本發(fā)明公開了一組核苷酸序列及應用，屬于基因檢測技術領域。

背景技術：

肺癌是世界范圍內也是中國最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤的首位。肺癌是肺部腫瘤的統(tǒng)稱，包括非小細胞肺癌和小細胞肺癌。非小細胞肺癌包括鱗癌、腺癌、腺鱗癌、大細胞癌、類癌等，占肺癌的85％左右。腫瘤的發(fā)生，是一系列腫瘤相關基因突變的結果，這些基因在腫瘤的形成過程中發(fā)揮著重要作用。腫瘤研究者已經研發(fā)出多種針對腫瘤基因的靶向治療藥物，如針對egfr基因突變肺腺癌的厄諾替尼和吉非替尼；針對肺癌中alk融合基因突變的克唑替尼等。alk融合基因突變中eml4-alk融合基因是非小細胞肺癌，特別是肺腺癌的一個新的驅動基因，在肺癌中的發(fā)生率約為5％。目前，至少已有14種eml4-alk的變異亞型被發(fā)現(xiàn)，這些變異亞型均為eml4的不同外顯子與alk的第20外顯子相融合。亞型1(v1)，為eml4的第13外顯子與alk的第20外顯子相連；亞型2(v2)，為eml4的第20外顯子與alk的第20外顯子相連；亞型3(v3)，有兩個亞亞型(v3a/b)，v3a為eml4的第6外顯子與alk的第20外顯子相連，而v3b為eml4的第6外顯子加上一個33bp的小片段再與alk的第20外顯子相連；亞型4(v4)，為eml4的第14外顯子加上一個11bp的小片段再與前面缺失49bp的alk的第20外顯子相連；亞型5(v5)，有兩個亞亞型(v5a/b)，v5a為eml4的第2外顯子與alk的第20外顯子相連，而v3b為eml4的第2外顯子加上一個117bp的小片段再與alk的第20外顯子相連；亞型6(v6)，為eml4的第13外顯子加上一個49bp的小片段再與alk的第20外顯子相連；亞型7(v7)，為eml4的第14外顯子與前面缺失12bp的alk的第20外顯子相連；亞型8(“v4”)，為eml4的第15外顯子缺失了后面19bp再與前面缺失20bp的alk的第20外顯子相連；亞型9(“v5”)，為eml4的第18外顯子與alk的第20外顯子相連。最常見的融合基因為亞型1，其次為亞型3。所有這些融合基因均具有生物學功能，其表達產物為一種嵌合型酪氨酸激酶，可激活alk基因的膜內催化區(qū)域，激活相關信號通路，促進細胞增殖、存活、遷移，最終導致細胞癌變。目前用于alk融合基因的檢測方法主要有熒光原位雜交(fish)、免疫組織化學和逆轉錄聚合酶鏈反應等。但所有這些方法都是針對手術或者活檢取材后的腫瘤組織進行的，對患者創(chuàng)傷性較大，難以用于常規(guī)檢查，并且由于肺癌異質性的影響，所檢測的腫瘤組織并不能反應腫瘤整體的情況。

外泌體由細胞內的多泡小體(multivesicularbodies,mvb)與細胞膜融合后以外分泌的形式釋放到細胞外，直徑約為40nm-100nm。外泌體廣泛存在于各種體液(血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、腦脊液、乳汁、腹水、羊水、眼淚、鼻腔粘液和支氣管肺泡灌洗液)中，攜帶有細胞來源相關的多種蛋白質、脂類、dna、mrna、mirna等，參與細胞間通訊、細胞增殖、細胞遷移、細胞分化、血管新生和免疫調節(jié)等過程。腫瘤在生長過程中會不斷地將外泌體釋放到周圍環(huán)境中去，存在于患者的血液中，也可經血液循環(huán)到達腹水和胸膜積液等惡性病變體液中，使得通過血液等更易獲得臨床標本進行腫瘤相關的標志物檢測成為可能。且外泌體能在4℃保存96h，或是在-80℃下保存更長時間，這些特點使得外泌體比其他樣品更適用于腫瘤的早期診斷和預后判斷。

