抗體衍生物本公開涉及新的抗體衍生物、用于制備它們的方法、包含它們的組合物及其在治療中的用途。前言雙特異性抗體單特異性抗體（如天然存在的IgG）具有兩個(gè)相同的抗原結(jié)合互補(bǔ)位，因?yàn)樗鼈冇蓛蓷l相同的重鏈和兩條相同的輕鏈組成。雙特異性抗體是改造的免疫球蛋白衍生物，其具有通常針對(duì)不同抗原或表位的兩個(gè)不同的結(jié)合互補(bǔ)位。已研發(fā)了重組雙特異性抗體（“雙特異性劑（bispecifics）”）用于多種不同的應(yīng)用，舉幾個(gè)例來(lái)說(shuō)，可能用于癌癥治療、炎性病癥和溶栓治療。在癌癥治療中，這些應(yīng)用包括效應(yīng)分子（轉(zhuǎn)化前體藥物的酶、放射性同位素、補(bǔ)體成分）、效應(yīng)細(xì)胞（CTL、NK細(xì)胞）的重新靶向和前體藥物或化療劑的遞送。在炎癥的背景中，已研發(fā)了雙特異性劑來(lái)抑制兩種或多種細(xì)胞因子。最近的工作探究它們作為胞內(nèi)雙特異性抗體（胞內(nèi)抗體）的用途（Kontermann和Müller,1999）。在一項(xiàng)研究中，用胞內(nèi)表達(dá)的雙抗體來(lái)抑制兩種細(xì)胞表面受體的功能性表達(dá)（Jendreyko等,2003）。雙特異性劑必須對(duì)疾病相關(guān)抗原具有強(qiáng)烈和選擇性的結(jié)合，并通過(guò)多種技術(shù)（如抗體人源化、轉(zhuǎn)基因人源化小鼠的使用或去免疫（de-immunization））設(shè)計(jì)為無(wú)免疫原性。產(chǎn)生具有充分質(zhì)量和足夠數(shù)量的材料用于體內(nèi)臨床前和臨床研究的困難妨礙了雙特異性抗體的廣泛發(fā)展。通常，高效的雙特異性抗體產(chǎn)生需要使得能夠形成穩(wěn)定的同源雙特異性蛋白質(zhì)的新的結(jié)構(gòu)形式和導(dǎo)致高水平產(chǎn)生的高效表達(dá)系統(tǒng)二者。已用多種方法來(lái)在原核和/或真核系統(tǒng)中產(chǎn)生雙特異性抗體，主要涉及抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的遺傳融合。還測(cè)試了一些有限的使用化學(xué)綴合的努力。重組雙特異性抗體在保存條件下的穩(wěn)定性以及這些分子的體內(nèi)穩(wěn)定性和半衰期是對(duì)臨床應(yīng)用具有強(qiáng)烈影響的關(guān)鍵參數(shù)。雙特異性劑必須足夠穩(wěn)定，以允許該分子在被降解前誘導(dǎo)治療裨益。幾項(xiàng)研究顯示，串聯(lián)scFv分子以及雙抗體在生理?xiàng)l件下失活，半衰期取決于所測(cè)試的抗體構(gòu)建體而不同。改善抗體分子穩(wěn)定性的一種方法是產(chǎn)生二硫鍵穩(wěn)定的分子，在VH-VL界面之間引入半胱氨酸橋來(lái)抑制VH和VL結(jié)構(gòu)域的解離。但是，已報(bào)道這些二硫鍵穩(wěn)定的雙特異性雙抗體在大腸桿菌（E.coli）中的產(chǎn)率明顯降低。因此，存在對(duì)適用于治療應(yīng)用的具有改善的穩(wěn)定性、半衰期和產(chǎn)率的其他雙特異性構(gòu)建體的需要。白細(xì)胞介素及其在TH介導(dǎo)的反應(yīng)中的作用CD4+T輔助（TH）淋巴細(xì)胞代表在適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要作用的細(xì)胞的異質(zhì)群體。這些細(xì)胞包括致力于對(duì)抗病原體的效應(yīng)細(xì)胞和避免對(duì)自身抗原的效應(yīng)反應(yīng)的調(diào)節(jié)T細(xì)胞（Treg）。術(shù)語(yǔ)TH源自這些細(xì)胞對(duì)幫助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體至關(guān)重要的觀察結(jié)果。另一方面，發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞負(fù)責(zé)幫助CD8+T細(xì)胞分化為所謂細(xì)胞介導(dǎo)免疫的殺傷效應(yīng)細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞本身可以是免疫反應(yīng)（如遲發(fā)型超敏反應(yīng)）中的免疫效應(yīng)細(xì)胞，其中這些細(xì)胞誘導(dǎo)主要表征為巨噬細(xì)胞激活的炎癥反應(yīng)。二十年前，描述了兩個(gè)T輔助細(xì)胞亞群。TH1細(xì)胞產(chǎn)生IFNγ，它們的主要作用是對(duì)抗胞內(nèi)微生物，而TH2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-5和IL-13，歷史上與特應(yīng)性和哮喘相關(guān)。TH1和TH2細(xì)胞發(fā)育處于某些轉(zhuǎn)錄因子的控制之下，包括T細(xì)胞中表達(dá)的T盒（Tbet）、TH1細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物和轉(zhuǎn)錄激活物（STAT）4，及TH2細(xì)胞的GATA結(jié)合蛋白（GATA）-3和STAT6。TH1分化主要由IL-12和IFNγ驅(qū)動(dòng)，而IL-4（在缺乏IL-12的情況下）驅(qū)動(dòng)TH2分化。在CD4+T細(xì)胞中，認(rèn)為IL-12信號(hào)發(fā)放連同抗原呈遞使細(xì)胞分化轉(zhuǎn)向T輔助（TH）1表型，并與促炎癥細(xì)胞因子干擾素γ（IFN-γ）的穩(wěn)健產(chǎn)生相關(guān)。最近描述的T輔助細(xì)胞的第三亞群（TH17細(xì)胞）在黏膜界面豐度高，其中它們包含致病細(xì)菌和真菌的感染。這些細(xì)胞產(chǎn)生涉及嗜中性、組織重塑和修復(fù)及抗微生物蛋白質(zhì)的產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-17A（也稱為IL-17）、IL-17F和IL-22。TH17的分化有些爭(zhēng)議：目前的共識(shí)是，IL-1和IL-6與TGF-β一起誘導(dǎo)早期TH17分化。已報(bào)道IL-21（類似于IL-2）作為TH17的生長(zhǎng)因子發(fā)揮作用。IL-6和TGF-β的組合誘導(dǎo)孤獨(dú)核受體類視黃醇相關(guān)孤獨(dú)受體（ROR）γt和RORα（其是決定TH17譜系分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子）以及IL-23R。STAT3調(diào)節(jié)IL-6誘導(dǎo)的RORγt和RORα表達(dá)及IL-17產(chǎn)生。與STAT3激活相反，STAT1激活抑制TH17細(xì)胞的發(fā)育。雖然IL-6激活STAT3和STAT1二者，但已顯示，在TH17細(xì)胞中，STAT3激活保持，而STAT1激活受抑制。已將IL-23與人TH17細(xì)胞的維持和激活相聯(lián)系。最初在小鼠和人類中作為完全分化的TH17細(xì)胞的細(xì)胞因子特征描述了IL-22。但是，最近顯示，不同亞群的人皮膚記憶T細(xì)胞（humanskin-homingmemoryTcell）產(chǎn)生IL-22，但不產(chǎn)生IL-17，也不產(chǎn)生IFNγ。產(chǎn)生IL-22的T細(xì)胞的分化可以通過(guò)在IL-6和TNF的存在下刺激幼稚T細(xì)胞或通過(guò)漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞的存在來(lái)促進(jìn)，且似乎獨(dú)立于RORC。人TH22細(xì)胞群體共表達(dá)趨化因子受體CCR6及皮膚受體CCR4和CCR10，其導(dǎo)致這些細(xì)胞可以在皮膚穩(wěn)態(tài)和病理學(xué)中很重要的假說(shuō)。長(zhǎng)期以來(lái)，認(rèn)為TH1細(xì)胞是多種自身免疫病中的主要效應(yīng)物，而已知TH2細(xì)胞涉及特應(yīng)性和哮喘。最近，已將TH17細(xì)胞作為罪魁禍?zhǔn)着c小鼠和人類中的多種自身免疫病和其他炎性疾病相聯(lián)系。之前與TH1細(xì)胞相關(guān)的許多疾病狀態(tài)（例如實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE，多發(fā)性硬化的模型）、膠原誘發(fā)關(guān)節(jié)炎和一些形式的結(jié)腸炎）顯示由依賴IL-23的TH17細(xì)胞或其他產(chǎn)生IL-17的淋巴樣細(xì)胞類型引起。TH17和Treg細(xì)胞功能間的失衡可以是這些疾病的一些中最重要的。雖然許多研究已分析了TH17細(xì)胞在腸炎和自身免疫的動(dòng)物模型中的作用，但只有幾項(xiàng)研究研究了TH17細(xì)胞在克隆病患者中的作用。在克隆病患者的固有層中發(fā)現(xiàn)增加數(shù)目的T細(xì)胞表達(dá)TH17細(xì)胞的主轉(zhuǎn)錄因子類視黃醇相關(guān)孤獨(dú)受體-ct（RORγt）。兩項(xiàng)獨(dú)立研究顯示人外周血中及來(lái)自健康個(gè)體和克隆病患者的腸中的TH17細(xì)胞（Acosta-Rodriguez等,2007；Annunziato等,2007）。這兩項(xiàng)研究顯示，這些細(xì)胞表征為表達(dá)RORγt、IL23R和CCR6，而它們?nèi)狈ψ鳛門H1細(xì)胞特征的趨化因子受體CXCR3。Annunziato等(2007)的研究證明他們命名為“TH17/TH1”細(xì)胞的腸中產(chǎn)生IL-17A的T細(xì)胞（包括還表達(dá)IL17A和IFNγ二者的T細(xì)胞群體）。Acosta-Rodriguez等(2007)鑒定了可以表征為CCR6+CCR4+表達(dá)的TH17細(xì)胞，而表達(dá)CCR6+CXCR3+的TH1細(xì)胞還包括產(chǎn)生IL17A和IFNγ二者的亞群。此外，最近的發(fā)現(xiàn)將CD161作為新的表面標(biāo)記與人TH17細(xì)胞相聯(lián)系，并顯示這些細(xì)胞來(lái)自CD161+CD4+T細(xì)胞祖先的唯一來(lái)源。TH1和TH17細(xì)胞之間的相互作用及IFNγ對(duì)TH17細(xì)胞的作用可以比之前的推測(cè)更復(fù)雜，需要進(jìn)一步的分析來(lái)闡明這些細(xì)胞譜系對(duì)克隆病及其他自身免疫病的具體貢獻(xiàn)。IL-6（由IL6基因編碼的蛋白質(zhì)）是作為促炎癥細(xì)胞因子和抗炎癥細(xì)胞因子二者發(fā)揮作用的白細(xì)胞介素。它由T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌來(lái)在例如感染期間和外傷后刺激免疫反應(yīng)，IL-6作為抗炎癥細(xì)胞因子的作用通過(guò)其對(duì)TNF-α和IL-1的抑制作用及IL-1ra和IL-10的激活來(lái)介導(dǎo)。IL-23是由兩個(gè)亞基組成的異二聚體細(xì)胞因子，一個(gè)亞基稱為p40（與另一細(xì)胞因子IL-12共有），另一個(gè)亞基稱為p19（由IL-23A基因編碼的IL-23α亞基）（見圖10A）。IL-23的兩個(gè)亞基通過(guò)二硫鍵連接。IL-23是抗感染炎癥反應(yīng)的重要部分。它促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9的上調(diào)，增加血管發(fā)生，并減少CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)。克隆病和潰瘍性結(jié)腸炎是炎性腸?。↖BD）的兩種主要疾病實(shí)體。克隆病在美國(guó)具有每100,000人6.3例的平均年發(fā)病率。雖然仍未完全了解它們的確切病因，但已提出，它們的發(fā)病機(jī)理表征為遺傳易感個(gè)體中過(guò)度的免疫反應(yīng)。許多年以來(lái)，認(rèn)為克隆病主要由TH1細(xì)胞介導(dǎo)，而潰瘍性結(jié)腸炎是TH2樣類型的炎癥。這為克隆病中提高的TH1細(xì)胞因子（如IFNγ和白細(xì)胞介素12（IL-12））水平和潰瘍性結(jié)腸炎中某些TH2細(xì)胞因子（如IL-13）的提高的表達(dá)所支持。Ustekinumab（CNTO1275；StelaraTM；Centocor,Inc.,Malvern,PA）是人免疫球蛋白G1κ（IgG1κ）單克隆抗體，其特異性結(jié)合IL-12和IL-23共有的p40亞基，并抑制IL-12和IL-23與細(xì)胞表面IL-12Rβ1受體相互作用，從而阻止IL-12或IL-23介導(dǎo)的信號(hào)級(jí)聯(lián)放大。Tocilizumab（Actemra）是抗IL-6受體的人源化重組IgG1κ單克隆抗體。FDA于2010年1月8日批準(zhǔn)Tocilizumab用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。但是，仍然存在對(duì)治療TH17和TH22細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)在其中發(fā)揮作用的疾病的其他有效療法的需要。此外，由于涉及這些疾病的免疫學(xué)反應(yīng)的復(fù)雜性，存在對(duì)作用于多種途徑（例如TH17和TH1）的療法的需要，只要這類雙特異性構(gòu)建體（例如，對(duì)IL-6和IL-23（可選地，以及IL-12）特異的構(gòu)建體）形式的療法代表重大挑戰(zhàn)。這類二價(jià)雙特異性構(gòu)建體不僅需要特異性抗原結(jié)合和中和結(jié)構(gòu)域，還需要穩(wěn)定，在體內(nèi)具有長(zhǎng)的平均滯留期和功效。雖然已作了許多努力來(lái)產(chǎn)生雙特異性抗體，但迄今所有的努力均未能產(chǎn)生這類具有長(zhǎng)的體內(nèi)滯留期的穩(wěn)定分子。此外，通過(guò)遺傳融合法產(chǎn)生雙特異性劑的許多努力未成功產(chǎn)生易于制備的，穩(wěn)定且具有高親和力的分子。本文所述雙特異性構(gòu)建體首次解決了這些問題。已通過(guò)靶向IL23和IL17A研發(fā)了靶向TH17細(xì)胞的雙特異性抗體（MabryR.等,2009）。本發(fā)明旨在提供有用的雙特異性抗體。發(fā)明人的新方法用scFv在原核系統(tǒng)中的高效產(chǎn)生和位點(diǎn)特異性化學(xué)綴合來(lái)產(chǎn)生大量雙特異性蛋白質(zhì)，避免了困擾產(chǎn)生雙特異性抗體的其他方法的許多問題。關(guān)鍵步驟是在重折疊前使用化學(xué)附著于多肽鏈的柔性接頭，其允許各scFv獨(dú)立于其他scFv重折疊，以產(chǎn)生功能性雙特異性構(gòu)建體。發(fā)明人的方法涉及將非天然氨基酸的體內(nèi)位點(diǎn)特異性摻入用于靶蛋白，該非天然氨基酸作為用于接頭（如PEG）的共價(jià)和位點(diǎn)特異性結(jié)合的反應(yīng)位點(diǎn)發(fā)揮作用（見WO2007/130453，其全部?jī)?nèi)容在此引用作為參考）。該方法的優(yōu)勢(shì)是，用來(lái)將scFv與接頭綴合的化學(xué)品(chemistry)與20種天然氨基酸正交。將非天然氨基酸摻入多肽的另一種方法描述于US7632024中（Cho等）。根據(jù)本發(fā)明，單鏈可變片段（scFv）易于大量產(chǎn)生，且可以容易地純化。B細(xì)胞克隆和功能篩選后的兔抗原特異性單克隆抗體拯救允許鑒定高質(zhì)量抗體。隨后人源化抗體并轉(zhuǎn)化為scFv。發(fā)明人針對(duì)具體靶標(biāo)（即，人IL-6、人IL-23和人IL-12）鑒定了許多人源化單克隆抗體。此外，他們產(chǎn)生了抗體片段，并改造它們來(lái)產(chǎn)生用于治療的靶向IL-6和IL-23或IL-6和IL12/23的雙特異性scFv分子，在該治療中，TH1和/或TH17細(xì)胞的抑制是有益的，包括炎性和自身免疫性疾病。Aliahmadi等(2009)EurJImmunol39,1221-1230描述了涉及抗分離的人IL-23p19亞基的山羊多克隆血清和抗-IL-6單克隆抗體的組合的某些實(shí)驗(yàn)。發(fā)明概述本發(fā)明提供包含抗-IL-6抗體或其衍生物，和抗-IL-23抗體或其衍生物的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體、產(chǎn)生這類構(gòu)建體的方法及這類構(gòu)建體在治療中的用途。本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體的抗體可以是分離的單克隆抗體，優(yōu)選地，它們是分離的人單克隆抗體。本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體的抗體可以是嵌合抗體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或其衍生物的構(gòu)架區(qū)已人源化。本發(fā)明的抗體衍生物可以包括整個(gè)可變區(qū)、可變區(qū)的重鏈（VH）、可變區(qū)的輕鏈（VL）、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、dAb或互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）。本發(fā)明的抗體衍生物完全保留或基本保留它們所衍生自的抗體的抗原結(jié)合活性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體衍生物是scFv。本發(fā)明還提供抗-IL-6抗體或其衍生物，和抗-IL-23抗體或其衍生物，產(chǎn)生這類抗體或其衍生物的方法，及這類抗體或其衍生物單獨(dú)或組合在治療中的用途?？梢孕揎棻景l(fā)明的抗體和抗體衍生物（包括雙特異性構(gòu)建體）來(lái)?yè)饺胍粋€(gè)或多個(gè)非天然氨基酸。在實(shí)施方案中，該抗-IL-6抗體或其衍生物可以包含來(lái)自13A8抗體的CDR區(qū)的特定基序。因此，本發(fā)明提供抗-IL-6抗體或其衍生物，其包含：含有氨基酸序列YIYTDX1STX2YANWAKG的CDR2區(qū)，其中：X1選自甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸；且X2選自苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；且優(yōu)選地，X1是絲氨酸或蘇氨酸，X2是色氨酸或酪氨酸；（SEQIDNO.335）和/或含有氨基酸序列RX1STLX2S的CDR5區(qū)，其中X1和X2獨(dú)立地是丙氨酸或蘇氨酸。（SEQIDNO.336）。在實(shí)施方案中，該抗-IL-6抗體或其衍生物可以包含氨基酸序列選自SEQIDNO10-15的至少1個(gè)、至少2個(gè)、至少3個(gè)、至少4個(gè)、至少5個(gè)或6個(gè)CDR區(qū)。CDR區(qū)可以選自可變區(qū)的重鏈（VH）的CDR（即SEQIDNO.10-12）和/或選自可變區(qū)的輕鏈（VL）的CDR（即SEQIDNO13-15）。在具體實(shí)施方案中，該抗-IL-6抗體或其衍生物可以包含SEQIDNO10-15的全部氨基酸序列。該抗-IL-6抗體或其衍生物可以包含抗-IL-6抗體或其衍生物的整個(gè)VH和/或VL。在具體實(shí)施方案中，該抗-IL-6抗體或其衍生物可以包含抗-IL-6抗體的VH（具有SEQIDNO.259的序列的VH）和/或抗-IL-6抗體的VL（具有SEQIDNO.261的序列的VL）。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該二價(jià)雙特異性構(gòu)建體，其包含抗-IL-6抗體或其衍生物，其是包含含有至少1個(gè)、至少2個(gè)或3個(gè)氨基酸序列為SEQIDNO.10-12的CDR區(qū)的重鏈及含有至少1個(gè)、至少2個(gè)或3個(gè)氨基酸序列為SEQIDNO.13-15的CDR區(qū)的輕鏈的scFv。