專利名稱：用酵母表達(dá)sTNFR免疫粘附素融合蛋白和多肽的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用基因工程方法構(gòu)建可溶性受體免疫黏附素蛋白及其聚合物，和用巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)生產(chǎn)該蛋白的方法，以及在治療TNF介導(dǎo)的疾病方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
炎癥是機(jī)體對諸如機(jī)械損傷、感染或抗原刺激引起的傷害而產(chǎn)生的一種防御反應(yīng)。當(dāng)炎癥由不適當(dāng)?shù)拇碳と缱陨砜乖饡r，炎癥反應(yīng)可病理性地表達(dá)，當(dāng)有害物去除后，炎癥反應(yīng)仍可以過度地或持久地病理性地表達(dá)。人們對炎癥的病因?qū)W認(rèn)識較少，但隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，近年來已經(jīng)獲得了關(guān)于炎癥分子方面的相當(dāng)多的信息，由此鑒定出據(jù)信在炎癥調(diào)節(jié)中作用顯著的某些細(xì)胞因子。細(xì)胞因子是調(diào)節(jié)細(xì)胞、特別是在細(xì)胞因子合成和釋放速發(fā)區(qū)域中的細(xì)胞行為的胞外蛋白。許多細(xì)胞因子與機(jī)體的炎癥反應(yīng)有關(guān)，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，白細(xì)胞介素-1、-2、-6(IL-1、IL-2、IL-6)，轉(zhuǎn)移生長因子-β(TGF-β)和巨噬細(xì)胞粒細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等，其中腫瘤壞死因子-α(TumorNecrosis Factor alpha，TNF-a)和白細(xì)胞介素-1(Interleukin-1，IL-7)是目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的兩種最有效的炎性細(xì)胞因子，分別被認(rèn)為是被稱為 “TNF-α介導(dǎo)的疾病”和“IL-1介導(dǎo)的疾病”的許多疾病和紊亂中的關(guān)鍵介質(zhì)的細(xì)胞因子。
腫瘤壞死因子(TNFs)是一族由數(shù)目眾多的細(xì)胞類型，包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。如果自發(fā)性或?qū)嶒炐约膊』蛭蓙y與體液或組織中較高水平的TNF相關(guān)，或從所述機(jī)體中取出的細(xì)胞或組織在培養(yǎng)中產(chǎn)生較高水平的TNF，那么所述疾病或紊亂被認(rèn)為是“TNF介導(dǎo)的疾病”。在許多情況下，由以下另外兩種狀況也可識別這類TNF介導(dǎo)的疾病(1)可以通過給與TNF在動物中試驗性地模擬與所述疾病或紊亂有關(guān)的病理學(xué)發(fā)現(xiàn)；以及(2)可以通過用抑制TNF作用的藥物，抑制或消除所述疾病或紊亂的實驗行動物模型中誘導(dǎo)的病理。在大多數(shù)TNF介導(dǎo)的疾病中，遇到至少三種狀況中的兩個，在許多“TNF介導(dǎo)的疾病”的疾病中，遇到所有三種狀況。非全部的急性和慢性TNF介導(dǎo)的炎癥疾病的一覽表包括(但不限于)以下
炎癥性腸炎(inflammatory bowel disease，IBD)包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis，UC)和克隆氏病(Crohn′s disease，CD)；關(guān)節(jié)的炎癥性疾病，包括骨關(guān)節(jié)炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；分泌性中耳炎；急性胰腺炎；病毒性心肌炎；牛皮癬；膿毒癥和膿毒性休克；肝硬化；子宮內(nèi)膜異位；多發(fā)性硬化；肌病(例如肌蛋白代謝，尤其是膿毒癥中)；急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)；全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)；缺血性損傷，包括小腦缺血(例如由創(chuàng)傷引起的腦損傷、癲癇、出血或中風(fēng)，每種都可能導(dǎo)致神經(jīng)變性)；充血性心力衰竭；再灌注損傷；移植排斥反應(yīng)；或由勞累、扭傷、軟骨損傷、創(chuàng)傷、整形外科、感染或其他疾病產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)。
目前研究報道的腫瘤壞死因子有TNF-α和TNF-β(或淋巴細(xì)胞毒素)，每一種作為三聚體分子是有活性的，被認(rèn)為通過交聯(lián)受體而啟動細(xì)胞信號。一系列證據(jù)表明TNF-α和TNF-β是主要的炎癥性細(xì)胞因子，在機(jī)體的許多炎癥反應(yīng)疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、硬皮病、膿血癥的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。這些已知的TNFs對許多不同的靶細(xì)胞具有重要的生理作用，這些靶細(xì)胞包含在多種刺激如感染或損傷而引起的炎癥反應(yīng)中。
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性、反復(fù)發(fā)作性、非特異性和多發(fā)性關(guān)節(jié)炎，它是全身結(jié)締組織和膠原纖維組織病變的局部表現(xiàn)，特別以手中指、趾等小關(guān)節(jié)最易受累。RA患者早期或急性期發(fā)病，關(guān)節(jié)紅、腫、熱、痛和運(yùn)動障礙，晚期則關(guān)節(jié)強(qiáng)直或畸形，并有骨和骨骼肌萎縮，在整個病程中，可有發(fā)熱、無力、貧血、多發(fā)病。本病的病因尚不明確，一般認(rèn)為其發(fā)病與自身免疫、遺傳、感染、病毒、內(nèi)分泌改變等有關(guān)，是一種自身免疫性疾病，在局部免疫系統(tǒng)活動性極度活躍時關(guān)節(jié)襯開始出現(xiàn)發(fā)炎癥狀。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎常常造成關(guān)節(jié)的破壞、疼痛和損害變形，進(jìn)而限制了患部關(guān)節(jié)的正常活動范圍。本病雖一般不致影響患者生命，但致殘率高，可造成嚴(yán)重殘廢使病人完全喪失勞動能力，如病變嚴(yán)重破壞頸椎或累及重要臟器也威脅患者生命。未經(jīng)治療的患者，兩年致殘率為50％，三年致殘率為70％，與正常人相比，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的平均壽命縮短10-15年，且嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，因此該病要早診斷早治療，以延緩致殘，降低致殘率。在我國該病的發(fā)病率約為0.3％～0.5％，平均約0.35％，女性與男性的發(fā)病人數(shù)之比約為3∶1或女性更多一些，患病人數(shù)約達(dá)450萬人。
