專利名稱：恥垢分枝桿菌菌苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的生物制品，特別是指恥垢分枝桿菌(Mycobacterium Smegmatis)CGMCC NO.0795菌苗，屬于微生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是危害人類健康的重大傳染病之一，多耐藥結(jié)核菌的大量出現(xiàn)以及與艾滋病并發(fā)使結(jié)核病人數(shù)急劇增加，對(duì)人類的健康形成極大成脅。在已感染結(jié)核菌人群中強(qiáng)反應(yīng)者(結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)時(shí)，硬結(jié)直徑≥15mm或有水泡、壞死，并除去已經(jīng)發(fā)病者)發(fā)病幾率極高，被稱為結(jié)核感染高危人群。我國(guó)目前有近半人口感染了結(jié)核菌，其中高危人群達(dá)5000萬之多。大量的結(jié)核高危人群是個(gè)巨大的隱患，他們本身發(fā)病率極高，又是潛在的傳染源，如何控制這些人群潛在的內(nèi)源性復(fù)發(fā)和外源性再感染，是全球結(jié)核病控制的重點(diǎn)之一。
目前國(guó)際對(duì)結(jié)核病的控制方式主要是對(duì)未感染人群接種卡介苗預(yù)防和對(duì)臨床病人采用長(zhǎng)期化療。然而，結(jié)核病預(yù)防沿用多年的卡介苗，其適用對(duì)象是尚未感染的健康人群，對(duì)已經(jīng)感染的高危人群無保護(hù)作用；長(zhǎng)期規(guī)則化療又很難被尚未發(fā)病的高危人群接受。因此，為高危人群尋找合適的保護(hù)手段，對(duì)結(jié)核病的控制將有重要意義。為此，我們提出新的結(jié)核病預(yù)防概念現(xiàn)代預(yù)防不僅僅指預(yù)防病原體對(duì)宿主的感染，更應(yīng)包括預(yù)防感染人群的發(fā)病。
上個(gè)世紀(jì)末，國(guó)內(nèi)學(xué)者在Stanford教授研究的基礎(chǔ)上，成功研制出M.vaccae菌苗，它在對(duì)結(jié)核病的輔助治療方面獲得顯著療效，這提示了對(duì)結(jié)核高危人群采取免疫預(yù)防的可能性；然而，M.vaccae菌苗在國(guó)外已受到嚴(yán)格的專利保護(hù)，不利于進(jìn)一步研究和應(yīng)用。目前類似的產(chǎn)品還有草分枝桿菌制劑，但其因注射副作用大，不能進(jìn)行多次注射而影響了作用效果；恥垢分枝桿菌也是一種非致病性、快生長(zhǎng)分枝桿菌，對(duì)機(jī)體有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用，國(guó)內(nèi)外尚無該菌苗的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于提供一種恥垢分枝桿菌菌苗的液體或凍干制劑的制備方法及其用途。
本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種恥垢分枝桿菌菌苗，該菌苗包括恥垢分枝桿菌(MycobacteriumSmegmatis)的裂解產(chǎn)物。
所述的菌苗中的細(xì)胞已用高壓蒸汽法裂解。
所述的菌苗包括恥垢分枝桿菌的細(xì)胞壁、菌體蛋白和富含細(xì)菌DNA具有較強(qiáng)免疫活性的CpG片段的復(fù)合物。
所述的復(fù)合物為液體菌苗或凍干制劑。
上述恥垢分枝桿菌菌苗是從恥垢分枝桿菌制備的。
所述的恥垢分枝桿菌菌苗的制備方法至少包括如下步驟步驟一菌體培養(yǎng)將液體低溫保藏菌種室溫下溶解，接種于改良羅氏培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)3-7天后轉(zhuǎn)種于改良羅氏培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)3-5天；步驟二菌體收集待菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，以生理鹽水洗下羅氏培養(yǎng)基表面的菌體并將上述菌體以生理鹽水洗滌一次或一次以上，離心收集菌體。離心條件為6000r/min、30min、4℃。