在實(shí)施方案中，該scFv可以包含SEQIDNO.259的氨基酸序列及含有SEQIDNO.261的氨基酸序列的輕鏈。本發(fā)明還提供抗-IL-6抗體或其衍生物，或者二價(jià)雙特異性構(gòu)建體，其包含以上條款(clause)的基于抗體28D2、18D4、8C8、9H4和9C8的抗-IL-6抗體或其衍生物，其中分別用對(duì)SEQIDNO20-25、30-35、40-45、50-55和60-65的稱謂來(lái)取代對(duì)SEQIDNO10-15的稱謂。對(duì)于基于28D2的抗-IL-6抗體和衍生物，可以用對(duì)SEQIDNO.263和265的稱謂來(lái)取代對(duì)SEQIDNO.259和261的稱謂。本發(fā)明還涵蓋具有抗-IL-6抗體或其衍生物的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體，其包含至少一個(gè)CDR區(qū)，該CDR區(qū)的氨基酸序列與選自SEQIDNO.10-15的氨基酸序列具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性。類似地，本發(fā)明還涵蓋具有抗-IL-6抗體或其衍生物的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體，其包含至少一個(gè)CDR區(qū)，該CDR區(qū)的氨基酸序列包含對(duì)選自SEQIDNO.10-15的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、缺失或取代。在實(shí)施方案中，該CDR區(qū)包含對(duì)選自SEQIDNO.10-15的氨基酸序列的至少一個(gè)保守氨基酸取代。本發(fā)明還提供包含抗-IL-6抗體或其衍生物的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體，其包含至少一個(gè)與具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO.10-15的氨基酸序列的CDR的抗-IL-6抗體結(jié)合相同的表位的CDR區(qū)。在實(shí)施方案中，該抗-IL-6抗體或其衍生物選自或衍生自13A8、9H4、9C8、8C8、18D4和28D2。在另一實(shí)施方案中，該抗-IL-23抗體或其衍生物可以包含來(lái)自31A12抗體的CDR區(qū)的特定基序。因此，本發(fā)明提供抗-IL-23抗體或其衍生物，其包含：含有氨基酸序列YYAX1WAX2G的CDR2區(qū)，其中：X1選自絲氨酸、脯氨酸和天冬氨酸；且X2選自賴氨酸和谷氨酰胺；（SEQID337）和/或含有氨基酸序列AX1TLX2S的CDR5區(qū)，其中：X1選自絲氨酸和丙氨酸；X2選自丙氨酸和蘇氨酸。（SEQID338）如本文所使用，CDR1指VHCDR1，CDR2指VHCDR2，CDR3指VHCDR3，CDR4指VLCDR1，CDR5指VLCDR2，CDR6指VLCDR3。在另一實(shí)施方案中，該抗-IL-23抗體或其衍生物可以包含氨基酸序列選自SEQIDNO90-95的至少1個(gè)、至少2個(gè)、至少3個(gè)、至少4個(gè)、至少5個(gè)或6個(gè)CDR區(qū)。該CDR區(qū)可以選自可變區(qū)的重鏈（VH）的CDR（即SEQIDNO.90-92）和/或選自可變區(qū)的輕鏈（VL）的CDR（即SEQIDNO.93-95）。在具體實(shí)施方案中，該抗-IL-23抗體或其衍生物可以包含SEQIDNO.90-95的全部氨基酸序列。該抗-IL-23抗體或其衍生物可以包含抗-IL-23抗體或其衍生物的整個(gè)VH和/或VL。在具體實(shí)施方案中，該抗-IL-23抗體或其衍生物可以包含抗-IL-23抗體的VH（具有SEQIDNO.267的序列的VH）和/或抗-IL-23抗體的VL（具有SEQIDNO.269的序列的VL）。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該二價(jià)雙特異性構(gòu)建體，其包含抗-IL-23抗體或其衍生物，其是包含含有至少1個(gè)、至少2個(gè)或3個(gè)具有SEQIDNO.90-92的氨基酸序列的CDR區(qū)的重鏈及含有至少1個(gè)、至少2個(gè)或3個(gè)具有SEQIDNO.93-95的氨基酸序列的CDR區(qū)的輕鏈的scFv。在實(shí)施方案中，該scFv可以包含SEQIDNO.267的氨基酸序列及含有SEQIDNO.269的氨基酸序列的輕鏈。本發(fā)明還提供抗-IL-23抗體或其衍生物，或者二價(jià)雙特異性構(gòu)建體，其包含以上條款的基于抗體49B7、16C6、34E11和35H4的抗-IL-23抗體或其衍生物，其中分別用對(duì)SEQIDNo100-105、110-115、120-25和130-135的稱謂來(lái)取代對(duì)SEQIDNO90-95的稱謂。本發(fā)明還涵蓋具有抗-IL-23抗體或其衍生物的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體，其包含至少一個(gè)CDR區(qū)，該CDR區(qū)的氨基酸序列與選自SEQIDNO.90-95的氨基酸序列具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性。類似地，本發(fā)明還涵蓋包含抗-IL-23抗體或其衍生物的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體，其包含至少一個(gè)CDR區(qū)，該CDR區(qū)的氨基酸序列包含對(duì)選自SEQIDNO.90-95的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、缺失或取代。在實(shí)施方案中，該CDR區(qū)包含對(duì)選自SEQIDNO.90-95的氨基酸序列的至少一個(gè)保守氨基酸取代。本發(fā)明還提供包含抗-IL-23抗體或其衍生物的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體，其包含至少一個(gè)與具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO.90-95的氨基酸序列的CDR的抗-IL-6抗體結(jié)合相同的表位的CDR區(qū)。在實(shí)施方案中，該抗-IL-23抗體或其衍生物選自或衍生自31A12、34E11、35H4、49B7和16C6。這類抗體可能與IL-23的p19亞基結(jié)合。在另一實(shí)施方案中，該抗-IL-23抗體或其衍生物還可以結(jié)合IL-12。不受限于理論，這類抗體可能與IL-23和IL-12共有的p40亞基結(jié)合。這類抗體在本文中稱為抗-IL-23/IL-12抗體。不排除抗體與p40結(jié)合，抑制IL-23，也抑制IL-12——這類抗體包含在“抗-IL-23抗體”的范圍內(nèi)。在實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抗-IL-23/IL-12抗體或其衍生物，其可以包含來(lái)自45G5或22H8的CDR區(qū)的特定基序。因此，本發(fā)明提供抗-IL-23/IL-12抗體或其衍生物，其抑制IL-12和IL-23二者，其包含：含有氨基酸序列WX1KG的CDR2區(qū)，其中X1是丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，優(yōu)選是丙氨酸或纈氨酸（SEQIDNO.358）；和/或含有氨基酸序列YAYX1GDAFDP的CDR3區(qū)，其中X1是丙氨酸或異亮氨酸；（SEQIDNO.339）和/或含有氨基酸序列SDYFNX1的CDR3區(qū)，其中X1是異亮氨酸或纈氨酸；（SEQIDNO.340）和/或含有氨基酸序列QX1SQX2的CDR4區(qū)，其中：X1是丙氨酸或絲氨酸，且X2選自甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸；優(yōu)選地，X2是絲氨酸或蘇氨酸；和/或（SEQIDNO.359）含有氨基酸序列ASX1LA的CDR5區(qū)，其中X1是賴氨酸或蘇氨酸。（SEQIDNO.341）和/或含有氨基酸序列QSYYDX1NAGYG的CDR6區(qū)，其中X1是丙氨酸或纈氨酸。（SEQIDNO.342）在實(shí)施方案中，該抗-IL-23/IL-12抗體或其衍生物可以包含氨基酸序列選自SEQIDNO140-145的至少1個(gè)、至少2個(gè)、至少3個(gè)、至少4個(gè)、至少5個(gè)或6個(gè)CDR區(qū)。該CDR區(qū)可以選自可變區(qū)的重鏈（VH）的CDR（即SEQIDNO.140-142）和/或選自可變區(qū)的輕鏈（VL）的CDR（即SEQIDNO.143-145）。在具體實(shí)施方案中，該抗-IL-23/IL-12抗體或其衍生物可以包含SEQIDNO.140-145的全部氨基酸序列。該抗-IL-23/IL-12抗體或其衍生物可以包含抗-IL-23/IL-12抗體或其衍生物的整個(gè)VH和/或VL。在具體實(shí)施方案中，該抗-IL-23/IL-12抗體或其衍生物可以包含抗-IL-23/IL-12抗體的VH（具有SEQIDNO.271的VH）和/或抗-IL-23/IL-12抗體的VL（具有SEQIDNO.273的VL）。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該二價(jià)雙特異性構(gòu)建體，其包含抗-IL-23/IL-12抗體或其衍生物，其是包含至少1個(gè)、至少2個(gè)或3個(gè)具有SEQIDNO.140-142的氨基酸序列的CDR區(qū)及含有至少1個(gè)、至少2個(gè)或3個(gè)具有SEQIDNO.143-145的氨基酸序列的CDR區(qū)的輕鏈的scFv。在實(shí)施方案中，該scFv可以包含含有SEQIDNO.271的氨基酸序列的重鏈及含有SEQIDNO.273的氨基酸序列的輕鏈。本發(fā)明還提供抗-IL-23/IL-12抗體或其衍生物，或者二價(jià)雙特異性構(gòu)建體，其包含以上條款的基于抗體45G5、1H1、4F3、5C5和14B5的抗-IL-23/IL-12抗體或其衍生物，其中分別用對(duì)SEQIDNO150-155、160-165、170-175、180-185和190-195的稱謂來(lái)取代對(duì)SEQIDNO140-145的稱謂。對(duì)于基于45G5的抗-IL-23/IL-12抗體和衍生物，可以用對(duì)SEQIDNO.275和277的稱謂來(lái)取代對(duì)SEQIDNO.271和273的稱謂。本發(fā)明還涵蓋包含抗-IL-23/IL-12抗體或其衍生物的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體，其包含至少一個(gè)CDR區(qū)，該CDR區(qū)的氨基酸序列與選自SEQIDNO.140-145的氨基酸序列具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性。類似地，本發(fā)明還涵蓋包含抗-IL-23/IL-12抗體或其衍生物的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體，其包含至少一個(gè)CDR區(qū)，該CDR區(qū)的氨基酸序列包含對(duì)選自SEQIDNO.140-145的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、缺失或取代。在實(shí)施方案中，該CDR區(qū)包含對(duì)選自SEQIDNO.140-145的氨基酸序列的至少一個(gè)保守氨基酸取代。本發(fā)明還提供具有抗-IL-23/IL-12抗體或其衍生物的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體，其包含至少一個(gè)與具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO.140-145的氨基酸序列的CDR的抗-IL-23/IL-12抗體結(jié)合相同的表位的CDR區(qū)。在實(shí)施方案中，該表位存在于IL-12和IL-23二者共有的p40亞基上。在實(shí)施方案中，該抗-IL-23/IL-12抗體或其衍生物選自或衍生自22H8、45G5、14B5、4F3、5C5和1H1。應(yīng)理解，上述可以形成二價(jià)雙特異性構(gòu)建體的部分的抗-IL-6抗體及其衍生物可以獨(dú)立地與上述抗-IL-23抗體或其衍生物（包括抗-IL-23/IL-12抗體及其衍生物）組合在單個(gè)二價(jià)雙特異性構(gòu)建體中。在這類構(gòu)建體中，抗-IL-6抗體或其衍生物，和抗-IL-23抗體或其衍生物二者都可以摻入非天然氨基酸，通過(guò)該非天然氨基酸將抗-IL-6抗體或其衍生物與抗-IL-23抗體或其衍生物偶聯(lián)。本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體可以進(jìn)一步在各抗體或其衍生物中的非天然氨基酸之間包含接頭。本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體可以進(jìn)一步包含聚乙二醇分子（PEG）。該P(yáng)EG分子可以可選地作為抗-IL-6抗體或其衍生物，和抗-IL-23抗體或其衍生物（包括抗-IL-23/IL-12抗體或其衍生物）之間的接頭。適宜地，還可以使用其他水溶性聚合物，如聚乙烯醇、多糖、聚環(huán)氧烷、羥乙基淀粉和多元醇。本文所述抗-IL-6和抗-IL-23抗體或其衍生物（包括抗-IL-23/IL-12抗體或其衍生物）本身有用。在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供在制備本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體中和/或在組合治療中具有特定用途的抗-IL-6和抗-IL-23（抗體）或其衍生物（包括抗-IL-23/IL-12抗體或其衍生物）?？梢钥蛇x地修飾該抗-IL-6和抗-IL-23抗體或其衍生物（包括抗-IL-23/IL-12抗體或其衍生物）來(lái)增加半衰期（例如通過(guò)PEG化）?？?IL-6抗體或其衍生物，和抗-IL-23抗體或其衍生物可以摻入非天然氨基酸來(lái)便于連接PEG基團(tuán)。本發(fā)明的一方面提供包含抗-IL-6抗體或其衍生物，和抗-IL-23抗體或其衍生物（其可以例如通過(guò)抗-IL-23/IL-12抗體或其衍生物）的組合（用于分開、順次或分開施用）。本發(fā)明還涵蓋包含抗-IL-6和抗-IL-23抗體衍生物（包括抗-IL-23/IL-12抗體衍生物）的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體，其中該抗體衍生物選自Fab、Fab’、F(ab)’、單鏈抗體（scFv）、kappabody、微抗體（Minibody）和Janusin。因此，本發(fā)明提供以下抗體或其衍生物：抗-IL-6抗體或其衍生物，其包含含有SEQIDNO.259的氨基序列的重鏈及含有SEQIDNO.261的氨基序列的輕鏈。抗-IL-23抗體或其衍生物，其包含含有SEQIDNO.267的氨基序列的重鏈及含有SEQIDNO.269的氨基序列的輕鏈?？?IL-23/IL-12抗體或其衍生物，其包含含有SEQIDNO.271的氨基序列的重鏈及含有SEQIDNO.273的氨基序列的輕鏈。在本發(fā)明的另一方面，提供編碼本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體的部分的多核苷酸。這類多核苷酸可以編碼本文公開的抗體或其衍生物。本發(fā)明還提供包含這類多核苷酸的載體、包含這類載體的宿主細(xì)胞（可選地，該宿主細(xì)胞為營(yíng)養(yǎng)缺陷型）、用于克隆和表達(dá)本文公開的抗體或其衍生物的寡核苷酸引物。本發(fā)明的具體寡核苷酸引物包括含有200-258的任一個(gè)中所示核苷酸序列之一的寡核苷酸引物。在本發(fā)明的另一方面，提供用于產(chǎn)生二價(jià)雙特異性構(gòu)建體的方法。該方法包括：（a）提供通過(guò)摻入至少一個(gè)非天然氨基酸修飾的抗-IL-6抗體或其衍生物；（b）提供通過(guò)摻入至少一個(gè)非天然氨基酸修飾的抗-IL-23抗體或其衍生物；（c）使該修飾的抗-IL-6抗體或其修飾的衍生物與修飾的抗-IL-23抗體或其修飾的衍生物反應(yīng)，使得二者通過(guò)各部分的非天然氨基酸之間的連接偶聯(lián)。該方法可以包括通過(guò)含有接頭部分的連接來(lái)偶聯(lián)該修飾的抗-IL-6抗體或其修飾的衍生物，和該修飾的抗-IL-23抗體或其修飾的衍生物，其中該接頭部分的一端與該修飾的抗-IL-6抗體或其修飾的衍生物的非天然氨基酸偶聯(lián)，該接頭部分的另一端與修飾的抗-IL-23抗體或其修飾的衍生物的非天然氨基酸偶聯(lián)。適宜的接頭的實(shí)例為本領(lǐng)域已知，且包括短肽序列。本發(fā)明還提供PEG作為接頭的用途。因此，在實(shí)施方案中，該接頭部分可以是PEG分子。該方法可以包括使用含有選自以下的基團(tuán)的非天然氨基酸：與其他部分連接之前的氮化物、氰基、氧化腈、炔、烯、應(yīng)變環(huán)辛炔、應(yīng)變環(huán)烯、環(huán)丙烯、降冰片烯或芳基、烷基或乙烯基鹵化物、酮、醛、酮縮醇、縮醛肼、酰肼、烷氧基胺、硼酸、有機(jī)錫、有機(jī)硅、β-甲硅烷基鏈烯基鹵化物、β-甲硅烷鏈烯基磺酸酯、吡喃酮、四嗪、噠嗪、芳基磺酸酯、氨基硫脲、氨基脲、四唑、α-酮酸基團(tuán)。具體而言，該非天然氨基酸可以是疊氮基高丙氨酸、高炔丙基甘氨酸、高烯丙基甘氨酸、對(duì)-溴苯丙氨酸、對(duì)-碘苯丙氨酸、疊氮基苯丙氨酸、乙?；奖彼峄蛞胰不奖彼?、含有內(nèi)部烯（如反式-巴豆烯）的氨基酸、絲氨酸烯丙醚、烯丙基甘氨酸、炔丙基甘氨酸、乙烯基甘氨酸、吡咯賴氨酸、N-σ-鄰-疊氮基芐氧基羰基-L-賴氨酸（AzZLys）、N-σ-炔丙氧基羰基-L-賴氨酸、N-σ-2-疊氮基乙氧基羰基-L-賴氨酸、N-σ-叔-丁氧基羰基-L-賴氨酸（BocLys）、N-σ-烯丙氧基羰基-L-賴氨酸（AlocLys）、N-σ-乙?；?L-賴氨酸（AcLys）、N-σ-芐氧基羰基-L-賴氨酸（ZLys）、N-σ-環(huán)戊氧基羰基-L-賴氨酸（CycLys）、N-σ-D-脯氨酰基-L-賴氨酸、N-σ-煙酰-L-賴氨酸（NicLys）、N-σ-N-Me-氨茴酰-L-賴氨酸（NmaLys）、N-σ-生物素酰-L-賴氨酸、N-σ-9-芴基甲氧基羰基-L-賴氨酸、N-σ-甲基-L-賴氨酸、N-σ-二甲基-L-賴氨酸、N-σ-三甲基-L-賴氨酸、N-σ-異丙基-L-賴氨酸、N-σ-丹酰-L-賴氨酸、N-σ-鄰,對(duì)-二硝基苯基-L-賴氨酸、N-σ-對(duì)-甲苯磺酰-L-賴氨酸、N-σ-DL-2-氨基-2-羧乙基-L-賴氨酸、N-σ-苯基丙酮酰胺-L-賴氨酸、N-σ-丙酮酰胺-L-賴氨酸；尤其是選自以下的基團(tuán)：與其他部分連接之前的氮化物、炔、烯、或芳基、烷基或乙烯基鹵化物、酮、醛、肼、酰肼、烷氧基胺、硼酸、有機(jī)錫、有機(jī)硅基團(tuán)。具體而言，該非天然氨基酸可以是疊氮基高丙氨酸、高炔丙基甘氨酸、高烯丙基甘氨酸、對(duì)-溴苯丙氨酸、對(duì)-碘苯丙氨酸、疊氮基苯丙氨酸、乙?；奖彼峄蛞胰不奖彼?、含有內(nèi)部烯（如反式-巴豆烯）的氨基酸、絲氨酸烯丙醚、烯丙基甘氨酸、炔丙基甘氨酸、乙烯基甘氨酸。該方法可以包括用通常稱為Click反應(yīng)的[3+2]環(huán)加成/[3+2]偶極環(huán)加成劑或氮化物-炔環(huán)加成反應(yīng)（其可以通過(guò)銅(I)、釕、其他金屬來(lái)催化，或通過(guò)應(yīng)變和/或吸電子基團(tuán)來(lái)促進(jìn)）、Heck反應(yīng)、Sonogashira反應(yīng)、Suzuki反應(yīng)、Stille偶聯(lián)、Hiyama/Denmark反應(yīng)、烯烴復(fù)分解反應(yīng)、Diels-alder反應(yīng)、羰基與肼、酰肼、烷氧基胺或羥基胺縮合來(lái)偶聯(lián)該修飾的抗-IL-6抗體或其修飾的衍生物，和該修飾的抗-IL-23抗體或其修飾的衍生物。也可能是Staudinger連接。