在美國，近4,000萬關(guān)節(jié)炎患者采用目前有效的NSAIDs，使用這些藥物有可能會導(dǎo)致胃潰瘍和其它嚴(yán)重的并發(fā)癥(如胃腸道出血或穿孔)。事實上，近期的一項研究評估指出，這些并發(fā)癥每年可造成107,000名美國人住院接受治療和16,500名美國人死亡。
據(jù)世界衛(wèi)生組織WHO報告提供的數(shù)字，約有1％的人在其一生中會患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病，這樣僅中國患者就將達(dá)1000多萬人，但目前的治療非常有限的，因而這類藥物將具有廣闊的市場前景。
據(jù)估計，在醫(yī)療保健和勞資損失方面，美國關(guān)節(jié)炎患者每年要耗費650億美元，用于因嚴(yán)重NSAIDs副作用面臨住院治療的年耗資超出的10億美元。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的醫(yī)療費用支出年增長率為7％。預(yù)計類風(fēng)濕性炎治療劑的銷售額將從1997年的約15億美元上升到2009年的66億美元。主要是由于新的生物制劑和新的細(xì)胞分裂素調(diào)節(jié)劑的近幾年將陸續(xù)上市，預(yù)計到2009年僅治療RA的生物藥品部分價值就達(dá)45億美元。
我國人口眾多，RA患者眾多，特別在高寒、高濕地區(qū)尤為突出，目前尚缺乏特別有效的治療藥物，現(xiàn)有藥物或療效差、或毒副作用大，對新型針對性強(qiáng)、有效率高、副作用小的免疫耐受型藥物有著迫切的要求。
關(guān)節(jié)組織中的TNFs主要由滑膜細(xì)胞的軟骨細(xì)胞產(chǎn)生。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)患者的血清及關(guān)節(jié)液中檢測出高水平TNFs已得到公認(rèn)，提示TNFs與RA的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切。研究表明TNFs是關(guān)節(jié)軟骨破壞的最重要的一種細(xì)胞因子。它能促進(jìn)滑膜組織的滑膜細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的增殖和分化；能促進(jìn)滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞合成并釋放前列腺素E2和膠原酶。PGE2和膠原酶引發(fā)滑膜炎癥反應(yīng)、軟骨基質(zhì)的崩解，而局部免疫復(fù)合物、游離的膠原等分解產(chǎn)物刺激TNFs的合成，這樣形成一個惡性循環(huán)。另外TNFs能刺激滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞合成過量的金屬蛋白酶包括膠原酶和基質(zhì)溶素，后者(又稱蛋白多糖酶)能溶解破壞軟骨基質(zhì)。TNFs還能作用滑膜細(xì)胞釋放纖維蛋白酶原激活劑，誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞釋放磷脂酶A2，而磷脂酶A2能抑制蛋白多糖前體物質(zhì)氨基多糖的合成，抑制軟骨細(xì)胞對多種生長因子促有絲分裂作用。此外TNFs還具有誘導(dǎo)IL-2和IL-6產(chǎn)生的詐用，在某些病理狀況下，TNF可與IL-2或IL-1發(fā)生協(xié)同性生物學(xué)效應(yīng)。
腫瘤壞死因子(TNFs)是炎癥和免疫反應(yīng)的主要介質(zhì)，對其活性的調(diào)節(jié)是調(diào)節(jié)和控制這些反應(yīng)的主要手段。由兩種截然不同的白細(xì)胞介素-1編碼基因IL-1α和IL-1β，分別編碼IL-1α蛋白和IL-1β蛋白。IL-1α和IL-1β兩種蛋白分子均具有約17.5Kda的分子量，并均曾以具有分子量約為31Kda的較大的前體分子在以前合成過，但他們在序列上顯示很少的相似性。兩種蛋白均為多效性的細(xì)胞因子，對不同的組織和對人類的許多病理，特別是在組織的免疫應(yīng)答和炎癥的過程中產(chǎn)生種種相似的效用。
TNF產(chǎn)生的生物活性是通過與特異性質(zhì)膜受體結(jié)合而介導(dǎo)的。TNF有兩個受體，分別稱為I型和II型TNF受體(TNF-RL和TNF-RII)，以單分子可溶形式天然存在。腫瘤壞死因子受體I，又稱為TNFR55、P55、P60、TNF-RI，CD編號為CD120a，是55-60kDI型跨膜糖蛋白，前體長455氨基酸殘基，切除29氨基酸的信號肽后，成熟膜蛋白長426氨基酸殘基。胞膜外區(qū)(182氨基酸)有4個CRD，其中有3個N-糖基化位點?？缒^(qū)有21氨基酸，胞漿區(qū)較長，有223氨基酸，有3個蛋白激酶C(PKC)作用位點，1個蛋白酪氨酸激酶(PTK)的作用位點。腫瘤壞死因子受體II又稱為TNFR75、P75、P80、TNF-RII，CD編號為CD120b，為75-80kD的I型跨膜糖蛋白，前體長461氨基酸殘基，N端為22氨基酸的信號肽，成熟蛋白長439氨基酸殘基，胞膜外區(qū)為235氨基酸，也有4個CRD，有2個N-糖基化位點。在靠近跨膜區(qū)的連接區(qū)還有一個富含絲/蘇/脯氨酸的STP區(qū)，是潛在的O-糖基化位點。跨膜區(qū)有30氨基酸，胞漿區(qū)長174氨基酸，有1個PKC作用位點。TNFRI與TNFRII在胞膜外區(qū)有28％的同源性，在胞漿區(qū)沒有同源性。TNFRI在胞漿區(qū)有一個約80氨基酸的死亡結(jié)構(gòu)域，TNFRII沒有同樣的結(jié)構(gòu)域，但其羧基端的78個氨基酸殘基可以結(jié)合TRAF2等胞漿信號蛋白，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。TNFRI和TNFRII分布十分廣泛，幾乎存在于所有有核細(xì)胞表面。通過每個分子的細(xì)胞外配體結(jié)合(ligand-binding)部分的蛋白酶剪切，它們都可以從細(xì)胞表面脫落而被轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的可溶性TNF受體(sTNFR)，即sTNFRI與sTNFRII。TNF的生物活性依賴于其與細(xì)胞表面的TNFR的結(jié)合。由于這些可溶性的TNFR可與TNF結(jié)合，所以又被稱為TNF結(jié)合蛋白(TNF-BPI和TNF-BPII)。一般認(rèn)為，可溶性TNFR可以結(jié)合TNF，從而局限或抵銷TNF活性，因而也可以作為TNF的拮抗劑。金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶都可能參與了可溶性受體的產(chǎn)生。
