本發(fā)明涉及基因的功能與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種hleg1基因及其應(yīng)用和藥物。

背景技術(shù)：

在過(guò)去的幾年里，肥胖癥病例在全世界范圍內(nèi)迅速增長(zhǎng)，目前已是導(dǎo)致人類死亡的第五號(hào)威脅。在發(fā)達(dá)國(guó)家，肥胖癥早在20世紀(jì)80年代就已初露端倪，病例在其后持續(xù)增加，只是在過(guò)去8年里增加速度有所減緩；而在發(fā)展中國(guó)家，肥胖患者每年都以極快的速度在增加。盡管肥胖一般不會(huì)直接導(dǎo)致死亡，但是，肥胖導(dǎo)致的并發(fā)癥，尤其是心血管疾病卻可以是致命的。在2010年，肥胖大約導(dǎo)致了340萬(wàn)人的死亡。此外，對(duì)美國(guó)本土的肥胖癥患者的研究表明，肥胖癥很可能會(huì)降低將來(lái)人類的平均壽命。據(jù)統(tǒng)計(jì)，為了治療肥胖癥，美國(guó)差不多每年要花費(fèi)1170億美元。同時(shí)，世界范圍內(nèi)對(duì)肥胖癥的關(guān)注也越來(lái)越多。但是，目前，對(duì)于有效治療肥胖癥的藥物的研究成果還比較少，且與肥胖癥相關(guān)的藥物靶點(diǎn)也比較少。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種hleg1基因，其編碼hleg1蛋白，hleg1蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示。

進(jìn)一步地，hleg1基因的堿基序列如seqidno.3所示。

本發(fā)明的另一目的在于提供的hleg1基因作為靶點(diǎn)基因在制備或篩選用于治療肥胖癥或減肥的藥物中的應(yīng)用，該藥物是抑制hleg1基因的表達(dá)水平的藥物。該藥物通過(guò)對(duì)hleg1基因的表達(dá)水平的抑制，減少hleg1蛋白的含量，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)治療肥胖癥或減肥的效果。

本發(fā)明的另一目的在于提供的hleg1基因作為靶點(diǎn)基因在制備或篩選用于治療脂肪缺少疾病或增肥的藥物中的應(yīng)用，該藥物是增強(qiáng)hleg1基因的表達(dá)水平的藥物。該藥物通過(guò)對(duì)hleg1基因的表達(dá)水平的增強(qiáng)，增加hleg1蛋白的含量，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)治療脂肪缺少疾病或增肥的效果。

本發(fā)明的另一目的在于提供的hleg1基因作為靶點(diǎn)基因在制備或篩選用于治療糖尿病的藥物中的應(yīng)用，該藥物是通過(guò)增強(qiáng)hleg1基因的表達(dá)水平以激活akt信號(hào)通路使glut2運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜表面的藥物。

本發(fā)明的另一目的在于提供的hleg1基因的rnai干擾載體在制備用于治療肥胖癥或減肥的藥物中的應(yīng)用，該rnai干擾載體沉默hleg1基因的表達(dá)。rnai干擾載體通過(guò)對(duì)hleg1基因的表達(dá)的沉默，使其編碼的hleg1蛋白的含量降低，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)治療肥胖癥或減肥的效果。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于治療肥胖癥或減肥的藥物，該藥物是以上述的hleg1基因?yàn)榘悬c(diǎn)，抑制hleg1基因的表達(dá)水平。

進(jìn)一步地，該藥物是用于沉默hleg1基因表達(dá)的rnai干擾載體。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于治療脂肪缺少疾病或增肥的藥物，其以hleg1基因?yàn)榘悬c(diǎn)，增強(qiáng)hleg1基因的表達(dá)水平。

本發(fā)明的另一目的在于提供含有上述hleg1基因的質(zhì)粒載體、細(xì)菌或細(xì)胞。

本發(fā)明提供的hleg1基因及其應(yīng)用和藥物的有益效果是：

本發(fā)明以現(xiàn)有技術(shù)沒(méi)有研究過(guò)的功能未知的人類的hleg1蛋白(如seqidno.1所示)和hleg1基因(如seqidno.3所示)為研究對(duì)象，為研究其功能，以mleg1基因敲除小鼠為模型動(dòng)物，利用遺傳學(xué)，分子生物學(xué)，生物化學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)的手段對(duì)mleg1蛋白(seqidno.2)及其編碼基因mleg1基因(如seqidno.4所示)的功能進(jìn)行了非常全面的研究。研究結(jié)果顯示：mleg1蛋白可以通過(guò)egfr受體蛋白調(diào)控體內(nèi)akt的信號(hào)，進(jìn)而調(diào)控機(jī)體內(nèi)的脂肪合成，表明mleg1基因和mleg1蛋白與機(jī)體內(nèi)的脂肪合成密切相關(guān)(增強(qiáng)mleg1基因的表達(dá)水平或者mleg1蛋白的表達(dá)水平或mleg1蛋白的含量，促使脂肪合成積累；抑制mleg1基因的表達(dá)水平或者mleg1蛋白的表達(dá)水平或mleg1蛋白的含量，降低脂肪積累)，也進(jìn)一步表明人類的hleg1基因(如seqidno.3所示)或hleg1蛋白(如seqidno.1所示)可以作為靶點(diǎn)基因或靶點(diǎn)蛋白用于制備與脂肪合成調(diào)控相關(guān)的藥物中，例如治療肥胖癥或增肥相關(guān)的藥物，本發(fā)明的研究結(jié)果為后期肥胖癥的治療或預(yù)防、癌癥病患者化療后的體質(zhì)恢復(fù)、脂肪缺少疾病治療、增肥、糖尿病治療、唾液腺疾病檢測(cè)等領(lǐng)域中的藥物研發(fā)供了一個(gè)全新的藥物靶點(diǎn)以及新的治療手段和思路。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，應(yīng)當(dāng)理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實(shí)施例，因此不應(yīng)被看作是對(duì)范圍的限定，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。

圖1本發(fā)明實(shí)施例1-5的檢測(cè)結(jié)果圖(圖中：a為采用northern印記分析檢測(cè)mleg1在野生型小鼠的不同組織的表達(dá)情況的結(jié)果圖；b為采用northern印記分析mleg1在野生型小鼠的唾液腺的3個(gè)腺體中表達(dá)情況的檢測(cè)結(jié)果圖；c為采用westernblot檢測(cè)mleg1蛋白在野生型小鼠的不同的組織中分布情況的結(jié)果圖；d為野生型小鼠和mleg1基因敲除型小鼠唾液中mleg1蛋白含量的檢測(cè)結(jié)果圖)；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例4的mleg1基因敲除策略示意圖；

圖3為本發(fā)明本發(fā)明實(shí)施例4-5的凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖(圖中：a為采用普通pcr方法檢測(cè)mleg1^δ/δ小鼠中第三個(gè)外顯子被敲除的凝膠電泳結(jié)果圖；b為采用rt-pcr檢測(cè)mleg1^δ/δ小鼠中第三個(gè)外顯子被敲除的凝膠電泳結(jié)果圖；c為采用westernblot方法檢測(cè)mleg1蛋白在mleg1^δ/δ小鼠唾液腺的表達(dá)情況的結(jié)果圖)；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例5的mleg1^δ/δ小鼠的mleg1基因的測(cè)序結(jié)果對(duì)比圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例6的mleg1^δ/δ小鼠和野生型小鼠的唾液腺的he染色結(jié)果對(duì)比圖；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例6采用唾液淀粉酶和細(xì)胞連接蛋白pan-cadherin進(jìn)行蛋白免疫熒光標(biāo)記觀察mleg1^δ/δ小鼠和野生型小鼠的唾液腺的結(jié)果對(duì)比圖；

圖7為本發(fā)明實(shí)施例6的mleg1^δ/δ小鼠和野生型小鼠的唾液腺分泌的粘液的阿新藍(lán)染色檢測(cè)結(jié)果對(duì)比圖；

圖8為本發(fā)明實(shí)施例7-8的檢測(cè)結(jié)果圖(圖中：a為mleg1^δ/δ小鼠和野生型小鼠的血指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果圖；b為mleg1^δ/δ小鼠和野生型小鼠的葡糖糖耐受情況的檢測(cè)結(jié)果圖；c為mleg1^δ/δ小鼠和野生型小鼠血清中的三酰甘油和膽固醇含量的檢測(cè)結(jié)果圖；d為mleg1^δ/δ小鼠和野生型小鼠肝臟中的三酰甘油和膽固醇含量的檢測(cè)結(jié)果圖)；

圖9為本發(fā)明實(shí)施例9的mleg1^δ/δ小鼠和野生型小鼠的不同部位的脂肪大小對(duì)比圖(圖中：a為mleg1^δ/δ小鼠和野生型小鼠背部脂肪直觀對(duì)比圖；b為1mleg1^δ/δ小鼠和野生型小鼠背側(cè)脂肪塊大小直觀對(duì)比圖；c為mleg1^δ/δ小鼠和野生型小鼠腹部脂肪直觀對(duì)比圖；d為mleg1^δ/δ小鼠和野生型小鼠腹部側(cè)脂肪塊大小直觀對(duì)比圖)；

圖10為本發(fā)明實(shí)施例9的mleg1^δ/δ小鼠和野生型小鼠的體重變化檢測(cè)結(jié)果圖(圖中：a為mleg1^δ/δ小鼠和野生型小鼠在正常飼料和高脂飼料飼養(yǎng)條件下的體重變化曲線圖；b為mleg1^δ/δ小鼠和野生型小鼠在高脂飼料飼養(yǎng)半年后的體型大小直觀對(duì)比圖)；

圖11為本發(fā)明實(shí)施例9的脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果圖(圖中：a為mleg1^δ/δ小鼠和野生型小鼠肝臟中脂肪β氧化相關(guān)基因的表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果圖；b為明mleg1^δ/δ小鼠和野生型小鼠肝臟中脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果圖)；

圖12為本發(fā)明實(shí)施例10的小鼠肝臟中脂肪合成途徑的示意圖；

圖13為本發(fā)明實(shí)施例11的mleg1^δ/δ小鼠和野生型小鼠肝臟中調(diào)控脂肪合成的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果圖；

圖14為本發(fā)明實(shí)施例12-14的akt磷酸化水平檢測(cè)結(jié)果圖(圖中：a為mleg1^δ/δ小鼠和野生型小鼠肝臟中的akt磷酸化水平的檢測(cè)結(jié)果圖；b為mleg1^δ/δ小鼠和野生型小鼠唾液腺中的akt磷酸化水平的檢測(cè)結(jié)果圖；c為經(jīng)野生型和mleg1^δ/δ小鼠唾液腺細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液中mleg1的蛋白水平；d為經(jīng)mleg1^δ/δ小鼠和野生型小鼠唾液腺細(xì)胞培養(yǎng)上清液培養(yǎng)后的hepg2細(xì)胞的akt磷酸化水平的檢測(cè)結(jié)果圖)

圖15為本發(fā)明實(shí)施例15-16的akt磷酸化水平的檢測(cè)結(jié)果圖(圖中：a為經(jīng)腹腔或者尾靜脈注射唾液腺原代培養(yǎng)上清后誘導(dǎo)mleg1^δ/δ小鼠肝臟的akt磷酸化水平的檢測(cè)結(jié)果圖；b為由野生型小鼠的唾液腺純化的不同mleg1蛋白濃度激活hepg2細(xì)胞的akt磷酸化水平的檢測(cè)結(jié)果圖)

圖16為本發(fā)明實(shí)施例16-18的akt磷酸化水平的檢測(cè)結(jié)果圖(圖中：a為通過(guò)柱層析和離子交換從唾液腺中純化得到的mleg1蛋白激活hepg2細(xì)胞的akt磷酸化水平的檢測(cè)結(jié)果圖；b為在抑制劑ly290004的作用條件下，經(jīng)mleg1^δ/δ小鼠和野生型小鼠唾液腺細(xì)胞原代培養(yǎng)的上清液培養(yǎng)后的hepg2細(xì)胞的akt磷酸化水平的檢測(cè)結(jié)果圖；c為在抑制劑ly290004的作用條件下，通過(guò)柱層析和離子交換從唾液腺中純化得到的mleg1蛋白激活hepg2細(xì)胞的akt磷酸化水平的檢測(cè)結(jié)果圖；d為經(jīng)mleg1蛋白培養(yǎng)后的hepg2細(xì)胞的酪氨酸磷酸化水平的檢測(cè)結(jié)果圖)；