該方法還可以包括：（a）提供宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包含具有編碼抗-IL-6抗體或其衍生物的多核苷酸的載體，該抗-IL-6抗體或其衍生物通過(guò)摻入至少一個(gè)非天然氨基酸來(lái)修飾；（b）提供宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包含具有編碼抗-IL-23抗體或其衍生物的多核苷酸的載體，該抗-IL-23抗體或其衍生物通過(guò)摻入至少一個(gè)非天然氨基酸來(lái)修飾；（c）在使得宿主細(xì)胞表達(dá)該修飾的抗-IL-6抗體或其衍生物或該修飾的抗-IL-23抗體或其衍生物的條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞；（d）分離該抗-IL-6抗體或其衍生物，和該抗-IL-23抗體或其衍生物；（e）使該修飾的抗-IL-6抗體或其衍生物與該修飾的抗-IL-23抗體或其衍生物反應(yīng)，使得該修飾的抗-IL-6抗體或其衍生物通過(guò)各修飾的抗體或其衍生物的非天然氨基酸之間的連接與該修飾的抗-IL-23抗體或其衍生物偶聯(lián)。如下文更詳細(xì)地討論，該方法還可以包括通過(guò)以下來(lái)?yè)饺敕翘烊话被幔ɡ鏏ha）：在具體的所選擇的氨基酸編碼的位置（通常是甲硫氨酸編碼的位置）處摻入它，并根據(jù)需要在不希望摻入非天然氨基酸的位置處突變靶蛋白質(zhì)的多核苷酸序列來(lái)消除甲硫氨酸（或其他具體的所選擇的氨基酸）密碼子，和/或根據(jù)需要在希望摻入非天然氨基酸的位置處突變靶蛋白質(zhì)的多核苷酸序列來(lái)提供一個(gè)或多個(gè)（通常為一個(gè)）新的甲硫氨酸（或其他具體的所選擇的氨基酸）密碼子。在本發(fā)明的另一方面，選擇適合包含在本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體中的親本抗體的方法包括以下步驟：（i）選擇對(duì)IL-6或IL-23特異的B細(xì)胞；（ii）整分出該B細(xì)胞的分開的樣品（例如，放入96細(xì)胞孔板的孔中）；（iii）培養(yǎng)該B細(xì)胞；（iv）分別從各整分樣品收集含有抗體的上清；（v）針對(duì)IL-6或IL-23結(jié)合測(cè)定來(lái)自各整分樣品的上清（例如使用ELISA）；（vi）針對(duì)IL-6或IL-23活性的抑制測(cè)定來(lái)自各整分樣品的上清；（vii）選擇來(lái)自顯示高水平的IL-6或IL-23活性抑制和/或強(qiáng)烈的IL-6或IL-23結(jié)合的孔的抗體；并（viii）可選地針對(duì)IL-12活性的抑制測(cè)定來(lái)自IL-23整分樣品的上清；并（ix）選擇還顯示高水平的IL-12活性和/或強(qiáng)烈的IL-12結(jié)合的IL-23抗體作為親本抗體。在本發(fā)明的另一方面，提供上述二價(jià)雙特異性構(gòu)建體用于治療。通常，上述二價(jià)雙特異性構(gòu)建體用于通過(guò)結(jié)合涉及TH17細(xì)胞分化的一種或多種分子或結(jié)合由激活的TH17細(xì)胞產(chǎn)生的一種或多種分子來(lái)治療TH17、TH22和/或TH17和TH1介導(dǎo)的疾病。在具體實(shí)施方案中，這類疾病包括多發(fā)性硬化、銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、尋常性天皰瘡、器官移植排斥、克隆病、炎性腸?。↖BD）、腸易激綜合癥（IBS）、紅斑狼瘡和糖尿病。本發(fā)明還提供包含抗-IL-6抗體和抗-IL-23抗體的組合療法用于治療TH17、TH22和/或TH17和TH1介導(dǎo)的疾病。具體而言，提供這類組合用于治療炎性和自身免疫性障礙。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示B細(xì)胞選擇。針對(duì)IL-6中和（通過(guò)B9細(xì)胞系增殖測(cè)定）和IL-6結(jié)合（通過(guò)ELISA）二者測(cè)定了來(lái)自B細(xì)胞的一塊96孔板的每個(gè)孔。排列來(lái)自各測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較。圖2顯示從V區(qū)拯救至(rescueto)scFv產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)方法概要。圖3A和B顯示所選擇的抗-IL-6兔/人嵌合抗體的人和靈長(zhǎng)類IL-6中和活性：在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)兔/人嵌合mAb。通過(guò)ELISA定量上清中的mAb。用B9細(xì)胞增殖測(cè)定測(cè)試它們對(duì)所示50pg/ml人IL-6或100pg/ml靈長(zhǎng)類IL-6的中和。圖3C和D顯示所選擇的抗-IL-6兔/人嵌合抗體的人和靈長(zhǎng)類IL-6中和活性：在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)兔/人嵌合mAb。通過(guò)ELISA定量上清中的mAb。用B9細(xì)胞增殖測(cè)定測(cè)試它們對(duì)所示50pg/ml人IL-6或100pg/ml靈長(zhǎng)類IL-6的中和。圖3E顯示所選擇的抗-IL6兔/人嵌合抗體的人IL-6中和活性：在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)兔/人嵌合mAb。通過(guò)ELISA定量上清中的mAb。用B9細(xì)胞增殖測(cè)定測(cè)試它們對(duì)所示50pg/ml人IL-6或100pg/ml靈長(zhǎng)類IL-6的中和。圖4顯示B細(xì)胞選擇。針對(duì)IL-23中和及IL-6結(jié)合測(cè)定了來(lái)自一塊B細(xì)胞96孔板的每個(gè)孔。排列各孔的兩項(xiàng)測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較。圖5A-5I顯示所選擇的抗IL-23兔/人嵌合抗體的人IL-23中和活性。衍生候選mAb，并測(cè)試異二聚體重組IL-23（eBioIL23）的中和。圖6A和6B顯示靈長(zhǎng)類和人IL-23的中和活性。用小鼠脾細(xì)胞測(cè)定針對(duì)異二聚體人IL-23（圖B）或靈長(zhǎng)類IL-23（圖A）的中和，比較了幾種mAb的轉(zhuǎn)染上清。測(cè)量轉(zhuǎn)染上清中的Ig水平來(lái)允許比較比活性。圖7A顯示IL-12和IL-23的結(jié)構(gòu)。圖7B顯示IL-12和IL-23受體及其結(jié)合機(jī)制。圖8A顯示用NK92細(xì)胞系測(cè)定針對(duì)人IL-12的中和，比較了幾種mAb的轉(zhuǎn)染上清。圖8B顯示所選擇的mAb對(duì)人IL-23的中和。在HEK293瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中表達(dá)了在來(lái)自B細(xì)胞克隆的初級(jí)拯救轉(zhuǎn)染（primaryrescuetransfection）中為陽(yáng)性的mAb，其中定量IgG濃度來(lái)計(jì)算EC50值。針對(duì)1200pg/ml的IL-23（eBiosciences）的中和測(cè)試了mAb。圖8C顯示所選擇的mAb對(duì)人IL-23的中和。在HEK293瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中表達(dá)了在來(lái)自B細(xì)胞克隆的初級(jí)拯救轉(zhuǎn)染中為陽(yáng)性的mAb，其中定量IgG濃度來(lái)計(jì)算EC50值。針對(duì)1200pg/ml的IL-23（eBiosciences）的中和測(cè)試了mAb。圖8D顯示所選擇的mAb對(duì)人IL-23的中和。在HEK293瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中表達(dá)了在來(lái)自B細(xì)胞克隆的初級(jí)拯救轉(zhuǎn)染中為陽(yáng)性的mAb，其中定量IgG濃度來(lái)計(jì)算EC50值。針對(duì)1200pg/ml的IL-23（eBiosciences）的中和測(cè)試了mAb。圖8E顯示所選擇的mAb對(duì)人IL-23的中和。在HEK293瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中表達(dá)了在來(lái)自B細(xì)胞克隆的初級(jí)拯救轉(zhuǎn)染中為陽(yáng)性的mAb，其中定量IgG濃度來(lái)計(jì)算EC50值。針對(duì)1200pg/ml的IL-23（eBiosciences）的中和測(cè)試了mAb。圖8F-8G顯示所選擇的mAb對(duì)人IL-12的中和。在HEK293瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中表達(dá)了在來(lái)自B細(xì)胞克隆的初級(jí)拯救轉(zhuǎn)染中為陽(yáng)性的mAb，其中定量IgG濃度來(lái)計(jì)算EC50值。針對(duì)1000pg/ml人IL-12的中和測(cè)試了mAb。圖8H和8I顯示所選擇的mAb對(duì)靈長(zhǎng)類IL-23的中和。在HEK293瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中表達(dá)了在來(lái)自B細(xì)胞克隆的初級(jí)拯救轉(zhuǎn)染中為陽(yáng)性的mAb，其中定量IgG濃度來(lái)計(jì)算EC50值。針對(duì)1000pg/ml靈長(zhǎng)類IL-23的中和測(cè)試了mAb。圖9A顯示在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)兔scFv。通過(guò)SDSPAGE定量上清中的scFv。用B9細(xì)胞增殖測(cè)定針對(duì)所示200pg/ml人IL-6的中和測(cè)試它們。圖9B顯示9C8人源化。通過(guò)將VH和VL的構(gòu)架區(qū)變?yōu)槿藰?gòu)架序列（有限地回復(fù)突變?yōu)橥脴?gòu)架序列）來(lái)人源化9C8（高親和力和高效價(jià)的嵌合mAb）。為人源化9C8比較了不同的人構(gòu)架序列。通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞來(lái)表達(dá)人源化mAb。用B9細(xì)胞增殖測(cè)定，針對(duì)中和50pg/ml人IL-6的能力測(cè)試了轉(zhuǎn)染上清。圖9C顯示人源化的抗-IL-6mAb。通過(guò)將VH和VL的構(gòu)架區(qū)變?yōu)槿藰?gòu)架序列（有限地回復(fù)突變?yōu)橥脴?gòu)架序列）來(lái)人源化9C8和18D4（高親和力和高效價(jià)的嵌合mAb）。通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞來(lái)表達(dá)人源化mAb。定量轉(zhuǎn)染上清中的IgG，并用B9細(xì)胞增殖測(cè)定，針對(duì)中和50pg/ml人IL-6的能力測(cè)試了轉(zhuǎn)染上清。圖9D顯示人源化的抗-IL-6mAb和scFv。通過(guò)將VH和VL的構(gòu)架區(qū)變?yōu)槿藰?gòu)架序列（有限地回復(fù)突變?yōu)橥脴?gòu)架序列）來(lái)人源化9C8（高親和力和高效價(jià)的嵌合mAb）。比較2種不同的VHCDR1序列，從兔scFv產(chǎn)生了2種人源化9C8scFv。兔scFv不進(jìn)行人源化而直接表達(dá)，并通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞來(lái)表達(dá)人源化mAb和scFv。用B9細(xì)胞增殖測(cè)定，針對(duì)中和50pg/ml人IL-6的能力測(cè)試了轉(zhuǎn)染上清。圖10顯示用于將CDR移植至scFv形式的人V區(qū)構(gòu)架上的PCR策略。VL，輕鏈V區(qū)；L，前導(dǎo)序列（信號(hào)肽）；FR，構(gòu)架區(qū)；CDR，互補(bǔ)決定區(qū)；箭頭指示各個(gè)引物及其在PCR擴(kuò)增中的方向性；通過(guò)鏈和CDR編號(hào)來(lái)標(biāo)示CDR特異性引物，H是VH，L是VL；還通過(guò)F（正向）和R（反向）來(lái)標(biāo)示引物方向性；VL-FR4和VH-FR1之間的曲線代表加入用于scFv構(gòu)建的20aa(G4S)4接頭。圖11A和11B顯示通過(guò)人源化scFv13A8來(lái)中和IL-6。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)人源化13A8抗-IL-6scFv。通過(guò)Ni親和力從上清純化scFv。用B9細(xì)胞增殖測(cè)定進(jìn)行中和人IL-6（B）或靈長(zhǎng)類IL-6（A）的測(cè)試。圖11C顯示通過(guò)抗IL-6人源化scFv來(lái)中和IL-6：在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)人源化9C8scFvv3-1（來(lái)自多步法）和28D2scFv，通過(guò)Ni層析純化，并比較IL-6誘導(dǎo)的B9細(xì)胞增殖的抑制。圖12顯示抗IL-2331A12scFv中和IL-23。將31A12mAb轉(zhuǎn)化為人源化scFv，并連同親本mAb在哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染中表達(dá)。用IL-17誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞測(cè)定針對(duì)600pg/mleBiosciences人IL-23的中和測(cè)試二者。圖13顯示人源化抗IL-2345G5scFv中和人IL-23：將人源化45G5scFv與嵌合mAb31A12和22H8相比較。所有mAb均在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，純化，并用IL-17誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞測(cè)定針對(duì)1.2ng/mleBiosciences人IL-23的抑制進(jìn)行測(cè)試。圖14A-14D顯示改造來(lái)去除2個(gè)Met殘基的人源化13A8scFv哺乳動(dòng)物表達(dá)構(gòu)建體的測(cè)試。在HEK細(xì)胞中表達(dá)多種雙突變構(gòu)建體和親本scFv（MM），并用體外B9生物測(cè)定針對(duì)50pg/ml人IL-6的抑制進(jìn)行測(cè)試。圖14E顯示在HEK293細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的取代兩個(gè)Met（僅顯示H34L形式）的人源化31A12scFv和包含親本Met的scFv的測(cè)試。在小鼠脾細(xì)胞測(cè)定中針對(duì)600pg/ml的eBiosciencesIL-23的生物學(xué)活性的抑制測(cè)試上清。圖14F和14G顯示用L或V取代H82Met（二者都與H34L組合）的人源化45G5scFv的測(cè)試，其與親本45G5嵌合mAb和無(wú)Met的31A12scFv（31A12-LL）比較。全都在HEK293細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。純化scFv和mAb，并在小鼠脾細(xì)胞測(cè)定中針對(duì)1200pg/ml的eBiosciencesIL-23的生物學(xué)活性的抑制進(jìn)行測(cè)試。圖14H顯示人源化抗IL-23scFv中和人IL-23。將野生型抗IL-23scFv22H8和45G5與所示用V或L取代H34的Met的22H8scFv比較。圖15顯示在N或C端或在Gly/Ser接頭中具有Aha的大腸桿菌28D2scFv對(duì)IL-6的中和：在大腸桿菌發(fā)酵中表達(dá)在N或C端或在Gly/Ser接頭中具有單個(gè)Met密碼子的28D2構(gòu)建體，用Aha取代Met。針對(duì)50pg/ml人IL-6的中和測(cè)試這些純化的scFv。圖16A顯示13A8c與20K線性PEG二炔的PEG化13A8cAha與20KPEG二炔的PEG化反應(yīng)物的SDSPAGE（還原，4-20%Tris-甘氨酸）。泳道1：13A8c單獨(dú)；泳道2：（-）對(duì)照——無(wú)銅；泳道3:200mL小規(guī)模反應(yīng)混合物；泳道4：600mL反應(yīng)物——離心——樣品上清。掃描激光光密度測(cè)定法顯示PEG化13A8cAHA的產(chǎn)率為70%（泳道4）。圖16B顯示31A12cAha與20K線性PEG二炔的PEG化。31A12cAha與20KPEG二炔的PEG化反應(yīng)物的SDSPAGE（還原，4-20%Tris-甘氨酸）。泳道1：分子量標(biāo)記；泳道3：（-）——無(wú)銅；泳道4：小規(guī)模反應(yīng)物；泳道5：400mL反應(yīng)物——離心——樣品上清。掃描激光光密度測(cè)定顯示PEG化31A12cAha的產(chǎn)率為59%（泳道5）。圖16C顯示13A8cAha與40K線性PEG二炔的PEG化。13A8c-40KPEG制備物的SDS-PAGE（還原，4-20%Tris-甘氨酸）。掃描激光光密度測(cè)定顯示51%的產(chǎn)率。圖16D顯示13A8LAha與20K線性PEG二炔的PEG化。SDS-PAGE（還原，4-20%Tris-甘氨酸）。掃描激光光密度測(cè)定顯示60%的產(chǎn)率。圖16E顯示45G5cAha與20K線性PEG二炔的PEG化。SDSPAGE（還原，4-20%Tris-甘氨酸）。泳道1：（-）對(duì)照——無(wú)銅；泳道2：小規(guī)模反應(yīng)物；泳道3：小規(guī)模反應(yīng)物，無(wú)三唑配體；泳道4：160mL反應(yīng)物——離心——樣品上清；泳道6：分子量標(biāo)記。掃描激光光密度測(cè)定顯示PEG化45G5c.-.的產(chǎn)率為59%。圖17A顯示28D2c-PEG中和IL-6。針對(duì)IL-6中和測(cè)定了在不同條件下重折疊的28D2c-30KPEG的2個(gè)樣品。圖17B和C顯示PEG-scFv穩(wěn)定性：31A12-PEG具有69℃的Tm。13A8-PEG具有66℃的Tm。這反映為這些分子在所示溶液中的穩(wěn)定性。在PBS（或所示Tween）中孵育各scFv-PEG，并測(cè)定相對(duì)于親本scFv（來(lái)自哺乳動(dòng)物表達(dá)）的效價(jià)。顯示了保存溫度（保存13或20天）；3XFT顯示冷凍和融化的三個(gè)循環(huán)。圖18A顯示13A8c-PEG-31A12c雙特異性劑的制備物：SDS-PAGE（還原，4-20%Tris-甘氨酸）。泳道1：分子量標(biāo)記；泳道2：13A8-PEG單獨(dú)；泳道3：（-）對(duì)照——無(wú)銅；泳道4：1000mL反應(yīng)物。圖18B顯示13A8n-PEG-45G5c雙特異性劑的制備物：SDS-PAGE（還原，4-20%Tris-甘氨酸）。泳道1：大規(guī)模反應(yīng)物1；泳道3：大規(guī)模反應(yīng)物2。圖18C顯示13A8c-PEG-22H8c雙特異性劑的制備物：SDS-PAGE（還原，4-20%Tris-甘氨酸）。泳道1：分子量標(biāo)記；泳道2：13A8c-PEG單獨(dú)；泳道3：（-）對(duì)照——無(wú)銅；泳道4：1150mL反應(yīng)物。圖18D顯示13A8c-40KPEG-31A12cAHA的制備物。SDS-PAGE（還原，4-20%Tris-甘氨酸）。泳道1：MW標(biāo)記；泳道2：13A8c-40KPEG；泳道3：反應(yīng)混合物的直接樣品；泳道4：最終加工混合物的樣品6uL上樣；泳道5：最終加工混合物的樣品12uL上樣；泳道6：無(wú)銅的反應(yīng)；泳道7：31A12cAHA單獨(dú)。