存在于受累關(guān)節(jié)滑液中的可溶性TNF受體(sTNFR)是TNF的一種重要的內(nèi)平衡天然調(diào)節(jié)劑和天然抑制物，但其量非常低。事實上，TNF-α介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在相當(dāng)程度上取決于TNF-α和sTNF-R之間是否平衡。健康人血循環(huán)中的sTNFR水平為1～2ng/ml，而RA患者滑膜液內(nèi)的sTNFR可能要比之高4～5倍，可中和過量的TNF。TNF-α與其同源分子TNF-β相等地與TNF細(xì)胞表面受體結(jié)合而介導(dǎo)它們的生理和病理作用。通過加入sTNFR可競爭性地結(jié)合TNF而使TNF不能與細(xì)胞表面的TNFR相互結(jié)合，從而抑制或減少引起的生物反應(yīng)。但sTNFR的半衰期特別短，通常為了延長其在體內(nèi)的穩(wěn)定時間而將其與免疫球蛋白IgG形成融合蛋白。
臨床上，針對細(xì)胞因子受體的治療策略已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，包括利用單克隆抗體、基因工程抗體或利用重組可溶性受體封閉其配體的作用。與抗體技術(shù)相比，重組可溶性受體的主要優(yōu)點是其屬于人體自身成分，在治療中不易引起免疫應(yīng)答的發(fā)生，因而安全性較好。但由于產(chǎn)生封閉效應(yīng)所需的重組可溶性受體往往劑量很大，因而規(guī)?；a(chǎn)較為困難，生產(chǎn)成本亦較高。此外，多數(shù)情況下，重組可溶性受體在體內(nèi)的半衰期很短，需要多次給藥，因此目前進(jìn)入臨床的重組可溶性受體多采用免疫粘附素(immunoadhesin)的策略，即在其C端通過基因融合技術(shù)加入免疫球蛋白的Fc段，使其成為融合蛋白，利用免疫球蛋白穩(wěn)定性好的特點，使其體內(nèi)半衰期延長。同時，由于免疫球蛋白Fc段可通過鏈間二硫鍵形成雙聚體，因而免疫粘附素融合蛋白亦形成雙聚體，能夠提高與其配體的親和力，更好地發(fā)揮療效。
免疫粘附素是指在基因水平將目的蛋白基因同免疫球蛋白的Fc片段基因相連，并在真核或原核細(xì)胞中表達(dá)出的具有上述兩部分結(jié)構(gòu)域的重組蛋白。由于目的蛋白同免疫球蛋白部分結(jié)構(gòu)域融合，使重組蛋白獲得了多種新的特性(1)引入的重鏈穩(wěn)定區(qū)CH結(jié)構(gòu)域使重組蛋白具有更長的半衰期，更適合于體內(nèi)的應(yīng)用。
(2)通過抗Fc段親和層析、葡萄球菌A(G)蛋白可以方便地進(jìn)行純化及免疫共沉淀實驗。
(3)由于存在大量商品化的與Fc段配套的產(chǎn)品，使融合蛋白的檢測更加方便、特異、敏感。
(4)Fc段具有穿過胎盤、結(jié)合補(bǔ)體并介導(dǎo)補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用，介導(dǎo)ADCC效應(yīng)等，這一特性被應(yīng)用于某些疾病的靶向性治療。
(5)不同免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA)Fc結(jié)構(gòu)域可以形成多聚體分子，提高重組蛋白結(jié)合抗原或配體的能力。
Ashkenazi等構(gòu)建了TNFR和IgG的融合蛋白，其二聚體分子與TNF的親和力較天然TNFR高6～8倍。體外實驗中，融合蛋白阻斷TNF裂解細(xì)胞的能力較可溶性TNFR高24倍，較中和性TNFmAb高4倍。在小鼠接受內(nèi)毒素半小時前給予融合蛋白能完全預(yù)防內(nèi)毒素誘導(dǎo)的死亡，在接受內(nèi)毒素后1h給予融合蛋白仍有明顯的保護(hù)作用。
TNFR-IgG含有TNFR的全部胞外部分，可與細(xì)胞表面的TNFR或可溶性TNF形成復(fù)合物。人TNFR-IgG1免疫粘附素可大大增強(qiáng)TNFR的免疫粘附作用，其抑制TNF細(xì)胞毒效應(yīng)為可溶性TNF受體的24倍，為TNF-αMcAb的4倍，對TNF的攻擊具有明顯的保護(hù)作用，TNFR-IgG1劑量是TNFMcAb的1/10時，其效應(yīng)仍高于后者，抗外源性TNF的細(xì)胞毒作用比后者強(qiáng)～50倍，比TNFR強(qiáng)100～500倍。(Jin H et al.Protection against rat endotoxic shock by p55 TNFRimmunoadhesincoparision with anti-TNF McAb.J.Infect.Dis.1994，170(5)1323-1326)晶體結(jié)構(gòu)表明，TNF與TNFRI作用的殘基數(shù)較多，而抗體與抗原的CDR則較少。因此，TNFR-IgGFc與TNF的結(jié)合可能比TNFMcAb與TNF結(jié)合更穩(wěn)定，其中尤以TNFRI-IgGFc-TNF復(fù)合物更為明顯，TNFRI-IgGFc中和TNF的能力要比TNFRII-IgGFc更強(qiáng)。TNGR-IgGFc對人體的免疫原性很弱，沒有明顯的毒副作用，在使用上安全可靠，特別適用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、敗血癥的疾病。
我國在重組可溶性受體的研究與開發(fā)方面尚處于落后狀態(tài)，雖然有一些相關(guān)實驗室的報道，但均未達(dá)到進(jìn)入開發(fā)的階段，其主要原因是此類藥物的臨床用量較大，并且多數(shù)需要用CHO真核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)生產(chǎn)，因而對開發(fā)生產(chǎn)的技術(shù)和設(shè)備條件要求高，生產(chǎn)成本高，投資強(qiáng)度高，我國目前的生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的培養(yǎng)表達(dá)技術(shù)水平不能滿足這些條件。隨著我國生物技術(shù)總體水平的提高，應(yīng)該重視重組可溶性受體藥物的開發(fā)研究問題，使我國在這一領(lǐng)域有所突破。
體外表達(dá)重組蛋白質(zhì)的方式有許多種，包括于大腸桿菌，桿狀病毒，酵母，哺乳動物細(xì)胞或其他表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明采用巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)生產(chǎn)所設(shè)計的腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素嵌合蛋白。這類蛋白和多肽以前一直用CHO系統(tǒng)來表達(dá)，近年來也有用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的研究。然而，原核大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)雖然表達(dá)量較高，但溶胞產(chǎn)物中純化重組蛋白質(zhì)十分困難，由大腸桿菌表達(dá)的外來蛋白質(zhì)常會聚集且形成不溶的包涵體，因此常需要包涵體的溶解作用及接下來的再折疊(Schein，C.H.andNoteborn，H.M.，Biotechnology，6291-294，1988；Wilkinson，D.L.and Hamson，R.G.，Biotechnology，9443-448，1991)，且大腸桿菌無法進(jìn)行轉(zhuǎn)譯后修飾作用，如糖基化作用。而CHO表達(dá)系統(tǒng)除由于前述原因外，其表達(dá)量太低、不能滿足臨床需要也嚴(yán)重制約了其應(yīng)用。