步驟三菌苗制備以生理鹽水或磷酸鹽緩沖液將上述菌體配成所需濃度的菌液，經(jīng)121℃、15min高壓，裂解菌體，制備細(xì)胞勻質(zhì)。
步驟四成品制備無菌條件下分裝上述細(xì)胞勻質(zhì)，即制得恥垢分枝桿菌液體菌苗，或經(jīng)冷凍干燥制得恥垢分枝桿菌菌苗的凍干制劑。
所述的改良羅氏培養(yǎng)基的配制方法為(2000ml)將天冬素4.5g、磷酸二氫鉀3.0g、檸檬酸鎂0.65g、硫酸鎂0.3g、馬鈴薯淀粉37.6g、丙三醇15.0ml、蒸餾水750ml混勻后，沸水浴至澄明，10磅20分鐘滅菌，即為基質(zhì)；將新鮮雞蛋洗凈瀝干，75％酒精中浸泡30分鐘，取出，放入無菌室，晾干；將雞蛋液1250ml打入容器攪勻后經(jīng)無菌紗布過濾入含基質(zhì)的大三角瓶中，混勻并加入2％孔雀綠液20ml混勻，倒入廣口瓶中，分裝中管，約7ml/管；最后在87℃-88℃，40分鐘條件下烤干。37℃無菌測(cè)定24h后貯存4℃冰箱備用。
上述恥垢分枝桿菌菌苗在制備一種生物制品中的用途為該生物制品可用于預(yù)防結(jié)核高危人群的內(nèi)源性復(fù)發(fā)和外源性再感染；或可用于促進(jìn)免疫功能處于低下狀態(tài)的結(jié)核菌感染人群的免疫功能恢復(fù)；或可用于抑制免疫功能處于亢進(jìn)狀態(tài)的結(jié)核菌感染人群的過強(qiáng)免疫應(yīng)答。
該生物制品可用于提高正常人群的Th1類免疫應(yīng)答。
綜上所述，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提供的菌苗集中了細(xì)菌細(xì)胞壁良好佐劑作用、菌體蛋白的抗原特異性及誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子的作用特點(diǎn)，并富含細(xì)菌DNA具有較強(qiáng)免疫活性的CpG片段；解決了國(guó)外類似制品菌體顆粒大、液體菌苗易形成菌團(tuán)的問題，避免或減少了目前常規(guī)菌苗注射后可能出現(xiàn)的副作用，提高制品的安全性；可多次注射，解決了國(guó)外類似制品皮內(nèi)途徑只能一次注射或三個(gè)月以上長(zhǎng)間隔注射效果欠佳的缺點(diǎn)。
本發(fā)明涉及的恥垢分枝桿菌菌苗不但可以預(yù)防正常人群被結(jié)核菌感染，更可經(jīng)濟(jì)、有效地控制結(jié)核高危人群潛在的內(nèi)源性復(fù)發(fā)和外源性再感染，這對(duì)控制結(jié)核病的蔓延、提高人類的生活質(zhì)量具有重要意義。此外，該菌苗對(duì)免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的皮膚病也有潛在的治療價(jià)值。


圖1為陰性對(duì)照組(生理鹽水組)豚鼠臟器病變外觀；圖2為本發(fā)明恥垢分枝桿菌菌苗預(yù)防組豚鼠臟器病變外觀；
圖3為陽性對(duì)照組(M.Vaccae菌苗組)豚鼠臟器病變外觀。
具體實(shí)施例方式
下面將結(jié)合附圖和具體實(shí)施例來對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明恥垢分枝桿菌(Mycobacterium Smegmatis)，已于2002年9月10日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCC，保藏編號(hào)為CGMCC NO.0795。
恥垢分枝桿菌菌苗是恥垢分枝桿菌的裂解產(chǎn)物，其制備方法為步驟一菌體培養(yǎng)將液體低溫保藏菌種室溫下溶解，接種于改良羅氏培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)3-7天后轉(zhuǎn)種于改良羅氏培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)3-5天；步驟二菌體收集待菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，以生理鹽水洗下羅氏培養(yǎng)基表面的菌體并將上述菌體以生理鹽水洗滌一次或一次以上，離心收集菌體。離心條件為6000r/min、30min、4℃。
