專利名稱：恥垢分枝桿菌制劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及生物技術(shù)領(lǐng)域、免疫學(xué)領(lǐng)域及微生物制品藥物用途領(lǐng)域，具體涉及恥垢分枝桿菌制劑的免疫調(diào)節(jié)功能驗(yàn)證及在結(jié)核病、哮喘、乙肝等疾病的預(yù)防和治療中的用途。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是世界衛(wèi)生組織(WHO)公布的危害人類健康的十大疾病之一，據(jù)WHO估算，全球已有近1/3的人感染了結(jié)核桿菌，有2000萬(wàn)活動(dòng)性結(jié)核病患者，每年新增800萬(wàn)-1000萬(wàn)患者、并有300萬(wàn)人因結(jié)核病死亡；如果控制策略得不到進(jìn)一步改善，估計(jì)在2000-2020年間，將有10億人感染結(jié)核菌、2億人患結(jié)核病、3500萬(wàn)人死于結(jié)核病(WHO report.Basicfacts on TB.World TB Day，24.Mar，2002.)。我國(guó)是世界上22個(gè)結(jié)核高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，據(jù)2000年全國(guó)第四次結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查的數(shù)據(jù)，全國(guó)有約5億人感染了結(jié)核桿菌，其中10％的人終生會(huì)發(fā)生結(jié)核病，這部分人因發(fā)病率高被稱為結(jié)核高危人群。
化學(xué)治療一直是最重要的結(jié)核病控制措施，但隨著耐藥結(jié)核菌的廣泛流行，加上抗癆藥物毒副作用大、化療周期長(zhǎng)等導(dǎo)致病人依從性差、治療過(guò)程反復(fù)和治療效果差。而且，在全球近1/3的結(jié)核菌感染者中，有相當(dāng)一部分潛伏感染者，結(jié)核發(fā)病率遠(yuǎn)高于普通人。如何預(yù)防已經(jīng)感染結(jié)核菌的潛伏感染者發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病人，是結(jié)核病控制必須解決的問(wèn)題?，F(xiàn)有的結(jié)核病預(yù)防制品卡介苗只適用于尚未感染的人群，對(duì)已感染人群無(wú)效，化學(xué)預(yù)防又因上述弊端很難被廣泛接受。因此，面對(duì)日益嚴(yán)重的結(jié)核疫情、特別是龐大的結(jié)核高危人群(結(jié)核菌潛伏感染者)，單純依靠化學(xué)治療很難徹底攻克這一頑癥，人們必須探索新的防治措施。
國(guó)際防癆會(huì)和WHO都曾在上個(gè)世紀(jì)90年代末期指出，應(yīng)把新型疫苗列為將來(lái)結(jié)核病的重要防治方向。人類要最終控制結(jié)核病，不僅要不遺余力地診斷和治療結(jié)核病人，更要開發(fā)有效的疫苗預(yù)防結(jié)核病的發(fā)生和傳播(Ann M.Ginsberg.What’s new in tuberculosis vaccines？Bulletin of the World Health Orgnization.2002，80(6))。若干專利和文獻(xiàn)公開了滅活母牛分枝桿菌(M.Vaccae)菌苗對(duì)結(jié)核病的治療情況。研究較多的是英國(guó)Stanford教授，他用輻射滅活或高溫滅活方式制備母牛分枝桿菌制劑，并采用皮下注射方式。研究顯示該制劑具有較好的免疫刺激作用，但此種母牛分枝桿菌制劑是全菌體制劑，菌體顆粒大、易形成菌團(tuán)，造成注射后出現(xiàn)明顯的局部甚至全身副反應(yīng)，限制了它在臨床上的連續(xù)多次使用，而單次使用此類制劑顯然不符合細(xì)胞免疫應(yīng)答需要多次重復(fù)刺激的基本原理，因而限制了母牛分枝桿菌的免疫效果。多年臨床研究也證實(shí)，Stanford研究的母牛分枝桿菌制劑目前對(duì)結(jié)核病的保護(hù)效果有限(Mayo RE，Stanford JL.Double-blind placebo-controlled trial of Mycobacterium vaccae immunotherapy fortuberculosis in KwaZulu，South Africa，1991-97.Trans R Soc Trop Med Hyg.2000Sep-Oct；94(5)563-8.Stanford J，Stanford C，Grange J.Immunotherapy withMycobacterium vaccae in the treatment of tuberculosis.Front Biosci.2004 May1；91701-19.)類似產(chǎn)品還有草分枝桿菌制劑，但其注射副作用大，不能進(jìn)行多次注射而影響了作用效果。進(jìn)一步開發(fā)研制安全有效的結(jié)核病預(yù)防和治療制劑是人們控制結(jié)核病的必然需要。
支氣管哮喘(哮喘)是全球范圍內(nèi)最常見的慢性呼吸道疾病之一，是一種由多種炎癥細(xì)胞特別是肥大細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞參與的慢性氣道炎癥性疾病，在易感者中這種炎癥可引起反復(fù)發(fā)作的喘息、氣促、胸悶和咳嗽等癥狀，常伴有廣泛而多變的氣流阻塞，炎癥還引起氣道對(duì)多種刺激因子反應(yīng)性增高。近年來(lái)人們逐漸認(rèn)識(shí)到T淋巴細(xì)胞在哮喘炎癥過(guò)程中所起的重要驅(qū)動(dòng)作用。根據(jù)分泌的細(xì)胞因子不同，T淋巴細(xì)胞可被分為Th0、Th1和Th2三種亞類。抗原刺激后短期內(nèi)，Th0細(xì)胞受細(xì)胞因子、抗原特性、激素等多種因素的影響，向Th1或Th2分化，IL-12促使Th0向Th1方向分化，后者分泌IL-2、INF-γ、TNF-β；IL-4和IL-10促使Th0向Th2方向分化，后者分泌IL-4、IL-5、IL-10、IL-13。Th1亞類和Th2亞類相互抑制，以致IL-4抑制Th1型反應(yīng)，INF-γ抑制Th2型反應(yīng)。目前已經(jīng)證實(shí)哮喘患者肺的淋巴細(xì)胞激活時(shí)產(chǎn)生IL-4和IL-5等Th2類細(xì)胞因子，而后者為IgE產(chǎn)生和嗜酸性粒細(xì)胞加入所必須。由此可見，哮喘患者存在明顯的Th2優(yōu)勢(shì)應(yīng)答。臨床治療哮喘主要通過(guò)應(yīng)用皮質(zhì)類固醇和支氣管舒張藥來(lái)減緩炎癥并回復(fù)氣路梗阻，但長(zhǎng)期使用皮質(zhì)類固醇可能導(dǎo)致不可接受的副反應(yīng)。近年研究表明Th1型反應(yīng)上調(diào)是結(jié)核病、哮喘和過(guò)敏性鼻炎等呼吸系統(tǒng)免疫失調(diào)類疾病病情逆轉(zhuǎn)的核心。
慢性乙肝是因?yàn)闄C(jī)體感染乙肝病毒(HBV)后沒有得到及時(shí)、有效的治療引起，該病在我國(guó)發(fā)病率高、危害大、缺乏有效的根治措施。現(xiàn)在認(rèn)為慢性乙肝患者的免疫應(yīng)答特別是細(xì)胞免疫應(yīng)答降低，這與體內(nèi)Th1/Th2的分化異常有關(guān)。機(jī)體持續(xù)的HBV感染導(dǎo)致Th1/Th2分化異常，使得Th1應(yīng)答降低伴或不伴有Th2應(yīng)答加強(qiáng)，這種異常分化不利于機(jī)體清除HBV，反而促進(jìn)了HBV的持續(xù)存在。細(xì)胞因子在此過(guò)程發(fā)揮重要作用。首先，HBV感染DCs(樹突狀細(xì)胞)的前體細(xì)胞或成熟的DCs，并在其中增殖，損害了DCs的功能[1.Wang FS，Xing LH，Liu MX，Zhu CL，et al.Dysfunction of peripheral blood dendritic cellsfrom patients wiTh chronic hepatitis B virus infection.World JGastroenterol.2001；7(4)537-41.2.Lohr HF，Pingel S，Bocher WO，etal.Reduced virus specific T helper cell induction by autologous dendriticcells in patients wiTh chronic hepatitis B-restoration by exogenousinterleukin-12.Clin Exp Immunol.2002；130(1)107-14.3.Beckebaum S，Cicinnati VR，Zhang X，et al.Hepatitis B virus-induced defect ofmonocyte-derived dendritic cells leads to impaired T helper type 1response in vitromechanisms for viral immune escape.Immunology.2003；109(4)487-95.]，使其分泌IL-12的能力降低，限制了Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞的分化。病毒特異性Th1細(xì)胞依靠分泌的多種細(xì)胞因子發(fā)揮直接抗病毒或間接免疫調(diào)節(jié)作用，如其分泌的IFN-γ既可以直接抑制病毒基因的復(fù)制，也可以促進(jìn)DC分泌IL-12，后者進(jìn)一步促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化，即IFN-γ和IL-12之間存在著相互正反饋[4.Szabo SJ，Dighe AS，Gubler U，et al.Regulation ofThe interleukin[IL]-12R beta 2 subunit expression in developing T helper1[Th1]and Th2 cells.J Exp Med.1997；185(5)817-24.]。DC細(xì)胞的激活和Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子是機(jī)體產(chǎn)生病毒特異性CTL的必要條件[5.Kasahara S，Ando K，Saito K，Sekikawa K，rt al.Lack of tumor necrosisfactor alpha induces impaired proliferation of hepatitis B virus-specificcytotoxic T lymphocytes.J Virol.2003；77(4)2469-76.]，后者是清除HBV的重要效應(yīng)細(xì)胞。對(duì)乙肝疫苗無(wú)應(yīng)答者的研究也顯示，疫苗的無(wú)應(yīng)答性主要與Th1缺乏反應(yīng)性有關(guān)[6.Chedid MG，Deulofeut H，Yunis DE，Defect inTh1-like cells of nonresponders to hepatitis B vaccine.Hum Immunol.1997；58(1)42-51.7.Vingerhoets J，Vanham G，Kestens L，et al.DeficientT-cell responses in non-responders to hepatitis B vaccinationabsenceof TH1 cytokine production.Immunol Lett.1994；39(2)163-8.]。Th2細(xì)胞的作用相反，主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10，參與B細(xì)胞增殖、抗體產(chǎn)生和超敏反應(yīng)性疾病，同時(shí)，IL-4和IL-10均抑制Th1分化，啟動(dòng)Th2分化。有研究表明慢性乙肝患者外周血CD4+T細(xì)胞中以Th0為主，在肝內(nèi)也以Th0為主，分泌低水平的IFN-γ，而IL-4的水平則較高，提示此類人群以Th2型應(yīng)答占優(yōu)勢(shì)[8.Bertoletti A，D’Elios MM，Boni C，et al.Different cytokine profilesof intraphepatic T cells in chronic hepatitis B and hepatitis C virusinfections.Gastroenterology.1997；112193-9.9.Chisari FV，F(xiàn)errari C.Hepatitis B virus immunopaThogenesis.Annu Rev Immunol.1995；1329-60.]，而病毒特異性Th2細(xì)胞可能有利于HBV的持續(xù)感染。因此，尋找可以活化Th1細(xì)胞、抑制Th2細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)制劑，對(duì)慢性乙肝的防治會(huì)有很大的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人通過(guò)對(duì)諸多分枝桿菌的文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)恥垢分枝桿菌有作為優(yōu)良免疫調(diào)節(jié)劑的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。恥垢分枝桿菌(Mycobacterium Smegmatis)是一種快生長(zhǎng)、非致病性分枝桿菌，具有較強(qiáng)的免疫原性，目前對(duì)于恥垢分枝桿菌的研究集中在利用恥垢分枝桿菌生長(zhǎng)快、非致病性作為外源基因的載體應(yīng)用于重組蛋白的研究。然而，一種生物制品要想真正服務(wù)于人類健康，除了具有明顯的有效性，還必須具有可靠的安全性。如背景技術(shù)中所述母牛分枝桿菌制劑，雖然具有較好的免疫刺激作用，但因工藝限制，使得安全性受限，進(jìn)而限制了臨床上的連續(xù)多次使用、影響了它的作用效果。恥垢分枝桿菌本身具有很好的免疫原性，但用該菌制備的恥垢分枝桿菌制劑能否成功應(yīng)用于臨床，安全性是一個(gè)重要因素。
眾所周知，細(xì)菌胞壁多糖具有很好的免疫刺激作用、菌體蛋白具有較好的抗原性、細(xì)菌核酸因富含CpG片斷具有優(yōu)異的免疫調(diào)節(jié)功能，如能綜合分枝桿菌胞壁多糖、菌體蛋白和核酸三大成份的優(yōu)點(diǎn)，有可能制備出很好的免疫調(diào)節(jié)劑。然而，含有這三大成份的全菌體制劑有個(gè)致命的弱點(diǎn)就是菌體顆粒大、引起難以接受的毒副作用，特別是分枝桿菌，因脂質(zhì)含量高、胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜，常規(guī)的細(xì)菌破碎方式很難使菌體充分裂解。因此，要想充分應(yīng)用分枝桿菌的免疫調(diào)節(jié)作用，使其真正應(yīng)用于臨床，工藝的選擇至關(guān)重要。發(fā)明人通過(guò)多年研究，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較、反思和進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在裂解過(guò)程中先破碎菌體，如壓力破碎或超聲破碎工藝，可更好的裂解分枝桿菌使其細(xì)胞壁充分裂解、釋放出菌體蛋白和核酸，并使裂解產(chǎn)物達(dá)到一種均質(zhì)、可溶狀態(tài)，同時(shí)采用低含量成型好的凍干輔劑凍干制品，使制品保持良好的穩(wěn)定性。經(jīng)以上工藝制備的恥垢分枝桿菌制劑與其它菌體制品(如輻射滅活制備的全菌體制劑或高壓蒸汽裂解制備的部分裂解菌體制劑)相比，在保留分枝桿菌良好免疫性的同時(shí)，因使菌體充分裂解，并最終獲得均質(zhì)、可溶的制劑，具有更好的安全性。
本發(fā)明提供的恥垢分枝桿菌制劑，優(yōu)選凍干制劑，是一種安全、有效的免疫調(diào)節(jié)劑，可增強(qiáng)正常機(jī)體的免疫功能、促進(jìn)免疫低下機(jī)體免疫功能的恢復(fù)和抑制免疫亢進(jìn)機(jī)體過(guò)強(qiáng)的免疫應(yīng)答，即具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用。恥垢分枝桿菌制劑能促進(jìn)Th1應(yīng)答、抑制Th2應(yīng)答，對(duì)結(jié)核病、肝炎以及哮喘等疾病有潛在的預(yù)防或/和治療效果。
本發(fā)明提供恥垢分枝桿菌制劑在制備用于免疫調(diào)節(jié)的藥物中的應(yīng)用，其中所述免疫調(diào)節(jié)為提高正常機(jī)體的免疫功能、促進(jìn)免疫低下機(jī)體免疫功能的恢復(fù)或抑制免疫亢進(jìn)機(jī)體過(guò)強(qiáng)的免疫應(yīng)答，促進(jìn)遲發(fā)型超敏反應(yīng)、促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖，具體的，所述免疫調(diào)節(jié)表現(xiàn)為促進(jìn)Th1類免疫應(yīng)答或抑制Th2類免疫應(yīng)答。本發(fā)明進(jìn)一步提供恥垢分枝桿菌制劑在制備用于治療結(jié)核病、肝炎如乙型肝炎、或哮喘的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供恥垢分枝桿菌制劑在制備用于加強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞對(duì)抗原的吞噬和處理能力、促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌GM-CSF或IL-1細(xì)胞因子、提高IL-12、IL-2、IFN-γ的表達(dá)量，或降低IL-4的表達(dá)量的藥物以及用于促進(jìn)機(jī)體對(duì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的微生物殺傷和清除能力，如促進(jìn)NO的產(chǎn)生的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的恥垢分枝桿菌制劑由恥垢分枝桿菌經(jīng)裂解制備而成，在裂解過(guò)程中首先破碎菌體，可采用高壓破碎法和超聲破碎法，優(yōu)選高壓破碎法。本發(fā)明基于將上述破碎方法應(yīng)用于恥垢分枝桿菌制劑的裂解制備，其具體步驟和參數(shù)選擇不作為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠進(jìn)行常規(guī)選擇而不影響制劑的效果。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，高壓破碎法為離心收集恥垢分枝桿菌，用凍干保護(hù)液稀釋后經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)破碎菌體，然后經(jīng)110℃-135℃蒸汽處理10-40分鐘，優(yōu)選121℃蒸汽處理20分鐘制得恥垢分枝桿菌制劑。凍干保護(hù)液為磷酸鹽緩沖液，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉多種凍干保護(hù)液，不限于本發(fā)明使用的具體試劑，本發(fā)明優(yōu)選使用的磷酸鹽緩沖液具有如下配比在1500重量份去離子水中加入3.75重量份味精、3.75重量份蔗糖、10.8重量份氯化鈉、6.525重量份無(wú)水磷酸二氫鉀配成鉀液，在1500重量份去離子水中加入3.75重量份味精、3.75重量份蔗糖、10.8重量份氯化鈉、27.45重量份無(wú)水磷酸氫二鈉配成鈉液，取1500重量份鉀液和1100重量份鈉液混合，使混合液的pH為6.0-8.0，優(yōu)選7.0-7.4，最優(yōu)選7.2，混合液通過(guò)G3漏斗過(guò)濾后110℃-135℃蒸汽處理10-40分鐘，優(yōu)選115℃蒸汽滅菌30分鐘即為磷酸鹽緩沖液。用凍干保護(hù)液稀釋制備成濕菌濃度為1-1000mg/ml的菌懸液，濕菌的優(yōu)選濃度根據(jù)使用的具體儀器，以達(dá)到良好的破碎效果為佳，優(yōu)選10mg/ml的菌懸液，高壓均質(zhì)機(jī)的高壓氣流剪切技術(shù)勻漿破碎菌體條件為400-2000bar，優(yōu)選1200bar。超聲破碎法為離心收集恥垢分枝桿菌，用凍干保護(hù)液稀釋后超聲破碎菌體，然后經(jīng)110℃-135℃蒸汽處理10-40分鐘，優(yōu)選121℃蒸汽處理20分鐘或60Co照射15分鐘制得恥垢分枝桿菌制劑。凍干保護(hù)液為磷酸鹽緩沖液，凍干保護(hù)液稀釋制備成濕菌濃度為1-1000mg/ml的菌懸液，優(yōu)選濃度根據(jù)使用的具體儀器，以達(dá)到良好的破碎效果為佳，優(yōu)選100mg/ml的菌懸液，超聲破碎儀破碎菌體條件200-2000W、破碎5秒間歇5秒為一次、共破碎30-200次，優(yōu)選1000W破碎180次。
本發(fā)明提供用于預(yù)防或治療結(jié)核病、肝炎、哮喘等疾病的藥物組合物或疫苗，所述藥物組合物或疫苗包含經(jīng)上述方法獲得的恥垢分枝桿菌制劑。
本申請(qǐng)
具體實(shí)施例方式
選用菌株號(hào)為CGMCC NO.0795的恥垢分枝桿菌為例進(jìn)行說(shuō)明，但不作為本發(fā)明的限制，任何其它恥垢分枝桿菌能夠取得同樣的效果。