酵母是一類種類繁多的生物資源，已知有80個屬約600多種，數(shù)千個分離株，具備安全無毒，不致病；遺傳背景較為清楚，容易進(jìn)行遺傳操作；容易進(jìn)行載體DNA的導(dǎo)入；培養(yǎng)條件簡單，容易進(jìn)行高密度發(fā)酵；良好的蛋白分泌能力；類似高等真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后的修飾功能等作為基因表達(dá)系統(tǒng)宿主條件。酵母表達(dá)系統(tǒng)通常可克服利用細(xì)菌系統(tǒng)時所遇到的某些問題，表大量較高，且有能力進(jìn)行各種轉(zhuǎn)譯后處理修飾作用。所表達(dá)的外來蛋白質(zhì)可分泌至培養(yǎng)物上清液中，其中并無其他許多蛋白質(zhì)存留，而使得蛋白質(zhì)的純化作用及過程的擴(kuò)大更為容易。甲醇酵母基因表達(dá)系統(tǒng)是一種最近發(fā)展迅速的外源蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)。甲醇酵母是可利用甲醇作為唯一碳源的酵母，主要有H.Polymorpha、Candida Bodinii、Pichia Pastoris三種，其中Pichia Pastoris作為基因表達(dá)系統(tǒng)使用得最多、最廣泛(李黃金等.《生物工程學(xué)報》，1998，14(4)337)。自從1987年Cregg等首次用巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)作為宿主表達(dá)外源蛋白以來，作為一種新的高效的表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母越來越引起人們的重視，到1995年，已有四十多種外源蛋白在該宿主菌中獲得表達(dá)。而最近幾年每年報道的在畢赤酵母中表達(dá)的外源基因就有幾十種，且一年比一年多，與以往的基因表達(dá)系統(tǒng)相比，它具有無可匹敵的高表達(dá)特性，已被認(rèn)為是最具有發(fā)展前景的生產(chǎn)蛋白質(zhì)的工具之一。這是由于與其它表達(dá)系統(tǒng)相比，巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有以下特點和優(yōu)勢1)含有特有的強(qiáng)有力的AOX(醇氧化酶基因)啟動子，用甲醇可嚴(yán)格地調(diào)控外源基因的表達(dá)；2)表達(dá)水平高，即可在胞內(nèi)表達(dá)，又可分泌型表達(dá)。畢赤酵母中，報道的最高表達(dá)量為破傷風(fēng)毒素C為12g/l，一般大于1g/l。絕大多數(shù)外源基因比在細(xì)菌、釀酒酵母、動物細(xì)胞中表達(dá)水平高。一般畢赤酵母中外源基因都帶有指導(dǎo)分泌的信號肽序列，使表達(dá)的外源目的蛋白分泌到發(fā)酵液中，有利于分離純化；3)發(fā)酵工藝成熟，易放大。已經(jīng)有大規(guī)模工業(yè)化高密度生產(chǎn)的發(fā)酵工藝，且細(xì)胞干重達(dá)100g/l以上，表達(dá)重組蛋白時，已成功放大到10000升；4)培養(yǎng)成本低，產(chǎn)物易分離。畢赤酵母所用發(fā)酵培養(yǎng)基十分廉價，一般碳源為甘油或葡萄糖及甲醇，其余為無機(jī)鹽，培養(yǎng)基中不含蛋白，有利于下游產(chǎn)品分離純化；而釀酒酵母所用誘導(dǎo)物一般為價格較高的半乳糖；5)外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定。一般外源蛋白基因整合到畢赤酵母染色體上，隨染色體復(fù)制而復(fù)制，不易丟失；6)作為真核表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母具有真核生物的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻譯后修飾加工功能。
蛋白質(zhì)的糖基化鏈參與細(xì)胞識別、激素受體結(jié)合、蛋白質(zhì)定位及宿主-微生物間相互作用，糖基化具組織和細(xì)胞特異性。蛋白糖鏈的剪切在高爾基體中進(jìn)行。釀酒酵母缺乏甘露糖酶，對表達(dá)的外源蛋白不進(jìn)行剪切，相反還會加上高達(dá)75個之多的甘露糖殘基，并含有許多側(cè)鏈，這就產(chǎn)生了過糖基化作用。過分糖基化作用阻遏蛋白與抗體的反應(yīng)活性，而且，出現(xiàn)在外鏈的大量α-1，3-甘露糖使蛋白呈免疫原性，因而該表達(dá)糖蛋白不能用于治療。巴斯德畢赤酵母中修飾糖鏈的平均長度為8-14個甘露糖，而釀酒酵母多達(dá)50-150個甘露糖，使得它表達(dá)的外源蛋白分子量大，且變異范圍廣。而巴斯德畢赤酵母的外鏈不含α-1，3-甘露糖，避免了免疫原性的問題。
巴斯德畢赤酵母屬于甲醇營養(yǎng)型酵母，其重要特征是能利用甲醇作為唯一的碳源和能源來源，甲醇可誘導(dǎo)其表達(dá)甲醇代謝所需的酶，如醇氧化酶(AlcoholOxidase AOX)、二羥丙酮合成酶(Dihydroxy-acetone synthase DHAS)和過氧化氫酶(catalase)，表達(dá)的AOX可達(dá)細(xì)胞蛋白的30％，而在葡萄糖、甘油或乙醇作為碳源時，AOX幾乎不表達(dá)，進(jìn)一步研究表達(dá)，AOX的表達(dá)是在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的，其基因啟動子具有明顯的調(diào)控功能，可用于外源基因的表達(dá)。外源基因在甲醇以外的碳源中處于非表達(dá)狀態(tài)，而在培養(yǎng)液加入甲醇后，外源基因即被誘導(dǎo)表達(dá)。
已經(jīng)在畢赤酵母染色體鑒定了二個AOX基因(AOX1和AOX2)，兩者編碼的蛋白有97％的同源性和幾乎相同的特異催化活性，但AOX1基因啟動子受甲醇強(qiáng)烈誘導(dǎo)，而AOX2啟動子則很弱，使得AOX1比AOX2表達(dá)量高得多。
巴斯德畢赤酵母演常見的表達(dá)載體有pPIC3、pPIC9、pPSC3k、pHIL-D1、pAO815等，表達(dá)載體結(jié)構(gòu)一般為AOX1基因的5`AOX1啟動子、3`AOX1終止序列，3`AOX1序列，多克隆位點、組氨酸脫氫酶篩選標(biāo)志基因(His4)，大腸桿菌pBR322質(zhì)粒片斷，外源目的基因一般插入5`AOX啟動子和轉(zhuǎn)錄終止信號之間的單克隆位點。
表達(dá)載體一般有兩種方式整合到畢赤酵母染色體上，一種是在His4或5`AOX1啟動子DNA片段的單酶切位點將質(zhì)粒載體切成線性，通過單交換整合到染色體上，這樣整合的菌株表型為Mut+，畢赤酵母染色體上AOX1基因保持完整；另一種是雙位點互換，含5`AOX1啟動子、外源基因和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的表達(dá)單元置換染色體上的有完整功能的AOX1基因，產(chǎn)生的菌株表型為Mut-，由于AOX1基因被置換，只能靠弱轉(zhuǎn)錄的AOX2基因，因此該菌利用甲醇速度慢，但這兩個表達(dá)菌的表達(dá)水平均較高。