步驟三菌苗制備以生理鹽水或磷酸鹽緩沖液將上述菌體配成所需濃度的菌液，經(jīng)121℃、15分鐘高壓、裂解菌體，制備細(xì)胞勻質(zhì)。
步驟四成品制備無菌條件下分裝上述細(xì)胞勻質(zhì)，即制得恥垢分枝桿菌液體菌苗，或經(jīng)冷凍干燥、制得恥垢分枝桿菌菌苗的凍干制劑。
其中，改良羅氏培養(yǎng)基配制方法為(2000ml)首先，將天冬素4.5g、磷酸二氫鉀3.0g、檸檬酸鎂0.65g、硫酸鎂0.3g、馬鈴薯淀粉37.6g、丙三醇15.0ml、蒸餾水750ml混勻后，沸水浴至澄明，10磅20分鐘滅菌，即為基質(zhì)。
其次，將新鮮雞蛋(約四斤)洗凈瀝干，75％酒精中浸泡30分鐘，取出，放入無菌室，晾干；然后，將雞蛋液1250ml打入瓷杯，攪勻后經(jīng)無菌紗布過濾入含基質(zhì)的大三角瓶中，混勻，并加入2％孔雀綠液20ml，混勻，倒入廣口瓶中，分裝中管，約7ml/管，最后在87℃-88℃烤干；37℃無菌測(cè)定24h后貯存4℃冰箱備用。
恥垢分枝桿菌菌苗應(yīng)用于動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果恥垢分枝桿菌菌苗預(yù)防高危結(jié)核的效力實(shí)驗(yàn)以結(jié)核強(qiáng)毒菌株腹股溝皮下注射健康豚鼠，建立結(jié)核菌感染的高危模型。感染后3天，給每只豚鼠肌肉注射0.1mg恥垢分枝桿菌菌苗進(jìn)行免疫預(yù)防，每周一次，連續(xù)4周。同時(shí)以生理鹽水作陰性對(duì)照組，以M.vaccae菌苗作陽性對(duì)照組(恥垢分枝桿菌菌苗和M.vaccae菌苗應(yīng)用劑量均為一人份/只)。結(jié)果觀察感染后第7周，解剖各組豚鼠，觀察肝、脾、肺、淋巴結(jié)等各臟器結(jié)核病變程度，根據(jù)《病理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法結(jié)核菌感染后病變指數(shù)標(biāo)準(zhǔn)》以雙盲法進(jìn)行評(píng)分；取各豚鼠的脾臟進(jìn)行活菌分離；同時(shí)取所有動(dòng)物的肝、脾、肺做病理檢查。各臟器外觀結(jié)果如圖1、圖2、圖3所示，其病理評(píng)分及活菌分離結(jié)果如下表1.豚鼠臟器病變指數(shù)(X±SD)陰性對(duì)照組 恥垢分枝桿菌菌苗組M.vaccae組病理指數(shù) 64.6±21.0 30.0±15.3** 34.4±22.1****治療組與對(duì)照組比較時(shí)，p＜0.01表2.豚鼠脾臟活菌分離數(shù)的對(duì)數(shù)值(X±SD)陰性對(duì)照組 恥垢分枝桿菌菌苗組M.vaccae組脾菌數(shù)對(duì)數(shù) 4.69±0.67 3.59±1.663.89±1.78病理切片結(jié)果為對(duì)照組動(dòng)物的肺、肝、脾多呈廣泛性粟粒樣結(jié)核結(jié)節(jié)或干酪樣壞死。M.vaccae組病變較輕，除有個(gè)例呈結(jié)核樣病變，多為治療后的類上皮樣結(jié)節(jié)、或呈現(xiàn)正常的組織切片；恥垢分枝桿菌菌苗預(yù)防組病變最輕，呈現(xiàn)非特異性增生、治療后類上皮樣結(jié)節(jié)、或正常的組織切片。
綜合上述結(jié)果，可以看出與對(duì)照組比較，恥垢分枝桿菌菌苗同M.vaccae菌苗一樣，可顯著減輕豚鼠臟器的病變程度、降低病理指數(shù)、抑制或殺死豚鼠體內(nèi)的結(jié)核菌。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論為恥垢分枝桿菌菌苗對(duì)已經(jīng)感染結(jié)核菌的“高?！彪嗍笥蓄A(yù)防作用。