圖1恥垢分枝桿菌制劑免疫小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)產(chǎn)生的IL-120陰性對(duì)照組 10.1mg恥垢分枝桿菌制劑組20.25mg恥垢分枝桿菌制劑組30.5mg恥垢分枝桿菌制劑組
*指恥垢組與對(duì)照組比較p＜0.05**指恥垢組與對(duì)照組比較p＜0.01圖2.恥垢分枝桿菌制劑免疫小鼠的脾臟T淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)產(chǎn)生的IL-20陰性對(duì)照組 10.1mg恥垢分枝桿菌制劑組20.25mg恥垢分枝桿菌制劑組30.5mg恥垢分枝桿菌制劑組**指恥垢組與對(duì)照組比較p＜0.01圖3.恥垢分枝桿菌制劑免疫小鼠的脾臟T淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)產(chǎn)生的IFN-γ(N.S指生理鹽水對(duì)照組，M.S指恥垢分枝桿菌制劑免疫組)*指脾臟T淋巴細(xì)胞體外以PPD刺激時(shí)，恥垢組與對(duì)照組比較p＜0.05圖4恥垢分枝桿菌制劑免疫小鼠的脾臟T淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)產(chǎn)生的IL-4(N.S指生理鹽水對(duì)照組，M.S指恥垢分枝桿菌制劑免疫組)☆指脾臟T淋巴細(xì)胞體外以ConA刺激時(shí)，恥垢組與對(duì)照組比較p＝0.065圖5.恥垢分枝桿菌制劑免疫小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)產(chǎn)生的GM-CSF0陰性對(duì)照組 10.1mg恥垢分枝桿菌制劑免疫組20.5mg恥垢分枝桿菌制劑免疫組 31.0mg恥垢分枝桿菌制劑免疫組**指恥垢組與對(duì)照組比較p＜0.01圖6.恥垢分枝桿菌制劑免疫小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)產(chǎn)生的IL-10陰性對(duì)照組 10.1mg恥垢分枝桿菌制劑免疫組20.5mg恥垢分枝桿菌制劑免疫組 31.0mg恥垢分枝桿菌制劑免疫組*指恥垢組與對(duì)照組比較p＜0.05圖7.恥垢分枝桿菌制劑免疫小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)產(chǎn)生的NO0陰性對(duì)照組 10.1mg恥垢分枝桿菌制劑免疫組20.5mg恥垢分枝桿菌制劑免疫組 31.0mg恥垢分枝桿菌制劑免疫組**指恥垢組與對(duì)照組比較p＜0.01圖8.恥垢分枝桿菌制劑對(duì)免疫功能低下小鼠的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響0陰性對(duì)照組 10.1mg恥垢分枝桿菌制劑免疫組20.5mg恥垢分枝桿菌制劑免疫組 31.0mg恥垢分枝桿菌制劑免疫組4正常對(duì)照組 **指各組與陰性對(duì)照組比較p＜0.0具體實(shí)施方式
實(shí)施例1恥垢分枝桿菌制劑的制備可采用不同的物理裂解方法制備恥垢分枝桿菌制劑，最優(yōu)選高壓破碎法。選用的菌株為恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)，本實(shí)施例選用菌株號(hào)CGMCC NO.0795的恥垢分枝桿菌為例進(jìn)行說(shuō)明，CGMCC NO.0795菌株在已公布的在先申請(qǐng)CN1483812A中記載。其它恥垢分枝桿菌菌株同樣適用。
1、高壓破碎法制備恥垢分枝桿菌制劑取改良羅氏培養(yǎng)基上新鮮培養(yǎng)的恥垢分枝桿菌，用生理鹽水洗脫收集菌體，再經(jīng)生理鹽水離心洗滌數(shù)次，精確稱重，用凍干保護(hù)液(磷酸鹽緩沖液)稀釋制備成濕菌濃度為10mg/ml的菌懸液，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)(丹麥APV公司生產(chǎn)的Homogenizer，Model-2000)的高壓氣流剪切技術(shù)勻漿破碎菌體，條件為1200bar、破碎4次，低溫低速離心去除顆粒沉淀物，低溫低速離心條件2-8℃、1000-6000轉(zhuǎn)/分離心10-30分鐘，本實(shí)施例采用4℃、3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，上清液體經(jīng)121℃蒸汽處理20分鐘即為恥垢分枝桿菌制劑。為保持更好的穩(wěn)定性，優(yōu)選將上述恥垢分枝桿菌制劑冷凍真空干燥制備成恥垢分枝桿菌凍干制劑。
該方法除了使用高壓均質(zhì)機(jī)的高壓氣流剪切技術(shù)，其它類似的高壓破碎技術(shù)均可，如采用French Pressure cell裂解細(xì)胞(400-12000Ib/in2)后低溫低速離心。
2、超聲破碎法制備恥垢分枝桿菌制劑取改良羅氏培養(yǎng)基上新鮮培養(yǎng)的恥垢分枝桿菌，用生理鹽水洗脫收集菌體，再經(jīng)生理鹽水離心洗滌數(shù)次，精確稱重，用凍干保護(hù)液(磷酸鹽緩沖液)稀釋制備成濕菌濃度為100mg/ml的菌懸液，經(jīng)超聲破碎儀(寧波新芝科器研究所生產(chǎn)的JY98-3超聲波細(xì)胞粉碎機(jī))破碎菌體，選用條件1000W、破碎5秒間歇5秒為一次、共破碎180次，低溫低速離心去除顆粒沉淀物，低溫低速離心條件2-8℃、1000-6000轉(zhuǎn)/分離心10-30分鐘，本實(shí)施例采用4℃、3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，上清液體經(jīng)121℃蒸汽處理20分鐘(或60Co照射15分鐘)即為恥垢分枝桿菌制劑。為保持更好的穩(wěn)定性，優(yōu)選將上述恥垢分枝桿菌制劑冷凍真空干燥制備成恥垢分枝桿菌凍干制劑。
本發(fā)明優(yōu)選使用磷酸鹽緩沖液作為凍干保護(hù)液，其組成和配比如下1)鉀液味精 3.75g蔗糖 3.75g氯化鈉10.8g無(wú)水磷酸二氫鉀6.525g去離子水 1500ml
2)鈉液味精 3.75g蔗糖 3.75g氯化鈉10.8g無(wú)水磷酸氫二鈉27.45g去離子水 1500ml3)凍干保護(hù)液取1500ml鉀液和1100ml鈉液混合，使混合液的pH為7.2，混合液通過(guò)G3漏斗過(guò)濾后再經(jīng)115℃蒸汽滅菌30min即為凍干保護(hù)液。
上述高壓破碎法或超聲破碎法制備的恥垢分枝桿菌制劑用于結(jié)核病、乙肝、哮喘的預(yù)防或治療的優(yōu)選劑量為0.01-10mg恥垢分枝桿菌制劑/劑，優(yōu)選0.05-5mg/劑，最優(yōu)選0.1-1mg/劑。所述0.01-10mg、0.05-5mg或0.1-1mg恥垢分枝桿菌制劑以及下面實(shí)施例中提及的0.1-1mg、2mg、5mg、10mg、50mg恥垢分枝桿菌制劑是指由相應(yīng)濕菌重量的恥垢分枝桿菌經(jīng)上述方法裂解后的裂解產(chǎn)物得到的制劑。
在先申請(qǐng)CN1483812A中提及的高壓蒸汽裂解法主要利用高溫殺滅恥垢分枝桿菌，同時(shí)高溫對(duì)細(xì)菌有一定的裂解作用，但由于胞壁裂解不充分，使裂解后的多數(shù)細(xì)菌菌體外觀不破壞，但可有限釋放少量蛋白和核酸。本發(fā)明所述的高壓破碎利用高壓氣流剪切技術(shù)，瞬間內(nèi)細(xì)菌承受的壓力發(fā)生劇烈變化，使細(xì)菌胞壁徹底崩解，充分釋放菌體蛋白和核酸，極少量未破碎的菌體或裂解不充分的細(xì)胞壁又經(jīng)低溫低速離心去除，最終得到均質(zhì)、可溶物。
通過(guò)對(duì)制備過(guò)程中系列指標(biāo)的檢測(cè)可以更直觀地看出兩種方法對(duì)恥垢分枝桿菌裂解效果的差別。
表1 恥垢分枝桿菌制劑兩種制備方法的比較