圖17為本發(fā)明實(shí)施例19的膜受體酪氨酸激酶(rtk)篩選檢測(cè)結(jié)果圖；

圖18為本發(fā)明實(shí)施例19-22的檢測(cè)結(jié)果圖(a為mleg1蛋白對(duì)細(xì)胞內(nèi)egfr受體蛋白的激活水平的檢測(cè)結(jié)果圖；b為在抑制劑ag1478作用條件下，mleg1蛋白對(duì)細(xì)胞內(nèi)egfr受體蛋白的激活水平的檢測(cè)結(jié)果圖；c為采用免疫共沉淀法檢測(cè)mleg1蛋白與egfr之間的相互作用的結(jié)果圖；d為mleg1蛋白灌胃mleg1^δ/δ小鼠后，不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)mleg1蛋白與egfr之間的相互作用的結(jié)果圖)。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市售購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

下面對(duì)本發(fā)明的hleg1蛋白及其應(yīng)用和藥物進(jìn)行具體說(shuō)明。

本發(fā)明的發(fā)明人選取小鼠為研究模型動(dòng)物，對(duì)leg1基因(liverenrichedgene1、肝富集基因1，該基因編碼表達(dá)出的蛋白稱之為leg1蛋白)和leg1蛋白在小鼠中的同源基因mleg1基因(如seqidno.4所示)和mleg1蛋白(seqidno.2)進(jìn)行相關(guān)功能性研究。揭示了mleg1基因及其編碼表達(dá)mleg1蛋白的功能，也同時(shí)揭示了在所有脊椎動(dòng)物中具有同源性的leg1基因和相應(yīng)leg1蛋白的功能。

mleg1也稱2310057j18rikrikencdna2310057j18gene(geneid：67719)，是leg1在小鼠中的同源基因，其在小鼠中的功能研究幾乎空白。生物信息分析顯示，mleg1基因位于10號(hào)染色體上，全長(zhǎng)約14.016kb，包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，其中翻譯起始位點(diǎn)atg位于第一個(gè)外顯子上。mleg1基因編碼一個(gè)長(zhǎng)為337個(gè)氨基酸的蛋白(如seqidno.2所示)，分析預(yù)測(cè)顯示其含有一具有20個(gè)氨基酸的前導(dǎo)信號(hào)肽，前導(dǎo)信號(hào)肽的序列為seqidno.2所示的第1-21位氨基酸序列，表明mleg1是一個(gè)新型的分泌蛋白。

人(homosapiens)的hleg1蛋白(其氨基酸序列如seqidno.1)與小鼠中的同源蛋白mleg1蛋白(其氨基酸序列如seqidno.2所示)具有71.2％的相似性，因此，通過(guò)對(duì)鼠的mleg1蛋白的編碼基因即mleg1基因(如seqidno.4所示)和mleg1蛋白的功能研究能夠?yàn)槿祟惖膆leg1基因(編碼序列即cds序列如seqidno.3所示)和hleg1蛋白的功能和應(yīng)用提供指導(dǎo)和參考的意義，同時(shí)為研發(fā)相關(guān)脂肪疾病的藥物提供理論依據(jù)。

leg1蛋白在斑馬魚(yú)(daniorerio)中具有兩個(gè)拷貝，分別是dleg1a蛋白(氨基酸序列如seqidno.5所示)和dleg1b蛋白(氨基酸序列如seqidno.6所示)，二者與mleg1蛋白分別具有47.5％和48.6％的相似性；存在于綿羊(ovisaries)中的oleg1蛋白(氨基酸序列如seqidno.7所示)，其與mleg1蛋白具有49.1％的相似性；存在于牛(bostaurus)中的bleg1蛋白(氨基酸序列如seqidno.8所示)，其與mleg1蛋白具有45.7％的相似性(本發(fā)明的相似性對(duì)比所用的方法是：使用歐洲生物信息中心(ebi)配對(duì)比對(duì)軟件needle，參數(shù)設(shè)置為：matrix:eblosum62，gap_penalty:10.0，extend_penalty:0.5進(jìn)行比對(duì))。

由于，leg1蛋白是在所有脊椎動(dòng)物中保守存在的分泌蛋白高度，它們的leg1蛋白具有相同的duf結(jié)構(gòu)域(例如seqidno.2中第28位-337位、seqidno.1中的第28位-320位、seqidno.5中的第29位-362位、seqidno.6中的第29位-362位、seqidno.7中的第34位-354位、以及seqidno.8中的第1位-317位，這些氨基酸殘基序列在三維空間中都構(gòu)成一個(gè)功能相似的duf結(jié)構(gòu)域)，因此，它們之間具有相似的功能和應(yīng)用前景。因此，對(duì)于所有脊椎動(dòng)物的leg1蛋白及其編碼基因的與脂肪合成相關(guān)的應(yīng)用均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

還需要說(shuō)明的是，由seqidno.1所示的序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的且與seqidno.1具有相同的生物活性的衍生序列所示的蛋白及其應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。只要在seqidno.1所示的leg1蛋白的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)上述的改造，使其改造后的突變體leg1與seqidno.1所示的leg1蛋白具有相同的duf結(jié)構(gòu)域，使其與leg1蛋白具有相同或相似的生物活性，對(duì)于這些突變體蛋白及其編碼基因的脂肪合成相關(guān)的應(yīng)用同樣屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

需要說(shuō)明的是，本發(fā)明所指的脊椎動(dòng)物包括人、鼠、斑馬魚(yú)、綿羊、牛，還包括兔、豬、馬、虎、豹、狼、狗、雞、鴨、魚(yú)、鵝、熊以及猴等，但不限于前述的動(dòng)物。

本發(fā)明通過(guò)遺傳學(xué)，分子生物學(xué)，生物化學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)的手段，以模式生物小鼠及人類細(xì)胞系為研究模型，對(duì)新型分泌蛋白mleg1的功能進(jìn)行全面系統(tǒng)的研究，通過(guò)提供大量證據(jù)證明分泌蛋白mleg1是一個(gè)新的信號(hào)分子，建立從mleg1到egfr/pi3k，最后激活akt的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并證明該網(wǎng)絡(luò)促進(jìn)小鼠體內(nèi)脂肪合成。同時(shí)本發(fā)明的發(fā)明人證明mleg1敲除的小鼠能正常生長(zhǎng)，更為重要的是mleg1敲除的小鼠可以抗高脂食物引起的肥胖癥。

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用背景為c57bl/6的野生型小鼠；利用cre-loxp系統(tǒng)，選用c57bl/6-tg(zp3-cre)93knw/jnju的cre工具鼠用于全身敲除mleg1基因，以獲得全身敲除mleg1基因的小鼠(mleg1^δ/δ敲除小鼠)。(上述各品系的小鼠均購(gòu)于南京生物醫(yī)藥研究院(nri))。飼養(yǎng)條件：溫度22℃，濕度50％～60％，并給予12h光照/12h黑暗的光周期。小鼠的普通飼料為上海斯萊克公司生產(chǎn)的大小鼠輻照育成料(m02-f)，高脂飼料為上海斯萊克公司生產(chǎn)的大小鼠高脂實(shí)驗(yàn)料(m04-f)。

實(shí)施例1

1.northern印跡分析mleg1在不同組織的表達(dá)情況

以8周齡的雄性的背景為c57bl/6的小鼠作為研究對(duì)象，采用northern印跡分析檢測(cè)mleg1基因的表達(dá)譜。以mleg1基因的反義鏈為探針，進(jìn)行northern印記分析，分析mleg1基因小鼠包含肝臟在內(nèi)的一系列消化器官(心臟(heart)、肝臟(liver)、胰腺(pancreas)、肺(lung)、腎(kidney)、胃(stomach)、腸(gut)、唾液腺(sg))中的表達(dá)情況。

northern印跡分析的實(shí)驗(yàn)方法如下。

1.1rna提取：

1.1.1取需要提取rna的組織，用液氮研碎至無(wú)明顯顆粒，研磨過(guò)程保持有液氮存在以防rna降解。

1.1.2取50-100mg樣品加入1mltrizol(reagent，lifetechnologies，cat.no.15596-026)，通過(guò)26g針頭抽打充分勻漿。

1.1.3室溫靜置5min。加入0.2ml氯仿用力混勻30秒，室溫靜置5min。4℃下12000g離心15min使各液相分離。

1.1.4取水相(即最上層液體)加入到0.5ml異丙醇中，顛倒混勻后室溫孵育10min，使rna析出。4℃下12000g離心15min，棄上清。

1.1.5沉淀加入1ml75％的乙醇(用depc水配置)清洗，并4℃下12000g離心5min棄上清。重復(fù)用75％的乙醇清洗一次，并充分除去上清。42℃烘干后加適量depc水溶解。提取的rna馬上用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)或保存在-80℃冰箱中，需要時(shí)直接取出使用。

1.2地高辛(dig)標(biāo)記探針制備：

(1)用dig標(biāo)記的dntp(10xpcrdiglabelingmix，rochecat.no.11585550910)代替dntp，通過(guò)pcr反應(yīng)將dig摻入到雙鏈dna中作為norhern的探針。pcr引物為：probef：ggctgtcctggcttcctg；prober：ctctccatctgttcattgttcc。pcr采用普通的taq酶(反應(yīng)體系為：模板1ul，正反引物各0.3ul，taq酶0.3ul，10x的buffer2ul，2.5mmdntp1ul，水15.1ul)(taq酶反應(yīng)體系下同)，反應(yīng)程序：步驟1：94℃3分鐘；步驟2：94℃30秒；步驟3：58℃30秒；步驟4：72℃30秒；步驟5：重復(fù)步驟2到步驟4，33次；步驟6：72℃10分鐘。

(2)pcr反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)大小和純度，并通過(guò)pcr純化試劑盒進(jìn)行純化。純化后的探針在100℃中變性10min，并馬上在冰上冷卻至少2min，用digeasyhyb(rochecat.no.11603558001)稀釋探針到25ng/ml，并保存在-20℃中備用。

1.3rna變性凝膠制備：rna凝膠電泳在在變性的緩沖液和凝膠中進(jìn)行。將10x的mops緩沖液(0.2mmops，50mmnaoac，10mmedta，ph7.0)用滅菌的去離子水稀釋到1x，并加入1.3％的瓊脂糖粉末，通過(guò)微波爐加熱充分融解，冷卻到50℃左右的時(shí)候加入5.3％的濃度為37％的甲醛，混勻后倒入制膠模具中，靜置冷卻凝固備用。

1.4rna樣品處理：取適量rna(即步驟1.1提取出的rna樣品，10到30μg)加入到17.5μlrna變性劑中(含10μl去離子甲酰胺，2μl10xmops，3.5μl37％甲醛，2μlrna上樣緩沖液(gelloadingbufferii，lifetechnologies，cat.no.am8546g)，65℃變性20min后馬上置于冰上10min。

1.5rna變性凝膠電泳：取冷卻凝固的rna變性膠置于1xmops電泳緩沖液中，加入rna樣品進(jìn)行電泳，同時(shí)加入rna分子marker(fermentascat.no.sm1821)進(jìn)行分子量估算，以4-10v/cm的電壓進(jìn)行電泳，根據(jù)片段大小決定電泳時(shí)間，一般為4～7小時(shí)。

1.6rna轉(zhuǎn)膜：

1.6.1取出已完成rna變性凝膠電泳的凝膠(rna膠)，用滅菌的去離子水清洗，并置于10x的ssc中平衡。按膠大小裁取適當(dāng)大小的hybond-n+膜(amershambiosciencecat.no.rpn303b)和3mm濾紙(whatmancat.no.3030917)，同樣在10xssc中平衡。

1.6.2取一干凈的敞口瓷盤容器，倒入10x的ssc緩沖液，并取一有機(jī)玻璃蓋于瓷盤上。裁取2層長(zhǎng)度略長(zhǎng)于有機(jī)玻璃，寬度略寬于rna膠的3mm濾紙，用10xssc浸潤(rùn)后蓋于有機(jī)玻璃上，濾紙縱向兩端浸泡于瓷盤中的ssc緩沖液中。將rna膠倒扣在濾紙上，再依次覆蓋上hybond-n⁺膜和兩層3mm濾紙，以及多層吸水紙，并上壓重物，轉(zhuǎn)膜過(guò)夜。轉(zhuǎn)膜完成后，取下膜在紫外交聯(lián)儀(uvpultravioletcrosslinkercat.no.cl-1000)下，150mj/cm2能量交聯(lián)。隨后用rna亞甲基藍(lán)染色液(0.3mnaoac，ph5.2，0.03％methyleneblue)染色，檢測(cè)rna轉(zhuǎn)膜效果及質(zhì)量。

1.7探針雜交及顯影分析：

dig探針的雜交和清洗用roche公司的dig洗滌和封閉試劑盒(rochecat.no.11585762001)依說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。具體如下。

1.7.1取一雜交管，將rna膜(由1.6.2步驟得到的)置于其中，加入適量預(yù)雜交液(rochecat.no.11603558001)，50℃封閉2小時(shí)。期間，取-20℃保存的dig標(biāo)記的探針，在100℃變性10min后在50℃平衡。封閉2小時(shí)后，加入平衡好的探針，50℃雜交過(guò)夜。