目前已有多種蛋白質(zhì)的基因在該表達(dá)系統(tǒng)中克隆成功，包括蛋白酶、酶抑制劑、受體、單鏈抗體等。盡管各種外源蛋白質(zhì)產(chǎn)生的水平不一，但各種蛋白質(zhì)在甲醇酵母中的產(chǎn)生水平均為在細(xì)菌、昆蟲或哺乳動物等表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)量的10～100倍(戴秀玉.《微生物學(xué)報》，1997，37(6)483--485)。如表皮生長因子(EGF)在釀酒酵母中的產(chǎn)量為7.4mg/L，而在甲醇酵母中為450mg/L，提高了60倍(彭毅等.《生物技術(shù)通報》，2000，(1)38)。椐報道，外源蛋白質(zhì)在甲醇酵母中的產(chǎn)量最高可達(dá)12g/L(Clare JJ et al.Bio/Technology，1991，9455--460)。
表達(dá)載體 首先，甲醇酵母中沒有穩(wěn)定的質(zhì)粒，所以其表達(dá)載體采用整合型質(zhì)粒。利用醇氧化酶(甲醇代謝的關(guān)鍵酶)基因-1(AOX1)的啟動子(PAOX1)和轉(zhuǎn)錄終止子(3`AOX1)構(gòu)建成整合型表達(dá)載體。PAOX1是一個極強(qiáng)的啟動子，醇氧化酶的產(chǎn)量最高可占甲醇酵母中可溶性蛋白質(zhì)的30％，所以能使外源蛋白質(zhì)在它的控制下高效產(chǎn)生。其次，在載體中加入釀酒酵母的分泌信號和前導(dǎo)肽序列(α因子)構(gòu)建分泌型載體，一方面可以減輕宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷，另一方面可以減少宿主細(xì)胞蛋白水解酶對外源蛋白質(zhì)的降解，pPIC9K、pMETαA、B、C均為此類載體。此外，使多拷貝目的基因整合入甲醇酵母染色體，形成多個表達(dá)單元，產(chǎn)生高產(chǎn)的菌株，此類載體有pAO815、pPIC3.5、pPIC9等。
受體菌 在以葡萄糖或甘油為碳源的培養(yǎng)基上生長時，甲醇酵母中AOX1基因的表達(dá)受到抑制，而在以甲醇為唯一碳源時，誘導(dǎo)基因表達(dá)，使外源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量更高。甲醇酵母適合高密度連續(xù)培養(yǎng)的條件，細(xì)胞干重達(dá)100g/L以上，蛋白質(zhì)產(chǎn)量極高(柴清等.《(生命的化學(xué)》，1997，17(4)36)。受體菌采用蛋白水解酶缺陷型，從而大大降低產(chǎn)物的降解。常用的甲醇酵母受體菌有GS115、KM71、PMAD11、PMAD16等。
經(jīng)過近幾年的發(fā)展完善，甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)已日趨成熟，應(yīng)用也日趨廣泛。國內(nèi)已有多篇在甲醇酵母中生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)成功的報道。美國Invitrogen公司也已開發(fā)出多種新型的甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)試劑盒，如Multi-copy PichiaExpression Kit、Easyselect Pichia Expression Kit、Pichia methanolia ExpressionSystem等，利用甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)克隆一個外源基因已十分方便。相信隨著對甲醇酵母研究的進(jìn)一步深入，它在生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)方面將日益展示出誘人的前景。
發(fā)明詳述本發(fā)明的目的在于提供一個高級的酵母表達(dá)系統(tǒng)以生產(chǎn)具有生物活性的新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素，該產(chǎn)品可作為一種生物制品藥物應(yīng)用于人類“TNF介導(dǎo)的疾病”的治療。
IgG類免疫球蛋白當(dāng)用于形成重組免疫粘附素嵌合體時，發(fā)現(xiàn)IgG可增加許多配體結(jié)合蛋白質(zhì)(受體)的半衰期。然而，此種嵌合體有一個問題，即在活性部份肽與Fc部分肽融合處會生成新的肽序列，其對于人體是一種新抗原，具免疫原性。
本發(fā)明采用T細(xì)胞免疫學(xué)上惰性的連接肽來連接活性肽與Fc，如圖4所示的連接序列Sequence No.4-12，如GlyGlySerGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。這些連接肽本身是免疫學(xué)上無活性的，在融合點處將這些連接肽插入，可將由于二個肽部分連接所產(chǎn)生的新抗原性消除。連接肽也可增加這些部分的撓性，且可保留生物活性。相對較長的連接肽有助于克服由嵌合體Fc部分帶來的可能的立體位阻，后者可干擾嵌合體的活性。
嵌合體有較天然sTNFR長得多的半衰期。由于接頭，也可設(shè)計以將產(chǎn)生新的免疫原性表位(新抗原)的可能性減低，此點是sTNFR及免疫球蛋白Fc片段的融合點。細(xì)胞因子通常是有相當(dāng)短半衰期的小蛋白質(zhì)，其可在各種組織中，包括不希望位置，快速消失。本發(fā)明所述的特異嵌合體也可充作設(shè)計及構(gòu)建其他細(xì)胞因子一Fc嵌合體的模型?？墒褂孟嗤蝾愃频慕宇^以減少產(chǎn)生新的免疫原性表位的可能性，同時保留生物活性。
本發(fā)明的特征在于在TNF可溶性受體與免疫球蛋白Fc之間引入了獨特的連接肽。經(jīng)特殊設(shè)計的連接肽可增加二部分的撓性，且因此維持其生物活性。雖然TNF可溶性受體及免疫球蛋白均源自人體，但在二分子融合點處始終有產(chǎn)生新的免疫原性表位的可能性。因此，本發(fā)明連接肽(其主要由T細(xì)胞惰性序列所組成)的其他優(yōu)點在于可在融合點減低免疫原性。若沒有連接肽存在，則TNF可溶性受體與免疫球蛋白Fc連接后所組成的新序列對人體而言將是一個新抗原。
本發(fā)明的特征還在于使用巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)生產(chǎn)，既可克服大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和CHO表達(dá)系統(tǒng)的一些缺陷，又可綜合這兩個表達(dá)系統(tǒng)的一些優(yōu)勢。
具體地說，本發(fā)明的新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素融合蛋白及其多聚體為下式所代表的物質(zhì)(Xa)m-L-Fc-L-(Xb)n其中Xa和Xb可以相同也可以不同；m和n分別獨立地為0或1，至少有一個為1.