說(shuō)明表1中所述的原始菌液濃度為10mg/ml。
從上表可以看出，同樣重量的恥垢分支桿菌經(jīng)高壓蒸汽裂解法釋放的蛋白量?jī)H為高壓破碎法的1/10，其他成份釋放量也明顯減少，導(dǎo)致裂解產(chǎn)物的吸光值偏低；破碎后菌液鏡檢也可看出二者的均質(zhì)程度不同，高壓破碎法制備的恥垢分支桿菌制劑比高壓蒸汽裂解法制備的恥垢分支桿菌制劑更為均勻，經(jīng)低溫低速離心后的制劑已不含有形的顆粒沉淀物。因此，高壓破碎法制備的恥垢分支桿菌制劑顯然具有更好的安全性，并可按細(xì)胞免疫的原理在臨床上連續(xù)多次使用，以達(dá)理想的免疫效果。
實(shí)施例2恥垢分枝桿菌制劑對(duì)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)和T淋巴細(xì)胞增殖功能的影響T淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫應(yīng)答重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，遲發(fā)型超敏反應(yīng)和T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)分別作為體內(nèi)、外細(xì)胞免疫功能的基本參數(shù)用來(lái)評(píng)價(jià)機(jī)體的免疫功能。此例說(shuō)明恥垢分枝桿菌制劑免疫小鼠后對(duì)遲發(fā)型超敏反應(yīng)和T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響。
給實(shí)驗(yàn)組小鼠和對(duì)照組小鼠分別皮下注射0.25mg恥垢分枝桿菌制劑和等體積的生理鹽水，每隔2周注射1次、共注射2次。末次免疫后2周，以10μgPPD/20μl攻擊右側(cè)足墊，同時(shí)以BSA作對(duì)照，以同樣劑量注射小鼠左側(cè)足墊，攻擊前與攻擊后24h分別測(cè)量足墊厚度。以攻擊前、后足墊腫脹(mm)為指標(biāo)判斷DTH反應(yīng)的強(qiáng)度。結(jié)果見表2。
表2 恥垢分枝桿菌制劑對(duì)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響(mm)