1.7.2次日，回收探針，rna膜按以下次序依次清洗：2xssc/0.1％sds常溫清洗，每次10min；0.5xssc/0.1％sds65℃清洗兩次，每次15min；0.1xssc/0.1％sds65℃清洗兩次，每次15min；洗滌緩沖液室溫清洗10min。加入10％digblockingbuffer封閉1小時(shí)，接著換入用10％digblockingbuffer以1:20000稀釋的anti-digoxigenin-apfabfragments抗體(rochecat.no.11093274910)室溫孵育2小時(shí)。洗滌緩沖液清洗兩次，每次15。

1.7.3最后將膜用檢測(cè)緩沖液平衡5min。取膜夾于塑料膜中，并于其中滴入ready-to-usecdp-star溶液(rochecat.no.12041677001)顯色，在熒光化學(xué)發(fā)光成像儀(clinxscienceinstrumentscat.no.3400)里成像。結(jié)果如圖1中的(a)所示。

由圖1中的(a)可知(圖1的(a)中：sg代表唾液腺、liver代表肝臟、gut代表腸道、lung代表肺、heart代表心臟、stomach代表胃、kidney代表腎、pancrease代表胰腺)，mleg1基因并沒(méi)有在肝臟中富集表達(dá)，卻在在唾液腺(sg)中有非常高的表達(dá)，而在其它組織(heat、liver、pancreas、lung、kidney、stomach、gut)中基本沒(méi)有檢測(cè)到mleg1的表達(dá)。

小鼠的唾液腺主要包括三個(gè)部分：(頜下腺(submandibulargland)，舌下腺(sublingulargland)和腮腺(parotid)，因此，采用northernblot印記分析(具體方法同實(shí)施例1)，本發(fā)明的發(fā)明人分別探究了mleg1基因在這3個(gè)腺體中的表達(dá)情況，結(jié)果如圖1中的(b)所示。

由圖1中的(b)可知(圖1的(b)中：parotid代表腮腺、sub-lingual代表舌下腺、sub-maxillary代表頜下腺)，mleg1基因在這3個(gè)腺體中均有明顯表達(dá)，其在腮腺組織中的表達(dá)高于頜下腺和舌下腺。

實(shí)施例2

由于mleg1蛋白在斑馬魚(yú)中的同源蛋白leg1是一個(gè)分泌蛋白，上述結(jié)果已表明mleg1基因主要在唾液腺表達(dá)，但是其mleg1蛋白也可能分泌運(yùn)輸?shù)絼e的組織中發(fā)揮作用。因此，本發(fā)明的發(fā)明人提取小鼠不同組織的總蛋白，通過(guò)westernblot檢測(cè)mleg1蛋白在不同的組織中分布情況。

采用westernblot檢測(cè)mleg1蛋白在不同的組織中分布情況。實(shí)驗(yàn)方法如下。

2.1蛋白提取：

小鼠猝死后，摘取目的組織(sg、liver、gut、blood、lung、heat、stomach、kindney、pancrease)，分別置于1.5ml離心管中，并迅速于液氮中冷凍，防止降解。提蛋白時(shí)，取出樣品，通過(guò)液氮研磨粉碎，將樣品粉末收集于離心管中，并加入蛋白裂解液(150mmnacl，50mmph7.6tris-hcl，0.1％sds，1％tritonx100，1.5％脫氧膽酸鈉，1x的complete(edta-free)(rochecat.no.11873580001)，100mg樣品加入100μl裂解液)，置于冰上，26g針頭抽打數(shù)次，4℃于垂直搖床孵育15min，4℃12000g離心15min，取上清，通過(guò)braford法測(cè)蛋白濃度。

2.2蛋白免疫引跡(westernblot)：

2.2.1取制備的10～20μg蛋白樣品進(jìn)行sds-page凝膠電泳，通過(guò)半干轉(zhuǎn)膜儀(transsdsemi-drytransfercell(bio-radcat.no.170-390)將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移到pvdf膜(milliporecat.no.ipvh00010)中。轉(zhuǎn)膜條件為20v，140ma，轉(zhuǎn)膜時(shí)間依蛋白大小而定，一般為50min到60min之間。

2.2.2轉(zhuǎn)膜后，用5％的脫脂牛奶封閉1小時(shí)，再加入稀釋于牛奶中的目的蛋白抗體(根據(jù)檢測(cè)的目標(biāo)蛋白來(lái)確定，本實(shí)施例為mleg1抗體，其稀釋比例依抗體而定，一般為1:1000)，室溫孵育1小時(shí)或4℃孵育過(guò)夜。

2.2.3pbst(0.1％tween20inpbs)100～150rpm清洗5x5min。加入相應(yīng)的1:10000稀釋于牛奶中的二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠igg(碧云天cat.no.a0216)或辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔igg(碧云天cat.no.a0208))，室溫孵育1小時(shí)，pbst100～150rpm清洗5x5min。

2.2.4加入顯色底物(thermocat.no.34095)在熒光化學(xué)發(fā)光成像儀(clinxscienceinstrumentscat.no.3400)里成像。結(jié)果如圖1中的(c)所示。

由圖1中的(c)可知(圖1的(c)中：sg代表唾液腺、liver代表肝臟、gut代表腸道、blood代表血清、lung代表肺、heart代表心臟、stomach代表胃、kidney代表腎、pancrease代表胰腺)，與rna表達(dá)位置相一致的，mleg1蛋白也主要存在于唾液腺(sg)中，其它組織包括肝臟，腸道，肺，心臟，位，腎，胰腺都沒(méi)有檢測(cè)到明顯的mleg1蛋白的存在，同時(shí)，小鼠血液中并沒(méi)有存在大量的mleg1，因此，在小鼠中，mleg1的蛋白合成和儲(chǔ)存都主要發(fā)生在唾液腺中。

實(shí)施例3

由于唾液腺是一個(gè)分泌性腺體，其最重要功能是分泌唾液，而mleg1也是一個(gè)分泌蛋白。因此，本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)mleg1是否會(huì)分泌到唾液中進(jìn)行了研究。

采用westernblot檢測(cè)mleg1在唾液中的含量。具體步驟如下。

3.1唾液收集：于小鼠腹腔按0.5mg/kg的量注射匹羅卡品(pilocarpine，sigma)，將毛細(xì)管置于小鼠口腔引流收集分泌的唾液。匹羅卡品是一種用于治療口腔干燥的藥物，它能促進(jìn)唾液的大量分泌。分別收集野生型小鼠和mleg1全身敲除小鼠(其獲得的方法見(jiàn)下文)分泌的唾液。

3.2唾液處理：收集的唾液，用1/5唾液體積的5x的laemmlibuffer(10％sds，250mmtris-hcl，0.1‰bromphenolblue，500mmdtt，50％glycerol)，100℃煮沸5分鐘。

3.3利用westernblot印記分析唾液中mleg1蛋白含量，具體操作參考實(shí)施例2的westernblot檢測(cè)步驟。結(jié)果如圖1中的(d)所示。

由圖1中的(d)可知(圖1的(d)中：wt為野生型小鼠，mleg1^δ/δ為mleg1基因全身敲除型小鼠)，mleg1蛋白確實(shí)大量存在于野生型小鼠的唾液中，而mleg1全身敲除小鼠的唾液中并不存在mleg1蛋白。

實(shí)施例4

mleg1基因全身敲除小鼠(mleg1^δ/δ)的獲得

為了獲得mleg全身敲除小鼠，本發(fā)明的發(fā)明人選用傳統(tǒng)的cre-loxp系統(tǒng)將小鼠中的mleg1基因進(jìn)行敲除。該系統(tǒng)主要是依賴cre酶能夠識(shí)別loxp序列，并將兩個(gè)同向的loxp序列中的序列進(jìn)行刪除，從而達(dá)到基因敲除的目的。而當(dāng)cre酶在特定時(shí)空表達(dá)時(shí)，即可以使mleg1在特定時(shí)空敲除，從而避免胚胎致死造成的研究難點(diǎn)。這里本發(fā)明的發(fā)明人將loxp序列插入到mleg1第三個(gè)外顯子的兩側(cè)，同時(shí)在第三個(gè)外顯子和其后面的loxp序列之間加入一個(gè)neo基因，用于正向抗性篩選。通過(guò)同源重組，胚胎移植和遺傳篩選本發(fā)明的發(fā)明人獲取mleg1第三個(gè)外顯子兩端加入loxp序列的mleg^fl/fl穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因小鼠。

cre-loxp系統(tǒng)的另一個(gè)組成部分是cre酶。當(dāng)cre酶受特定空間或特定時(shí)間激活的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)時(shí)，就能在特定空間或時(shí)間將loxp序列進(jìn)行刪除。基于該原理獲取mleg1敲除小鼠的敲除策略如圖2所示。這里，本發(fā)明的發(fā)明人選用zp3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)cre表達(dá)的小鼠對(duì)mleg1進(jìn)行全身敲除。zp3是卵透明帶3(zonapellucidaglycoprotein3)基因，該基因只在第一次減數(shù)分裂前的卵母細(xì)胞中表達(dá)。

因此，將mleg1^fl/fl小鼠與zp3驅(qū)動(dòng)cre表達(dá)的小鼠(c57bl/6-tg(zp3-cre)93knw/jnju)配種時(shí)，得到zp3-cre⁺mleg1^fl/wt的小鼠。其中的母鼠產(chǎn)生的卵母細(xì)胞中，由于zp3啟動(dòng)子的激活，誘導(dǎo)cre酶的表達(dá)，從而將mleg1基因的第三個(gè)外顯子進(jìn)行敲除。將得到的母鼠與野生型公鼠配種后，得到zp3-cre⁺mleg1^δ/wt和zp3-cre^-mleg1^δ/wt小鼠。zp3-cre^-mleg1^δ/wt小鼠自交即可得到mleg1^δ/δ和mleg1^wt/wt小鼠。mleg1^δ/δ小鼠即為mleg1基因全身敲除小鼠。

采用pcr法，從上述得到的mleg1^δ/δ和mleg1^wt/wt小鼠中，鑒定出mleg1^δ/δ小鼠：

取小鼠并剪取腳趾用于編號(hào)，同時(shí)收集剪下腳趾用堿裂解法提取基因組dna。往收集的腳趾中加入75μl的裂解液i(25mmnaoh，edta0.2mm，ph12)，95℃30min，冰上冷卻。再加入75μl的裂解液ii(tris40mm，ph5)中合。充分反應(yīng)后作為pcr模板，每20μlpcr反應(yīng)中加入4μl模板進(jìn)行反應(yīng)?；蛐丸b定引物：上游引物mleg1fwd：cctttcttaatgacacttcagtatgt；下游引物mleg1rv：cacatgcctattcactctctcc。pcr采用普通的taq酶，反應(yīng)條件為：1、94℃3分鐘，2、94℃30秒，3、58℃30秒，4、72℃30秒，5、重復(fù)2到4步33次，6、72℃10分鐘。將pcr產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，其中野生型小鼠產(chǎn)生一條685bp的條帶，突變體小鼠由于第三個(gè)外顯子和部分內(nèi)含子被刪除，產(chǎn)生一個(gè)293bp大小的條帶(如圖3中的(a)所示)。

將鑒定出的mleg1^δ/δ小鼠按常規(guī)方法進(jìn)行飼養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

此外，雜交配種的結(jié)果顯示：當(dāng)對(duì)mleg1^δ/w自交配種時(shí)，mleg1^δ/δ小鼠可以正常的出生，呈現(xiàn)正常的1:3孟德?tīng)栠z傳比例。幼鼠可生長(zhǎng)發(fā)育為健康成鼠，且mleg1^δ/δ成年小鼠可以正常的產(chǎn)生后代，其每胎小鼠個(gè)數(shù)與野生型沒(méi)有明顯差異。

實(shí)施例5

mleg1^δ/δ小鼠的驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證mleg1確實(shí)被敲除，本發(fā)明的發(fā)明人分別收取鑒定為mleg1^δ/δ和mleg1^wt/wt的小鼠的唾液腺，提取總rna，進(jìn)一步合成cdna。實(shí)驗(yàn)方法如下。

5.1提取總rna：分別提取mleg1^δ/δ和mleg1^wt/wt的小鼠的唾液腺的總rna，提取方法同實(shí)施例1中的1.1步驟的rna提取。

5.2rna逆轉(zhuǎn)錄成cdna：取1μg提取的rna樣品，加入1μl50μm的oligodt，加入1μl10mmdntp，用水補(bǔ)齊到10μl。65℃變性5min，冰上至少1分鐘。加入10μlcdna混合物(4μl5xfirstlinebuffer，2μl0.1mdtt，1μlm-mlvrt酶，3μldepc水)。37℃反應(yīng)50min后在70℃15min終止反應(yīng)。合成的cdna用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)或保存于-20冰箱中。