恥垢分枝桿菌菌苗的藥理學(xué)研究以正常、免疫功能低下和免疫功能亢進(jìn)的動(dòng)物模型分別探討了恥垢分枝桿菌菌苗的免疫調(diào)節(jié)作用及其作用機(jī)理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)恥垢分枝桿菌菌苗可提高正常動(dòng)物的免疫功能，尤其是提高Th1類免疫應(yīng)答，包括增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、遲發(fā)性超敏反應(yīng)、提高IL-12和IL-2等Th1類細(xì)胞因子和巨噬細(xì)胞內(nèi)殺傷因子(NO)的表達(dá)，這對(duì)預(yù)防結(jié)核等細(xì)胞內(nèi)感染的疾病具有重要意義；同時(shí)，在免疫功能低下的動(dòng)物模型中，恥垢分枝桿菌菌苗可促進(jìn)免疫功能的恢復(fù)，在免疫功能亢進(jìn)的動(dòng)物模型中，恥垢分枝桿菌菌苗可抑制過強(qiáng)的免疫應(yīng)答。由此可看出，恥垢分枝桿菌菌苗具有雙向免疫調(diào)節(jié)功能，這對(duì)因感染時(shí)期不同而呈現(xiàn)不同免疫狀態(tài)的結(jié)核菌感染人群的預(yù)防有重要意義。
恥垢分枝桿菌菌苗的毒理學(xué)研究按新藥臨床前研究的要求，進(jìn)行了恥垢分枝桿菌菌苗對(duì)小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)、Beagle犬的長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)以及豚鼠的全身過敏實(shí)驗(yàn)和家兔的熱源實(shí)驗(yàn)。取3種劑量(分別為人用劑量的25000倍、50000倍、250000倍)，經(jīng)腹腔、肌肉2種途徑注射小鼠，結(jié)果均未引起實(shí)驗(yàn)小鼠的異常癥狀及死亡。取3種劑量(相當(dāng)于擬臨床人用量的62.5倍、625倍和3125倍時(shí))，給Beagle犬連續(xù)肌肉注射14周，在實(shí)驗(yàn)前、中、末期和恢復(fù)期，通過一般行為、血常規(guī)、血生化、尿常規(guī)、心電圖和病理學(xué)等指標(biāo)的檢測(cè)，均未發(fā)現(xiàn)Beagle犬出現(xiàn)毒性反應(yīng)。同時(shí)，熱源實(shí)驗(yàn)和全身過敏實(shí)驗(yàn)分別證明了恥垢分枝桿菌菌苗無熱源反應(yīng)、不引起全身速發(fā)性變態(tài)反應(yīng)。
總之，恥垢分枝桿菌菌苗實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該菌苗可提高正常小鼠的細(xì)胞免疫功能，促進(jìn)免疫功能低下小鼠免疫功能的恢復(fù)；抑制免疫功能亢進(jìn)豚鼠超強(qiáng)的免疫應(yīng)答；在結(jié)核菌感染的動(dòng)物模型中，該菌苗可顯著抑制已經(jīng)感染的動(dòng)物體內(nèi)結(jié)核菌的繁殖、近而減輕臟器的病變程度；在豬血清致敏的動(dòng)物模型中，該菌苗可顯著抑制模型動(dòng)物過敏反應(yīng)的發(fā)生；同時(shí)，該菌苗具有良好的安全性。
最后所應(yīng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
權(quán)利要求
1.一種恥垢分枝桿菌菌苗，其特征在于該菌苗包括恥垢分枝桿菌(Mycobacterium Smegmatis)CGMCC NO.0795的裂解產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的恥垢分枝桿菌菌苗，其特征在于所述的菌苗中的細(xì)胞已用高壓蒸汽法裂解。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的恥垢分枝桿菌菌苗，其特征在于所述的菌苗包括恥垢分枝桿菌的細(xì)胞壁、菌體蛋白和富含細(xì)菌DNA具有較強(qiáng)免疫活性的CpG片段的復(fù)合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的恥垢分枝桿菌菌苗，其特征在于所述的復(fù)合物為液體菌苗或凍干制劑。
