢測人體液中煙曲霉菌的一個有效方法。

此外，黃曲霉菌用同樣的引物對，并采用配套的探針序列亦可進行擴增檢測。其檢測結(jié)果如附圖2所示，但是此結(jié)果與臨床結(jié)果比對發(fā)現(xiàn)，熒光定量pcr檢測ct值的cutoff需要定在ct<33才為陽性。

在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。