5.3pcr鑒定：

用mleg1基因的第三個(gè)外顯子兩側(cè)的引物2qpcrf282：cctctgcagtttggctggcagt和3’armrev-1：tccaaggatgaggcatgggcttc，分別對(duì)野生型和mleg1敲除小鼠的cdna進(jìn)行pcr。pcr采用普通的taq酶，反應(yīng)條件為:1、94℃3分鐘，2、94℃30秒，3、58℃30秒，4、72℃30秒，5、重復(fù)2到4步33次，6、72℃10分鐘。

5.4擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，結(jié)果如圖3中的(b)所示(圖3的(b)中：wt為野生型小鼠，mleg1^δ/δ為mleg1基因全身敲除型小鼠)，野生型小鼠將產(chǎn)生一條約377bp大小的條帶，而突變體小鼠由于第三個(gè)外顯子的刪除將產(chǎn)生一條大小為192bp大小的條帶。同時(shí)擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)純化后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如圖9所示，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，mleg1^δ/δ的pcr產(chǎn)物的第三個(gè)外顯子確實(shí)被刪除(如圖4所示)。

5.5采用westernblot檢測(cè)mleg1^δ/δ和野生型的小鼠的唾液腺中的mleg1蛋白水平，具體步驟可參考實(shí)施例2。檢測(cè)結(jié)果如圖3中的(c)所示。

由圖3中的(c)可知，mleg1^δ/δ小鼠的唾液腺確實(shí)不表達(dá)出mleg1蛋白，而野生型的小鼠唾液腺表達(dá)出mleg1蛋白。

以上數(shù)據(jù)充分說(shuō)明，本發(fā)明的發(fā)明人獲得了mleg1^δ/δ小鼠，且mleg1基因敲除后并不影響該小鼠的生存和繁殖，以此mleg1^δ/δ小鼠作為研究mleg1基因的功能的模型動(dòng)物，所得到的研究結(jié)果可信度高。

實(shí)施例6

檢測(cè)mleg1的敲除對(duì)唾液腺的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響。

小鼠唾液腺的三個(gè)腺體中都表達(dá)mleg1，而頜下腺是小鼠唾液腺的最大組成部分，因此，本發(fā)明的發(fā)明人以頜下腺為研究對(duì)象，研究mleg1基因的敲除是否會(huì)對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響。

6.1采用he染色法觀察mleg1基因敲除是否會(huì)對(duì)唾液腺的形態(tài)結(jié)構(gòu)造成影響。

6.1.1制備頜下腺組織切片：小鼠頜下腺用4％的多聚甲醛(sigma，目錄號(hào)：p6148，溶解于pbs)在室溫中固定1小時(shí)后，用pbs洗兩次，每次10分鐘。在一個(gè)小空間內(nèi)，如1.5mleppendorf管的帽子中，用溫度約45℃的1.5％的低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液(用30％蔗糖pbs溶液煮沸溶化配制)冷卻固定。之后在30％的蔗糖pbs溶液中4℃平衡過(guò)夜。平衡后，這些小塊用o.c.t.復(fù)合物(sakura目錄號(hào)：4583)固定在塑料模型的底部。取-80℃預(yù)冷的酒精加入干冰，將塑料模型置入其中冷凍。冰凍的樣品立即使用，或-80℃下于密封盒中儲(chǔ)存。切片時(shí)，冰凍的樣品塊用o.c.t.復(fù)合物固定在支撐物中。樣品切片前在切片機(jī)(leica，hm505)-30℃下預(yù)冷平衡兩小時(shí)。樣品切成8～12μm厚度的薄片，多聚賴氨包被的玻璃載玻片(menzel，目錄號(hào)：j2800amnz)收集切的薄片上，收集樣品馬上使用或置于-80℃下保存。

6.1.2he染色：取出已經(jīng)切好的冰凍切片，蘇木素染色5min，流水沖洗5min，1％的鹽酸乙醇(1％的鹽酸+99％無(wú)水乙醇)分化5s，流水沖洗10min，伊紅染色5min，然后80％，95％，100％的乙醇一次清洗，每個(gè)2s，洗凈伊紅。放入二甲苯透明，滴上加拿大樹(shù)脂封片，鏡檢觀察。結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，mleg1^δ/δ小鼠和野生型小鼠的唾液腺he染色結(jié)果并無(wú)顯著差別，兩者都包含中空、伊紅染色較深的導(dǎo)管，以及伊紅染色稍淺的實(shí)質(zhì)腺泡組織，并且它們都有完整而緊湊的結(jié)構(gòu)，意味著mleg1敲除后對(duì)唾液腺的管狀運(yùn)輸系統(tǒng)和唾液分泌單元的發(fā)育和形態(tài)結(jié)構(gòu)并無(wú)顯著影響。

6.2采用蛋白免疫熒光標(biāo)記法觀察mleg1基因敲除是否會(huì)對(duì)唾液腺的形態(tài)結(jié)構(gòu)造成影響。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證mleg1敲除是否會(huì)對(duì)唾液腺的形態(tài)結(jié)構(gòu)造成影響，本發(fā)明的發(fā)明人選取兩個(gè)唾液腺的標(biāo)記蛋白唾液淀粉酶(amylase)和細(xì)胞連接蛋白(pan-cadherin)，進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，從細(xì)胞層面上分析研究mleg1的敲除對(duì)唾液腺形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。實(shí)驗(yàn)方法如下。

6.2.1制備頜下腺組織切片：方法同6.1.1步驟，或者直接采用步驟6.1.1已制備好的組織切片。

6.2.2取如上所述處理的組織切片用pbst(0.2％tritonx100)滲透，增加膜的通透性，便于抗體穿過(guò)細(xì)胞膜，一般處理時(shí)間為5min，接著用pbb(0.5％bsa(sangoncat.no.a0332)溶于1×pbs)清洗10min。

6.2.3用pbb配置20％的山羊血清進(jìn)行封閉，按100:1的比例用pbb稀釋一抗即抗pan-cadherin抗體(sigmac1821)，在4℃孵育樣品過(guò)夜。60rpm下，pbb清洗3x10min。以1:400比例用pbb稀釋熒光二抗(goatanti-mouseigg(h+l)secondaryantibody，alexafluorplus647，thermo，a32728)，并以1/500的比例加入dapi(beyotimecat.no.c1002)，室溫孵育1小時(shí)。60rpm下，pbb清洗3x10min后，用80％的甘油進(jìn)行封片。

6.2.4激光共聚焦顯微鏡(olympusfv1000)采集數(shù)據(jù)。結(jié)果如圖7所示。

6.2.5amylase蛋白免疫熒光標(biāo)記，方法與步驟6.2.1-6.2-4基本相同，區(qū)別在于，在6.2.3步驟中用抗amylase抗體(santacruzsc-9890)替換抗pan-cadherin抗體，熒光二抗替換為(goatanti-rabbitigg(h+l)secondaryantibody，alexafluor488，thermo，a-11034)。結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，mleg1敲除并沒(méi)有影響唾液淀粉酶(amylase)和細(xì)胞連接蛋白(pan-cadherin)的表達(dá)和分布，暗示著mleg1的敲除確實(shí)沒(méi)有對(duì)唾液腺的組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞組成和分布產(chǎn)生明顯的影響。

6.4對(duì)mleg1^δ/δ小鼠的唾液腺唾液產(chǎn)生功能進(jìn)行研究。

唾液腺的一個(gè)重要功能是產(chǎn)生和分泌唾液，因此，本發(fā)明的發(fā)明人也對(duì)mleg1^δ/δ小鼠的唾液腺唾液產(chǎn)生功能進(jìn)行研究。腺泡細(xì)胞分泌產(chǎn)生的粘液(mucin)可以被阿新藍(lán)(alcianblue)染色。因此，本發(fā)明的發(fā)明人用阿新藍(lán)染色評(píng)估唾液腺的分泌能力。用阿新藍(lán)分別染色野生型和mleg1^δ/δ小鼠的頜下腺切片。方法如下。

6.4.1制備頜下腺組織切片：同步驟6.1.1。

6.4.2阿新藍(lán)染色：切片用雙蒸水復(fù)水，之后用3％的乙酸處理3分鐘，接著阿新藍(lán)染色液(1％的阿新藍(lán)，3％的冰醋酸，ph2.5)室溫染色30分鐘，流水沖洗2分鐘后，雙蒸水潤(rùn)洗，用二甲苯潤(rùn)洗脫水后用加拿大樹(shù)脂封片鏡檢觀察。結(jié)果如圖7所示。

由圖7顯示的結(jié)果可知，野生型小鼠和mleg1^δ/δ小鼠的導(dǎo)管之間的腺泡都存在非常明顯的濃縮的阿新藍(lán)陽(yáng)性信號(hào)(圖7中箭頭所指位置)，意味著頜下腺腺泡都可以正常的產(chǎn)生和分泌粘液。因此，mleg1基因的敲除并沒(méi)有影響頜下腺分泌唾液的能力。

實(shí)施例7

7.1檢測(cè)mleg1^δ/δ小鼠血漿脂肪含量。

由于mleg1是一個(gè)分泌蛋白，而mleg1的敲除似乎對(duì)小鼠的唾液腺的發(fā)育和功能并沒(méi)有造成影響，因此唾液腺可能并不是mleg1的靶器官，也就是說(shuō)，mleg1可能運(yùn)輸?shù)絼e的器官進(jìn)而發(fā)揮功能。為了對(duì)mleg1的功能進(jìn)行研究，本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)小鼠進(jìn)行全身檢查，研究mleg1^δ/δ小鼠是否會(huì)出現(xiàn)一些生理上的異常。本發(fā)明的發(fā)明人抽取小鼠的血液，對(duì)血清中的各項(xiàng)血指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)方法如下。

7.1.1將小鼠麻醉后，通過(guò)股動(dòng)脈取血并置入抗凝管中，于1000g離心5min，取上清。

7.1.1將稀釋的上清通過(guò)自動(dòng)生化分析儀(迪安診斷代檢)(奧林巴斯)檢測(cè)各項(xiàng)血指標(biāo)。檢測(cè)結(jié)果如圖8中的(a)所示。

由圖8中的(a)可知(圖8的(a)中：位于上方的大括號(hào)半框顯示的是降低的指標(biāo)項(xiàng)目，位于下方的大括號(hào)半框顯示的mleg1^δ/δ小鼠中升高的指標(biāo)項(xiàng)目，wt1wt2為野生型，zcba1，zga2，zga3，為mleg1^δ/δ小鼠)，mleg1^δ/δ小鼠中三酰甘油的含量顯著減少。此外，3種膽汁酸(t-bil，dbil和ibil)都有所減少，而膽汁酸也跟脂肪的吸收代謝相關(guān)，這暗示著mleg1^δ/δ小鼠的代謝，尤其是脂肪代謝可能出現(xiàn)異常。因此，本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)小鼠進(jìn)行了甄別代謝是否紊亂的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)：葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)。

7.2葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)，具體方法如下。

7.2.1實(shí)驗(yàn)前小鼠饑餓過(guò)夜使血糖降低到最低水平，按1g葡萄糖每kg小鼠體重的量腹腔注射葡萄糖液(葡萄糖溶于滅菌pbs中)，分別在注射后0min，15min，30min，60min和90min檢測(cè)小鼠血糖含量。血糖含量通過(guò)roche血糖儀(accuchek)檢測(cè)。結(jié)果如圖8中的(b)所示。

由圖8中的(b)所顯示的結(jié)果可知(圖8的(b)中：實(shí)線為mleg1^δ/δ小鼠，虛線為野生型小鼠)，腹腔注射了葡萄糖的野生型小鼠由于葡萄糖被吸收，血糖先是上升，在注射后30min達(dá)到頂點(diǎn)，而為了維持機(jī)體的血糖平衡，機(jī)體會(huì)通過(guò)分泌胰島素降低血糖含量，因此在注射葡萄糖30min后，野生型小鼠的血糖開(kāi)始緩慢下降。而注射了葡萄糖的mleg1^δ/δ小鼠，葡萄糖卻以更快的速度被吸收并進(jìn)入血液循環(huán)，注射后10min，血糖含量就已達(dá)到最高點(diǎn)，且比野生型小鼠的血糖最高點(diǎn)更高。另一方面，mleg1^δ/δ小鼠的血液中的葡萄糖也以更快的速率回到平衡狀態(tài)。因此，盡管mleg1^δ/δ小鼠保留了的血糖吸收和調(diào)控機(jī)能，但mleg1^δ/δ小鼠的代謝出現(xiàn)了某種程度的異常。

實(shí)施例8

檢測(cè)mleg1^δ/δ小鼠肝臟脂肪含量

肝臟是哺乳動(dòng)物體內(nèi)最大的器官，是機(jī)體代謝的中樞所在，是脂類合成代謝和分解代謝的重要場(chǎng)所。此外，當(dāng)肝臟合成脂肪時(shí)需要通過(guò)血液循環(huán)運(yùn)往脂肪組織，當(dāng)機(jī)體處于饑餓狀態(tài)，需要利用脂肪時(shí)，脂肪組織儲(chǔ)存的脂肪需要通過(guò)血液循環(huán)運(yùn)往肝臟進(jìn)行利用。通過(guò)對(duì)小鼠血清中的脂肪含量檢測(cè)來(lái)驗(yàn)證mleg1敲除影響了肝臟的功能。