注*指恥垢制劑組與對(duì)照組比較p＜0.05給實(shí)驗(yàn)組小鼠和對(duì)照組小鼠分別皮下注射0.25mg恥垢分枝桿菌制劑和等體積的生理鹽水，每周一次、連續(xù)注射3周。末次免疫后一周，無(wú)菌取脾、制備單個(gè)核細(xì)胞懸液，使細(xì)胞濃度為2×106/ml，分裝96孔板，每孔200μl，然后添加20μl ConA或PPD或完全培養(yǎng)基(作空白對(duì)照)，ConA與PPD在孔內(nèi)終濃度分別為5μg/ml和15μg/ml，每個(gè)處理重復(fù)2-3孔；37℃，5％CO2全濕潤(rùn)培養(yǎng)70h后，每孔加入10μlMTT(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，離心去上清。每孔加入100μl20％SDS-DMF細(xì)胞裂解液，37℃過(guò)夜，置酶標(biāo)儀(Wellscan MK3)上比色，測(cè)定波長(zhǎng)為570nm，參考波長(zhǎng)為630nm。計(jì)算復(fù)孔的OD值平均值以反應(yīng)T細(xì)胞增殖強(qiáng)度。結(jié)果見表3。
表3 恥垢分枝桿菌制劑對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞增殖功能的影響