產(chǎn)率（2個(gè)上樣的平均值）=56%，產(chǎn)物與單價(jià)的比為4.5:1。圖18E顯示13A8L-PEG-31A12c雙特異性劑的制備物。SDS-PAGE（還原，4-20%Tris-甘氨酸）。泳道1：31A12-20KPEG+13A8LAha形成雙特異性劑的反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)反應(yīng)產(chǎn)率為37%。圖19A顯示31A12c-PEG-13A8c中和IL-6和IL-23的功能活性。將雙特異性劑對(duì)IL6和IL23的生物活性與scFv單獨(dú)相比較。A：雙特異性劑的13A8scFv部分的抗IL-6活性。19B：還測(cè)量了該雙特異性劑的31A12cscFv部分的抗IL-23活性。從該滴定計(jì)算EC50。圖20A顯示皮下施用的28D2cscFv的大鼠PK。用1mg/kg的抗IL-6scFv28D2c皮下處理大鼠。在所示時(shí)間點(diǎn)采血，用抗IL-6中和測(cè)定測(cè)量大鼠血漿中28D2的存在。圖20B顯示皮下施用的31A12c-PEG-13A8c雙特異性劑的大鼠PK：用1mg/kg的31A12c-PEG-13A8c雙特異性劑皮下處理大鼠。在所示時(shí)間點(diǎn)采血，用抗IL-6中和測(cè)定測(cè)量大鼠血漿中雙特異性劑的存在。在此包含來(lái)自圖20B的28D2scFv的PK數(shù)據(jù)用于比較。圖21顯示13A8n-PEG-31A12c雙特異性劑的生物活性。在B9生物測(cè)定中測(cè)量雙特異性劑對(duì)50pg/ml的IL-6的中和。包含哺乳動(dòng)物13A8scFv蛋白質(zhì)用于比較。圖22顯示13A8n-PEG-45G5對(duì)IL-6和IL-23的功能活性。顯示雙特異性劑對(duì)IL6和IL23的生物活性。用B9細(xì)胞系生物測(cè)定（對(duì)于IL-6）和小鼠脾細(xì)胞測(cè)定（對(duì)于IL-23）測(cè)量13A8n-PEG-45G5雙特異性劑對(duì)50pg/ml人IL-6（22A）和1200pg/ml（22B）人eBiosciencesIL-23的中和。從曲線計(jì)算EC50值。圖23顯示13A8c-PEG-22H8c對(duì)IL-6和IL-23的活性。顯示13A8c-PEG-22H8c對(duì)IL-6和IL-23的生物活性。用B9細(xì)胞系生物測(cè)定（對(duì)于IL-6）和小鼠脾細(xì)胞測(cè)定（對(duì)于IL-23）測(cè)量13A8c-PEG-22H8雙特異性劑對(duì)50pg/ml人IL-6（A）和1200pg/ml（B）人eBiosciencesIL-23的中和。從曲線計(jì)算EC50值。圖24顯示13A8c-40KPEG-31A12c對(duì)IL-6和IL-23的活性。顯示13A8c-40kPEG31A12c對(duì)IL-6和IL-23的生物活性。用B9細(xì)胞系生物測(cè)定（對(duì)于IL-6）和小鼠脾細(xì)胞測(cè)定（對(duì)于IL-23）測(cè)量雙特異性劑對(duì)50pg/ml人IL-6（A）和1200pg/ml（B）人eBiosciencesIL-23的中和。從曲線計(jì)算EC50值。圖25A顯示大鼠中皮下施用后13A8c-40KPEG-31A12c雙特異性劑、13A8c-20KPEG-31A12c雙特異性劑、13A8c-PEG和裸scFv（28D2）的血清水平（如在B9測(cè)定中測(cè)量）。圖25B顯示大鼠中皮下施用后13A8c-40KPEG-31A12c雙特異性劑、13A8c-20KPEG-31A12c雙特異性劑、13A8c-PEG和裸scFv（28D2）血清水平的藥物動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果。圖26A顯示TH17/22細(xì)胞的體外極化。在體內(nèi)和體外系統(tǒng)中都可以產(chǎn)生不同的人T細(xì)胞亞群（包括TH17和TH22細(xì)胞）。圖26B顯示體外人Th17發(fā)育：按所示用抗-CD3/28單獨(dú)或在LPS和TGFb的存在下體外刺激人PBMC7天。然后按所示用PMA+洛諾霉素再刺激它們，并進(jìn)行IL-17和RORC染色。圖26C顯示可以從培養(yǎng)的PBMC產(chǎn)生TH17和TH22。在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中觀察到TH17，而隨抗CD3刺激的PBMC觀察到TH17和TH22。用抗CD3/28+IL-1b+LPS或異源PBMC+肽聚糖刺激PBMC5天，然后用PMA+洛諾霉素再刺激，并進(jìn)行胞內(nèi)IL-17和IL-22染色。圖27顯示用所選擇的scFv抑制Th17和Th22體外發(fā)育。在所示scFv的存在下在抗CD3+抗CD28和LPS+IL-1+TGFb中培養(yǎng)人PBMC5天。5天后，用PMA+洛諾霉素再刺激細(xì)胞，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定產(chǎn)生CD4、IL-17和IL-22的細(xì)胞的%。圖28顯示混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。顯示單獨(dú)使用或組合使用的抗IL-6和IL-23scFv對(duì)TH17分化的抑制作用。在用異源PBMC刺激期間向PBMC培養(yǎng)物中加入所示抗IL-6scFv和抗IL-23scFv。5天后，洗滌細(xì)胞，用PMA+洛諾霉素再刺激，并進(jìn)行IL-17染色。圖29顯示雙特異性抗IL-6/IL-23抗體對(duì)TH17分化的有益抑制作用。單獨(dú)或組合測(cè)試抗IL-6和抗IL-23mAb（13A8和31A12），以及31A12c-20KPEG-13A8c雙特異性劑。在用異源PBMC刺激期間向PBMC培養(yǎng)物中加入mAb或雙特異性劑。顯示所加入的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的摩爾濃度。5天后，洗滌細(xì)胞，用PMA+洛諾霉素再刺激，并進(jìn)行IL-17染色。圖30顯示TH17/22細(xì)胞的體內(nèi)極化。在體內(nèi)和體外系統(tǒng)中都可以產(chǎn)生不同的人T細(xì)胞亞群（包括TH17和TH22細(xì)胞）。圖31A顯示用抗IL-6和IL-23的拮抗劑的組合處理人源化scid/hu小鼠。用人異源皮膚移植已成功移入人免疫細(xì)胞的NSG小鼠，并每2天接受100mg的13A8c-PEG抗IL-6和31A12c-PEG抗IL-23（scFv-PEG）。皮膚移植30天后，回收脾，用PMA/洛諾霉素刺激單細(xì)胞懸液，并測(cè)定胞內(nèi)細(xì)胞因子。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析CD3+/CD4+細(xì)胞的IL-17和IL-22產(chǎn)生。圖31B顯示來(lái)自抗IL-6和IL-23的拮抗劑的組合處理的人源化scid/hu小鼠的脾的CD3+/CD4+細(xì)胞中胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)。如前圖中所述，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析了來(lái)自處理和未處理的皮膚異源移植NSG小鼠的脾細(xì)胞CD3+/CD4+細(xì)胞的胞內(nèi)IL-17和IL-22。數(shù)據(jù)顯示抗IL-6和抗IL-23處理的動(dòng)物中IL-17和IL-22陽(yáng)性CD4+T細(xì)胞的所有群體的明顯減少。按照所示TH17或TH22細(xì)胞的亞群，將數(shù)據(jù)作為處理或未處理小鼠的平均值和SEM作圖。圖32顯示13A8cPEG-31A12c雙特異性劑對(duì)抑制Sci/hu異源移植模型中Th17和Th22分化的作用：用異源人皮膚移植已建立了人免疫系統(tǒng)的成年scid小鼠。所示EOD處理4周后，體外激活脾細(xì)胞，通過(guò)多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量各人CD4T細(xì)胞中的細(xì)胞因子。每個(gè)點(diǎn)表示單只處理的小鼠或?qū)φ招∈?，每只小鼠代?個(gè)時(shí)間點(diǎn)（對(duì)于所示每種細(xì)胞因子）。單特異性scFv抗-IL23是31A12cPEG；雙特異性scFv抗IL6IL23是13A8c-20KPEG-31A12c。未處理的小鼠接受安慰劑。如通過(guò)產(chǎn)生IL-17（圖32A，*p<0.05）和IL-22（圖32B，p<0.05）的CD4+人T細(xì)胞的抑制測(cè)量，13A8c-20KPEG-31A12c顯著減少了Th17細(xì)胞的分化。所有其他圖測(cè)量一般白細(xì)胞標(biāo)記，并顯示13A8c-20KPEG-31A12c并非廣泛地免疫抑制TH17/22細(xì)胞以外的白細(xì)胞。圖33顯示安慰劑處理的小鼠（A）的表皮切片的組織分析，與13A8c-20kPEG-31A12c抗IL-6/抗IL-23雙特異性劑處理的小鼠（B）比較，其中13A8c-20kPEG-31A12c抗IL-6/抗IL-23雙特異性劑顯著減少銀屑病的組織特征，尤其是表皮厚度。圖34顯示完成利用scid/hu異源移植模型的6個(gè)實(shí)驗(yàn)，在處理期間由不知情的病理學(xué)家評(píng)定臨床評(píng)分，并總結(jié)在圖34A中（臨床評(píng)分）。組織切片分析使得能夠高度定量地測(cè)量最有意義的銀屑病度量，尤其是表皮厚度，其是公正的測(cè)量，顯示在圖34B中（定量表皮厚度）。雙特異性scFv對(duì)降低銀屑病臨床評(píng)分和表皮厚度具有高度明顯和有效的作用。圖35A顯示耳增生小鼠模型的結(jié)果：小鼠在第0、1、2和3天按20μL的體積在右耳接受rhIL-23（1μg）的皮內(nèi)注射。PBS注入對(duì)側(cè)耳作為對(duì)照。在第4天測(cè)量耳厚度。第一圖顯示IL-23注射耳的耳厚度，與PBS注射耳相比較。第二圖顯示IL-23注射耳與各動(dòng)物的PBS注射耳相比的厚度增加。圖35B顯示在第-1和2天用載體或13A8c-20KPEG-31A12c（100ugi.p.）處理小鼠時(shí)耳增生模型的結(jié)果。第一圖顯示IL-23注射耳的耳厚度，與載體或13A8c-20KPEG-31A12c二者處理的動(dòng)物中的PBS注射耳相比較。第二圖顯示各動(dòng)物的IL-23注射耳與PBS注射耳相比較時(shí)耳厚度的增加。圖35C顯示僅在第-1天用載體或13A8c-20KPEG-31A12c或13A8c-40KPEG-31A12c（100ugi.p.）處理小鼠時(shí)耳增生模型的結(jié)果。第一圖顯示IL-23注射耳的耳厚度，與載體、13A8c-20KPEG-31A12c或13A8c-40KPEG-31A12c二者處理的動(dòng)物中的PBS注射耳相比較。第二圖顯示各動(dòng)物的IL-23注射耳與PBS注射耳相比較時(shí)耳厚度的增加。圖35D顯示在第-1和2天用載體或13A8c-40KPEG-31A12c（100ugi.p.）處理小鼠時(shí)耳增生模型的結(jié)果。第一圖顯示IL-23注射耳的耳厚度，與載體、13A8c-40KPEG-31A12c或Ustekinumab二者處理的動(dòng)物中的PBS注射耳相比較。第二圖顯示各動(dòng)物的IL-23注射耳與PBS注射耳相比較時(shí)耳厚度的增加。圖36A顯示抗IL-23嵌合抗體與包被在ELISA平板上的IL-12的結(jié)合。包含抗IL-6抗體（13A8）作為陰性對(duì)照。在第一圖中，將人IL-12包被在平板上。22H8顯示強(qiáng)結(jié)合，而31A12和49B7顯示較弱但仍為陽(yáng)性的結(jié)合。在第二圖中，將猴IL-12（獼猴）包被在平板上。在此，49B7、31A12和22H8都顯示與獼猴IL-12的強(qiáng)結(jié)合。在第三圖中，用人IL-12p40亞基包被平板。22H8顯示強(qiáng)結(jié)合，而49B7和31A12與p40亞基的結(jié)合較弱。圖36B顯示NK92細(xì)胞生物測(cè)定中獼猴IL-12誘導(dǎo)的干擾素γ分泌的中和。31A12和22H8二者都顯示強(qiáng)烈抑制獼猴IL-12。圖36C顯示NK92細(xì)胞生物測(cè)定中人IL-12誘導(dǎo)的干擾素γ分泌的中和。在此，與獼猴IL-12不同，31A12或49B不中和人IL-12。22H8中和獼猴IL-12和人IL-12二者。發(fā)明詳述雙特異性構(gòu)建體本說(shuō)明書尤其描述與IL-6和IL-23結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體。已知IL-6和IL-23都在TH17細(xì)胞的分化和激活中發(fā)揮作用。激活的TH17細(xì)胞轉(zhuǎn)而通過(guò)多種下游途徑涉及介導(dǎo)免疫反應(yīng)。這兩種細(xì)胞因子在TH17分化的不同階段發(fā)揮作用，IL-6在TH17途徑的T細(xì)胞定向中非常早地發(fā)揮作用，而IL-23作用于定向TH17細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供新的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體，其抑制TH17激活途徑中兩個(gè)不同的點(diǎn)，且對(duì)由TH17產(chǎn)物介導(dǎo)的一些下游炎癥反應(yīng)具有附加抑制作用（例如，在成纖維細(xì)胞、內(nèi)脾細(xì)胞、上脾細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中）。通過(guò)靶向IL-6和IL-23二者，雙特異性分子能夠在TH17途徑中的多個(gè)點(diǎn)抑制TH17介導(dǎo)的反應(yīng)，且可能以比對(duì)應(yīng)的單特異性抗體單獨(dú)高的效價(jià)作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，由于產(chǎn)生二價(jià)雙特異性抗體所涉及的不確定性，保留其組成抗體的功能特征或具有改善的功能特征的穩(wěn)定的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體的成功產(chǎn)生是令人驚奇和出乎意料的結(jié)果。此外，本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體可以調(diào)節(jié)（例如抑制）TH22細(xì)胞激活。TH22是最近鑒定（Eyerich等,2009）的不同亞群的T輔助細(xì)胞，其涉及炎癥和創(chuàng)傷愈合過(guò)程，尤其是與皮膚炎癥相聯(lián)系（Nograles等,2009）。它們的激活及隨后作用的機(jī)制仍是研究的課題，但細(xì)胞本身表征為分泌IL-22和TNF-α，而不分泌IL-17或干擾素γ。Th22細(xì)胞尚未充分表征，但可以分離自銀屑病患者，且表達(dá)與就其他T細(xì)胞亞群觀察到的基因表達(dá)譜不同的基因表達(dá)譜。已報(bào)道了IL-22表達(dá)依賴于IL-23（Kreymborg等,2007）。此處進(jìn)行的研究進(jìn)一步表明，與依賴IL-21進(jìn)行生長(zhǎng)刺激的Th17細(xì)胞不同，Th22細(xì)胞依賴于IL-2。本發(fā)明的抗體和二價(jià)雙特異性構(gòu)建體可以對(duì)IL-23或?qū)L-23和IL-12二者特異。因此，本發(fā)明提供抗體和二價(jià)雙特異性構(gòu)建體的亞群，其結(jié)合IL-23，也靶向IL-12分子。不希望受限于理論，此亞群的抗-IL-23抗體（本文中稱為抗-IL-23/IL-12抗體）可能可以結(jié)合IL-12和IL-23二者共有的p40亞基（見例如圖10）。除IL-23外，靶向IL-23的p40亞基的那些可能抑制IL-12。此外，抗p40的抗體可以結(jié)合削弱IL-23活性而不抑制IL-12活性的表位。相反，預(yù)期靶向IL-23的p19亞基的那些抗體將不結(jié)合IL-12。IL-12涉及TH1介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，因此，這些具體的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體不僅可以用于調(diào)節(jié)TH17細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，還可以用于調(diào)節(jié)TH1細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)。這在治療其病因具有TH1介導(dǎo)的方面和TH17介導(dǎo)的方面二者的病癥中可以尤其有利。因此，在實(shí)施方案中，本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體，其包含抗-IL-6抗體或其衍生物，和抗-IL-23抗體或其衍生物。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體，其包含抗-IL-6抗體或其衍生物，和抗-IL-23/IL-12抗體或其衍生物?？梢杂皿w外方法和體內(nèi)方法二者針對(duì)其在調(diào)節(jié)IL-23和IL-6二者活性中的用途測(cè)定本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體的具體實(shí)例。下文進(jìn)一步討論二價(jià)雙特異性構(gòu)建體的成分及其鑒定和制備的手段。親本抗-IL-6、抗-IL-23和抗-IL-23/IL-12抗體的產(chǎn)生可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)技術(shù)來(lái)鑒定本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體中的抗體及其衍生物所基于的起始抗體。這些抗體在本文中稱為親本抗體。親本抗體的選擇在實(shí)施方案中，根據(jù)它們結(jié)合IL-6、IL-23或IL-12的能力來(lái)選擇親本抗體。可以通過(guò)測(cè)定它們的Kd值來(lái)測(cè)量親本抗體的結(jié)合。在另一實(shí)施方案中，根據(jù)它們調(diào)節(jié)IL-6、IL-23或IL-12的活性的能力來(lái)選擇親本抗體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)它們結(jié)合IL-6、IL-23或IL-12的能力及它們調(diào)節(jié)IL-6、IL-23或IL-12的活性的能力來(lái)選擇親本抗體?？梢葬槍?duì)它們抑制IL-6、IL-23或IL-12的生物活性的能力選擇親本抗體，或者可以針對(duì)它們促進(jìn)IL-6、IL-23或IL-12的生物活性的能力選擇它們。優(yōu)選地，針對(duì)它們抑制IL-6、IL-23和IL-12的能力選擇親本抗體。親本抗體的來(lái)源在實(shí)施方案中，親本抗體或其衍生物可以獲自相同或分開的動(dòng)物物種。親本抗體可以例如獲自靈長(zhǎng)類、嚙齒類、兔形目動(dòng)物、胼足亞目或軟骨魚中產(chǎn)生的抗體。親本抗體可以獲自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。例如，它們可以獲自已在遺傳上改變?yōu)榫哂腥嗣庖呦到y(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠，例如。在這類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中產(chǎn)生的抗體可以具有由外源免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的抗體的特征，例如，來(lái)自Xenomouse的抗體可以視為人抗體。在一種或多種親本抗體獲自嚙齒類的情況下，有利地，該嚙齒類是小鼠或大鼠。在抗體獲自兔形目動(dòng)物的情況下，有利地，該兔形目動(dòng)物是兔子。在一種或多種親本抗體獲自胼足亞目的情況下，它們獲自駱駝、美洲鴕或單峰駝。