其中Xa和Xb為腫瘤壞死因子可溶性受體sTNFRI(

圖1，Sequence No.1)、腫瘤壞死因子結(jié)合蛋白TNF-BPI或其多肽，和/或sTNFR II(圖2，Sequence No.2)、腫瘤壞死因子結(jié)合蛋白TNF-BPII或其多肽；其中Fc為免疫球蛋白IgG的Fc區(qū)，優(yōu)選為免疫球蛋白IgG1的Fc區(qū)(圖3，Sequence No.3)；其中L為零或免疫學(xué)上無活性的接頭肽，選自圖4所示的序列(Sequence No.4-12)，優(yōu)選為序列11(SequenceNo.11)。
本發(fā)明提供了一種用酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)具有生物活性的新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素融合蛋白及其多聚體的方法，所述方法包括(a)在酵母表達(dá)載體中插入含有免疫學(xué)上無活性的接頭肽序列的編碼新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素融合蛋白或多肽的聚核苷酸序列，其中載體含有多個克隆位點；和(b)利用步驟(a)的載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)慕湍妇?，并且在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)酵母菌株生成新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素融合蛋白或多肽。
及(c)用適當(dāng)?shù)募兓椒ㄌ幚聿襟E(b)的上清，提純新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素蛋白。優(yōu)選用PBS平衡的蛋白質(zhì)A瓊脂糖柱純化，結(jié)合于蛋白質(zhì)A瓊脂糖柱上的重組人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素蛋白質(zhì)以檸檬酸鹽溶液洗脫。
上述的方法中表達(dá)載體包括整合型質(zhì)粒pPIC9K、pPIC3.5、pPIC9、pPICZαA、pMETαA、B、C等載體，優(yōu)選為pPICZαA。其中酵母菌株是巴斯德畢赤氏(Pichiapastoris)酵母，包括GS115、KM71、PMAD11、PMAD16等，優(yōu)選為GS115。
應(yīng)用本發(fā)明的新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素融合蛋白及其多聚體或其組合，采用醫(yī)藥上可接受的載體，用于治療“TNF介導(dǎo)的疾病”，這類炎癥性疾病包括但不限于炎癥性腸炎(inflammatory bowel disease，IBD)包潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克隆氏病(Crohn′s disease，CD)；關(guān)節(jié)的炎癥性疾病，包括骨關(guān)節(jié)炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；分泌性中耳炎；急性胰腺炎；病毒性心肌炎；牛皮癬；膿毒癥和膿毒性休克；肝硬化；子宮內(nèi)膜異位；多發(fā)性硬化；肌病(例如肌蛋白代謝，尤其是膿毒癥中)；急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)；全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)；缺血性損傷，包括小腦缺血(例如由創(chuàng)傷引起的腦損傷、癲癇、出血或中風(fēng)，每種都可能導(dǎo)致神經(jīng)變性)；充血性心力衰竭；再灌注損傷；移植排斥反應(yīng)；或由勞累、扭傷、軟骨損傷、創(chuàng)傷、整形外科、感染或其他疾病產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)。尤其適合治療“TNF介導(dǎo)的疾病”中的自身免疫性疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、牛皮癬、移植排斥反應(yīng)、全身炎癥反應(yīng)綜合征等炎癥性疾病。
本發(fā)明的目的是通過以下措施來達(dá)到的1、克隆編碼人腫瘤壞死因子可溶性受體I和II(sTNF RI和sTNF RII)的基因本發(fā)明的人腫瘤壞死因子可溶性受體I和II(sTNFRI和sTNFRII)的編碼序列是用PCR法從人心肌細(xì)胞cDNA文庫中克隆得到的。人腫瘤壞死因子受體I基因全長4016堿基對；蛋白編碼序列為第316至3451核苷酸片斷，全長3136堿基對；可溶性受體sTNFRI的序列為第524至2063核苷酸片斷(Genomics 1992，13(1)，219-224)，全長1540堿基對，其DNA序列及其編碼的氨基酸序列見序列1(SequenceNo.1)。人腫瘤壞死因子受體II基因全長4323堿基對；蛋白編碼序列為90至2115核苷酸片斷，全長2026堿基對；可溶性受體sTNF RII的序列為第156至1178核苷酸片斷(Genomics 1996，35(1)，94-100)，全長1023堿基對，其DNA序列及其編碼的氨基酸序列見序列2(Sequence No.2)。
2、克隆編碼人免疫球蛋白IgG1Fc的基因本發(fā)明的人免疫球蛋白IgG1Fc基因的編碼序列是用PCR法從人心肌細(xì)胞cDNA文庫中克隆得到的。得到的全長696堿基對的基因片斷包括了全部IgG1Fc區(qū)(第28至696核苷酸片斷)和部分鉸鏈區(qū)(第1至27核苷酸片斷)的編碼序列(Sequence No.3A)。中國人的IgG1Fc基因是將上述克隆到的IgG1Fc的基因的535位堿基T點突變?yōu)镃，這樣由密碼子TCC編碼的絲氨酸(Ser)就突變?yōu)槊艽a子CCC編碼的脯氨酸(Pro)(Sequence No.3B)(王海濤國家八六三計劃項目驗收自評估報告《人源抗-HBs全基因克隆及其表達(dá)研究》http//www.886688.com/863jt.htm)。
3、構(gòu)建含有人腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素基因的酵母表達(dá)質(zhì)粒。
按常規(guī)分子克隆方法，將PCR擴(kuò)增的人腫瘤壞死因子可溶性受體編碼基因片斷和人免疫球蛋白IgG1Fc基因片斷用連接酶按設(shè)計要求經(jīng)連接肽基因連接。再經(jīng)一定的酶切之后，插入酵母表達(dá)載體pPICZαA(購自INVITROGEN)，使其與α-因子信號短肽表達(dá)成融合蛋白，所得表達(dá)質(zhì)粒稱為pPICZαA/(Xa)m-L-Fc-L-(Xb)n，其構(gòu)建過程見圖5。
4、用pPICZαA/(Xa)m-L-Fc-L-(Xb)n表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115并篩選高效表達(dá)株CS115/pPICZαA/(Xa)m-L-Fc-L-(Xb)n。
5、高效表達(dá)株CS115/pPICZαA/(Xa)m-L-Fc-L-(Xb)n的培養(yǎng)與甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。
將單菌落接種于BMGH培養(yǎng)液，加℃振搖培養(yǎng)過夜。次日轉(zhuǎn)接種于較大體積的同種培養(yǎng)液，30℃繼續(xù)培養(yǎng)至O.D600＝16-20。離心收集細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮于BMMH誘導(dǎo)培養(yǎng)液，30℃，振蕩培養(yǎng)，每小時加入甲醇，使其最終濃度為1％。4天后離心收集上清。
6、人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素的純化上述收集的上清經(jīng)超濾濃縮至一定體積后，使其通過用PBS平衡的蛋白質(zhì)A瓊脂糖柱，結(jié)合于蛋白質(zhì)A瓊脂糖柱上的重組人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素蛋白質(zhì)以檸檬酸鹽溶液洗脫。用SDS-PAGE檢測其分子量大小及相對純度，凍干，-70℃保存。