為了克服現(xiàn)有技術檢測對患者損傷較大的不足，本發(fā)明旨在提供一種能夠快速檢測生物樣本中eml4-alk融合基因的方法。

技術實現(xiàn)要素：

基于上述目的，本發(fā)明首先提供了一組用于pcr擴增的核苷酸序列組合，所述序列組合選自由seqidno.1-8所示核苷酸序列的一種或多種。

在一個優(yōu)選的實施方案中，所述序列組合由由seqidno.1-8所示核苷酸序列組成。

其次，本發(fā)明提供了所述的序列組合在eml4-alk融合基因快速檢測中的應用。

最后，本發(fā)明提供了一種快速檢測eml4-alk融合基因的方法，所述方法包括：

(1)提取生物樣本的總rna；

(2)以步驟(1)獲得的rna為模板，反轉錄獲得cdna；

(3)以步驟(2)獲得的cdna為板，進行pcr擴增，所述引物為由seqidno.1-8所示核苷酸序列的一種或多種；

(4)對步驟(3)獲得的擴增引物進行分析。

在一個優(yōu)選的實施方案中，步驟(1)所述生物樣本來源于體液。

更為優(yōu)選地，所述體液為血清。

在一個優(yōu)選的實施方案中，步驟(3)所述引物由seqidno.1-8所示核苷酸序列的組合而成。

在一個優(yōu)選的實施方案中，步驟(4)所述的分析為電泳法。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，步驟(4)所述的分析為dna測序法。

更為優(yōu)選地，步驟(4)所述dna測序法中以seqidno.1所示的核苷酸為測序引物。

本發(fā)明所提供的引物組合用于pcr擴增時能夠特異性地識別eml4-alk融合基因的序列并擴增，具有高度特異性，只需一次擴增，就能檢測出9種肺癌eml4-alk變異亞型。

本發(fā)明所提供的方法涉及的樣本取材方便，能全面反應腫瘤遺傳信息，其所采用的生物樣本獲取比腫瘤組織樣本的獲取操作更為簡單；包含的腫瘤基因信息豐富；特別適用于腫瘤組織樣本不易得到的晚期肺癌患者；可實現(xiàn)eml4-alk融合基因的無創(chuàng)檢測。

本發(fā)明所提供的方法操作簡單，降低了實驗成本、簡化了實驗步驟，并具有良好的可重復性，特異性和敏感性高，而且其dna測序法可以通過dna一代測序即可完成，大大減低了測序成本，測序周期明顯縮短，在更短的時間內即可獲得檢測報告，可以快速、準確、直觀地檢測出肺癌相關的eml4-alk融合基因，檢測結果準確可靠，為肺癌的早期診斷和分子分型提供參考依據(jù)，也可用于eml4-alk融合基因的篩查。

附圖說明

圖1.肺癌患者1分離的血清外泌體在電鏡形態(tài)觀察圖；

圖2.肺癌患者1血清外泌體的westernblot鑒定圖譜；

圖3.肺癌患者1血清外泌體中eml4-alk基因融合rt-pcr電泳圖譜；

圖4.肺癌患者1rt-pcr擴增得到的eml4-alk融合基因融合位點的測序結果；

圖5.肺癌患者2血清外泌體的電鏡形態(tài)觀察圖；

圖6.肺癌患者2血清外泌體中eml4-alk基因融合rt-pcr電泳圖譜；

圖7.肺癌患者2rt-pcr擴增得到的eml4-alk融合基因融合位點的測序結果

具體實施方式

下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的保護范圍構成任何限制。

實施例1

利用本發(fā)明進行的肺癌患者eml4-alk亞型v3a/b融合基因的檢測，具體方法如下：

1.血清收集：用血生化管采集待檢者外周血5ml，室溫靜置30分鐘后，300g離心15分鐘，經分離出的標本從上到下清晰地分成2層，依次為血清層和血細胞層。取血清層上清2000g，離心10分鐘去除死亡細胞，取上清10000g離心30分鐘去除細胞碎片，最后取上清，分裝后-80℃凍存?zhèn)溆?。以上過程保證在4-6小時內完成。

2.血清外泌體分離：外泌體提取采用sbi公司exoquicktm外泌體提取試劑盒提取，按試劑盒說明書結合文獻報道進行操作，以血清為例，步驟如下:

1)從-80℃冰箱中取出血清，各取每份血清樣品500μl快速解凍，4℃3000×g離心15分鐘。

2)離心后取上清，經過0.45μm濾器過濾。

3)過濾后的血清液體約500μl加入exoquicktm試劑120μl，蓋緊管蓋，顛倒混勻3次。混合物置于4℃冰箱中反應過夜(至少12小時)。

4)4℃，13000rpm，離心30分鐘，去除上清液，保留沉淀。

5)4℃，13000rpm，離心3分鐘，充分去除上清液，保留沉淀即為外泌體微粒，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