這類“駱駝”抗體的使用可以是有利的，因?yàn)橐阎@些物種產(chǎn)生僅有單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的高親和力抗體。在使用胼足亞目抗體的情況下，使用VHH結(jié)構(gòu)域或其修飾變體是有利的。在一種或多種親本抗體獲自軟骨魚的情況下，有利地，該軟骨魚是鯊魚。在一種或多種親本抗體獲自靈長(zhǎng)類的情況下，有利地，該靈長(zhǎng)類是猴或猿。抗體的永生化可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)技術(shù)來(lái)永生化親本抗體。因此，本發(fā)明提供從適合用于摻入本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體中的親本抗體產(chǎn)生的單克隆抗體。具體抗體的組合本發(fā)明還提供包含抗體和/或其衍生物的組合的組合物。該組合包含IL-6抗體或其衍生物，和IL-23抗體或其衍生物。該IL-23抗體或其衍生物還可以結(jié)合IL-12?？贵w及其衍生物的優(yōu)選組合包含下文定義的IL-6抗體中的任一種，其與下文定義的抗-IL-23或抗-IL-23/IL-12抗體中的任一種組合。預(yù)期包含這類組合的組合物具有比單獨(dú)施用時(shí)的單種抗體更高的活性?？贵w或其衍生物的尤其優(yōu)選的組合是抗-IL-6抗體13A8或基于13A8的衍生物，和抗-IL-23抗體31A12或基于31A12的衍生物。與任一抗原單獨(dú)相比，抗體的此組合提供更高的TH17細(xì)胞活性的抑制。該組合具有比本領(lǐng)域已知的抗體更高的TH17細(xì)胞抑制活性。此外，它在有利地低的劑量下顯示此抑制活性。抗體或其衍生物的尤其優(yōu)選的組合包含與PEG化IL-23抗體或其衍生物組合的PEG化IL-6抗體或其衍生物。該IL-23抗體或其衍生物還可以結(jié)合IL-12（即，是IL-23/IL-12抗體）?？贵w的人源化可以對(duì)二價(jià)雙特異性構(gòu)建體的抗體進(jìn)行改變來(lái)使它們?cè)趯?duì)人施用時(shí)具有更低的免疫原性。這種改變可以包含通常稱為嵌合化、人源化、CDR移植、去免疫和/或構(gòu)架區(qū)氨基酸突變?yōu)閷?duì)應(yīng)的最接近的人種系序列（種系化（germlining））的技術(shù)中的一種或多種。對(duì)抗體進(jìn)行這種改變具有這樣的優(yōu)勢(shì)，使得否則將引出宿主免疫反應(yīng)的抗體對(duì)宿主免疫系統(tǒng)而言更“不可見”或完全“不可見”，使得這種免疫反應(yīng)不發(fā)生或減少。因此，按照此實(shí)施方案所述改變的抗體將比對(duì)應(yīng)的未進(jìn)行任意這種（類）改變的抗體保持可施用更長(zhǎng)的時(shí)期，具有降低的免疫反應(yīng)相關(guān)副作用或無(wú)免疫反應(yīng)相關(guān)副作用。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解如何確定是否及必須以什么程度改變抗體來(lái)阻止它引出不想要的宿主免疫反應(yīng)。因此，本發(fā)明提供人源化或嵌合抗體，其已改變，使得它們包含來(lái)自一種或多種生物的氨基酸序列，或包含合成的氨基酸序列（例如，本發(fā)明的人源化或嵌合抗體可以包含與獲自嚙齒類的CDR區(qū)連接的人構(gòu)架區(qū)）。具體的目的抗體因此，根據(jù)本發(fā)明，提供具體的人源化抗-IL-6、抗-IL-23和抗-IL-23/IL-12抗體。這些抗體基于顯示結(jié)合IL-6、IL-23或p40并調(diào)節(jié)（例如抑制）其生物活性的能力的親本抗體。此外，本發(fā)明提供的具體抗體在永生化和人源化之后保留或基本保留這些能力。具體的目的人源化抗體包括以下：抗-IL-6抗體：13A8（包含SEQIDNO.259的VH和SEQIDNO.261的VL）；9H4（包含SEQIDNO.46的VH和SEQIDNO.48的VL）；9C8（包含SEQIDNO.56的VH和SEQIDNO.58的VL）；8C8(包含SEQIDNO.36的VH和SEQIDNO.38的VL）；18D4（包含SEQIDNO.26的VH和SEQIDNO.28的VL）；和28D2（(包含SEQIDNO.16的VH和SEQIDNO.18的VL）。抗-IL-23抗體：31A12（包含SEQIDNO.267的VH和SEQIDNO.269的VL）；34E11（包含SEQIDNO.116的VH和SEQIDNO.118的VL）；35H4（包含SEQIDNO.126的VH和SEQIDNO.128的VL）；49B7（包含SEQIDNO.96的VH和SEQIDNO.98的VL）；和16C6（包含SEQIDNO.106的VH和SEQIDNO.108的VL）?？?IL-23/IL-12抗體：45G5（包含SEQIDNO.275的VH和SEQIDNO.277的VL）；14B5（包含SEQIDNO.186的VH和SEQIDNO.188的VL）；4F3（包含SEQIDNO.166的VH和SEQIDNO.168的VL）；5C5（包含SEQIDNO.176的VH和SEQIDNO.178的VL）；22H8（包含SEQIDNO.271的VH和SEQIDNO.273的VL）；和1H1（包含SEQIDNO.156的VH和SEQIDNO.158的VL）。尤其優(yōu)選的人源化抗體是13A8、31A12和22H8的人源化形式?？贵w變體本發(fā)明還提供抗體變體例如作為二價(jià)雙特異性構(gòu)建體的成分。該抗體保留或基本保留結(jié)合親和力及調(diào)節(jié)IL-6、IL-23或IL-12的生物活性的能力（例如，與其親本抗體相比，變體抗體的Kd值是至少80%，通過(guò)本文中公開的測(cè)定法測(cè)定，其調(diào)節(jié)生物活性的能力是其親本抗體的至少80%）?？梢酝ㄟ^(guò)突變重鏈和/或輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域來(lái)獲得變體抗體或其衍生物，以改變抗體的結(jié)合特性。例如，可以在編碼一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)的核酸分子中產(chǎn)生突變來(lái)提高或降低抗體對(duì)IL-6或IL-23的Kd值；提高或降低抗體調(diào)節(jié)IL-6、IL-23或IL-12的生物活性的能力；或改變抗體的結(jié)合特異性。用位點(diǎn)定向誘變引入這類突變的技術(shù)為本領(lǐng)域公知?？梢酝ㄟ^(guò)突變重鏈和/或輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域來(lái)獲得其他變體抗體或其衍生物，以改變等電點(diǎn)（pI），增強(qiáng)pH為3-7.5（最終制劑的范圍）的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，避免二硫鍵改組。見例如SEQIDNO332，31A12pI優(yōu)化，其中修飾以下氨基酸：Q26R、L56R、K109-G110insR和Q142K；SEQID334，13A18pI優(yōu)化，其中修飾以下氨基酸：Q26R、L56R、K112-G113insR和Q145K。此外，可以通過(guò)突變重鏈和/或輕鏈的可變區(qū)來(lái)增強(qiáng)穩(wěn)定性，以減少產(chǎn)物在溶液中的聚集，見例如SEQIDNO331，預(yù)測(cè)增強(qiáng)溶解性并減少產(chǎn)物聚集的31A12F12S突變；SEQIDNO.333，組合pI優(yōu)化和F12S突變的31A12。在另一實(shí)施方案中，可以在一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)中突變核酸分子。可以在構(gòu)架區(qū)或恒定區(qū)中產(chǎn)生突變來(lái)增加抗-IL-6或抗-IL-23抗體的半衰期。還可以在構(gòu)架區(qū)或恒定區(qū)中產(chǎn)生突變來(lái)改變抗體的免疫原性；提供用于與另一分子共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的位點(diǎn)；或改變諸如補(bǔ)體結(jié)合的特性。因此，根據(jù)本發(fā)明，可以在單種突變抗體中的構(gòu)架區(qū)、恒定區(qū)和可變區(qū)的每一個(gè)中產(chǎn)生突變。備選地，可以在單種突變抗體中的構(gòu)架區(qū)、可變區(qū)或恒定區(qū)的僅一個(gè)中產(chǎn)生突變。序列變異在實(shí)施方案中，本發(fā)明提供與突變前的抗-IL-6抗體具有至少90%序列同一性的變體抗-IL-6抗體。優(yōu)選地，該變體抗-IL-6抗體與突變前的抗-IL-6抗體具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。在實(shí)施方案中，本發(fā)明提供與突變前的抗-IL-23抗體具有至少90%序列同一性的變體抗-IL-23抗體。優(yōu)選地，該變體抗-IL-23抗體與突變前的抗-IL-23抗體具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。在實(shí)施方案中，本發(fā)明提供與突變前的抗-IL-23/IL-12抗體具有至少90%序列同一性的變體抗-IL-23/IL-12抗體。優(yōu)選地，該變體抗-IL-23/IL-12抗體與突變前的抗-IL-23/IL-12抗體具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。添加缺失取代在實(shí)施方案中，與突變前的抗-IL-6抗體相比，變體抗-IL-6抗體的VH或VL區(qū)中存在不超過(guò)10個(gè)氨基酸改變。在另一實(shí)施方案中，與突變前的抗-IL-23抗體相比，變體抗-IL-23抗體的VH或VL區(qū)中存在不超過(guò)10個(gè)氨基酸改變。在另一實(shí)施方案中，與突變前的抗-IL-23/IL-12抗體相比，變體抗-IL-23/IL-12抗體的VH或VL區(qū)中存在不超過(guò)10個(gè)氨基酸改變。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，變體抗-IL-6抗體的VH或VL區(qū)中、變體抗-IL-23抗體中或變體抗-IL-23/IL-12抗體中存在不超過(guò)5個(gè)氨基酸改變，更優(yōu)選不超過(guò)3個(gè)氨基酸改變。在另一實(shí)施方案中，與突變前的抗-IL-6抗體相比、與突變前的抗-IL-23抗體相比或與突變前的抗-IL-23/IL-12抗體相比，變體抗-IL-6抗體、變體抗-IL-23抗體或變體抗-IL-23/IL-12抗體的恒定區(qū)中存在不超過(guò)15個(gè)氨基酸改變，更優(yōu)選存在不超過(guò)10個(gè)氨基酸改變，甚至更優(yōu)選不超過(guò)5個(gè)氨基酸改變。抗體衍生物可以用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)和方法來(lái)產(chǎn)生抗體衍生物。本發(fā)明的抗體衍生物保留或基本保留它們所衍生自的抗體的結(jié)合親和力及調(diào)節(jié)IL-6、IL-23或p40的生物活性的能力?？贵w衍生物的實(shí)例包括衍生自本文中公開的抗-IL-6、抗-IL-23和抗-IL-23/IL-12抗體的Fab、Fab’、F(ab)’及scFv構(gòu)建體、Kappabody、微抗體和Janusin。Fab、Fab’、F(ab)’在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供抗-IL-6抗體或變體抗-IL-6抗體的Fab、Fab’、F(ab)’片段。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供抗-IL-23抗體或變體抗-IL-23抗體的Fab、Fab’、F(ab)’片段。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供抗-IL-23/IL-12抗體或變體抗-IL-23/IL-12抗體的Fab、Fab’、F(ab)’片段。單鏈抗體（scFv）在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供抗-IL-6抗體或變體抗-IL-6抗體的scFv衍生物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供抗-IL-23抗體或變體抗-IL-23抗體的scFv衍生物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供抗-IL-23/IL-12抗體或變體抗-IL-23/IL-12抗體的scFv衍生物。為了產(chǎn)生單鏈抗體（scFv），將編碼VH和VL的DNA片段與另一編碼柔性接頭的片段有效連接，使得VH和VL序列可以表達(dá)為連續(xù)的單鏈蛋白質(zhì)，VL和VH區(qū)通過(guò)該柔性接頭連接（見例如Bird等(1988)Science242:423-426；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.美國(guó)85:5879-5883；McCafferty等,Nature(1990)348:552-554）。單鏈抗體可以是單價(jià)（如果僅使用單個(gè)VH和VL）、二價(jià)（如果使用兩個(gè)VH和VL）或多價(jià)（如果使用超過(guò)兩個(gè)VH和VL）。在實(shí)施方案中，用來(lái)自抗-IL-6抗體的一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)來(lái)制備單鏈抗體。在另一實(shí)施方案中，用來(lái)自抗-IL-6抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)來(lái)制備單鏈抗體。在實(shí)施方案中，用來(lái)自抗-IL-23抗體的一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)來(lái)制備單鏈抗體。在另一實(shí)施方案中，用來(lái)自抗-IL-23抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)來(lái)制備單鏈抗體。在實(shí)施方案中，用來(lái)自抗-IL-23/IL-12抗體的一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)來(lái)制備單鏈抗體。在另一實(shí)施方案中，用來(lái)自抗-IL-23/IL-12抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)來(lái)制備單鏈抗體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，抗-IL-6單鏈抗體衍生自上文所述的人源化抗-IL-6抗體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，抗-IL-23單鏈抗體衍生自上文所述的人源化抗-IL-23抗體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，抗-IL-23/IL-12單鏈抗體衍生自上文所述的人源化抗-IL-23/IL-12抗體。在實(shí)施方案中，單鏈抗體的輕鏈和重鏈通過(guò)具有以下氨基酸序列的接頭部分連接：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO.327),GGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO.328)，GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO.329)GGGGSGGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO.330)。本發(fā)明的接頭部分可以是重復(fù)3至5次的序列GGGGS，或非整數(shù)重復(fù)的GGGGS序列，見例如SEQIDNO.330。在實(shí)施方案中，本發(fā)明的單鏈抗體與PEG共價(jià)連接。Kappabody、微抗體和Janusin在另一實(shí)施方案中，可以用編碼抗-IL-6抗體、抗-IL-23抗體或抗-IL-23/IL-12抗體的核酸分子來(lái)制備其他修飾抗體。例如，可以用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)制備“Kappabody”（ILl等,ProteinEng10:949-57(1997)）、“微抗體”（Martin等,EMBOJ13:5303-9(1994)）或“Janusin”（Traunecker等,EMBOJ10:3655-3659(1991)和Traunecker等"Janusin:newmoleculardesignforbispecificreagents"IntJCancerSuppl7:51-52(1992)）?；パa(bǔ)決定區(qū)（CDR）互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）是見于抗原受體（例如免疫球蛋白和T細(xì)胞受體）的可變（V）結(jié)構(gòu)域中的柔性環(huán)形式的相對(duì)短的氨基酸序列。免疫球蛋白和T細(xì)胞受體二者的CDR是這些分子的決定其特異性并與特異性配體接觸的部分。CDR是該分子的最可變部分，并促成這些分子的多樣性，允許免疫球蛋白和T細(xì)胞受體識(shí)別許多種抗原。因此，組成本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體的抗-IL-6、抗-IL-23和抗-IL-23/IL-12抗體中的這些區(qū)域在決定該抗體的特異性中發(fā)揮關(guān)鍵作用，預(yù)期具有共同的具體CDR區(qū)的抗體將具有相同或相似的抗原特異性。因此，在本發(fā)明的一方面，抗-IL-6、抗-IL-23和抗-IL-23/IL-12抗體或其衍生物包含它們所基于的抗體的CDR區(qū)。還應(yīng)指出，認(rèn)為一些CDR區(qū)在抗體特異性中發(fā)揮比其他CDR區(qū)重要的作用。具體而言，在設(shè)計(jì)包含在二價(jià)雙特異性構(gòu)建體的抗體或其衍生物中，使用VH結(jié)構(gòu)域的至少第三互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）通常有利，因?yàn)橐阎@些在所有CDR區(qū)的結(jié)合特異性和親和力中發(fā)揮主要作用。因此，本發(fā)明提供組成本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體的抗體和抗體衍生物包含親本抗體的CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5和CDR6中的至少一個(gè)。優(yōu)選地，組成二價(jià)雙特異性構(gòu)建體的抗體和抗體衍生物至少包含CDR3。在實(shí)施方案中，與突變前的抗-IL-6抗體相比，突變的抗-IL-6抗體具有至少一個(gè)保持未變的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）。該未變的CDR可以是CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6。在另一實(shí)施方案中，與突變前的抗-IL-23抗體相比，突變的抗-IL-23抗體具有至少一個(gè)保持未變的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）。該未變的CDR可以是CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6。在實(shí)施方案中，與突變前的抗-IL-23/IL-12抗體相比，突變的抗-IL-23/IL-12抗體具有至少一個(gè)保持未變的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）。