8.1檢測(cè)血清中的脂肪含量。實(shí)驗(yàn)方法如下。

8.1.1取10周齡野生型和mleg1^δ/δ小小鼠的血清，在儀器上檢測(cè)血清中的三酰甘油和膽固醇含量，重復(fù)3次，結(jié)果以平均值表示。結(jié)果如圖8中的(c)所示。

由圖8中的(c)可知(圖8的(c)中：灰色柱狀為mleg1^δ/δ小鼠，白色柱狀為野生型小鼠，trig代表三酰甘油，tchol代表膽固醇)，mleg1^δ/δ小鼠血液中三酰甘油減少，只有野生型小鼠的一半左右。

8.2檢測(cè)肝臟組織中的脂肪含量。

上述結(jié)果暗示mleg1敲除影響了肝臟的功能。因此，本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)肝臟進(jìn)行重點(diǎn)研究，對(duì)肝臟脂肪含量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖8中的(d)所示。

由圖8中的(d)可知(圖8的(d)中：灰色柱狀為mleg1^δ/δ小鼠，白色柱狀為野生型小鼠，trig代表三酰甘油，tchol代表膽固醇)，在肝臟中，三酰甘油也是顯著的減少，同時(shí)，mleg1^δ/δ小鼠肝臟中膽固醇的含量也顯著地減少。

實(shí)施例9

mleg1敲除小鼠脂肪組織中脂肪儲(chǔ)存量減少。

mleg1^δ/δ小鼠血液和肝臟中脂肪含量的減少促使本發(fā)明的發(fā)明人去研究脂肪的儲(chǔ)存場(chǎng)所，也即脂肪組織中的脂肪含量是否減少。小鼠的脂肪組織主要有腹部脂肪組織和背部脂肪組織。

10.1分別檢測(cè)小鼠的腹部脂肪組織和背部脂肪組織的脂肪含量，實(shí)驗(yàn)方法如下。

10.1.1小鼠猝死后，采用常規(guī)方法解剖觀察腹部和背部脂肪。結(jié)果如圖9所示。

由圖9中的(a)和(b)的顯示結(jié)果可知，10周齡的mleg1^δ/δ小鼠中，背部脂肪組織中的脂肪含量減少的尤為明顯，而腹部脂肪組織中脂肪含量也有一定程度的減少(如圖9中的(c)和(d)所示)。因此mleg1的敲除，確實(shí)減少了小鼠體內(nèi)的脂肪儲(chǔ)存。

10.2小鼠在高脂喂食條件下的生長(zhǎng)情況

上述結(jié)果，也進(jìn)一步促使本發(fā)明的發(fā)明人猜想小鼠是否會(huì)對(duì)高脂食物喂食引起的肥胖產(chǎn)生抵抗。通過(guò)對(duì)不同類型的小鼠持續(xù)地喂食高脂飼料。實(shí)驗(yàn)方法如下。

10.2.1在鼠籠中提供充足的正常食物或高脂食物，讓小鼠自由采食。

10.2.2在不同的時(shí)間點(diǎn)(4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16、17、19、22、24周齡)檢測(cè)其體重，重復(fù)兩次，每次每組3到6只小鼠，結(jié)果以平均值表示。以檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，以體重值(單位為g)為縱坐標(biāo)，繪制小鼠的體重變化曲線圖，結(jié)果圖10中的(a)所示。

由圖10中的(a)可知(圖中：chow代表正常食物飼養(yǎng)、hfd代表高脂飼料飼養(yǎng)、mleg1^δ/δchow代表采用正常食物飼養(yǎng)的mleg1^δ/δ、mleg1^δ/δhfd代表采用高脂食物飼養(yǎng)的mleg1^δ/δ、wtchow代表采用正常食物飼養(yǎng)的野生型小鼠、wthfd代表采用高脂食物飼養(yǎng)的野生型小鼠)，當(dāng)給野生型和mleg1^δ/δ小鼠進(jìn)行正常食物的喂食時(shí)，兩種小鼠的體重都隨著年齡增長(zhǎng)而增長(zhǎng)。而當(dāng)用高脂食物代替正常食物進(jìn)行喂食時(shí)，野生型的小鼠由于獲取過(guò)多的能量并將這些能量以脂肪的形式進(jìn)行儲(chǔ)存，因此，野生型的小鼠在高脂喂食的情況下，體重快速增長(zhǎng)，并最終發(fā)展成為肥胖癥。同時(shí)，突變體小鼠在高脂喂食下，體重增長(zhǎng)與正常飲食的小鼠并無(wú)明顯差別。

另外，當(dāng)用高脂食物進(jìn)行喂食六個(gè)月后，野生型小鼠體型增大，腹部和背部存在很厚的脂肪層，表現(xiàn)出非常明顯的肥胖癥狀，而mleg1^δ/δ小鼠則繼續(xù)保持著在正常喂食情況下小鼠的體型(如圖10中的(b)所示)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)mleg1的功能確實(shí)與脂肪代謝息息相關(guān)。

實(shí)施例10

脂肪酸合成能力的減弱導(dǎo)致mleg1^δ/δ小鼠脂類減少

10.1檢測(cè)肝臟中β氧化相關(guān)酶類的表達(dá)水平

脂肪含量的減少一方面可能是脂肪消耗增加，另一方面則可能脂肪酸或三酰甘油合成減少所致。脂肪酸的分解代謝主要在肝臟中通過(guò)β氧化實(shí)現(xiàn)。因此，通過(guò)熒光定量pcr(qrt-pcr)檢測(cè)β氧化相關(guān)酶類的表達(dá)水平來(lái)驗(yàn)證mleg1^δ/δ小鼠脂肪含量的減少是由脂肪消耗增加還是脂肪酸或三酰甘油合成減少所致。實(shí)驗(yàn)方法如下。

10.1.1采用qrt-pcr檢測(cè)野生型和mleg1^δ/δ小鼠肝臟β氧化相關(guān)酶基因(fbp1/pcx/acox/pepck)的表達(dá)水平，每組取三只獨(dú)立的小鼠，基因表達(dá)量以β-actin為參照歸一化后，表達(dá)量以平均值表示。qrt-pcr的檢測(cè)方法如下(后文同此)：

(1)rna提?。翰僮鞣椒ㄍ瑢?shí)施例1中的1.1rna提取步驟，或者直接采用實(shí)施例1中的1.1rna提取步驟所提取出的rna樣本進(jìn)行檢測(cè)。(2)rna純化：由于trizol法抽提的總rna可能會(huì)含有基因組dna的污染，因此，用于熒光定量pcr的rna樣品先用dna酶消化除去可能的存在的dna。50μl反應(yīng)體系中，按每10μg總rna加入2單位無(wú)rna酶污染的dnasei(nebcat.no.m0303s)，加入5μl10x的反應(yīng)緩沖液，用depc水補(bǔ)齊到50μl。37℃反應(yīng)20min后用minikit(qiagencat.no.74106)進(jìn)行rna純化。(3)rna逆轉(zhuǎn)錄：純化后的rna經(jīng)上述步驟逆轉(zhuǎn)錄為cdna，rna通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(m-mlvfirststrandkit，lifetechnologies，cat.no.c28025-032)合成cdna。(4)合成步驟如下：取1μg提取的rna樣品，加入1μl50μm的oligodt，加入1μl10mmdntp，用水補(bǔ)齊到10μl。65℃變性5min，冰上至少1分鐘。加入10μlcdna混合物(4μl5xfirstlinebuffer，2μl0.1mdtt，1μlm-mlvrt酶，3μldepc水)。37℃反應(yīng)50min后在70℃15min終止反應(yīng)。合成的cdna用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)或保存于-20冰箱中。

(5)熒光定量pcr：以得到的cdna為模板進(jìn)行熒光定量pcr。熒光定量反應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)使用ssofasttmevasupermix試劑盒(bio-radcat.no.172-5201)進(jìn)行。每個(gè)反應(yīng)以10μl體系進(jìn)行，其中含cdna模板0.5μl，supermix5μl，10μm正反向引物各0.5μl，雙蒸水3.5μl。熒光定量pcr所用正反向引物為：正向引物betaactinfwd：gtgacgttgacatccgtaaaga；反向引物betaactinrv：gccggactcatcgtactcc。熒光信號(hào)的定量通過(guò)cfx96tmreal-timesystem(bio-radc1000tmthermalcycler)進(jìn)行。各基因所用引物如表1所示。

檢測(cè)結(jié)果如圖11的(a)所示。

表1.本發(fā)明實(shí)施例進(jìn)行qrt-pcr所用的引物序列表

由圖11中的(a)可知(圖11的(a)中：縱坐標(biāo)為相對(duì)表達(dá)水平，橫坐標(biāo)為相關(guān)的β氧化酶基因的相對(duì)表達(dá)水平)，脂肪酸的分解代謝主要在肝臟中通過(guò)β氧化實(shí)現(xiàn)，對(duì)比野生型和mleg1^δ/δ小鼠肝臟中β氧化相關(guān)酶類的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)mleg1基因的敲除并沒(méi)有造成這些基因表達(dá)的異常升高，說(shuō)明mleg1的敲除并沒(méi)有加速β氧化的發(fā)生，即并沒(méi)有造成脂肪消耗的增加。mleg1^δ/δ小鼠的脂肪減少由脂肪酸或三酰甘油合成減少所致。

10.2檢測(cè)肝臟中脂肪酸合成相關(guān)酶類的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)方法如下。

10.2.1采用與10.1.1類似的方法檢測(cè)野生型和mleg1^δ/δ小鼠肝臟脂肪酸合成相關(guān)酶(acc1/acc2/fas/scd1/acl/gpat1/dgat1/dgat2)的表達(dá)水平，所用引物如下表1所示。

檢測(cè)結(jié)果如圖11中的(b)所示。

由圖11中的(b)可知(圖11的(b)中：縱坐標(biāo)為相對(duì)表達(dá)水平，橫坐標(biāo)為脂肪酸合成相關(guān)酶)，通過(guò)比較野生型和mleg1^δ/δ小鼠肝臟中脂肪酸合成相關(guān)酶類的表達(dá)譜時(shí)，發(fā)現(xiàn)這些酶的表達(dá)均有不同程度的降低。脂肪酸從頭合成相關(guān)的幾個(gè)酶的表達(dá)都有不同程度的減少，基本為野生型的一半左右。其中，acc1，acc2，fas和dgat1在mleg1^δ/δ敲除小鼠中都顯著減少。

當(dāng)進(jìn)一步的觀察這些基因在脂類合成過(guò)程中發(fā)揮的作用時(shí)，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)這些基因編碼催化從三羧酸循環(huán)產(chǎn)物到脂肪酸合成一系列生化反應(yīng)的酶類(如圖12所示，圖中：方框標(biāo)注的是mleg1敲除后差異表達(dá)的基因)。這些基因(scd1/fasn/acc/acl)的表達(dá)下調(diào)，意味著mleg1^δ/δ小鼠的肝臟中脂肪從頭合成能力的減弱，即將其它能源物質(zhì)轉(zhuǎn)化為脂肪酸并進(jìn)行脂肪存儲(chǔ)的能力顯著減弱。肝臟內(nèi)合成脂肪的減少，解釋了肝臟內(nèi)部血管附近中性脂肪的減少，解釋了mleg1^δ/δ小鼠血液中三酰甘油為何減少，也解釋了mleg1^δ/δ小鼠脂肪組織脂肪減少的原因。

實(shí)施例11

11.1檢測(cè)調(diào)控脂類合成基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平

調(diào)控脂類合成基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子主要有4個(gè)，pparγ，chrebp，pgc1α和srebp1c。因此，本發(fā)明的發(fā)明人先對(duì)肝臟中這幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)方法如下。

11.1.1采用與步驟11.1.1類似的方法檢測(cè)野生型和mleg1^δ/δ小鼠肝臟轉(zhuǎn)錄因子(pparγ，chrebp，pgc1α和srebp1c)表水平具體實(shí)驗(yàn)方法可參考實(shí)施例2中的步驟2.1-2.4，所用的相關(guān)引物見(jiàn)表1，檢測(cè)結(jié)果如圖13所示。

由圖13可知(圖中：縱坐標(biāo)為相對(duì)表達(dá)水平，橫坐標(biāo)為調(diào)控脂肪合成的轉(zhuǎn)錄因子)，4種轉(zhuǎn)錄因子(pparγ，chrebp，pgc1α和srebp1c)中只有srebp1c的表達(dá)在mleg1^δ/δ小鼠肝臟中顯著減少，因此，mleg1^δ/δ小鼠中肝臟的脂類合成酶的表達(dá)下降是srebp1c表達(dá)減少所致。