本方法得到的血清外泌體經電鏡鑒定(見圖1)和外泌體特異的分子標志物鑒定(見圖2)表明從血清中可以分離得到的外泌體。

3.待測樣本總rna提?。嚎俽na提取采用invitrogen公司試劑提取，按試劑說明書結合文獻報道進行操作，以外泌體為例，步驟如下:

(1)向外泌體微粒中加入1mltrizol，充分混勻，于室溫培養(yǎng)5分鐘。

(2)加入0.2ml氯仿，蓋緊瓶蓋劇烈振蕩15秒，放置2－3分鐘。2－8℃，10000－12000×g離心15分鐘。

(3)將上層水相轉移到一個新的離心管中，加入0.25ml異丙醇，混勻，室溫放置10分鐘，2－8℃，10000－12000×g離心10分鐘。

(4)棄上清，加入至少1ml75％的異丙醇洗滌，2－8℃，不大于7500×g離心5分鐘。

(5)棄上清，空氣干燥5－10分鐘，加入無rnase的水20μl，反復抽吸使rna溶解。

(6)55－60℃保溫10分鐘，-80℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

4.待測樣本cdna制備：

使用promega公司的goscript^tm反轉錄體系對總rna進行反轉錄，步驟如下：

(1)根據(jù)每個rna樣品的濃度計算200ngrna所需的體積。

(2)根據(jù)每個樣品的體積數(shù)加入適量體積的無rna的水，總體積為4μl。

(3)向每個樣品中加入1μl隨機引物(0.5μg)。

(4)混勻后將其放入70℃加熱5分鐘，加熱后立即將其放置在冰上，5分鐘后用小型離心機離心10秒，然后放置在冰上。

(5)按照下表配制反轉錄體系：

(6)將15μl配制好的反轉混合液與之前的5μl樣品充分混合，在25℃退火5分鐘。

(7)42℃延伸1小時。

(8)將樣品放置于70℃加熱15分鐘以滅活反轉錄酶的活性。

5.eml4-alk融合基因的pcr擴增：

基于eml4-alk不同融合方式設計能夠對其進行特異性擴增的引物，包括seqidno.1-seqidno.8的序列。配制50μlpcr反應液：25μl2×taqpcr混合物，2μlrt-pcr聯(lián)合引物(primer1-8，濃度為10pm/條)，3μl反轉的cdna以及20μl雙蒸水。按下列條件進行pcr反應：94℃2分鐘；94℃30秒，60℃30秒，72℃1分鐘，35個循環(huán)；72℃5分鐘；4℃放置。

6.電泳檢測：取3μl擴增產物進行電泳檢測，采用2％(m/v)濃度瓊脂糖凝膠，150v恒定電壓電泳15分鐘，染色后在紫外燈下檢查擴增效果，電泳檢測結果見圖3。圖3中gapdh為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase),和notch1為notchhomolog1，是外泌體中mrna含量比較多基因，作為參照物。

7.pcr產物純化：對pcr產物進行純化，純化方式選用ampurebeads，去除反應液中殘留的引物、dntps、鹽分、非特異pcr產物，最終滿足產物長度在200-500bp，dna純度：od260/od280＝1.6-2.0。

8.pcr產物測序：采用普通dna測序方法，以primer1為測序引物，對樣本進行測序分析，測序成本低，測序周期短。測序結果見圖4。

9.信息分析：將測序結果與不同eml4-alk融合方式的融合基因序列進行比對，其中融合基因序列來源于ncbi人類基因組參考序列，以此確定樣本相應的基因信息。通過序列分析，eml4-alk融合基因亞型鑒定為v3a/b型。

實施例.2肺癌患者血清的eml4-alk亞型v1融合基因檢測

利用本發(fā)明進行肺癌患者血清的eml4-alk亞型v1融合基因檢測，具體方法同實施例1，血清分離得到的外泌體電鏡結果見圖5、pcr產物電泳檢測結果見圖6、pcr產物測序結果見圖7。

檢測結果表明本發(fā)明提供的eml4-alk融合基因檢測具有較高的特異性，通過序列分析，eml4-alk融合基因亞型鑒定為v1型。

序列表

<110>中國人民解放軍總醫(yī)院

中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所

<120>一組核苷酸序列及在eml4-alk融合基因快速檢測中的應用

<160>8

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>homosapiens

<400>1

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<210>2

<211>23

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<211>25

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