該未變的CDR可以是CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6。CDR氨基酸序列內(nèi)的基序本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，甚至對(duì)于單個(gè)CDR，也存在在決定具體抗體或其衍生物的特異性中尤其重要的具體區(qū)域（本文中稱為基序）。這些區(qū)域的特異性可以由許多因素決定，如它們的構(gòu)象及帶電荷的氨基酸殘基在該區(qū)域內(nèi)的定位。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)來(lái)鑒定這些基序，包括表位作圖及比較已知結(jié)合相同靶標(biāo)的抗體的序列。因此，本發(fā)明提供包含具有具體基序的CDR的抗體或其衍生物。在實(shí)施方案中，該CDR包含取自以下抗體的CDR區(qū)的至少3個(gè)、至少4個(gè)、至少5個(gè)或至少6個(gè)連續(xù)氨基酸：13A8（SEQIDNO.10-15的CDR）；9H4（SEQIDNO.50-55的CDR）；9C8（SEQIDNO.60-65的CDR）；8C8（SEQIDNO.40-45的CDR）；18D4（SEQIDNO.30-35的CDR）；28D2（SEQIDNO.20-25的CDR）；31A12（SEQIDNO.90-95的CDR）；34E11（SEQIDNO.120-125的CDR）；35H4（SEQIDNO.130-135的CDR）；49B7（SEQIDNO.100-105的CDR）；16C6（SEQIDNO.110-115的CDR）；45G5（SEQIDNO.150-155的CDR）；14B5（SEQIDNO.190-195的CDR）；4F3（SEQIDNO.170-175的CDR）；5C5（RSEQIDNO.180-185的CD）；22H8（SEQIDNO.140-145的CDR）；和1H1（SEQIDNO.16-165的CDR）。在另一實(shí)施方案中，該CDR包含取代的取自上述CDR的連續(xù)氨基酸序列。具體而言，基序可以包含至少3個(gè)、至少4個(gè)、至少5個(gè)或至少6個(gè)殘基，其中氨基酸的同一性和位置相對(duì)于序列中的其他氨基酸固定，與對(duì)應(yīng)的取代前的CDR的氨基酸相比可以取代一個(gè)或兩個(gè)氨基酸。優(yōu)選地，該取代是保守取代。這種基序的實(shí)例可以見于22H8抗-IL-23/IL-12抗體的CDR2區(qū)內(nèi)?；蚩梢酝ㄟ^(guò)下式來(lái)描述：氨基酸序列WX1KG，其中X1是丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，優(yōu)選丙氨酸或纈氨酸；見于本發(fā)明的抗-IL-23/IL-12抗體的CDR的共同基序的其他實(shí)例包括：CDR3區(qū)中的包含氨基酸序列YAYX1GDAFDP的基序，其中X1是丙氨酸或異亮氨酸；（SEQIDNO.339）和/或CDR3區(qū)中的包含氨基酸序列SDYFNX1的基序，其中X1是異亮氨酸或纈氨酸；（SEQIDNO.340）和/或CDR4區(qū)中的包含氨基酸序列QX1SQX2的基序，其中X1是丙氨酸或絲氨酸；和X2選自甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸；優(yōu)選地，X2是絲氨酸或蘇氨酸；和/或CDR5區(qū)中的包含氨基酸序列ASX1LA的基序，其中X1是賴氨酸或蘇氨酸；（SEQIDNO.341）和/或CDR6區(qū)中的包含氨基酸序列QSYYDX1NAGYG的基序，其中X1是丙氨酸或纈氨酸；（SEQIDNO.342）見于本發(fā)明的IL-23抗體的CDR的共同基序的實(shí)例包括：CDR2區(qū)中的包含氨基酸序列YYAX1WAX2G的基序，其中X1選自絲氨酸、脯氨酸和天冬氨酸；和X2選自賴氨酸和谷氨酰胺；（SEQIDNO.337）和/或CDR5區(qū)中的包含氨基酸序列AX1TLX2S的基序，其中X1選自絲氨酸和丙氨酸；X2選自丙氨酸和蘇氨酸；（SEQIDNO.338）。見于本發(fā)明的IL-6抗體的CDR的共同基序的實(shí)例包括：CDR2區(qū)中的包含氨基酸序列YIYTDX1STX2YANWAKG的基序，其中X1選自甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸；和X2選自苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；和優(yōu)選地，X1是絲氨酸或蘇氨酸，而X2是色氨酸或酪氨酸；（SEQIDNO.335）和/或CDR5區(qū)中的包含氨基酸序列RX1STLX2S的基序，其中X1和X2獨(dú)立地是丙氨酸或蘇氨酸。（SEQIDNO.336）摻入非天然氨基酸的修飾本發(fā)明提供非天然氨基酸殘基摻入抗-IL-6、抗-IL-23和抗-IL-23/IL-12抗體或其衍生物來(lái)為抗-IL-6抗體或其衍生物、抗-IL-23或抗-IL-23/IL-12抗體或其衍生物提供附著點(diǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到許多可能適宜的非天然氨基酸，包括例如疊氮基高丙氨酸（Aha）。其他非天然氨基酸包括疊氮基正亮氨酸、3-(1-萘基)丙氨酸、3-(2-萘基)丙氨酸、對(duì)-乙炔基-苯丙氨酸、對(duì)-炔丙基-氧-苯丙氨酸、間-乙炔基-苯丙氨酸、6-乙炔基-色氨酸、5-乙炔基-色氨酸、(R)-2-氨基-3-(4-乙炔基-1H-吡咯-3-基)丙酸、對(duì)-溴苯丙氨酸、對(duì)-碘苯丙氨酸、對(duì)-疊氮基苯丙氨酸、3-(6-氯吲哚基)丙氨酸、3-(6-溴吲哚基)丙氨酸、3-(5-溴吲哚基)丙氨酸、高烯丙基甘氨酸、高炔丙基甘氨酸和對(duì)-氯苯丙氨酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該非天然氨基酸是Aha。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將理解，為了控制附著位點(diǎn)，有必要改造抗體或其衍生物的氨基酸序列，使得非天然氨基酸僅定位在將要發(fā)生附著的位置。在實(shí)施方案中，非天然氨基酸可以定位在本文公開的抗體或其衍生物的N端。在實(shí)施方案中，非天然氨基酸可以定位在本文公開的抗體或其衍生物的C端。在實(shí)施方案中，非天然氨基酸可以定位在本文公開的scFv的VH和VL部分之間的連接區(qū)中（例如SEQIDNO.327內(nèi)）。在實(shí)施方案中，待摻入二價(jià)雙特異性構(gòu)建體的各抗體中存在單個(gè)附著點(diǎn)。抗體或其衍生物、scFv和/或本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體的部分的實(shí)例包括SEQIDNo.287至312。在實(shí)施方案中，通過(guò)在摻入非天然氨基酸（如Aha）取代甲硫氨酸（Met）的營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主細(xì)胞中表達(dá)抗體來(lái)達(dá)到非天然氨基酸的摻入。為了存在單個(gè)附著位點(diǎn)，必須改造抗體核苷酸序列來(lái)去除不定位在希望的附著位點(diǎn)的任意天然存在的甲硫氨酸密碼子。這可以通過(guò)用其他氨基酸（通常是天然氨基酸）的密碼子取代它們來(lái)達(dá)到。由于1-2個(gè)甲硫氨酸殘基常見于免疫球蛋白VH區(qū)的構(gòu)架區(qū)和CDR內(nèi)，在VL區(qū)中不常見，有必要為這些殘基找到適宜的取代，其中它們的存在不影響希望的蛋白質(zhì)的表達(dá)、穩(wěn)定性或功能（例如結(jié)合或靶標(biāo)中和活性）。然后可以優(yōu)化此無(wú)甲硫氨酸的scFv來(lái)在甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)菌菌株中表達(dá)，純化，重折疊，并測(cè)試生物活性?？蛇x地，可以在序列中保留超過(guò)一個(gè)甲硫氨酸密碼子，以允許摻入超過(guò)一個(gè)非天然氨基酸（如Aha）。如果甲硫氨酸并非天然存在于希望的附著位點(diǎn)，可以引入單個(gè)（或可選地，超過(guò)一個(gè)）甲硫氨酸密碼子，其作為具有用于附著的化學(xué)反應(yīng)位點(diǎn)的非天然氨基酸的插入位點(diǎn)。修飾為包含非天然氨基酸的抗體可以附著于一個(gè)或多個(gè)分開的實(shí)體。這些實(shí)體包括連接基團(tuán)和/或其他類似地修飾的抗體。適宜的接頭的實(shí)例為本領(lǐng)域已知，且包括短肽序列。本發(fā)明還提供PEG作為接頭的用途。因此，在實(shí)施方案中，摻入非天然氨基酸的抗-IL-6抗體或其衍生物可以與PEG連接基團(tuán)共價(jià)連接，該P(yáng)EG連接基團(tuán)轉(zhuǎn)而與摻入非天然氨基酸的抗-IL-23或抗-IL-23/IL-12抗體或其衍生物連接。然后可以純化并重折疊這類雙特異性PEG化構(gòu)建體來(lái)產(chǎn)生穩(wěn)定的生物活性治療蛋白質(zhì)。適宜地，本發(fā)明中的修飾為包含非天然氨基酸的抗體或其衍生物可以直接（例如，不使用連接基團(tuán)）與其他類似地修飾的分子（包括但不限于其他抗體或其衍生物、染料、藥物或毒素）連接。標(biāo)記和衍生化本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體或抗體可以衍生化或與另一分子連接。一般而言，這樣衍生二價(jià)雙特異性構(gòu)建體，使得組成抗體或其衍生物的結(jié)合活性和生物活性不受衍生化或標(biāo)記的不利影響。例如，本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體可以與一種或多種其他分子實(shí)體功能性連接（通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)、遺傳融合、單價(jià)結(jié)合或其他方式），如檢測(cè)劑、細(xì)胞毒劑、藥物和/或可以介導(dǎo)抗體或抗體部分與另一分子（如鏈霉抗生物素蛋白核心區(qū)或聚組氨酸標(biāo)記）的結(jié)合的蛋白質(zhì)或肽。一類衍生的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體是標(biāo)記的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體。可以用來(lái)衍生本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體的有用的檢測(cè)劑包括縈光化合物，其包括縈光素、異硫氰酸縈光素、羅丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻紅蛋白、鑭系化合物磷光體（lanthanidephosphor）等。還可以用用于檢測(cè)的酶來(lái)標(biāo)記二價(jià)雙特異性構(gòu)建體，如辣根過(guò)氧化物酶、-半乳糖苷酶、縈光素酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。用可檢測(cè)的酶標(biāo)記二價(jià)雙特異性構(gòu)建體時(shí)，通過(guò)加入該酶用來(lái)產(chǎn)生可識(shí)別的反應(yīng)產(chǎn)物的其他試劑來(lái)檢測(cè)它。例如，在存在物質(zhì)辣根過(guò)氧化物酶時(shí)，過(guò)氧化氫和二氨基聯(lián)苯胺的加入產(chǎn)生可檢測(cè)的有色反應(yīng)產(chǎn)物。還可以用生物素標(biāo)記二價(jià)雙特異性構(gòu)建體，并通過(guò)間接測(cè)量抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合來(lái)檢測(cè)。還可以用預(yù)先確定的由第二報(bào)道分子識(shí)別的多肽表位（例如，亮氨酸拉鏈對(duì)序列、第二抗體的結(jié)合部位、金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域、附加表位）標(biāo)記二價(jià)雙特異性構(gòu)建體。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)多種長(zhǎng)度的間隔臂附著標(biāo)記來(lái)減少潛在的空間位阻。還可以用放射性標(biāo)記的氨基酸標(biāo)記二價(jià)雙特異性構(gòu)建體。放射性標(biāo)記可以用于診斷目的和治療目的二者?？梢栽谠\斷上使用放射性標(biāo)記的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體來(lái)例如測(cè)定受試者中的IL-6和/或IL-23水平。此外，可以在治療上使用放射性標(biāo)記的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體來(lái)治療由TH17途徑介導(dǎo)的疾病。放射性標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于以下放射性同位素或放射性核素：3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I。還可以通過(guò)用諸如DOTA的螯合部分的衍生化來(lái)使放射性同位素結(jié)合于抗體或雙特異性劑。幾種有用的成像和治療放射性同位素與這些螯合劑緊密結(jié)合。還可以用諸如聚乙二醇（PEG）、甲基或乙基、或糖基的化學(xué)基團(tuán)衍生化二價(jià)雙特異性構(gòu)建體。這些基團(tuán)可以用來(lái)改善抗體的生物特征，例如，增加血清半衰期或增加組織結(jié)合?？贵w/衍生物的表達(dá)可以用常規(guī)重組技術(shù)表達(dá)本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體和組成二價(jià)雙特異性構(gòu)建體的抗體及其衍生物。此外，在構(gòu)建體和/或抗體及其衍生物包含非天然氨基酸時(shí)，可以使用WO2007/130453中所述的重組方法。用來(lái)表達(dá)二價(jià)雙特異性構(gòu)建體和抗體及其衍生物的核苷酸序列、載體、宿主細(xì)胞等是本發(fā)明的目的。多核苷酸在實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼上文定義的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體和組成二價(jià)雙特異性構(gòu)建體的抗體及其衍生物的核苷酸序列。因此，本發(fā)明涵蓋編碼以下的核苷酸序列：（1）本發(fā)明的單克隆抗體；（2）本發(fā)明的人源化抗體；（3）本發(fā)明的基于（1）和（2）的變體抗體；（4）本發(fā)明的（1）至（3）的抗體的衍生物；和（5）本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體。在實(shí)施方案中，該核苷酸序列編碼抗-IL-6抗體的部分。這類序列的實(shí)例在SEQIDNO.7和9中給出，其是命名為13A8的IL-6抗體的VH和VL區(qū)的核苷酸序列。在實(shí)施方案中，該核苷酸序列編碼抗-IL-23抗體的部分。這類序列的實(shí)例在SEQIDNO.87和89中給出，其是命名為31A12的抗-IL-23抗體的VH和VL區(qū)的核苷酸序列。在實(shí)施方案中，該核苷酸序列編碼抗-IL-23/IL-12抗體的部分。這類序列的實(shí)例在SEQIDNO.137和139中給出，其是命名為22H8的抗-IL-23/IL-12抗體的VH和VL區(qū)的核苷酸序列。在實(shí)施方案中，該二價(jià)雙特異性構(gòu)建體可以表達(dá)為單一產(chǎn)物。啟動(dòng)子在實(shí)施方案中，本發(fā)明的核苷酸序列與啟動(dòng)子序列有效連接。適宜的啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于T5/Lac啟動(dòng)子、T7/Lac或修飾的T7/lac啟動(dòng)子、Trc或tac啟動(dòng)子、噬菌體pL或pR溫度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、tetA啟動(dòng)子/操縱基因、araBAD（pBAD）啟動(dòng)子、rhaPBAD啟動(dòng)子和lacUV5啟動(dòng)子。其他適宜的啟動(dòng)子可以從Terpe,K.(2006)(ApplMicrobiolBiotechnol72:211–222)鑒定。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該啟動(dòng)子是T5/Lac啟動(dòng)子。載體在實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含可選地與啟動(dòng)子序列有效連接的本發(fā)明的核苷酸序列的載體。宿主細(xì)胞在實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)染，并能夠表達(dá)包含在該載體內(nèi)的核苷酸序列的宿主細(xì)胞?？蛇x地，該宿主細(xì)胞是能夠摻入非天然氨基酸取代具體的天然氨基酸（例如，AHA取代Met）的營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞。適宜的真核細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞。優(yōu)選地，該宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞，尤其是大腸桿菌B384，其是甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞。備選地，該細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，更優(yōu)選它們是人細(xì)胞，還更優(yōu)選它們是人胚腎細(xì)胞（例如HEK293或HEK293c18細(xì)胞）或CHO細(xì)胞。引物在本發(fā)明的實(shí)施方案中，提供用于克隆和表達(dá)抗-IL-6、抗-IL-23抗體和抗-IL-23/IL-12抗體及其衍生物的引物。這些引物的長(zhǎng)度在10至40個(gè)核苷酸之間，優(yōu)選它們的長(zhǎng)度在15至30個(gè)核苷酸之間。由于本文公開的抗體及其衍生物的核酸序列的公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠確定適宜的引物序列。具體的目的引物序列在SEQIDNO.200-258中給出，其用于克隆和表達(dá)本文公開的抗體和scFv。非天然氨基酸的摻入WO2007/130453中公開了用非天然氨基酸來(lái)允許將部分綴合于肽。下文也討論了這種蛋白質(zhì)工程。蛋白質(zhì)工程方法中的第一步通常是選擇一組具有希望的化學(xué)性質(zhì)的非天然氨基酸。非天然氨基酸的選擇取決于預(yù)先確定的化學(xué)性質(zhì)和希望在靶分子或靶蛋白質(zhì)中進(jìn)行的修飾。一旦選擇，可以從供應(yīng)商購(gòu)買或化學(xué)合成非天然氨基酸?？梢詫⑷我鈹?shù)目的非天然氨基酸摻入靶分子，且可以根據(jù)待附著的希望的化學(xué)部分的數(shù)目而變?；瘜W(xué)部分可附著于全部非天然氨基酸或僅僅附著于一些非天然氨基酸。此外，取決于希望的結(jié)果，可以將相同或不同的非天然氨基酸摻入分子。在某些實(shí)施方案中，將至少兩種不同的非天然氨基酸摻入分子，一個(gè)化學(xué)部分（如PEG）附著于非天然氨基酸殘基之一，而另一化學(xué)部分（如細(xì)胞毒劑）附著于另一非天然氨基酸。多種非天然氨基酸可以用于本發(fā)明的方法。通常，選擇或設(shè)計(jì)用于本發(fā)明的非天然氨基酸來(lái)提供在二十種天然氨基酸中不可得的附加特征。例如，可選地設(shè)計(jì)或選擇非天然氨基酸來(lái)修飾它們所摻入的分子（包括蛋白質(zhì)）的生物學(xué)性質(zhì)。