實(shí)施例12

12.1mleg1^δ/δ小鼠肝臟中的akt的磷酸化水平

srebp1c的活性調(diào)控主要有兩種方式：其一是未被磷酸化的srebp1c通常駐留在細(xì)胞質(zhì)中，而akt通過(guò)mtorc1調(diào)控srebp1c的磷酸化，從而使得其從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核中，并發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄活性；其二是akt可以以一種不是特別明了的機(jī)制正向調(diào)控srebp1c的轉(zhuǎn)錄水平。因此srebp1c的活性調(diào)控主要是通過(guò)akt的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

本實(shí)施例中，本發(fā)明的發(fā)明人檢測(cè)脂類合成中心肝臟，以及mleg1表達(dá)的唾液腺中akt活性水平。而akt的活性可以用其磷酸化水平來(lái)指示。因此，可通過(guò)檢測(cè)磷酸化水平來(lái)反應(yīng)akt的活性。實(shí)驗(yàn)方法如下。

12.1.1按步驟3.1方法提取肝臟，唾液腺蛋白，通過(guò)westernblot，使用akt磷酸化抗體(cellsignalling#4060p)檢測(cè)akt的磷酸化水平。

檢測(cè)結(jié)果如圖14中的(a)和(b)所示。

由圖14中的(a)和(b)可知(圖中：wt代表野生型小鼠，mleg1^δ/δ代表mleg1基因敲除小鼠)，mleg1^δ/δ小鼠肝臟中的akt的磷酸化水平顯著低于野生型小鼠(如圖14的(a)所示)。而唾液腺中的akt磷酸化的差異更為顯著，野生型小鼠中存在明顯的磷酸化akt蛋白，而mleg1^δ/δ小鼠的唾液腺中基本檢測(cè)不到akt的磷酸化(如圖14的(b)所示)。這些結(jié)果都證明，mleg1^δ/δ小鼠akt的活性受到了抑制，也給出了srebp1c表達(dá)減少的解釋。

實(shí)施例13

唾液腺細(xì)胞分泌到上清液的因子可以誘導(dǎo)hepg2細(xì)胞akt磷酸化

為了驗(yàn)證mleg1的敲除是否和肝臟中akt活性減弱直接相關(guān)，本發(fā)明的發(fā)明人首先采取體外的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)檢測(cè)mleg1能否能夠激活akt。由于mleg1是在小鼠唾液腺中豐富表達(dá)的分泌蛋白，如果對(duì)唾液腺細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，則可以在細(xì)胞培養(yǎng)上清中得到分泌出來(lái)的mleg1。因此，本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)唾液腺原代培養(yǎng)的細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行westernblot檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)方法如下。

13.1唾液腺細(xì)胞的原代培養(yǎng)：

13.1.1小鼠斷頸處死后，迅速的取下唾液腺，并用滅菌的pbs清洗兩次，除盡粘附的毛發(fā)。用剪刀將取下的唾液腺剪碎。

13.1.2以40mg/ml的比例將剪碎的唾液腺收集到buffer中(體積為v)。每2mlbuffer中加入25μl透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase)，25μl二型膠原酶(collagenaseii)和250μl50mm的cacl2，于37℃孵育40min。

13.1.31500rpm離心去上清，并重復(fù)步驟13.1.2。

13.1.41500rpm離心去上清，并用v體積的buffer清洗，離心去上清，再用1/2v的buffer重復(fù)清洗一次，離心去上清。

13.1.5用1/2v的buffer重懸浮離心下來(lái)的組織，并用細(xì)胞過(guò)濾器(cellstrainer，bdcat.no.352340)過(guò)濾取濾液用msg培養(yǎng)液培養(yǎng)。

其中，所用溶液配方如下：

buffer：(1％bsa(amrescocat.no.0332)inhank’sbuffer(beyotime，cat.no.c0218))。

重組酶配方：用buffer溶解透明質(zhì)酸酶(sangonbiotech，cat.no.a002594)，濃度為40mg/ml；用buffer溶解二型膠原酶(gibcocat.no.17101-015)，濃度為23mg/ml。酶溶液均新鮮配置為宜。

msg培養(yǎng)液：dmem高糖培養(yǎng)基(gibcocat.no.11965-092)，1x的青霉素和鏈霉素(beyotine，cat.no.c0222)，1x的insulin-transferin-selenium-x(gibco，cat.no.41400-045)，1μm的dexamethasone(sigmad4902)，10％的胎牛血清(gibcocat.no.16000-044)。

13.2提取經(jīng)原代培養(yǎng)后的唾液腺細(xì)胞的總蛋白：取上述步驟得到的培養(yǎng)液，于1000g離心5min，棄上清后加入sds裂解液(63mmtris-hcl，ph6.8，10％甘油，5％β-巰基乙醇，3.5％sds，1x的complete)裂解，100℃變性7min后進(jìn)行后續(xù)westernblot檢測(cè)分析或保存于-20℃中。(對(duì)于貼壁細(xì)胞，按如下進(jìn)行：去培養(yǎng)上清后，加入sds裂解液，用細(xì)胞刮刮下貼壁細(xì)胞后收集于1.5ml離心管中。100℃變性7min后進(jìn)行后續(xù)westernblot檢測(cè)分析或保存于-20℃中)。

13.3直接取原代培養(yǎng)后的細(xì)胞培養(yǎng)上清用于后續(xù)進(jìn)行westernblot檢測(cè)。

13.4westernblot檢測(cè)的方法同步驟實(shí)施例3的步驟3.2。檢測(cè)結(jié)果如圖14中的(c)所示。

由圖14中的(c)可知(圖14的(c)中：ckmedia代表未培養(yǎng)唾液腺細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液，salivarymedia代表培養(yǎng)了野生型唾液腺細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液，salivarycell代表唾液腺原代培養(yǎng)的細(xì)胞)，細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清中都存在mleg1蛋白，并且通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞中的akt蛋白量確證細(xì)胞培養(yǎng)上清中的mleg1并不是由于細(xì)胞污染導(dǎo)致的。

實(shí)施例14

在實(shí)施例13的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，本發(fā)明的發(fā)明人用這種含有mleg1的培養(yǎng)液(來(lái)自野生型唾液腺細(xì)胞培養(yǎng)上清)和不含mleg1蛋白的培養(yǎng)液(來(lái)自mleg1^δ/δ小鼠唾液腺細(xì)胞培養(yǎng)上清)去培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞hepg2，研究唾液腺分泌物能否直接促進(jìn)肝癌細(xì)胞akt的磷酸化，并且這種誘導(dǎo)激活磷酸化akt的能力在有無(wú)mleg1蛋白條件下是否存在差異。實(shí)驗(yàn)方法如下。

14.1人肝癌細(xì)胞hepg2培養(yǎng)：用dmem高糖型培養(yǎng)基加入10％的新生牛血清(gibcocat.no.16010-159)培養(yǎng)在5％co2，37℃的恒溫及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代時(shí)，除盡培養(yǎng)液，用0.25％胰酶(edta-free，sigmacat.no.t4549)適時(shí)消化，取適量細(xì)胞傳代培養(yǎng)或后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

14.2以原代培養(yǎng)野生型小鼠唾液腺細(xì)胞和mleg1^δ/δ小鼠唾液腺細(xì)胞培養(yǎng)上清孵育貼壁生長(zhǎng)的hepg2細(xì)胞，分別在20分鐘和10小時(shí)后收集細(xì)胞樣品。

14.3通過(guò)westernblot，用akt磷酸化抗體檢測(cè)p-akt的含量，以反應(yīng)akt的磷酸化水平。

14.4結(jié)果如圖14中的(d)所示。

由圖14中的(d)可知(圖14的(d)中：ck代表mleg1^δ/δ小鼠唾液腺細(xì)胞培養(yǎng)上清，mleg1代表野生型小鼠唾液腺細(xì)胞培養(yǎng)上清)，不論是培養(yǎng)hepg2細(xì)胞10小時(shí)，還是20分鐘，用野生型唾液腺細(xì)胞上清培養(yǎng)的hepg2細(xì)胞的akt的磷酸化水平都顯著高于用mleg1^δ/δ上清培養(yǎng)的細(xì)胞，并且在短短的20分鐘內(nèi)mleg1就可以誘導(dǎo)akt的磷酸化，證明野生型小鼠唾液腺分泌物確實(shí)能夠促進(jìn)akt磷酸化，而當(dāng)mleg1敲除后，唾液腺分泌物對(duì)akt激活的能力顯著下降，證明唾液腺分泌的mleg1可以直接或間接的對(duì)akt進(jìn)行活性調(diào)節(jié)。

實(shí)施例15

唾液腺細(xì)胞分泌到上清液的因子可以誘導(dǎo)mleg1^δ/δ小鼠肝臟akt的磷酸化

上述體外實(shí)驗(yàn)證明野生型唾液腺細(xì)胞分泌物能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的akt的磷酸化。進(jìn)一步的，本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)這些分泌物能否對(duì)體內(nèi)的肝臟akt的磷酸化水平進(jìn)行調(diào)控進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)方法如下。

15.1分別采用腹腔注射和尾靜脈注射方法將野生型和mleg1^δ/δ小鼠唾液腺原代培養(yǎng)細(xì)胞分泌的上清注射到mleg1^δ/δ小鼠中。

15.2注射后1小時(shí)猝死小鼠，收集肝臟，并通過(guò)westernblot，使用akt磷酸化抗體檢測(cè)肝臟中akt的磷酸化水平是否發(fā)生變化。結(jié)果如圖15中的(a)所示。

由圖15中的(a)可知(圖15的(a)中：wt代表野生型小鼠唾液腺細(xì)胞培養(yǎng)上清，mleg1^δ/δ代表mleg1^δ/δ小鼠唾液腺細(xì)胞培養(yǎng)上清，lumbar代表腹腔注射，vein代表尾靜脈注射)，不論是腹腔注射或尾靜脈注射的野生型的唾液腺細(xì)胞分泌物都能促進(jìn)mleg1^δ/δ小鼠肝臟akt的磷酸化。以上結(jié)果證明，含mleg1的唾液腺分泌物同樣可以對(duì)體內(nèi)肝臟中的akt磷酸化進(jìn)行調(diào)控，此外，該結(jié)果還暗示唾液腺分泌物可以通過(guò)血液運(yùn)輸最終到達(dá)肝臟發(fā)揮作用。

實(shí)施例16

從唾液腺純化所得的不同濃度的mleg1蛋白誘導(dǎo)akt的磷酸化

野生型和mleg1^δ/δ小鼠唾液腺細(xì)胞最直接的差別在于它們能否表達(dá)mleg1，那么，野生型和mleg1^δ/δ小鼠唾液腺細(xì)胞分泌物造成的akt磷酸化差異是否是由mleg1直接造成的，即mleg1蛋白是否能夠直接誘導(dǎo)akt的磷酸化。本發(fā)明的發(fā)明人通過(guò)如下實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行研究。

16.1柱層析分離純化的mleg1蛋白誘導(dǎo)akt的磷酸化水平。實(shí)驗(yàn)方法如下。

16.1.1取兩到三只野生型小鼠的唾液腺，置于預(yù)冷的pbs緩沖液中漂洗，取出后用剪刀剪成細(xì)小的碎片，之后轉(zhuǎn)移到組織勻漿器中。加入4ml裂解液(50mm的tris-hcl，ph8.0，150mm的nacl，0.5％的np40，2x的complete)，冰上充分勻漿。之后用23g針頭反復(fù)抽碎，4℃垂直搖床孵育30min，4℃離心機(jī)12000g離心15min，取上清。

16.1.2將上清在4℃中勻速通過(guò)sephalose6b分子篩，其中洗脫用pbs緩沖液。以4ml/管收集不同洗脫組分。

16.1.3并通過(guò)westernblot檢測(cè)各組分中mleg1的含量。取mleg1含量最高的一管為純化的mleg1，并以大腸桿菌中重組表達(dá)的mleg1蛋白為對(duì)照，估算mleg1的濃度，并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

16.1.4將純化的mleg1蛋白稀釋至不同的濃度(分別為3.14x10^-2ng/μl、0.314ng/μl和3.14ng/μl)分別加入hepg2培養(yǎng)基培養(yǎng)hepg2中，37℃孵育20分鐘后，然后提取細(xì)胞總蛋白(提取方法參考步驟13.2)，并通過(guò)westernblot檢測(cè)各濃度下的akt的磷酸化水平(參考步驟14.3，相應(yīng)抗體選用抗p-akt抗體(s473，cellsignalling#4060p)，使用時(shí)稀釋比例為1:1000)。結(jié)果如圖15中的(b)所示。

由圖15中的(b)可知(圖15的(b)中：a代表3.14ng/μl、b代表0.314ng/μl、c代表3.14x10^-2ng/μl、“-”代表未加入)，mleg1蛋白可以誘導(dǎo)akt的磷酸化，并且納克級(jí)的mleg1即可誘導(dǎo)hepg2細(xì)胞的akt磷酸化。