注**指恥垢制劑組與對(duì)照組比較p＜0.01結(jié)論上述結(jié)果表明恥垢分枝桿菌制劑可以促進(jìn)小鼠的遲發(fā)型超敏反應(yīng)和T淋巴細(xì)胞增殖功能，即上調(diào)正常小鼠的免疫功能。
實(shí)施例3恥垢分枝桿菌制劑對(duì)小鼠Th1和Th2類細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響Th細(xì)胞是免疫系統(tǒng)重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，根據(jù)分泌的細(xì)胞因子不同，Th細(xì)胞被分為Th1和Th2兩大類，前者主要分泌IFN-γ和IL-2等，后者主要分泌IL-4、IL-5和IL-10等。Th1/Th2的動(dòng)態(tài)平衡受多因素調(diào)節(jié)，其中IL-12被認(rèn)為是Th1應(yīng)答的始動(dòng)因子，促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化。Th1/Th2應(yīng)答維持一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)機(jī)體的免疫狀態(tài)至關(guān)重要。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，呼吸系統(tǒng)的多種疾病與Th1/Th2的失衡有關(guān)，對(duì)結(jié)核病而言，Th1優(yōu)勢(shì)應(yīng)答介導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)，Th2優(yōu)勢(shì)應(yīng)答則介導(dǎo)以遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)為主的反應(yīng)，伴隨著病理性免疫損傷(MosmannTR，Sad S.The expanding universeof T-cell subsetsTh1，Th2 and more.Immunol Today，1996，17138-146.)本例通過(guò)研究恥垢分枝桿菌制劑對(duì)Th1、Th2類細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響，說(shuō)明恥垢分枝桿菌制劑對(duì)機(jī)體Th1/Th2應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用。
以不同劑量的恥垢分枝桿菌制劑免疫小鼠，同時(shí)以等體積的生理鹽水注射另一組小鼠作為對(duì)照。末次免疫后1周，無(wú)菌取出脾臟淋巴細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度分別為2.0×106/ml和2.5×106/ml，分裝24孔板，每孔1ml，并添加100μl ConA或PPD，37℃、5％CO2全濕潤(rùn)培養(yǎng)72h后離心，取上清，-30℃保存。分別用小鼠IL-2、IL-4和IFN-γ ELISA試劑盒測(cè)定脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中相應(yīng)細(xì)胞因子含量，用小鼠IL-12 ELISA試劑盒測(cè)定腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-12含量。測(cè)定值經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果見圖1-4。
此例結(jié)果說(shuō)明恥垢分枝桿菌制劑可以提高Th1類細(xì)胞因子如IL-12、IL-2、和IFN-γ的表達(dá)量，降低Th2類細(xì)胞因子如IL-4的表達(dá)量。由此可推斷恥垢分枝桿菌制劑可上調(diào)Th1類應(yīng)答、抑制Th2類應(yīng)答，這對(duì)結(jié)核、哮喘、乙肝等免疫介導(dǎo)疾病的防治具有重要意義。
實(shí)施例4恥垢分枝桿菌制劑對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞分泌IL-1和GM-CSF的影響巨噬細(xì)胞是一種重要的抗原遞呈細(xì)胞和免疫效應(yīng)細(xì)胞，可分泌多種細(xì)胞因子發(fā)揮多種免疫功能。如GM-CSF除了對(duì)炎癥反應(yīng)有重要的調(diào)節(jié)作用，還可增強(qiáng)粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的吞噬功能，誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟和功能性分布；IL-1是一種重要的炎癥介質(zhì)，在抗微生物感染中具有重要作用，同時(shí)具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用，可增強(qiáng)抗原提呈細(xì)胞對(duì)抗原的吞噬活性和遞呈能力等。此例通過(guò)探討恥垢分枝桿菌制劑對(duì)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響，說(shuō)明該制劑對(duì)抗原遞呈系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例3，結(jié)果見圖5、6。
以上結(jié)果說(shuō)明恥垢分枝桿菌制劑可促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞分泌GM-CSF和IL-1等細(xì)胞因子，由此可推斷該制劑有望能夠加強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞對(duì)抗原的吞噬和處理能力。
實(shí)施例5恥垢分枝桿菌制劑對(duì)小鼠體內(nèi)一氧化氮產(chǎn)生的影響NO在體內(nèi)是一種重要的信號(hào)分子和有力的效應(yīng)分子，其水平提高有利于機(jī)體對(duì)寄生在細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌、病毒的殺傷和清除作用。巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)經(jīng)適當(dāng)?shù)拇碳ぴ烧T導(dǎo)產(chǎn)生NO，產(chǎn)生的NO快速氧化成NO-2，通過(guò)檢測(cè)NO-2可反映NO的產(chǎn)生水平。此例說(shuō)明恥垢分枝桿菌制劑免疫小鼠后對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞NO產(chǎn)生情況的影響。
以不同劑量的恥垢分枝桿菌制劑免疫小鼠，同時(shí)以等體積的生理鹽水注射另一組小鼠作為對(duì)照。末次免疫后1周，無(wú)菌取出腹腔巨噬細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×106/ml，分裝24孔板，每孔1ml，并添加100μl LPS，37℃、5％CO2全濕潤(rùn)培養(yǎng)24h后離心，取上清，-30℃保存。用Griess試劑顯色法檢測(cè)上清中NO的含量。結(jié)果見圖7。
此例顯示恥垢分枝桿菌制劑可促進(jìn)NO的產(chǎn)生，這將有利于機(jī)體對(duì)已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核桿菌等微生物發(fā)揮殺傷和清除作用。
實(shí)施例6恥垢分枝桿菌制劑對(duì)免疫功能低下機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用本例說(shuō)明恥垢分枝桿菌制劑對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠免疫功能的影響。將40只Balb/c小鼠隨機(jī)分成5組，分別為恥垢分枝桿菌制劑低、中、高劑量組、陰性對(duì)照組和正常對(duì)照組，每組8只。正常對(duì)照組在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中不給任何藥物；恥垢分枝桿菌制劑低、中、高劑量組動(dòng)物首先分別以0.1mg、0.5mg和1.0mg恥垢分枝桿菌制劑免疫一次，陰性對(duì)照組動(dòng)物注射等體積生理鹽水，一周后給恥垢分枝桿菌制劑低、中、高劑量組和陰性對(duì)照組動(dòng)物皮下注射環(huán)磷酰胺100mg/kg，造成免疫功能低下模型，于注射環(huán)磷酰胺后第1天和第3天再分別加強(qiáng)免疫一次、劑量和方式同首次免疫。注射環(huán)磷酰胺后一周，同實(shí)施例2無(wú)菌分離培養(yǎng)脾淋巴細(xì)胞，培養(yǎng)70h后每孔加入20μl 5mg/ml MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖強(qiáng)度。結(jié)果見圖8。
如圖所示，正常對(duì)照組T淋巴細(xì)胞增殖強(qiáng)度明顯強(qiáng)于陰性對(duì)照組，說(shuō)明免疫功能低下模型建立成功；恥垢分枝桿菌制劑免疫組T淋巴細(xì)胞增殖強(qiáng)度明顯強(qiáng)于陰性對(duì)照組甚至強(qiáng)于正常對(duì)照組，說(shuō)明恥垢分枝桿菌制劑有促進(jìn)免疫功能低下機(jī)體免疫功能的恢復(fù)作用。
實(shí)施例7恥垢分枝桿菌制劑對(duì)免疫功能亢進(jìn)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用此例以I型和IV型超敏模型為例，說(shuō)明恥垢分枝桿菌制劑對(duì)免疫超敏動(dòng)物的免疫調(diào)節(jié)作用。
表4 豬血清致敏小鼠的發(fā)病指數(shù)