例如，可選地通過(guò)在分子（如蛋白質(zhì)）中納入非天然氨基酸來(lái)修飾以下性質(zhì)：毒性、生物分布、溶解性、穩(wěn)定性（例如熱穩(wěn)定性、水解穩(wěn)定性、氧化穩(wěn)定性、對(duì)酶降解的抗性等）、便于純化和處理、結(jié)構(gòu)性質(zhì)、光譜性質(zhì)、化學(xué)和/或光化學(xué)性質(zhì)、催化活性、作為疫苗發(fā)揮作用的能力、氧化還原電位、半衰期、與其他分子反應(yīng)（例如共價(jià)或非共價(jià)）的能力等。本文所用的“非天然氨基酸”指除硒代半胱氨酸和以下二十種遺傳編碼的α-氨基酸之外的任意氨基酸、修飾氨基酸或氨基酸類似物：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸。式I顯示α-氨基酸的一般結(jié)構(gòu)：非天然氨基酸通常是具有式I的任意結(jié)構(gòu)，其中R基是除用于二十種天然氨基酸中的取代基之外的任意取代基。二十種天然氨基酸的結(jié)構(gòu)見例如任意生物化學(xué)教科書，如L.Stryer的Biochemistry,第3版1988,FreemanandCompany,NewYork。應(yīng)注意，本文公開的非天然氨基酸可以是除以上二十種α-氨基酸之外的天然存在的化合物。因?yàn)楸疚墓_的非天然氨基酸通常僅在側(cè)鏈中與天然氨基酸不同，所以非天然氨基酸以與它們?cè)谔烊淮嬖诘牡鞍踪|(zhì)中形成酰胺鍵的方式相同的方式與其他氨基酸（例如天然或非天然氨基酸）形成酰胺鍵。但是，非天然氨基酸具有使它們區(qū)別于天然氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)。例如，式I中的R可選地包含烷基、芳基、芳基鹵化物、乙烯基鹵化物、β-甲硅烷基鏈烯基鹵化物、β-甲硅烷基鏈烯基磺酸酯、烷基鹵化物、乙酰基、酮、氮丙啶、腈、硝基、氧化腈、鹵化物、?；?、酮基、疊氮基、酮縮醇、縮醛、羥基、肼、氰基、鹵、酰肼、鏈烯基、炔基、醚、硫醚、環(huán)氧化物、砜、硼酸、硼酸酯（boronateester）、硼烷、苯基硼酸、硫醇、硒基、磺?；⑴鹚猁}、硼酸（boronate）、二氧磷基、膦?；?、膦、雜環(huán)、吡啶基、萘基、二苯甲酮、受限環(huán)，如環(huán)辛炔、環(huán)丙烯、降冰片烯硫酯、烯酮、亞胺、醛、酯、硫羰酸、羥基胺、氨基、羧酸、α-酮羧酸、α或β不飽和酸和酰胺、乙醛酰酰胺、或有機(jī)硅烷、吡喃酮、四嗪、噠嗪、酰肼、肼、烷氧基胺、芳基磺酸酯、芳基鹵化物、氨基硫脲、氨基脲、四唑基等或其任意組合。非天然氨基酸的具體實(shí)例包括但不限于：對(duì)-乙?；?L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙?；?GlcNAcβ-絲氨酸、β-O-GlcNAc-L-絲氨酸、三-O-乙?；?GalNAc-α-蘇氨酸、α-GalNAc-L-蘇氨酸、L-Dopa、氟化苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、對(duì)-疊氮基-L-苯丙氨酸、對(duì)-?；?L-苯丙氨酸、對(duì)-苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸絲氨酸、膦酰絲氨酸、膦酰酪氨酸、對(duì)-碘-苯丙氨酸、對(duì)-溴苯丙氨酸、對(duì)-氨基-L-苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、吡咯賴氨酸、N-σ-鄰-疊氮基芐氧基羰基-L-賴氨酸（AzZLys）、N-σ-炔丙氧基羰基-L-賴氨酸、N-σ-2-疊氮基乙氧基羰基-L-賴氨酸、N-σ-叔-丁氧基羰基-L-賴氨酸（BocLys）、N-σ-烯丙氧基羰基-L-賴氨酸（AlocLys）、N-σ-乙?；?L-賴氨酸（AcLys）、N-σ-芐氧基羰基-L-賴氨酸（ZLys）、N-σ-環(huán)戊氧基羰基-L-賴氨酸（CycLys）、N-σ-D-脯氨酰基-L-賴氨酸、N-σ-煙酰-L-賴氨酸（NicLys）、N-σ-N-Me-氨茴酰-L-賴氨酸（NmaLys）、N-σ-生物素酰-L-賴氨酸、N-σ-9-芴基甲氧基羰基-L-賴氨酸、N-σ-甲基-L-賴氨酸、N-σ-二甲基-L-賴氨酸、N-σ-三甲基-L-賴氨酸、N-σ-異丙基-L-賴氨酸、N-σ-丹酰-L-賴氨酸、N-σ-鄰,對(duì)-二硝基苯基-L-賴氨酸、N-σ-對(duì)-甲苯磺酰-L-賴氨酸、N-σ-DL-2-氨基-2-羧乙基-L-賴氨酸、N-σ-苯基丙酮酰胺-L-賴氨酸、N-σ-丙酮酰胺-L-賴氨酸，下文或本文其他地方所列的那些等；例如，選擇對(duì)-乙酰基-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcβ-絲氨酸、β-O-GlcNAc-L-絲氨酸、三-O-乙酰基-GalNAc-α-蘇氨酸、α-GalNAc-L-蘇氨酸、L-Dopa、氟化苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、對(duì)-疊氮基-L-苯丙氨酸、對(duì)-酰基-L-苯丙氨酸、對(duì)-苯甲?；?L-苯丙氨酸、L-磷酸絲氨酸、膦酰絲氨酸、膦酰酪氨酸、對(duì)-碘-苯丙氨酸、對(duì)-溴苯丙氨酸、對(duì)-氨基-L-苯丙氨酸和異丙基-L-苯丙氨酸。芳基取代可以發(fā)生在多種位置，例如鄰位、間位、對(duì)位，并將一個(gè)或多個(gè)功能基團(tuán)放置在芳基環(huán)上。其他目的非天然氨基酸包括但不限于：包含光活化交聯(lián)劑的氨基酸；自旋示蹤的氨基酸；染料標(biāo)記的氨基酸；縈光氨基酸；金屬結(jié)合的氨基酸；包含金屬的氨基酸；放射性氨基酸；具有新的功能基團(tuán)的氨基酸；具有改變的親水性、疏水性、極性或形成氫鍵的能力的氨基酸；與其他分子共價(jià)或非共價(jià)相互作用的氨基酸；photocaged和/或光異構(gòu)化氨基酸；包含生物素或生物素類似物的氨基酸；糖基化的氨基酸，如糖取代的絲氨酸、其他糖類修飾的氨基酸；包含酮的氨基酸；包含聚乙二醇或聚醚、多元醇、或多糖的氨基酸；可進(jìn)行易位的氨基酸；可進(jìn)行環(huán)加成的氨基酸；重原子取代的氨基酸；可化學(xué)切割和/或光切割的氨基酸；與天然氨基酸相比具有長(zhǎng)側(cè)鏈的氨基酸，例如聚醚或長(zhǎng)鏈烴，例如大于約5個(gè)或大于約10個(gè)碳；包含碳連接的糖的氨基酸；氧化還原活性氨基酸；包含氨基硫羰酸的氨基酸；包含藥物部分的氨基酸；及包含一個(gè)或多個(gè)毒性部分的氨基酸。除包含新的側(cè)鏈的非天然氨基酸外，非天然氨基酸還可選地包含例如式II和III的結(jié)構(gòu)所示的修飾的主鏈結(jié)構(gòu)：其中Z通常包含OH、NH.sub.2、SH、NH.sub.2O--、NH--R'、R'NH--、R'S—或S--R'--；X和Y（其可以相同或不同）通常包含S、N或O；R和R'（其可選地相同或不同）通常選自與上文針對(duì)具有式I的非天然氨基酸所述的R基的組成相同的列表，以及氫或(CH.sub.2).sub.x或天然氨基酸側(cè)鏈。例如，本文公開的非天然氨基酸可選地在式II和III所示的氨基或羧基中包含取代。此類非天然氨基酸包括但不限于：側(cè)鏈對(duì)應(yīng)于例如二十種天然氨基酸或?qū)?yīng)于非天然側(cè)鏈的α-羥酸、α-硫羰酸、α-氨基硫代羧酸或α-α-雙取代氨基酸。它們還包括但不限于：β-氨基酸或γ-氨基酸，如取代的β-丙氨酸和γ-氨基丁酸。此外，α-碳上的取代或修飾可選地包括L或D異構(gòu)體，如D-谷氨酸、D-丙氨酸、D-甲基-O-酪氨酸、氨基丁酸等。其他結(jié)構(gòu)備選包括環(huán)氨基酸，如脯氨酸類似物，以及3-、4-、6-、7-、8-和9-元環(huán)脯氨酸類似物。一些非天然氨基酸（如芳基鹵化物（對(duì)-溴苯丙氨酸、對(duì)-碘苯丙氨酸））提供萬(wàn)能的鈀催化的與乙炔或乙炔反應(yīng)物（acetylenereaction）的交聯(lián)反應(yīng)，其允許在芳基鹵化物和多種偶聯(lián)配偶體之間形成碳-碳、碳-氮和碳-氧鍵。例如，許多非天然氨基酸基于諸如酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸等的天然氨基酸。酪氨酸類似物包括對(duì)位取代的酪氨酸、鄰位取代的酪氨酸和間位取代的酪氨酸，其中該取代的酪氨酸包含乙?；⒈郊柞；?、氨基、肼、羥基胺、硫羥基、羧基、異丙基、甲基、C6-C20直鏈或支鏈烴、飽和或不飽和烴、O-甲基、聚醚基、硝基等。此外，還考慮多取代的芳基環(huán)。谷氨酰胺類似物包括但不限于：α-羥基衍生物、β-取代衍生物、環(huán)衍生物和酰胺取代的谷氨酰胺衍生物。示例性苯丙氨酸類似物包括但不限于：間位取代的苯丙氨酸，其中取代基包含羥基、甲氧基、甲基、烯丙基、乙?；?。非天然氨基酸的具體實(shí)例包括但不限于：鄰位、間位和/或?qū)ξ恍问降陌被峄虬被犷愃莆铮ǚ翘烊话被幔ǜ呦┍拾彼?、順式或反式巴豆基甘氨酸?,6,6-三氟-2-氨基己酸、2-aminopheptanoicacid、正纈氨酸、正亮氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、鄰-、間-或?qū)?甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙?；?GlcNAcβ-絲氨酸、L-Dopa、氟化苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、對(duì)-疊氮基苯丙氨酸、對(duì)-?；?L-苯丙氨酸、對(duì)-苯甲?；?L-苯丙氨酸、L-磷酸絲氨酸、膦酰絲氨酸、膦酰酪氨酸、對(duì)-碘-苯丙氨酸、鄰-、間-或?qū)?溴苯丙氨酸、2-、3-或4-吡啶基丙氨酸、對(duì)-碘苯丙氨酸、二氨基丁酸、氨基丁酸、苯并呋喃基丙氨酸、3-溴-酪氨酸、3-(6-氯吲哚基)丙氨酸、3-(6-溴吲哚基)丙氨酸、3-(5-溴吲哚基)丙氨酸、對(duì)-氯苯丙氨酸、對(duì)-乙炔基-苯丙氨酸、對(duì)-炔丙基-氧-苯丙氨酸、間-乙炔基-苯丙氨酸、6-乙炔基-色氨酸、5-乙炔基-色氨酸、(R)-2-氨基-3-(4-乙炔基-1H-吡咯-3-基)丙酸、疊氮基正亮氨酸、疊氮基高丙氨酸、對(duì)-乙?；奖彼帷?duì)-氨基-L-苯丙氨酸、高炔丙基甘氨酸、對(duì)-乙基-苯丙氨酸、對(duì)-乙炔基-苯丙氨酸、對(duì)-炔丙基-氧-苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、3-(2-萘基)丙氨酸、3-(1-萘基)丙氨酸、3-碘-酪氨酸、O-炔丙基-酪氨酸、高谷氨酰胺、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、3-硝基-L-酪氨酸、三-O-乙?；?GlcNAcβ-絲氨酸、L-Dopa、氟化苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、對(duì)-疊氮基-L-苯丙氨酸、對(duì)-?；?L-苯丙氨酸、對(duì)-乙?；?L-苯丙氨酸、間-乙酰基-L-苯丙氨酸、硒代甲硫氨酸、碲代甲硫氨酸、硒代半胱氨酸、炔苯丙氨酸、O-烯丙基-L-酪氨酸、O-(2-丙炔基)-L-酪氨酸、對(duì)-乙硫基羰基-L-苯丙氨酸、對(duì)-(3-氧代丁?；?-L-苯丙氨酸、對(duì)-苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸絲氨酸、膦酰絲氨酸、膦酰酪氨酸、高炔丙基甘氨酸、疊氮基高丙氨酸、對(duì)-碘-苯丙氨酸、對(duì)-溴-L-苯丙氨酸、二羥基-苯丙氨酸、二羥基-L-苯丙氨酸、對(duì)-硝基-L-苯丙氨酸、間-甲氧基-L-苯丙氨酸、對(duì)-碘-苯丙氨酸、對(duì)-溴苯丙氨酸、對(duì)-氨基-L-苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、三氟亮氨酸、正亮氨酸、4-、5-或6-氟-色氨酸、4-氨基色氨酸、5-羥基色氨酸、生物胞素、氨基羥基乙酸、間-羥基苯丙氨酸、間-烯丙基苯丙氨酸、間-甲氧基苯丙氨酸基團(tuán)、β-GlcNAc-絲氨酸、α-GalNAc-蘇氨酸、對(duì)-乙酰乙酰基苯丙氨酸、對(duì)-鹵-苯丙氨酸、硒代甲硫氨酸、乙基硫氨酸、S-亞硝基-高半胱氨酸、硫代-脯氨酸、3-噻吩基-丙氨酸、高-烯丙基-甘氨酸、三氟異亮氨酸、反式和順式-2-氨基-4-己烯酸、2-丁炔基-甘氨酸、烯丙基-甘氨酸、對(duì)-疊氮基-苯丙氨酸、對(duì)-氰基-苯丙氨酸、對(duì)-乙炔基-苯丙氨酸、六氟亮氨酸、1,2,4-三唑-3-丙氨酸、2-氟-組氨酸、L-甲基組氨酸、3-甲基-L-組氨酸、β-2-噻吩基-L-丙氨酸、β-(2-噻唑基)-DL-丙氨酸、高炔丙基甘氨酸（HPG）和疊氮基高丙氨酸（AHA）等。多種非限制性非天然氨基酸的結(jié)構(gòu)在圖中提供，例如US2003/0108885A1的圖29、30和31，該專利的全部?jī)?nèi)容在此引用作為參考。酪氨酸類似物包括對(duì)位取代的酪氨酸、鄰位取代的酪氨酸和間位取代的酪氨酸，其中該取代的酪氨酸包含乙?；?、苯甲?；?、氨基、肼、羥基胺、硫羥基、羧基、異丙基、甲基、C6-C20直鏈或支鏈烴、飽和或不飽和烴、O-甲基、聚醚基、硝基等。此外，還考慮多取代的芳基環(huán)。本發(fā)明的谷氨酰胺類似物包括但不限于：α-羥基衍生物、β-取代衍生物、環(huán)衍生物和酰胺取代的谷氨酰胺衍生物。苯丙氨酸類似物的實(shí)例包括但不限于：間位取代的苯丙氨酸，其中取代基包含羥基、甲氧基、甲基、烯丙基、乙?；取Ｙ嚢彼犷愃莆锇∟-σ取代的，如吡咯賴氨酸、N-σ-鄰-疊氮基芐氧基羰基-L-賴氨酸（AzZLys）、N-σ-炔丙氧基羰基-L-賴氨酸、N-σ-2-疊氮基乙氧基羰基-L-賴氨酸、N-σ-叔-丁氧基羰基-L-賴氨酸（BocLys）、N-σ-烯丙氧基羰基-L-賴氨酸（AlocLys）、N-σ-乙?；?L-賴氨酸（AcLys）、N-σ-芐氧基羰基-L-賴氨酸（ZLys）、N-σ-環(huán)戊氧基羰基-L-賴氨酸（CycLys）、N-σ-D-脯氨?；?L-賴氨酸、N-σ-煙酰-L-賴氨酸（NicLys）、N-σ-N-Me-氨茴酰-L-賴氨酸（NmaLys）、N-σ-生物素酰-L-賴氨酸、N-σ-9-芴基甲氧基羰基-L-賴氨酸、N-σ-甲基-L-賴氨酸、N-σ-二甲基-L-賴氨酸、N-σ-三甲基-L-賴氨酸、N-σ-異丙基-L-賴氨酸、N-σ-丹酰-L-賴氨酸、N-σ-鄰,對(duì)-二硝基苯基-L-賴氨酸、N-σ-對(duì)-甲苯磺酰-L-賴氨酸、N-σ-DL-2-氨基-2-羧乙基-L-賴氨酸、N-σ-苯基丙酮酰胺-L-賴氨酸、N-σ-丙酮酰胺-L-賴氨。此外，其他實(shí)例可選地包括（但不限于）：酪氨酸氨基酸的非天然類似物；谷氨酰胺氨基酸的非天然類似物；苯丙氨酸氨基酸的非天然類似物；絲氨酸氨基酸的非天然類似物；蘇氨酸氨基酸的非天然類似物；烷基、芳基、?；?、疊氮基、氰基、鹵、肼、酰肼、羥基、鏈烯基、炔基、醚、硫醇、磺?；⑽?、酯、硫羰酸、硼酸鹽、硼酸（boronate）、二氧磷基、膦?；?、膦、雜環(huán)、烯酮、亞胺、醛、羥基胺、酮、酮縮醇、縮醛、應(yīng)變環(huán)辛炔、應(yīng)變環(huán)烯、環(huán)丙烯、降冰片烯、氧化腈、β-甲硅烷基鏈烯基鹵化物、β-甲硅烷鏈烯基磺酸酯、吡喃酮、四嗪、噠嗪、烷氧基胺、芳基磺酸酯、芳基鹵化物、氨基硫脲、氨基脲、四唑、α-酮酸或氨基取代的氨基酸，或其任意組合；具有光活化交聯(lián)劑的氨基酸；自旋示蹤的氨基酸；縈光氨基酸；具有新的功能基團(tuán)的氨基酸；與另一分子共價(jià)或非共價(jià)相互作用的氨基酸；金屬結(jié)合的氨基酸；包含金屬的氨基酸；放射性氨基酸；photocaged氨基酸；光異構(gòu)化氨基酸；包含生物素或生物素類似物的氨基酸；糖基化或糖類修飾的氨基酸；包含酮的氨基酸；包含聚乙二醇的氨基酸；包含聚醚的氨基酸；重原子取代的氨基酸；可化學(xué)切割或可光切割的氨基酸；具有長(zhǎng)側(cè)鏈的氨基酸；包含毒性基團(tuán)的氨基酸；糖取代的氨基酸，例如糖取代的絲氨酸等；包含碳連接的糖的氨基酸；氧化還原活性氨基酸；包含α-羥基的酸；包含氨基硫羰酸的氨基酸；α、α雙取代的氨基酸；β-氨基酸；和環(huán)氨基酸。通常，可以選擇或設(shè)計(jì)本文用于某些實(shí)施方案的非天然氨基酸來(lái)提供在二十種天然氨基酸中不可得的附加特征。例如，可選地設(shè)計(jì)或選擇非天然氨基酸來(lái)修飾例如它們所摻入的蛋白質(zhì)的生物學(xué)性質(zhì)。例如，可選地通過(guò)在蛋白質(zhì)中納入非天然氨基酸來(lái)修飾以下性質(zhì)：毒性、生物分布、溶解性、穩(wěn)定性（例如熱穩(wěn)定性、水解穩(wěn)定性、氧化穩(wěn)定性、對(duì)酶降解的抗性等）、便于純化和處理、結(jié)構(gòu)性質(zhì)、光譜性質(zhì)、化學(xué)和/或光化學(xué)性質(zhì)、催化活性、氧化還原電位、半衰期、與其他分子反應(yīng)（例如共價(jià)或非共價(jià)）的能力等。氨基酸類似物的其他實(shí)例可選地包括（但不限于）：酪氨酸氨基酸的非天然類似物；谷氨酰胺氨基酸的非天然類似物；苯丙氨酸氨基酸的非天然類似物；絲氨酸氨基酸的非天然類似物；蘇氨酸氨基酸的非天然類似物；烷基、芳基、?；?、疊氮基、氰基、鹵、肼、酰肼、羥基、鏈烯基、炔基、醚、硫醇、磺?；⑽?、酯、硫羰酸、硼酸鹽、硼酸（boronate）、二氧磷基、膦?；㈧?、雜環(huán)、烯酮、亞胺、醛、羥基胺、酮、酮縮醇、縮醛、應(yīng)變環(huán)辛炔、應(yīng)變環(huán)烯、環(huán)丙烯、降冰片烯、氧化腈、β-甲硅烷基鏈烯基鹵化物、β-甲硅烷鏈烯基磺酸酯、吡喃酮、四嗪、噠嗪、烷氧基胺、芳基磺酸酯、芳基鹵化物、氨基硫脲、氨基脲、四唑、α-酮酸或氨基取代的氨基酸，或其任意組合；具有光活化交聯(lián)劑的氨基酸；自旋示蹤的氨基酸；縈光氨基酸；具有新的功能基團(tuán)的氨基酸；與另一分子共價(jià)或非共價(jià)相互作用的氨基酸；金屬結(jié)合的氨基酸；包含金屬的氨基酸；放射性氨基酸；photocaged氨基酸；光異構(gòu)化氨基酸；包含生物素或生物素類似物的氨基酸；糖基化或糖類修飾的氨基酸；包含酮的氨基酸；包含聚乙二醇的氨基酸；包含聚醚的氨基酸；重原子取代的氨基酸；可化學(xué)切割或可光切割的氨基酸；具有長(zhǎng)側(cè)鏈的氨基酸；包含毒性基團(tuán)的氨基酸；糖取代的氨基酸，例如糖取代的絲氨酸等；包含碳連接的糖的氨基酸；氧化還原活性氨基酸；包含α-羥基的酸；包含氨基硫羰酸的氨基酸；α、α雙取代的氨基酸；β-氨基酸；及除脯氨酸外的環(huán)氨基酸。適合用于本發(fā)明的方法的非天然氨基酸還包括具有附著于氨基酸側(cè)鏈的糖部分的那些。在實(shí)施方案中，具有糖部分的非天然氨基酸包括具有Man、GalNAc、Glc、Fuc或Gal部分的絲氨酸或蘇氨酸氨基酸。包括糖部分的非天然氨基酸的實(shí)例包括但不限于：例如，三-O-乙?；?GlcNAcβ-絲氨酸；β-O-GlcNAc-L-絲氨酸；三-O-乙?；?GalNAc-α-蘇氨酸；α-GalNAc-L-蘇氨酸；O-Man-L-絲氨酸；四-乙?；?O-Man-L-絲氨酸；O-GalNAc-L-絲氨酸；三-乙?；?O-GalNAc-L-絲氨酸；Glc-L-絲氨酸；四乙?；?Glc-L-絲氨酸；fuc-L-絲氨酸；三-乙?；?fuc-L-絲氨酸；O-Gal-L-絲氨酸；四-乙酰基-O-Gal-L-絲氨酸；β-O-GlcNAc-L-蘇氨酸；三-乙酰基-β-GlcNAc-L-蘇氨酸；O-Man-L-蘇氨酸；四-乙?；?O-Man-L-蘇氨酸；O-GalNAc-L-蘇氨酸；三-乙?；?O-GalNAc-L-蘇氨酸；Glc-L-蘇氨酸；四乙?；?Glc-L-蘇氨酸；fuc-L-蘇氨酸；三-乙?；?fuc-L-蘇氨酸；O-Gal-L-蘇氨酸；四-乙酰基-O-Gal-L-絲氨酸；β-N-乙酰葡糖胺-O-絲氨酸；α-N-乙酰半乳糖胺-O-蘇氨酸；縈光氨基酸，如包含萘基或丹?；?-氨基香豆素或7-羥基香豆素側(cè)鏈的那些；可光切割或可光異構(gòu)化的氨基酸，如包含偶氮苯或硝基芐基Cys、Ser或Tyr側(cè)鏈的那些；對(duì)-羧基-甲基-L-苯丙氨酸；高谷氨酰胺；2-氨基辛酸；對(duì)-疊氮基苯丙氨酸；對(duì)-苯甲?；奖彼?；對(duì)-乙?；奖彼?；間-乙酰基苯丙氨酸；2,4-二氨基丁酸（DAB）等。本發(fā)明包括以上的未保護(hù)和乙酰化的形式。