16.2來(lái)自野生型小鼠和mleg1^δ/δ小鼠唾液腺的組分誘導(dǎo)akt的磷酸化水平。實(shí)驗(yàn)方法如下。

16.2.1分別提取野生型小鼠和mleg1^δ/δ小鼠唾液腺富含mleg1蛋白的組分。

16.2.2將16.2.1提取的組分分別加入到hepg2培養(yǎng)基中培養(yǎng)hepg2，37℃孵育20分鐘后，然后提取培養(yǎng)后的細(xì)胞的總蛋白(提取方法可參考步驟13.2)。

16.2.3通過(guò)westernblot檢測(cè)各濃度下的akt的磷酸化水平(具體可參考步驟13.2，相應(yīng)抗體選用抗p-akt抗體(s473，cellsignalling#4060p)，使用時(shí)稀釋比例為1:1000)。結(jié)果如圖16中的(a)所示。

由圖16中的(a)可知(圖16的(a)中：“-”代表mleg1^δ/δ小鼠唾液腺總蛋白，“+”代表野生型小鼠唾液腺總蛋白)，野生型小鼠唾液腺含mleg1組分誘導(dǎo)akt磷酸化顯著強(qiáng)于mleg1^δ/δ小鼠唾液腺相應(yīng)組分。

實(shí)施例17

mleg1激活akt依賴pi3k通路

由于mleg1是一個(gè)細(xì)胞分泌蛋白，而用mleg1培養(yǎng)hepg2細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，mleg1相當(dāng)于一個(gè)細(xì)胞外蛋白，同時(shí)akt的磷酸化是細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)重要的信號(hào)傳遞過(guò)程，因此，這里涉及細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)化為激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的過(guò)程?？v觀已知的細(xì)胞外信號(hào)誘導(dǎo)的akt磷酸化，主要依賴于pi3k磷酸化pip2，并將其轉(zhuǎn)化為pip3，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)akt的磷酸化。因此，mleg1誘導(dǎo)的akt磷酸化可能也依賴pi3k通路。本發(fā)明的發(fā)明人選用pi3k的特異性抑制劑ly290004抑制pi3k信號(hào)通路，并觀察pi3k通路被抑制后，mleg1對(duì)akt激活能力是否發(fā)生改變。實(shí)驗(yàn)方法如下。

17.1處理前，hepg2細(xì)胞用0.1％血清饑餓培養(yǎng)過(guò)夜，用0.25％胰酶(edta-free，sigmacat.no.t4549)適時(shí)消化，取適量細(xì)胞置于離心管中，

17.2用野生型(含mleg1)和mleg1^δ/δ(不含mleg1)小鼠唾液腺細(xì)胞原代培養(yǎng)的上清液培養(yǎng)hepg2細(xì)胞，并在野生型小鼠唾液腺細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中加入不同濃度(低到高依次為10μm，20μm和40μm)的pi3k抑制劑ly290004(cellsignaling)抑制pi3k通路。

17.3通過(guò)westernblot檢測(cè)各濃度下的akt的磷酸化水平，具體操作可參考步驟18.2.2。檢測(cè)結(jié)果如圖16中的(b)所示。

17.4另外，在步驟17.1之后，用柱層析純化的mleg1和10μm的ly290004培養(yǎng)hepg2細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15min，1000g離心5min去上清。加入sds裂解液裂解細(xì)胞提取蛋白(具體操作可參考步驟13.2)。

17.5通過(guò)westernblot檢測(cè)hepg2細(xì)胞的akt的磷酸化水平。檢測(cè)結(jié)果如圖16中的(c)所示。

由圖16中的(b)可知(圖16的(b)中：wtmedia代表野生型小鼠唾液腺原代培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)上清，“-”代表未加入，a代表加入濃度為10μm，b代表加入濃度為10μm，c代表加入濃度為10μm，ckmedia代表mleg1^δ/δ小鼠唾液腺細(xì)胞培養(yǎng)上清)，野生型小鼠唾液腺原代培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)上清(wtmedia)激活akt的能力顯著強(qiáng)于mleg1^δ/δ小鼠唾液腺細(xì)胞培養(yǎng)上清(ckmedia)，當(dāng)在wtmedia里面加入不同濃度pi3k抑制劑ly29004時(shí)，均可以非常顯著地抑制野生型小鼠的唾液腺成分引起的akt的磷酸化。說(shuō)明，當(dāng)加入ly290004時(shí)，含mleg1的培養(yǎng)液不再能誘導(dǎo)akt的磷酸化，并且細(xì)胞內(nèi)的akt磷酸化保持在非常低的水平。而pten的磷酸化水平并沒(méi)有隨著ly290004的加入升高，證明這種akt磷酸化水平的抑制并不是由于pten引起的。

同時(shí)，由圖16中的(c)可知(圖16的(c)中：上排中的“-”代表mleg1^δ/δ小鼠唾液腺，“+”代表野生型小鼠唾液腺；下排中的“-”代表加入ly29004，“+”代表未加入ly29004)，本發(fā)明的發(fā)明人在hepg2培養(yǎng)基中加入柱層析純化的mleg1和10μmly290004，發(fā)現(xiàn)ly290004能夠完全的抑制mleg1對(duì)akt磷酸化的誘導(dǎo)。因此，mleg1誘導(dǎo)的akt磷酸化依賴于pi3k信號(hào)通路。

實(shí)施例18

mleg1通過(guò)rtk激活akt

細(xì)胞外信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)需要經(jīng)過(guò)細(xì)胞膜，而連接細(xì)胞外信號(hào)與細(xì)胞內(nèi)pi3k信號(hào)的一類膜蛋白即受體酪氨酸激酶(receptortyrosinekinase，rtk)。rtk與相應(yīng)配體結(jié)合后能夠自身磷酸化并磷酸化下游底物，并且這種磷酸化發(fā)生在酪氨酸殘基上，因此，可以通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總酪氨酸磷酸化的水平差異來(lái)甄別mleg1誘導(dǎo)的akt磷酸化是否是通過(guò)rtk來(lái)實(shí)現(xiàn)的。實(shí)驗(yàn)方法如下。

18.1往hepg2細(xì)胞培養(yǎng)基中加入mleg1并培養(yǎng)hepg2細(xì)胞，然后提取細(xì)胞總蛋白。

18.2通過(guò)酪氨酸磷酸化抗體4g10(millipore，05-321)檢查細(xì)胞內(nèi)的總的酪氨酸磷酸化的水平。結(jié)果如圖16中的(d)所示。

由圖16中的(d)可知(圖16的(d)中：ck為未加入mleg1)，mleg1蛋白加入后，細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸磷酸化水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組。此外，western結(jié)果也指示，發(fā)生酪氨酸磷酸化的蛋白的分子量都較大，這與rtk的分子量都較大非常吻合。進(jìn)一步暗示著mleg1促進(jìn)akt的磷酸化是很可能是通過(guò)rtk來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

實(shí)施例19

mleg1激活egfr

人類基因組中，總共有58個(gè)基因編碼rtk，因此，本發(fā)明的發(fā)明人決定研究mleg1是具體通過(guò)激活哪個(gè)rtk來(lái)傳遞信號(hào)的，這里本發(fā)明的發(fā)明人選取了r&d的rtk篩選系統(tǒng)。該系統(tǒng)通過(guò)將49個(gè)rtk的抗體分別交聯(lián)在同一張膜上，通過(guò)這些抗體將細(xì)胞裂解液中的相應(yīng)的rtk蛋白拉下并附著在膜上?；趓tk激活會(huì)在自身的酪氨酸上發(fā)生磷酸化特性，可以通過(guò)酪氨酸磷酸化抗體檢測(cè)各個(gè)附著的rtk酪氨酸磷酸化水平，用以指示rtk的激活情況。實(shí)驗(yàn)方法如下。

19.1受體酪氨酸激酶的的篩選通過(guò)rtkassaykit(proteomeprofilerhumanphospho-rtkarraykit，r&dcat.no.ary001b)依說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。該kit總共可以檢測(cè)58個(gè)rtk中的49個(gè)，操作步驟簡(jiǎn)而言之，用mleg1和對(duì)照分別處理細(xì)胞(長(zhǎng)滿于10cm培養(yǎng)皿)，用500μllysisbuffer17裂解細(xì)胞。rtk篩選膜經(jīng)assaybuffer1封閉1小時(shí)后，敷上細(xì)胞裂解液結(jié)合過(guò)夜，通過(guò)1xwashbuffer洗3次，每次10分鐘，加入用1xarraybuffer2以1：5000倍稀釋的anti-phospho-tyrosine-hrpdetectionantibody，室溫孵育2小時(shí)。1xwashbuffer洗3次，每次10分鐘后，敷上chemireagentmix顯影，通過(guò)熒光化學(xué)發(fā)光成像儀(clinxscienceinstrumentscat.no.3400)里成像收集信號(hào)。結(jié)果圖17所示。

由圖17可知，hepg2細(xì)胞中大部分rtk的活性并不受是否加入mleg1的影響，都保持在較低的水平，而只有egfr(如圖17中圓圈圈出的點(diǎn)所示)在mleg1摻入后，其酪氨酸磷酸化顯著增加，意味著mleg1加入，激活了egfr，并進(jìn)一步激活下游akt信號(hào)。

進(jìn)一步地，本發(fā)明的發(fā)明人通過(guò)egfr的磷酸化特異性抗體檢測(cè)mleg1對(duì)細(xì)胞內(nèi)egfr的激活水平的影響，由圖18的(a)的結(jié)果也顯示(圖18的(a)中：“-”代表未加入，“+”代表加入)，mleg1的摻入可以非常迅速地激活egfr受體，并在之后激活akt信號(hào)。

實(shí)施例20

mleg1激活akt依賴egfr的激活

由實(shí)施例21的rtk的篩選結(jié)果顯示mleg1很可能通過(guò)egfr的激活來(lái)誘導(dǎo)akt的磷酸化，如果通過(guò)egfr的抑制劑抑制egfr的活性能阻斷mleg1誘導(dǎo)的akt的磷酸化，則將進(jìn)一步證實(shí)mleg1是通過(guò)egfr來(lái)激活akt的。這里本發(fā)明的發(fā)明人選取egfr的特異性抑制劑ag1478來(lái)抑制egfr的活性。實(shí)驗(yàn)方法如下。

20.1hepg2細(xì)胞培養(yǎng)，具體可參考步驟18.1。

20.2往細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入添加物(bsa、mleg1、ag1478)，進(jìn)行處理，培養(yǎng)15分鐘后，提取總蛋白(參考步驟13.2)，并進(jìn)行westernblot檢測(cè)各處理組中的各蛋白(p-akt、akt、p-egfr)水平(參考步驟2.2)。結(jié)果如圖18中的(b)所示。

由圖18中的(b)可知，當(dāng)hepg2細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入柱層析分離的mleg1時(shí)，可以誘導(dǎo)akt磷酸化，而加入牛血清白蛋白的bsa對(duì)照組，akt磷酸化基本不受影響。當(dāng)往培養(yǎng)基中再加入1μm的ag1478抑制egfr活性時(shí)，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)mleg1誘導(dǎo)的akt磷酸化被阻斷。同時(shí)，對(duì)egfr的磷酸化水平研究發(fā)現(xiàn)，mleg1處理誘導(dǎo)了egfr的磷酸化，而加入ag1478后，egfr的激活則被抑制。因此，mleg1誘導(dǎo)akt的磷酸化依賴于細(xì)胞膜表面的egfr受體的激活。

實(shí)施例21

mleg1與egfr受體存在蛋白與蛋白間的互作

以上的結(jié)果顯示mleg1可以通過(guò)egfr激活pi3k信號(hào)，從而誘導(dǎo)akt的磷酸化。egfr是細(xì)胞膜表面的一個(gè)受體蛋白，而mleg1是一個(gè)分泌蛋白，因此mleg1可能直接與egfr結(jié)合，作為一個(gè)信號(hào)分子直接激活下游信號(hào)。因此，本發(fā)明的發(fā)明人接著通過(guò)免疫共沉淀檢測(cè)mleg1與egfr之間是否存在互作。

由于以上結(jié)果顯示mleg1能夠影響肝臟的功能，本發(fā)明的發(fā)明人通過(guò)將柱層析分離純化的mleg1蛋白去孵育肝臟勻漿分離得到的細(xì)胞。由于mleg1激活egfr的反應(yīng)非常迅速，而激活后的egfr很快走向降解，因此，本發(fā)明的發(fā)明人用mleg1在4℃孵育肝細(xì)胞，同時(shí)加入交聯(lián)劑dsp穩(wěn)定mleg1和其潛在互作蛋白的相互作用，隨后將mleg1洗凈并通過(guò)np40裂解液裂解肝細(xì)胞進(jìn)行免疫共沉淀。實(shí)驗(yàn)方法如下。