7、用鼠L929細(xì)胞檢測本發(fā)明所生產(chǎn)的重組人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素對hTNF的中和活性作用，測活方法按徐春曉等的文獻(xiàn)(中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2000，20(3)132)方法進(jìn)行，MMT顯色，測量A570。
附圖簡述圖1是編碼人TNFRI的DNA序列及氨基酸序列圖2是編碼人TNFRII的DNA序列及氨基酸序列圖3A是人FcDNA序列及氨基酸序列圖3B是中國人FcDNA序列及氨基酸序列圖4是連接肽序列。
圖5是巴斯德畢赤氏酵母表達(dá)載體的圖解說明。
圖6是利用本發(fā)明的巴斯德畢赤氏酵母表達(dá)載體系統(tǒng)克隆人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素方案的圖解說明。
圖7是本發(fā)明的巴斯德畢赤氏酵母表達(dá)載體pPICZαA/sTNFRII-IgG1Fc的圖解說明。
圖8是本發(fā)明表達(dá)純化的人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素的聚丙烯酰胺電泳圖。
圖9是本發(fā)明生產(chǎn)的重組人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素對人腫瘤壞死因子的抑制作用。
以下通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明實施例一編碼人腫瘤壞死因子可溶性受體sTNF RII基因的克隆根據(jù)已知的人腫瘤壞死因子可溶性受體sTNFRII的cDNA序列，設(shè)計并合成下列上下游引物，其序列如下N15'-GAA TTC CAT ATG CTG CCG GCG CAG GTG GCA TTT AC-3’C15’-AC GGA TCC ACC GCC ACC GGG TAA GTG TAC TG-3，
上游引物N1中引入EcoR 1酶切位點，下游引物C1中分別引入BamHI酶切位點和氨基酸序列GlyGlyGlyGlySer的接頭。PCR擴(kuò)增出sTNFRII，同時去掉信號肽，并在其羧基端引入短肽。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為1μl人心肌細(xì)胞cDNA文庫，10×PCR緩沖液5μl，10mmol/LdNTP1μl，50μmol/L上、下游引物各1μl，加水至50μl。經(jīng)95℃預(yù)變性5min后，加入pfuDNA聚合酶2U。PCR循環(huán)為94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 60s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。按標(biāo)準(zhǔn)操作程序純化PCR產(chǎn)物。所得純化PCR產(chǎn)物用EcoR1和BamHI雙酶切，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳純化后得到的基因1038bp基因片段。
實施例二 編碼人免疫球蛋白IgG1Fc基因的克隆根據(jù)已知的人免疫球蛋白IgG1Fc的cDNA序列，設(shè)計并合成下列上下游引物，其序列如下N25’-TA GGA TCC GGA GGT GGA GGT AGC GTT GAG CCC AAA TCT-3’C25’-AT CTC GAG TTA CTA CTG CGT GTA GTG GTTG-3’上游引物N2中分別引入BamHI酶切位點和氨基酸序列GlySerGlyGlyGlyGlySer的接頭，下游引物C2中引入XholI酶切位點。PCR擴(kuò)增出IgG1Fc，并在其氨基端引入短肽GlySerGlyGlyGly GlySer，羧基端引入翻譯中止信號TAGTAA。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為1μl人心肌細(xì)胞cDNA文庫，10×PCR緩沖液5μl，10mmol/LdNTP1μl，50μmol/L上、下游引物各1μl，加水至50μl。經(jīng)95℃預(yù)變性5min后，加入pfuDNA聚合酶2U。PCR循環(huán)為94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 90s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。按標(biāo)準(zhǔn)操作程序純化PCR產(chǎn)物。所得純化PCR產(chǎn)物用BamHI和XholI雙酶切，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳純化后得到的基因711bp基因片段。
實施例三人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素酵母表達(dá)載體的構(gòu)建將克隆得到的兩個基因片段用T4連接酶連接后得到人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素基因sTNFRII-IgG1Fc。用EcoR1和Not1雙酶切酵母表達(dá)載體pPICZαA質(zhì)粒，將sTNFRII-IgG1Fc基因克隆入這兩種內(nèi)切酶位點中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選具有Zeocin耐藥性的轉(zhuǎn)化株，從這些耐藥株中提取質(zhì)粒，用酶切和測序分析篩選得到含有人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素基因正確序列并與α-因子在同一閱讀框內(nèi)的質(zhì)粒pPICZαA/sTNFRII-IgG1Fc。
實施例四高效表達(dá)人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素的巴斯德畢赤酵母表達(dá)菌株的構(gòu)建與篩選用限制性核酸內(nèi)切酶SaC1切開環(huán)形表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA/sTNFRII-IgG1Fc使之線型化。將線型化了的pPICZαA/sTNFRII-IgG1Fc表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母株GS115，經(jīng)同源重組得到表達(dá)人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素的巴斯德畢赤酵母表達(dá)菌株GS115/pPICZαA/sTNFRII-IgG1Fc。篩選具有Zeoein耐藥性的轉(zhuǎn)化體。將所有的耐Zeoein轉(zhuǎn)化體分別接種于少量培養(yǎng)液并用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)(具體方法詳見實施例五)。離心收集上清，用SDS-PAGE電泳檢測上清中所表達(dá)的人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素的量，從中篩選高表達(dá)株。
實施例五高效表達(dá)人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素的巴斯德畢赤酵母表達(dá)菌株的培養(yǎng)與甲醇誘導(dǎo)將單個新鮮的畢赤酵母工程菌GS115/pPICZαA/sTNFRII-IgG1Fc接種于BMMH培養(yǎng)液，36℃，繼續(xù)培養(yǎng)至O.D.60016-20。離心收集細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮于1/5原體體積的BMMH誘導(dǎo)液中，30～C，振蕩培養(yǎng)，每24小時加入甲醇使甲醇最終濃度為1％，四天后離心收集上清。取少量上清用15％SDS-PAGE電泳分析。如圖8中的“粗品”即未經(jīng)純化的上清中有明顯的分子量為60KDa左右的蛋白帶，此為酵母表達(dá)后分泌至上清中的人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素。