I型超敏模型將Balb/c小鼠隨機(jī)分成恥垢分枝桿菌制劑低、中、高劑量組和陰性對(duì)照組，每只小鼠腹腔注射0.5ml標(biāo)化的稀釋血清進(jìn)行致敏，隔日一次，共3次，建立I型超敏模型。末次致敏后次日，給恥垢分枝桿菌制劑低、中、高劑量組小鼠分別注射0.1mg、0.5mg和1.0mg恥垢分枝桿菌制劑，隔日一次，連續(xù)7次，同時(shí)給對(duì)陰性對(duì)照組小鼠注射等體積生理鹽水。末次注射后次日，以高濃度豬血清給所有小鼠行尾靜脈攻擊，1ml/只。根據(jù)發(fā)病指數(shù)記分標(biāo)準(zhǔn)，判斷小鼠發(fā)病情況，記錄發(fā)病動(dòng)物數(shù)及發(fā)病指數(shù)(分值在1分以上者為發(fā)病)(參考《中國(guó)生物制品規(guī)程》(2000版)。結(jié)果見表4。
IV型超敏模型在結(jié)核菌感染的初、中期，機(jī)體的免疫功能處于亢進(jìn)狀態(tài)，表現(xiàn)為皮膚變態(tài)反應(yīng)(IV型超敏反應(yīng)，DTH)增強(qiáng)。給PPD皮膚實(shí)驗(yàn)陰性的豚鼠皮下注射結(jié)核桿菌1100cfu/0.5ml/只，建立遲發(fā)型超敏反應(yīng)模型。然后將模型動(dòng)物隨機(jī)分成恥垢分枝桿菌制劑低、中、高劑量組和陰性對(duì)照組，在結(jié)核菌感染后的3d、10d、17d、24d分別給恥垢分枝桿菌低、中、高劑量組豚鼠每只肌肉注射0.1mg、0.25mg和0.5mg恥垢分枝桿菌制劑，給陰性對(duì)照組豚鼠每只注射0.5ml生理鹽水。在結(jié)核菌感染后6w，給豚鼠背部皮內(nèi)注射PPD 0.1ml/只，48h后觀察、測(cè)量注射局部的紅腫和硬結(jié)，記錄縱、橫徑，以縱、橫徑平均值指示DTH的強(qiáng)弱。結(jié)果見表5。
表5 結(jié)核菌感染豚鼠的遲發(fā)型超敏反應(yīng)

說(shuō)明表中測(cè)試的注射后48h硬結(jié)大小，單位為mm。
結(jié)論恥垢分枝桿菌制劑可抑制免疫亢進(jìn)機(jī)體過(guò)強(qiáng)的免疫應(yīng)答，以降低機(jī)體的病理性損傷。
實(shí)施例2-7證明恥垢分枝桿菌制劑具有優(yōu)良的免疫調(diào)節(jié)作用，除了可以提高正常機(jī)體的免疫功能，尚可促進(jìn)免疫低下機(jī)體免疫功能的恢復(fù)和抑制免疫亢進(jìn)機(jī)體過(guò)強(qiáng)的免疫應(yīng)答，即恥垢分枝桿菌制劑具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用，這對(duì)結(jié)核病等隨著病程不同、機(jī)體免疫功能不同的疾病的防治具有重要意義。而且，恥垢分枝桿菌制劑在發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用時(shí)以上調(diào)節(jié)Th1應(yīng)答、下調(diào)Th2應(yīng)答為主要方式，對(duì)結(jié)核病、肝炎如乙肝等細(xì)胞內(nèi)感染性疾病以及哮喘等以Th2應(yīng)答異常增高類疾病具有預(yù)防和治療效果。
實(shí)施例8恥垢分枝桿菌制劑對(duì)結(jié)核病的防治效果此例說(shuō)明以結(jié)核菌攻擊豚鼠后，以恥垢分枝桿菌制劑免疫的保護(hù)效果。
結(jié)核菌感染豚鼠后，每周一次，連續(xù)4周給豚鼠肌肉注射下列制備物之一1)生理鹽水(陰性對(duì)照)2)0.25mg恥垢分枝桿菌制劑感染后第7周，殺死豚鼠并解剖，觀察肝、脾、肺、淋巴結(jié)等各臟器結(jié)核病變程度，并以雙盲法進(jìn)行病變?cè)u(píng)分；無(wú)菌勻漿脾臟，測(cè)試結(jié)核分枝桿菌菌落形成單位；并取豚鼠的肝、脾、肺，固定后作病理檢查。結(jié)果如下臟器外觀陰性對(duì)照組豚鼠肺和脾上有大量、明顯的結(jié)核病灶，肝上也可見到典型的結(jié)核病灶；恥垢分枝桿菌制劑組豚鼠肺和脾上結(jié)核病灶明顯減少、有的動(dòng)物幾乎不見結(jié)核病灶。其病變?cè)u(píng)分統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果見表6。
表6 恥垢分枝桿菌制劑對(duì)結(jié)核菌感染動(dòng)物的保護(hù)效果

說(shuō)明*指恥垢制劑組與陰性對(duì)照組比較p＜0.05**指恥垢制劑組與陰性對(duì)照組比較p＜0.01病理學(xué)檢查陰性對(duì)照組動(dòng)物的肺、肝、脾多呈廣泛性粟粒性結(jié)核灶或干酪樣壞死，恥垢分枝桿菌制劑組各臟器病變均輕于陰性對(duì)照組，結(jié)核病變范圍局限、程度較輕，多為增殖性結(jié)節(jié)、非特異性炎癥或幾乎正常的組織切片。
脾臟結(jié)核桿菌荷菌量脾臟勻漿后作系列稀釋，再接種改良羅氏培養(yǎng)基，計(jì)數(shù)結(jié)核桿菌菌落形成單位，計(jì)算其對(duì)數(shù)值，作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果見表6。
實(shí)施例2-7從免疫調(diào)節(jié)的角度證明恥垢分枝桿菌制劑對(duì)結(jié)核病有防治效果，實(shí)施例8從結(jié)核模型動(dòng)物上直接證明恥垢分枝桿菌制劑對(duì)結(jié)核病的防治有顯著效果，從此例尤其可以看出該制劑對(duì)已經(jīng)感染結(jié)核菌的機(jī)體有很好的防治效果，這對(duì)我國(guó)乃至全球龐大的結(jié)核潛伏感染者的預(yù)防具有重要意義。
實(shí)施例9恥垢分枝桿菌制劑的急性毒性試驗(yàn)本例通過(guò)將恥垢分枝桿菌制劑一次性大劑量注射小鼠、觀察其毒性反應(yīng)、死亡情況等說(shuō)明該制劑無(wú)急性毒性作用。結(jié)果見表7。
表7 恥垢分枝桿菌制劑對(duì)小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)