21.1抗體交聯(lián)：取30μlproteina/g(beyotimecat.no.p2012)，低速(500～1000g)離心去上清。4℃預(yù)冷的pbs清洗兩次后加入抗體(20μg抗體溶于1x100μlpbs中)，室溫孵育30min。離心去上清。用300μlpbs清洗3次珠子，加入50μldss溶液(5μl10xpbs，36μlh2o，9μl2.5mmdss(thermo，cat.no.21655)，室溫孵育50分鐘。離心去上清后，用50μl100mmph2.2甘氨酸清洗珠子3次，300μl含1％np40的pbs清洗兩次，最后用300μlpbs清洗一次。交聯(lián)抗體的珠子保持濕潤(rùn)，使用前離心棄盡上清。

21.2通過(guò)柱層析分離，得到野生型唾液腺的含mleg1的組分以及mleg1^δ/δ小鼠唾液腺不含mleg1的組分。

21.3用上述組分分別孵育肝臟勻漿分離得到的細(xì)胞，4℃孵育肝細(xì)胞，同時(shí)加入交聯(lián)劑dsp穩(wěn)定mleg1和其潛在互作蛋白的相互作用。

21.4免疫共沉淀：組織或細(xì)胞通過(guò)np40裂解液(50mm的tris-hcl，ph8.0，150mm的nacl，1％的np40，2mmedta，1mmpmsf，2x的complete)充分勻漿，4℃垂直搖床充分裂解15min，4℃下12000g離心15min，取上清用于后續(xù)操作。往上清中加入交聯(lián)了抗體的珠子，4℃孵育過(guò)夜后。用4℃預(yù)冷的pbst(0.1％tween20)清洗3次，再用預(yù)冷pbs清洗兩次。加入50μl100mmph2.2甘氨酸洗脫珠子上結(jié)合的蛋白，加入2μl1mph9.5的甘氨酸中和ph后于-20℃保存或是直接后續(xù)分析。

21.5通過(guò)westernblot檢測(cè)mleg1抗體拉下來(lái)的蛋白。結(jié)果如圖18中的(c)所示。

由圖18中的(c)可知(圖18的(c)中：input代表用于免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)的蛋白；“-”代表為灌胃mleg1蛋白的對(duì)照組；“+”代表灌胃mleg蛋白的實(shí)驗(yàn)組；ip:α-mleg1代表mleg1抗體結(jié)合并拉下mleg1蛋白及其相互作用蛋白)，未加入mleg1的肝細(xì)胞中的egfr并不能被mleg1的抗體拉下，而加入mleg1后，mleg1抗體共沉淀組分中除了含有mleg1蛋白外，還含有egfr蛋白，因此，mleg1與egfr之間確實(shí)存在相互作用。

實(shí)施例22

上述的研究表明mleg1調(diào)節(jié)肝臟akt活性的功能是通過(guò)結(jié)合并激活egfr來(lái)實(shí)現(xiàn)的，這需要mleg1能夠到達(dá)肝臟并與egfr相結(jié)合。本發(fā)明的發(fā)明人知道m(xù)leg1在唾液腺中表達(dá)，并分泌入唾液中。那么這種口腔中的mleg1是否能到達(dá)肝臟并與肝臟中的egfr發(fā)生相互作用呢？為了模擬這一情況，通過(guò)如下實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了研究。

22.1將柱層析純化的mleg1按每克小鼠體重用50ng的mleg1從口腔灌胃入mleg1^δ/δ小鼠中。

22.2灌胃后不同時(shí)間點(diǎn)(0、10、20、40、60min)將小鼠猝死并收集肝臟樣品，通過(guò)mleg1的抗體對(duì)肝臟可能存在的mleg1蛋白進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)處理后mleg1^δ/δ小鼠mleg1蛋白與egfr相互作用的結(jié)果，具體可參考步驟21.2-21.5。

借助上述方法模擬唾液腺分泌的mleg1進(jìn)入消化道后的行為。

基于以上理論，mleg1需要在肝臟中發(fā)揮作用，那么灌胃后小鼠的肝臟理應(yīng)存在mleg1蛋白。結(jié)果如圖18中的(d)所示。

由圖18中的(d)可知，小鼠灌胃10分鐘后即可在其肝臟中檢測(cè)到mleg1蛋白，并且蛋白量在灌胃20分鐘后達(dá)到最大值，灌胃40分鐘和60分鐘后肝臟中的mleg1開(kāi)始減少。同時(shí)，本發(fā)明的發(fā)明人觀察到灌胃10分鐘后，mleg1結(jié)合的egfr最多，之后結(jié)合的egfr蛋白量隨著時(shí)間的延續(xù)不斷減少。這可能是由于mleg1與egfr快速結(jié)合并迅速傳遞下游信號(hào)所致：體外實(shí)驗(yàn)中mleg1在1分鐘之內(nèi)就可以激活egfr，egfr在3分鐘之內(nèi)磷酸化水平就開(kāi)始減少。同時(shí)，本發(fā)明的發(fā)明人也檢查了這種灌胃的mleg1蛋白對(duì)下游akt的激活情況。mleg1灌胃后10分鐘后，肝臟中的akt磷酸化就有所增加，并且這種增加灌胃后40分鐘到60分鐘更為明顯。綜合以上結(jié)果，唾液腺分泌表達(dá)的mleg1可以通過(guò)消化道被血液吸收，并最終到達(dá)臟并激活肝臟中的egfr，從而激活akt，最終對(duì)肝細(xì)胞的生理功能進(jìn)行調(diào)控。

綜上所述，在給正常小鼠持續(xù)喂食高脂肪含量(10％)的食物時(shí)，該小鼠的體重將持續(xù)增重，最終導(dǎo)致肥胖，以及一系列肥胖綜合癥的發(fā)生。而當(dāng)敲除mleg1基因，即抑制mleg1的功能時(shí)，即使持續(xù)喂食高脂肪含量食物，小鼠體重增長(zhǎng)跟喂食正常食物并無(wú)明顯差別，并未發(fā)展出肥胖的癥狀。這意味著mleg1的功能抑制，可以抑制過(guò)度飲食所引起的肥胖。mleg1的功能是通過(guò)egfr-akt-srebp1c信號(hào)軸來(lái)發(fā)揮調(diào)控脂肪合成的，意味著干擾mleg1，egfr，akt，srebp1c中的任意一個(gè)因子功能的化合物，都有可能作為發(fā)展抑制飲食引起的肥胖的藥物。因此，抑制mleg1-egfr-akt-srebp1c信號(hào)軸的作用，阻斷新的脂肪的合成，有可能成為治療肥胖癥的新手段。而在農(nóng)業(yè)動(dòng)物中敲除leg1同源基因或通過(guò)特定化合物下調(diào)leg1的表達(dá)或活性，可以減少脂肪積累。

此外，mleg1蛋白能夠通過(guò)egfr-akt-srebp1c信號(hào)軸來(lái)促進(jìn)脂肪合成，因此，mleg1可以用于制備促進(jìn)脂肪合成的藥劑，一方面用于治療脂肪缺少的疾病，包括化療引起的脂肪缺少等，另一方面也可以用于增肥作用，包括用于瘦弱人群的增肥、飼養(yǎng)動(dòng)物的增肥等。

另外，mleg1蛋白可以通過(guò)與egfr相互作用激活akt信號(hào)。同時(shí)，前人研究指出糖尿病發(fā)生的一個(gè)重要機(jī)制是肝臟對(duì)胰島素信號(hào)發(fā)生抵抗，使得胰島素不能很好的激活akt信號(hào)，從而無(wú)法使肝細(xì)胞胞漿中的glut2蛋白運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜表面，導(dǎo)致血糖無(wú)法運(yùn)輸進(jìn)入肝臟進(jìn)行轉(zhuǎn)換，最終血糖含量過(guò)高。而mleg1蛋白可以不通過(guò)胰島素激活akt，這意味著mleg1蛋白同時(shí)是一種潛在的治療糖尿病的藥物。

由于mleg1(leg1)蛋白在所有脊椎動(dòng)物中都保守存在，因此，這些物種中的leg1蛋白，包含人類中的hleg1蛋白，將具相似的功能。因此，在這些物種中的leg1蛋白以及關(guān)于leg1-egfr-akt-srebp1c信號(hào)軸的功能與應(yīng)用都是都在本發(fā)明專利的保護(hù)范圍之內(nèi)。

綜上所述研究結(jié)果，本發(fā)明的主要結(jié)論如下：

(1)mleg1^δ/δ小鼠體內(nèi)脂肪含量減少，并對(duì)高脂喂食導(dǎo)致的肥胖癥產(chǎn)生抵抗。

(2)mleg1^δ/δ小鼠肝臟中由于akt活性的減弱導(dǎo)致脂肪合成能力的減弱。

(3)mleg1能夠促進(jìn)人肝癌細(xì)胞hepg2和小鼠肝臟的akt磷酸化。

(4)mleg1通過(guò)與egfr相互作用，激活egfr，再經(jīng)egfr/pi3k信號(hào)軸激活akt。當(dāng)抑制egfr或是pi3k信號(hào)中其中一個(gè)時(shí)，mleg1則不再能激活akt。

(5)在小鼠體內(nèi)，肝臟外源性的mleg1參與調(diào)控肝臟akt活性水平。唾液腺表達(dá)的mleg1被分泌到唾液中，并經(jīng)過(guò)消化道進(jìn)入血液循環(huán)，并最終到達(dá)肝臟發(fā)揮作用。體外灌胃進(jìn)入消化道中的mleg1蛋白可以在10分鐘之內(nèi)進(jìn)入血液到達(dá)肝臟，并與egfr結(jié)合激活下游akt信號(hào)。

本研究對(duì)從未報(bào)道過(guò)相關(guān)功能的mleg1進(jìn)行了詳實(shí)的研究。研究指出mleg1蛋白是機(jī)體內(nèi)自然存在的一個(gè)脂肪代謝調(diào)控因子。它由mleg1基因編碼，并主要在唾液腺中富集表達(dá)，轉(zhuǎn)錄翻譯后的mleg1蛋白可以被運(yùn)輸?shù)礁闻K，通過(guò)與肝臟表面的egfr受體結(jié)合，激活pi3k—akt—srebp1c信號(hào)通路，調(diào)控肝臟中脂肪的從頭合成途徑，從而對(duì)整個(gè)機(jī)體的脂肪代謝進(jìn)行調(diào)控。

本研究指出mleg1蛋白主要在唾液腺中富集表達(dá)，因此mleg1蛋白可以作為唾液腺形態(tài)結(jié)構(gòu)及疾病診斷的一個(gè)分子標(biāo)記。

本研究指出mleg1主要由唾液腺表達(dá)，因此mleg1的啟動(dòng)子可以用于制備在唾液腺特異性表達(dá)某種基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，包括用于制備唾液腺特異性表達(dá)cre的工具鼠等。

總之，本發(fā)明以現(xiàn)有技術(shù)沒(méi)有研究過(guò)的mleg1基因?yàn)榛A(chǔ)，以mleg1基因敲除小鼠為研究對(duì)象，利用遺傳學(xué)，分子生物學(xué)，生物化學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)的手段對(duì)mleg1基因的功能進(jìn)行了非常全面的研究，研究結(jié)果表明mleg1蛋白可以通過(guò)egfr調(diào)控體內(nèi)akt的信號(hào)，進(jìn)而調(diào)控機(jī)體內(nèi)的脂肪合成，該結(jié)果表明mleg1基因和蛋白與機(jī)體內(nèi)的脂肪合成密切相關(guān)，也進(jìn)一步表明人類的hleg1基因或hleg1蛋白可以作為靶點(diǎn)基因或靶點(diǎn)蛋白用于制備與肥胖相關(guān)的藥物中去，該研究結(jié)果為后期人為對(duì)人類肥胖癥的治療或預(yù)防、癌癥病人化療后的體質(zhì)恢復(fù)或增肥、糖尿病治療等領(lǐng)域的藥物研發(fā)供了一個(gè)全新的藥物靶點(diǎn)以及新的治療手段和思路。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110>浙江大學(xué)

<120>一種hleg1基因及其應(yīng)用和藥物

<160>8

<170>patentinversion3.5

<210>1

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>1

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<210>2

<211>337

<212>prt

<213>小鼠（musmusculus）

<400>2

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ser

<210>3

<211>49

<212>dna

<213>智人（homosapiens）

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<210>4

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<212>dna

<213>小鼠（musmusculus）

<400>4

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<210>5

<211>364

<212>prt

<213>斑馬魚(yú)（daniorerio）

<400>5

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<210>6

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<212>prt

<213>斑馬魚(yú)（daniorerio）

<400>6

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151015

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202530

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<210>7

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<212>prt

<213>綿羊（ovisaries）

<400>7

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provalglu

355

<210>8

<211>317

<212>prt

<213>牛（bostaurus）

<400>8

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151015

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210215220

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