5.上述任一權(quán)利要求所述的恥垢分枝桿菌菌苗的制備方法，恥垢分枝桿菌菌苗從恥垢分枝桿菌制備。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的恥垢分枝桿菌菌苗的制備方法，其特征在于它至少包括如下步驟步驟一菌體培養(yǎng)將液體低溫保藏菌種室溫下溶解，接種于改良羅氏培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)3-7天后轉(zhuǎn)種于改良羅氏培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)3-5天；步驟二菌體收集待菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，以生理鹽水洗下羅氏培養(yǎng)基表面的菌體并將上述菌體以生理鹽水洗滌一次或一次以上，離心收集菌體。離心條件為6000r/min、30min、4℃。步驟三菌苗制備以生理鹽水或磷酸鹽緩沖液將上述菌體配成所需濃度的菌液，經(jīng)121℃、15min高壓，裂解菌體，制備細(xì)胞勻質(zhì)。步驟四成品制備無菌條件下分裝上述細(xì)胞勻質(zhì)，即制得恥垢分枝桿菌液體菌苗，或經(jīng)冷凍干燥制得恥垢分枝桿菌菌苗的凍干制劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的恥垢分枝桿菌菌苗的制備方法，其特征在于所述的改良羅氏培養(yǎng)基的配制方法為(2000ml)將天冬素4.5g、磷酸二氫鉀3.0g、檸檬酸鎂0.65g、硫酸鎂0.3g、馬鈴薯淀粉37.6g、丙三醇15.0ml、蒸餾水750ml混勻后，沸水浴至澄明，10磅20分鐘滅菌，即為基質(zhì)；將新鮮雞蛋洗凈瀝干，75％酒精中浸泡30分鐘，取出，放入無菌室，晾干；將雞蛋液1250ml打入容器攪勻后經(jīng)無菌紗布過濾入含基質(zhì)的大三角瓶中，混勻并加入2％孔雀綠液20ml混勻，倒入廣口瓶中，分裝中管，約7ml/管；最后在87℃-88℃，40分鐘條件下烤干。37℃無菌測(cè)定24h后貯存4℃冰箱備用。
8.上述任一權(quán)利要求所述的恥垢分枝桿菌菌苗在制備一種生物制品中的用途，該生物制品可用于預(yù)防結(jié)核高危人群的內(nèi)源性復(fù)發(fā)和外源性再感染；或可用于促進(jìn)免疫功能處于低下狀態(tài)的結(jié)核菌感染人群的免疫功能恢復(fù)；或可用于抑制免疫功能處于亢進(jìn)狀態(tài)的結(jié)核菌感染人群的過強(qiáng)免疫應(yīng)答。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的恥垢分枝桿菌菌苗在制備一種生物制品中的用途，其特征在于該生物制品可用于提高正常人群的Th1類免疫應(yīng)答。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種恥垢分枝桿菌菌苗，是恥垢分枝桿菌(Mycobacterium Smegmatis)的裂解產(chǎn)物，集中了細(xì)菌細(xì)胞壁良好佐劑作用、菌體蛋白的抗原特異性及誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子的作用特點(diǎn)，并富含細(xì)菌DNA具有較強(qiáng)免疫活性的CpG片段。該菌苗是通過收集生長(zhǎng)于改良羅氏培養(yǎng)基上的恥垢分枝桿菌，用高壓蒸汽法裂解制備得到的。該恥垢分枝桿菌菌苗可用于提高正常人群對(duì)結(jié)核菌的免疫功能，促進(jìn)免疫功能處于低下狀態(tài)的結(jié)核菌感染人群的免疫功能恢復(fù)，抑制免疫功能處于亢進(jìn)狀態(tài)的結(jié)核菌感染人群的過強(qiáng)免疫應(yīng)答；尤其用于對(duì)結(jié)核高危人群的免疫預(yù)防。
文檔編號(hào)A61K39/04GK1483812SQ0213068
公開日2004年3月24日 申請(qǐng)日期2002年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月18日
發(fā)明者王國(guó)治, 徐苗, 陳保文, 沈小兵, 蘇城 申請(qǐng)人:中國(guó)藥品生物制品檢定所