結(jié)論上述3種劑量注射小鼠均未引起異常癥狀及死亡；從最大注射量10mg/20g/只小鼠，可推斷小鼠的最小致死量大于500mg/kg。
實(shí)施例10恥垢分枝桿菌制劑的局部刺激作用本例將恥垢分枝桿菌制劑肌肉注射于2只家兔(1mg/ml/只)，形成對(duì)照地，給另2只家兔肌肉注射1ml生理鹽水。注射后48h，處死家兔，取出注射局部肌肉，縱向切開，觀察注射局部刺激反應(yīng)，并取注射局部小塊肌肉做病理檢查。結(jié)果同生理鹽水對(duì)照組一樣，恥垢分枝桿菌制劑組家兔注射局部肌纖維未見變性壞死、未見出血、水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等異常改變。結(jié)論恥垢分枝桿菌制劑對(duì)注射局部無(wú)不良刺激作用。
實(shí)施例11恥垢分枝桿菌制劑的的全身過(guò)敏試驗(yàn)此例說(shuō)明恥垢分枝桿菌制劑應(yīng)用于機(jī)體是否會(huì)引起全身過(guò)敏反應(yīng)。
將豚鼠隨機(jī)分成3組，注射下列物質(zhì)之一1)陽(yáng)性對(duì)照組隔日肌肉注射BSA 0.5mg/0.5ml/只2)陰性對(duì)照組隔日肌肉注射生理鹽水0.5ml/只3)恥垢分枝桿菌制劑組隔日肌肉注射恥垢分枝桿菌制劑5mg/0.5ml/只每周1次，共注射3次。在首次致敏后第14天和第21天分別從后肢靜脈注射攻擊(給陽(yáng)性對(duì)照組豚鼠攻擊BSA 4mg/ml/只，給恥垢分枝桿菌制劑組和陰性對(duì)照組豚鼠攻擊恥垢分枝桿菌制劑10mg/ml/只)。在攻擊后1小時(shí)內(nèi)，密切觀察豚鼠有無(wú)抓鼻、豎毛、呼吸困難、痙攣、休克甚至死亡等過(guò)敏癥狀，并按癥狀分級(jí)，癥狀越嚴(yán)重，級(jí)數(shù)越高。
表8 各組豚鼠反應(yīng)結(jié)果 如表8所示，陽(yáng)性對(duì)照組豚鼠在攻擊后有8只出現(xiàn)典型過(guò)敏癥狀后死亡，其余4只出現(xiàn)連續(xù)、多次的咳嗽、伴有明顯的呼吸困難或痙攣等過(guò)敏癥狀，恥垢制劑組和陰性對(duì)照組豚鼠攻擊后，均未出現(xiàn)任何異常反應(yīng)，說(shuō)明恥垢分枝桿菌制劑不會(huì)引起全身過(guò)敏反應(yīng)。
實(shí)施例12恥垢分枝桿菌制劑的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)此例說(shuō)明恥垢分枝桿菌制劑高劑量、長(zhǎng)期、多次應(yīng)用于Beagle犬是否會(huì)蓄積而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性作用及其嚴(yán)重程度。
以不同劑量恥垢分枝桿菌制劑肌肉注射Beagle犬(1mg/只、10mg/只或50mg/只)，對(duì)另一組動(dòng)物注射生理鹽水作陰性對(duì)照，每周1次、連續(xù)注射14周。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間每天觀察各組動(dòng)物的外觀體征、行為活動(dòng)、進(jìn)食與飲水量、糞便性狀及有無(wú)死亡等，每1周測(cè)定一次體重，在實(shí)驗(yàn)的前期、中期、末期和恢復(fù)期分別對(duì)Beagle犬血液細(xì)胞學(xué)、血清生化學(xué)、心電圖檢測(cè)以及尿常規(guī)進(jìn)行測(cè)定，并于最后一次給藥后24小時(shí)活殺部分動(dòng)物并解剖，其余動(dòng)物繼續(xù)觀察2周后活殺并解剖。解剖時(shí)全面細(xì)致觀察各臟器情況，再取心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、甲狀腺、腦、胸腺、卵巢、子宮、睪丸等稱重，計(jì)算臟器系數(shù)，同時(shí)取胃、腸(十二指腸、空腸、回腸)、胰臟、淋巴結(jié)、膀胱、前列腺等各系統(tǒng)的主要器官，作病理組織學(xué)檢查。
結(jié)果見表9-17。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，個(gè)別動(dòng)物的單項(xiàng)指標(biāo)有偶然的一過(guò)性變化，但均在動(dòng)物的正常變動(dòng)范圍內(nèi)，且無(wú)劑量依賴性，由此可知，該變化并非藥物所致。與對(duì)照組比較，在實(shí)驗(yàn)的前、中、末期和恢復(fù)期，恥垢分枝桿菌制劑各劑量組動(dòng)物外觀體征、行為均正常，血液細(xì)胞學(xué)、血清生化、心電圖和尿常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)，給藥組與對(duì)照組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；解剖時(shí)各臟器外觀和病理學(xué)檢查均未見異常。
結(jié)論恥垢分枝桿菌制劑在低于或等于試驗(yàn)所用劑量下、長(zhǎng)期、多次使用不會(huì)產(chǎn)生毒性作用。
表9 恥垢分枝桿菌制劑長(zhǎng)期肌注對(duì)Beagle犬外周血相及出凝血時(shí)間的影響(X±SD)

注*與對(duì)照組比較P≤0.05；其余各組與對(duì)照組比較P＞0.05。
表10 恥垢分枝桿菌制劑長(zhǎng)期肌注對(duì)Beagle犬白細(xì)胞分類的影響(X±SD)

注*與對(duì)照組比較P≤0.05；其余各組與對(duì)照組比較P＞0.05。
表11 恥垢分枝桿菌制劑長(zhǎng)期肌注對(duì)Beagle犬血清各生化指標(biāo)的影響(X±SD)

注*與對(duì)照組比較P≤0.05；其余各組與對(duì)照組比較P＞0.05。
表12 恥垢分枝桿菌制劑長(zhǎng)期肌注對(duì)Beagle犬血清各生化指標(biāo)的影響(X±SD)

注恥垢分枝桿菌制劑各劑量組與對(duì)照組比較P＞0.05
表13 恥垢分枝桿菌制劑長(zhǎng)期肌注對(duì)Beagle犬心電圖的影響(X±SD)

注*與對(duì)照組比較P＜0.05；其余各組與對(duì)照組比較P＞0.05。
表14 恥垢分枝桿菌制劑長(zhǎng)期肌注對(duì)Beagle犬尿常規(guī)的影響(X±SD)

注恥垢分枝桿菌制劑各劑量組與對(duì)照組比較P＞0.05
表15 恥垢分枝桿菌制劑長(zhǎng)期肌注對(duì)Beagle犬各主要臟器系數(shù)的影響(X±SD)(給藥末期；4只/組) 注恥垢分枝桿菌制劑各劑量組與對(duì)照組比較P＞0.05
表16 恥垢分枝桿菌制劑長(zhǎng)期肌注對(duì)Beagle犬各主要臟器系數(shù)的影響(X±SD)(恢復(fù)期；2只/組) 注恥垢分枝桿菌制劑各劑量組與對(duì)照組比較P＞0.05
表17 恥垢分枝桿菌制劑長(zhǎng)期肌注對(duì)Beagle犬各主要臟器組織學(xué)檢查結(jié)果