實施例六 重組人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素的純化將離心收集的上清經(jīng)centracon plus 80(Millpore)超濾濃縮至一定體積后，使其通過用PBS平衡的蛋白質(zhì)A瓊脂糖柱，結(jié)合于蛋白質(zhì)A瓊脂糖柱上的重組人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素蛋白質(zhì)以檸檬酸鹽溶液洗脫。先后用含10mM、20mM和50mM的檸檬酸鹽溶液(pH3.0)洗脫，分別收集洗脫樣品，從各收集管中取出少許樣品進(jìn)行電泳分析，結(jié)果見圖7。絕大部分重組人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素可被50mM的檸檬酸鹽溶液(pH3.0)洗脫。由此法所得到的重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素在SDS-PAGE上呈單一的分子量為60kd的蛋白帶(圖8)。將從蛋白質(zhì)A瓊脂糖柱上所收集的含人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素的蛋白溶液經(jīng)PBS透析脫鹽后，凍干，干燥，-70℃保存，此為純化的重組人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素。
實施例七 重組人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素活性檢測重組人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素的活性表現(xiàn)為對TNF-α生物學(xué)活性的中和活性，TNF-α的活性測定采用最常應(yīng)用的結(jié)晶紫染色法(FlickDA，Gifford GE.Comparison ofin vitro cell cytotoxic assay for tumor necrosisfactor.J Immunol Methods，1984，68167-175)，以鼠L929細(xì)胞株為測定細(xì)胞。常規(guī)制備96孔L929細(xì)胞單層，37℃5％二氧化碳培養(yǎng)8小時。純化后的重組人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素用PBS稀釋，與0.2ng的人TNF-α37℃保溫2小時，用含放線菌素D的1640培養(yǎng)基二倍序列稀釋，每孔0.1ml，繼續(xù)培養(yǎng)20小時，MTT法測定每孔的光吸收值，計數(shù)得到的一組殺傷率與對應(yīng)的稀釋倍數(shù)的對數(shù)值作圖，得出殘存TNF的活性，從而反映出本發(fā)明產(chǎn)品的生物活性(圖9)。從圖9所示結(jié)果可以看出，大腸桿菌表達(dá)的腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素的活性較單純的可溶性受體高約一個數(shù)量級，本發(fā)明巴斯德畢赤酵母表達(dá)的腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素的活性較大腸桿菌表達(dá)的高約一個數(shù)量級，CHO系統(tǒng)表達(dá)的腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素的活性較本發(fā)明巴斯德畢赤酵母表達(dá)的高約2～3倍。
權(quán)利要求
1.下式物質(zhì)所代表的新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素融合蛋白及其多聚體(Xa)m-L-Fc-L-(Xb)n其中m和n分別獨立地為0或1，至少有一個為1；其中Xa和Xb可以相同也可以不同，Xa和Xb為腫瘤壞死因子可溶性受體sTNFRI、腫瘤壞死因子結(jié)合蛋白TNF-BPI或其多肽，和/或sTNFRII、腫瘤壞死因子結(jié)合蛋白TNF-BPII或其多肽；其中Fc為免疫球蛋白IgG的Fc區(qū)；其中L為免疫學(xué)上無活性的接頭肽，選自的序列4-12(Sequence No.4-12)。
2.編碼權(quán)利要求1中任一物質(zhì)的核酸序列。
3.編碼權(quán)利要求1中任一物質(zhì)的氨基酸序列
4.一種生產(chǎn)具有生物活性的權(quán)利要求1中的新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素融合蛋白及其多聚體的方法，其特征在于采用酵母表達(dá)系統(tǒng)，所述方法包括以下步驟(a)在酵母表達(dá)載體中插入含有免疫學(xué)上無活性的接頭肽序列的編碼新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素融合蛋白或多肽的核苷酸序列，其中載體含有多個克隆位點；和(b)利用步驟(a)的載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)慕湍妇?，并且在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)酵母菌株生成新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素融合蛋白或多肽。及(c)用適當(dāng)?shù)募兓椒ㄌ幚聿襟E(b)的上清，提純新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中步驟(c)純化方法為用PBS平衡的蛋白質(zhì)A瓊脂糖柱純化，結(jié)合于蛋白質(zhì)A瓊脂糖柱上的重組人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素蛋白質(zhì)以檸檬酸鹽溶液洗脫。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中表達(dá)載體包括質(zhì)粒pPIC9K，pPIC3.5，pPIC9，pPICZαA，pMETαA、B、C等。
7.權(quán)利要求6所述表達(dá)載體為pPICZαA。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中酵母菌株是巴斯德畢赤氏(Pichiapastoris)酵母，包括GS115、KM71、PMAD11、PMAD16等。
9.權(quán)利要求8所述的巴斯德畢赤氏(Pichia pastoris)酵母為GS115。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求4--9中所述的方法生產(chǎn)的新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素融合蛋白及其多聚體與藥學(xué)上可接受的載體構(gòu)成的組合物，用于制備治療TNF介導(dǎo)的疾病的藥物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10中所述的組合物，用于制備治療“TNF介導(dǎo)的疾病”中的自身免疫性疾病的藥物，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、牛皮癬、移植排斥反應(yīng)、全身炎癥反應(yīng)綜合征等炎癥性疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組人腫瘤壞死因子可溶性受體和/或多肽免疫粘附素及用巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)生產(chǎn)的方法，本發(fā)明還包括利用本發(fā)明所生產(chǎn)的融合蛋白或其組合物用于治療需要中和TNF－α的有害作用的疾病即“TNF介導(dǎo)的疾病”方面的應(yīng)用。
文檔編號A61P37/00GK1490335SQ0213086
公開日2004年4月21日 申請日期2002年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月14日
發(fā)明者張慶勇 申請人:張慶勇