注恥垢分枝桿菌制劑各劑量組與對(duì)照組動(dòng)物各臟器外觀和病理檢查均未見異常實(shí)施例9-12從急性毒性、局部刺激、全身過(guò)敏和長(zhǎng)期毒性等角度對(duì)恥垢分枝桿菌制劑作了系統(tǒng)的安全性評(píng)價(jià)，結(jié)果說(shuō)明該制劑無(wú)上述毒性。
綜合12個(gè)實(shí)施例，結(jié)果表明恥垢分枝桿菌制劑是一種安全、有效的免疫調(diào)節(jié)劑，具有優(yōu)良的免疫調(diào)節(jié)作用，除可增強(qiáng)正常機(jī)體的免疫功能，還可促進(jìn)免疫低下機(jī)體免疫功能的恢復(fù)和抑制免疫亢進(jìn)機(jī)體過(guò)強(qiáng)的免疫應(yīng)答，即具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)結(jié)核病等隨著病程不同、機(jī)體免疫功能不同類疾病的防治具有重要意義。恥垢分枝桿菌制劑以促進(jìn)Th1應(yīng)答、下調(diào)Th2應(yīng)答為主的調(diào)節(jié)方式對(duì)結(jié)核病、乙肝等細(xì)胞內(nèi)感染性疾病以及哮喘等以Th2應(yīng)答異常增高類疾病有潛在的預(yù)防或/和治療效果。特定的結(jié)核菌保護(hù)效果試驗(yàn)更直觀地說(shuō)明恥垢分枝桿菌制劑對(duì)已經(jīng)感染結(jié)核菌的機(jī)體可提供很好的保護(hù)效果，表明恥垢分枝桿菌制劑是一種安全有效的結(jié)核病預(yù)防和治療性疫苗。
權(quán)利要求
1.一種恥垢分枝桿菌制劑，所述制劑由恥垢分枝桿菌經(jīng)裂解制備而成，其特征在于裂解過(guò)程中首先破碎菌體。
2.如權(quán)利要求1所述的制劑，其為凍干制劑。
3.如權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述破碎采用高壓破碎法。
4.如權(quán)利要求3所述的制劑，其中所述高壓破碎法為離心收集恥垢分枝桿菌，用凍干保護(hù)液稀釋后經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)破碎菌體，然后經(jīng)110℃-135℃蒸汽處理10-40分鐘，優(yōu)選121℃蒸汽處理20分鐘制得恥垢分枝桿菌制劑。
5.如權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述破碎采用超聲破碎法。
6.如權(quán)利要求5所述的制劑，其中所述超聲破碎法為離心收集恥垢分枝桿菌，用凍干保護(hù)液稀釋后超聲破碎菌體，然后經(jīng)110℃-135℃蒸汽處理10-40分鐘，優(yōu)選121℃蒸汽處理20分鐘或60Co照射15分鐘制得恥垢分枝桿菌制劑。
7.如權(quán)利要求4或6所述的制劑，其中凍干保護(hù)液為磷酸鹽緩沖液，優(yōu)選具有如下重量配比的磷酸鹽緩沖液在1500重量份去離子水中加入3.75重量份味精、3.75重量份蔗糖、10.8重量份氯化鈉、6.525重量份無(wú)水磷酸二氫鉀配成鉀液，在1500重量份去離子水中加入3.75重量份味精、3.75重量份蔗糖、10.8重量份氯化鈉、27.45重量份無(wú)水磷酸氫二鈉配成鈉液，取1500重量份鉀液和1100重量份鈉液混合，使混合液的pH為6.0-8.0，優(yōu)選7.0-7.4，最優(yōu)選7.2，混合液通過(guò)G3漏斗過(guò)濾后110℃-135℃蒸汽處理10-40分鐘，優(yōu)選115℃蒸汽滅菌30分鐘即為磷酸鹽緩沖液。
8.一種藥物組合物，包含權(quán)利要求1-7所述的恥垢分枝桿菌制劑。
9.權(quán)利要求8所述的藥物組合物，用于預(yù)防或治療結(jié)核病。
10.一種疫苗，包含權(quán)利要求1-7所述的恥垢分枝桿菌制劑。
11.權(quán)利要求10所述的疫苗，用于預(yù)防或治療結(jié)核病。
12.恥垢分枝桿菌制劑在制備用于免疫調(diào)節(jié)的藥物中的應(yīng)用，其中所述恥垢分枝桿菌制劑由恥垢分枝桿菌經(jīng)裂解制備而成。
13.如權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其中所述免疫調(diào)節(jié)為提高正常機(jī)體的免疫功能。
14.如權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其中所述免疫調(diào)節(jié)為促進(jìn)遲發(fā)型超敏反應(yīng)、促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖、加強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞對(duì)抗原的吞噬和處理能力或促進(jìn)機(jī)體對(duì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的微生物殺傷和清除能力，例如用于促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌GM-CSF或IL-1細(xì)胞因子或促進(jìn)NO的產(chǎn)生。
15.如權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其中所述免疫調(diào)節(jié)為促進(jìn)免疫低下機(jī)體免疫功能的恢復(fù)或抑制免疫亢進(jìn)機(jī)體過(guò)強(qiáng)的免疫應(yīng)答。
16.如權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其中所述藥物用于促進(jìn)Th1類免疫應(yīng)答或抑制Th2類免疫應(yīng)答，例如用于提高IL-12、IL-2、IFN-γ的表達(dá)量，或降低IL-4的表達(dá)量。
17.恥垢分枝桿菌制劑在制備用于預(yù)防或治療結(jié)核病、肝炎、或哮喘的藥物中的應(yīng)用，其中所述恥垢分枝桿菌制劑由恥垢分枝桿菌經(jīng)裂解制備而成。
18.如權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其中所述藥物用于預(yù)防或治療結(jié)核病。
19.如權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其中所述藥物用于預(yù)防或治療乙肝或哮喘。
20.如權(quán)利要求12-19任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中恥垢分枝桿菌制劑的有效劑量為0.01-10mg/劑，優(yōu)選0.05-5mg/劑，最優(yōu)選0.1-1mg/劑。
全文摘要
本發(fā)明提供一種恥垢分枝桿菌制劑，由恥垢分枝桿菌(Mycobacterium Smegmatis)經(jīng)破碎裂解制備而成，如高壓破碎法或超聲破碎法，是一種安全、有效的免疫調(diào)節(jié)劑，可增強(qiáng)正常機(jī)體的免疫功能、促進(jìn)免疫低下機(jī)體免疫功能的恢復(fù)和抑制免疫亢進(jìn)機(jī)體過(guò)強(qiáng)的免疫應(yīng)答，即具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用。恥垢分枝桿菌制劑能促進(jìn)Th1應(yīng)答、抑制Th2應(yīng)答，對(duì)結(jié)核病、肝炎如乙肝、以及哮喘等疾病有潛在的預(yù)防或/和治療效果，是一種安全有效的結(jié)核病預(yù)防和治療性疫苗。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1699554SQ20051007663
公開日2005年11月23日 申請(qǐng)日期2005年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月13日
發(fā)明者王國(guó)治, 徐苗, 陳保文, 沈小兵, 蘇城 申請(qǐng)人:中國(guó)藥品生物制品檢定所