（還見，例如，標(biāo)題為"RemodelingandGlycoconjugationofPeptides"的WO03/031464A2；標(biāo)題為"SaccharideCompositions,MethodsandApparatusfortheirsynthesis"的美國(guó)專利號(hào)6,331,418；Tang和Tirrell,J.Am.Chem.Soc.(2001)123:11089-11090；及Tang等,Angew.Chem.Int.Ed.,(2001)40:8；所有文獻(xiàn)在此以其整體引用作為參考）。上文提供的許多非天然氨基酸可從例如SigmaAldrich（美國(guó)）商業(yè)購(gòu)得?？蛇x地按US2004/138106A1（在此引用作為參考）的實(shí)施例中所提供或用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法合成不能商業(yè)購(gòu)得的那些。對(duì)于有機(jī)合成技術(shù)，見例如，F(xiàn)essendon和Fessendon的OrganicChemistry（1982,第2版,WillardGrantPress,BostonMass.）；March的AdvancedOrganicChemistry（第3版,1985,WileyandSons,NewYork）；Carey和Sundberg的AdvancedOrganicChemistry（第3版,A部分和B部分,1990,PlenumPress,NewYork）；及WO02/085923；所有文獻(xiàn)在此引用作為參考。例如，以WO02/085923中概述的方法（見例如該出版物的圖14）合成間位取代的苯丙氨酸。通常，將NBS（N-溴丁二酰亞胺）加入間位取代的甲苯化合物，產(chǎn)生間位取代的芐基溴化物，然后該芐基溴化物與丙二酸化合物反應(yīng)，產(chǎn)生間位取代的苯丙氨酸。用于間位的典型取代基包括但不限于酮、甲氧基、烷基、乙?；取＠?，通過(guò)使NBS與3-甲基苯乙酮的溶液反應(yīng)來(lái)制備3-乙?；?苯丙氨酸。更多詳情見下文實(shí)施例。用類似的合成來(lái)產(chǎn)生3-甲氧基苯丙氨酸。在這種情況下，芐基溴化物間位上的R基是--OCH.sub.3.（見例如Matsoukas等,J.Med.Chem.,1995,38,4660-4669，以其整體引入作為參考）。在一些情況下，已知的關(guān)于合成酶（例如，用來(lái)氨酰化外部突變體tRNA的外部突變體tRNA合成酶）的活性部位的信息使非天然氨基酸的設(shè)計(jì)出現(xiàn)偏差。例如，提供三類谷氨酰胺類似物，包括在酰胺氮上取代的衍生物（1）、γ位上是甲基的衍生物（2）及N-Cy環(huán)衍生物（3）?；诖竽c桿菌GlnRS（其中關(guān)鍵結(jié)合部位殘基與酵母GlnRS同源）的x射線晶體結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)類似物來(lái)彌補(bǔ)谷氨酰胺側(cè)鏈的10.ANG.shell內(nèi)的殘基的一系列側(cè)鏈突變，例如，可以通過(guò)增加Gln的Cy位上的空間體積來(lái)彌補(bǔ)活性部位Phe233突變?yōu)樾〉氖杷园被帷＠?，可選地用N-鄰苯二甲酰-L-谷氨酸1,5-酐（WO02/085923的圖23中的化合物編號(hào)4）來(lái)合成酰胺氮上具有取代基的谷氨酰胺類似物。（見例如King&Kidd,J.Chem.Soc.,3315-3319,1949；Friedman&Chatterrji,J.Am.Chem.Soc.81,3750-3752,1959；Craig等,J.Org.Chem.53,1167-1170,1988；和Azoulay等,Eur.J.Med.Chem.26,201-5,1991；所有文獻(xiàn)在此以其整體引入作為參考）。通常通過(guò)先作為鄰苯二甲酰亞胺保護(hù)胺，然后在乙酸中回流來(lái)從谷氨酰胺制備酐。然后用大量胺打開酐，在酰胺上產(chǎn)生一系列取代基。用肼脫保護(hù)鄰苯二甲?；a(chǎn)生WO2002/085923的圖23中所示的自由氨基酸。γ位上的取代通常通過(guò)烷化谷氨酸來(lái)達(dá)到。（見例如Koskinen&Rapoport,J.Org.Chem.54,1859-1866,1989，其在此引入作為參考）?？蛇x地通過(guò)先用9-溴-9-苯基芴（PhflBr）烷化氨基部分（見例如Christie&Rapoport,J.Org.Chem.1989,1859-1866,1985，其在此引入作為參考），然后用O-叔-丁基-N,N'-二異丙基異脲酯化酸部分來(lái)制備例如WO02/085923的圖24中的化合物編號(hào)5所示的受保護(hù)的氨基酸。KN(Si(CH.sub.3).sub.3).sub.2的加入?yún)^(qū)域選擇性地在甲酯的α位脫質(zhì)子，形成烯醇化物，然后可選地用一系列烷基碘烷化該烯醇化物。叔丁酯和Phf1基團(tuán)的水解產(chǎn)生希望的γ-甲基谷氨酰胺類似物（WO02/085923的圖24中的化合物編號(hào)2，該專利在此引入作為參考）?？蛇x地按之前所述以4個(gè)步驟從Boc-Asp-Ot-Bu制備WO02/085923的圖25中的化合物編號(hào)3所示的N-Cy環(huán)類似物。（見例如Barton等,TetrahedronLett.43,4297-4308,1987；和Subasinghe等,J.Med.Chem.354602-7,1992；每篇文獻(xiàn)在此引入作為參考）。如圖25中所示，產(chǎn)生N-t-Boc-吡咯烷酮、吡咯烷酮或惡唑烷酮的陰離子，然后加入化合物7，產(chǎn)生Michael加成產(chǎn)物。然后用TFA脫保護(hù)產(chǎn)生自由氨基酸?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法來(lái)合成三氟亮氨酸（Tfl）和六氟亮氨酸（Hfl）。例如，可以以分步的方式合成5',5',5'-三氟-DL-亮氨酸，首先用乙醇稀釋市售三氟甲基巴豆酸，并在催化劑的存在下氫化。然后，可以回流混合物，并蒸餾酯。然后，可以通過(guò)回流和蒸餾來(lái)衍生α-肟基-5',5',5'-三氟異己酸，然后再結(jié)晶5',5',5'-三氟-DL-亮氨酸。同樣，可以以多個(gè)步驟從六氟丙酮和溴丙酮酸乙酯制備(S)-5,5,5,5',5',5'-六氟亮氨酸，其包括通過(guò)發(fā)面酵母或通過(guò)利用oxazaborolidine催化劑的兒茶酚硼烷高度對(duì)映體選擇性地還原α-酮酸酯中的羰基。（更多細(xì)節(jié)見例如Rennert,Anker,Biochem.1963,2,471；Zhang等,Helv.Chim.Acta1998,81,174-181,R.,ProtSci.7:419-426(1998)；Hendrickson等,AnnualRev.Biochem.73:147-176(2004)；美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0030108885和20030082575；以及共同未決的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/571,810；所有文獻(xiàn)在此以其整體引入作為參考）。本公開的新穎性的一點(diǎn)涉及已摻入一個(gè)或多個(gè)氟化非天然氨基酸的富含亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的分子的提高的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性。同樣，可以通過(guò)已公開的方法來(lái)合成高炔丙基甘氨酸（HPG）和疊氮基高丙氨酸（AHA）。例如，按照Mangold等,Mutat.Res.,1989,216,27，在此以其整體引入作為參考。雙特異性構(gòu)建體的合成形成雙特異性劑的一般方法在實(shí)施方案中，可以按照以下方法制備本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體，該方法包括：（i）提供宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包含載體，該載體具有編碼抗-IL-6抗體或其衍生物的多核苷酸，該抗體或衍生物通過(guò)摻入至少一個(gè)非天然氨基酸來(lái)修飾；（ii）提供宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包含載體，該載體具有編碼抗-IL-23抗體或其衍生物的多核苷酸，該抗體或衍生物通過(guò)摻入至少一個(gè)非天然氨基酸來(lái)修飾；（iii）在使得宿主細(xì)胞表達(dá)該修飾的抗-IL-6抗體或其衍生物，和修飾的抗-IL-23抗體或其衍生物的條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞；（iv）分離該抗-IL-6抗體或其衍生物，和抗-IL-23抗體或其衍生物；（v）使該抗-IL-6抗體或其衍生物與該抗-IL-23抗體或其衍生物反應(yīng)，使得該抗-IL-6抗體或其衍生物通過(guò)各部分的非天然氨基酸之間的連接與該抗-IL-23抗體或其衍生物偶聯(lián)。還可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)制備本發(fā)明的雙特異性構(gòu)建體。這些包括體細(xì)胞雜交、化學(xué)偶聯(lián)和重組技術(shù)。體細(xì)胞雜交涉及兩種雜交瘤的融合及由產(chǎn)生的四源雜交瘤（quadroma）分泌的雙特異性劑的純化。已描述了兩種不同的方法：（1）兩個(gè)已建立的雜交瘤的融合產(chǎn)生四源雜交瘤（Milstein和Cuello,1983；Suresh等,1986）；及（2）一個(gè)已建立的雜交瘤與衍生自用第二抗原免疫的小鼠的淋巴細(xì)胞的融合產(chǎn)生三源雜交瘤（trioma）（Nolan和Kennedy,1990）。用于研發(fā)bsMAb的體細(xì)胞雜交涉及與用于制備雜交瘤的那些相似的方法。但是，兩種不同重鏈和兩種不同輕鏈在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的產(chǎn)生和隨機(jī)結(jié)合導(dǎo)致很大比例非功能性分子的組裝。需要開發(fā)復(fù)雜的純化技術(shù)來(lái)純化具有所需特異性的雙特異性劑，且這通常妨礙大規(guī)模制備用于臨床用途。但是，本發(fā)明提供用體細(xì)胞雜交制備的上文公開的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體。本領(lǐng)域已知的抗體的化學(xué)偶聯(lián)最初在近40年前實(shí)現(xiàn)。通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)兩種不同的多克隆抗體產(chǎn)生了第一種雙特異性多克隆抗體（Nisonoff和Rivers,1961）。此化學(xué)操作涉及在它們的內(nèi)部重鏈二硫鍵解離兩種不同抗體，并通過(guò)化學(xué)綴合交聯(lián)兩半分子。為了制備bsMAb，使用了與ε-氨基或鉸鏈區(qū)硫醇基反應(yīng)的大量雙功能試劑。這些交聯(lián)劑可以分為同雙功能試劑和異雙功能試劑兩類。同雙功能試劑與通過(guò)還原內(nèi)部重鏈二硫鍵產(chǎn)生的自由硫醇反應(yīng)。5,5-二硫代二(2-硝基苯甲酸)（DTNB）或鄰-亞苯基雙馬來(lái)酰亞胺（O-PDM）可以激活MAb的Fab’片段上的硫醇基。DTNB發(fā)揮作用來(lái)再生兩個(gè)Fab’之間的二硫鍵，而O-PDM發(fā)揮作用來(lái)在兩個(gè)Fab’之間形成硫醚鍵。通常，O-PDM的硫醚鍵可以比DTNB再生的二硫鍵更穩(wěn)定。異雙功能試劑可以在蛋白質(zhì)上引入使得該蛋白質(zhì)能夠與第二蛋白質(zhì)反應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)。已用N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶二硫)丙酸酯（SPDP）與伯氨基反應(yīng)來(lái)引入自由硫醇基。SPDP可以組合已暴露氨基的任意兩種蛋白質(zhì)，包括抗體和Fab’片段，不考慮種類或同種型。但是，此方法導(dǎo)致分子的隨機(jī)交聯(lián)，因此顯示批次與批次的變異和不想要的作用，如蛋白質(zhì)的變性和/或抗體活性的喪失。但是，本發(fā)明提供用化學(xué)偶聯(lián)制備的上文公開的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體。還可以用重組技術(shù)來(lái)制備雙特異性抗體。與通過(guò)化學(xué)交聯(lián)或兩個(gè)雜交瘤克隆的融合制備的常規(guī)雙特異性抗體相比，這類通過(guò)遺傳工程衍生的雙特異性抗體提供了幾個(gè)優(yōu)勢(shì)，包括大小上更好的控制和雙特異性劑的親和力。通過(guò)僅用可變結(jié)構(gòu)域作為構(gòu)件，重組抗體缺乏抗體的Fc區(qū)，因此不誘導(dǎo)Fc介導(dǎo)的免疫效應(yīng)子功能。過(guò)去幾年已研發(fā)了多種不同的重組雙特異性抗體形式。在它們之中，串聯(lián)單鏈Fv分子和雙抗體及其多種衍生物是最廣泛用于構(gòu)建重組雙特異性抗體的形式。在一個(gè)共同主題中，這些分子的構(gòu)建從識(shí)別不同抗原的兩種單鏈Fv（scFv）片段（通過(guò)肽接頭連接的免疫球蛋白重鏈和輕鏈的可變區(qū)）開始。串聯(lián)scFv分子（taFv）代表用附加的肽接頭簡(jiǎn)單連接兩個(gè)scFv分子的直接形式。存在于這些串聯(lián)scFv分子中的兩個(gè)scFv片段形成分開的折疊實(shí)體。因此，可以用多種接頭來(lái)連接兩個(gè)scFv片段，已報(bào)道了長(zhǎng)度為至多63個(gè)殘基的接頭。雖然親本scFv片段可以在細(xì)菌中以可溶形式正常表達(dá)，但是，常觀察到串聯(lián)scFv分子在細(xì)菌中形成不可溶聚集體。因此，重折疊流程或哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的使用常應(yīng)用于產(chǎn)生可溶性串聯(lián)scFv分子。因此，本發(fā)明提供用上文詳述的重組技術(shù)制備的上文公開的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體。在上述優(yōu)選制備方法中，該非天然氨基酸在連接前包含氮化物、氰基、氧化腈、炔、烯、應(yīng)變環(huán)辛炔、應(yīng)變環(huán)烯、環(huán)丙烯、降冰片烯或芳基、烷基或乙烯基鹵化物、酮、醛、酮縮醇、縮醛、肼、酰肼、烷氧基胺、硼酸、有機(jī)錫、有機(jī)硅、β-甲硅烷基鏈烯基鹵化物、β-甲硅烷鏈烯基磺酸酯、吡喃酮、四嗪、噠嗪、芳基磺酸酯、氨基硫脲、氨基脲、四唑、α-酮酸基團(tuán)。該非天然氨基酸可以是疊氮基高丙氨酸、高炔丙基甘氨酸、高烯丙基甘氨酸、對(duì)-溴苯丙氨酸、對(duì)-碘苯丙氨酸、疊氮基苯丙氨酸、乙酰基苯丙氨酸或乙炔基苯丙氨酸、含有內(nèi)部烯（如反式-巴豆烯）的氨基酸、絲氨酸烯丙醚、烯丙基甘氨酸、炔丙基甘氨酸、或乙烯基甘氨酸、吡咯賴氨酸、N-σ-鄰-疊氮基芐氧基羰基-L-賴氨酸（AzZLys）、N-σ-炔丙氧基羰基-L-賴氨酸、N-σ-2-疊氮基乙氧基羰基-L-賴氨酸、N-σ-叔-丁氧基羰基-L-賴氨酸（BocLys）、N-σ-烯丙氧基羰基-L-賴氨酸（AlocLys）、N-σ-乙?；?L-賴氨酸（AcLys）、N-σ-芐氧基羰基-L-賴氨酸（ZLys）、N-σ-環(huán)戊氧基羰基-L-賴氨酸（CycLys）、N-σ-D-脯氨?；?L-賴氨酸、N-σ-煙酰-L-賴氨酸（NicLys）、N-σ-N-Me-氨茴酰-L-賴氨酸（NmaLys）、N-σ-生物素酰-L-賴氨酸、N-σ-9-芴基甲氧基羰基-L-賴氨酸、N-σ-甲基-L-賴氨酸、N-σ-二甲基-L-賴氨酸、N-σ-三甲基-L-賴氨酸、N-σ-異丙基-L-賴氨酸、N-σ-丹酰-L-賴氨酸、N-σ-鄰,對(duì)-二硝基苯基-L-賴氨酸、N-σ-對(duì)-甲苯磺酰-L-賴氨酸、N-σ-DL-2-氨基-2-羧乙基-L-賴氨酸、N-σ-苯基丙酮酰胺-L-賴氨酸、N-σ-丙酮酰胺-L-賴氨酸。例如，在上述優(yōu)選制備方法中，該非天然氨基酸在連接前包含氮化物、炔、烯、或芳基、烷基或乙烯基鹵化物、酮、醛、肼、酰肼、烷氧基胺、硼酸、有機(jī)錫、有機(jī)硅基團(tuán)。該非天然氨基酸可以是疊氮基高丙氨酸、高炔丙基甘氨酸、高烯丙基甘氨酸、對(duì)-溴苯丙氨酸、對(duì)-碘苯丙氨酸、疊氮基苯丙氨酸、乙?；奖彼峄蛞胰不奖彼帷⒑袃?nèi)部烯（如反式-巴豆烯）的氨基酸、絲氨酸烯丙醚、烯丙基甘氨酸、炔丙基甘氨酸或乙烯基甘氨酸。在上述優(yōu)選制備方法中，用于將第一部分與第二部分偶聯(lián)的反應(yīng)是[3+2]偶極環(huán)加成或Click反應(yīng)、Heck反應(yīng)、Sonogashira反應(yīng)、Suzuki反應(yīng)、Stille偶聯(lián)、Hiyama/Denmark反應(yīng)、烯烴復(fù)分解反應(yīng)、Diels-alder反應(yīng)、或羰基與肼、酰肼、烷氧基胺或羥基胺縮合。二價(jià)雙特異性構(gòu)建體和抗體的PEG化本領(lǐng)域已知的重組雙特異性抗體的缺點(diǎn)之一是它們?cè)隗w內(nèi)的循環(huán)時(shí)間短。雙抗體、單鏈雙抗體和串聯(lián)scFv分子具有50-60kDa的分子量，這可以導(dǎo)致這些實(shí)體通過(guò)外滲、蛋白酶解和腎排出從循環(huán)快速清除這些實(shí)體。這些實(shí)體的示例性起始半衰期（t1/2α）低于30分鐘。已采取幾種方法來(lái)改善重組抗體的藥物動(dòng)力學(xué)。一種方法是增加這些分子的大小。還可以通過(guò)改變連接可變結(jié)構(gòu)域的接頭的長(zhǎng)度來(lái)產(chǎn)生分子量為100-115kDa的二聚體單鏈雙抗體分子。其他方法依賴于雙特異性劑與具有長(zhǎng)半衰期的血清蛋白質(zhì)的結(jié)合。這些包括雙特異性抗體與人血清白蛋白（HSA）、HSA結(jié)合肽或衍生自天然具有長(zhǎng)半衰期的激素的肽的融合。這類方法可以應(yīng)用于本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體。但是，本發(fā)明還提供聚乙二醇聚合物（PEG）的用途，本文首次顯示其在延長(zhǎng)本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體的半衰期中尤其有利。PEG具有希望在最終的雙特異性產(chǎn)物中得到并解決scFv所特有的問題的幾種化學(xué)性質(zhì)。PEG化應(yīng)改善蛋白質(zhì)溶解性并提高scFv穩(wěn)定性，從而減少scFv聚集和沉淀。此外，諸如PEG的長(zhǎng)和柔性的接頭增加了兩個(gè)抗體片段的物理分隔，允許它們相互獨(dú)立地重折疊。這解決了通過(guò)遺傳融合連接的雙特異性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重折疊中常出現(xiàn)的問題之一（即，兩種組成抗體之間不受控和不希望的交聯(lián)）。通常通過(guò)諸如賴氨酸、半胱氨酸和組氨酸殘基的反應(yīng)位點(diǎn)來(lái)將PEG聚合物共價(jià)連接至生物分子。但是，為了達(dá)到最佳穩(wěn)定性，需要緊密控制附著于靶分子的聚合物的量。PEG聚合物與蛋白質(zhì)中反應(yīng)位點(diǎn)的綴合常產(chǎn)生PEG修飾的蛋白質(zhì)的異質(zhì)混合物，其可以導(dǎo)致亞適的穩(wěn)定化和半衰期延長(zhǎng)，以及PEG反應(yīng)位點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)活性重要（例如，它們定位在受體結(jié)合部位中或附近）時(shí)聚合物修飾的蛋白質(zhì)的生物活性可能的喪失。本發(fā)明通過(guò)將二價(jià)雙特異性構(gòu)建體的組成抗體改造為在具體位置包含非天然氨基酸，并使PEG與這些非天然氨基酸反應(yīng)來(lái)提供此問題的解決方案。PEG接頭的使用還由于可以使用的化學(xué)合成的通用性而比上文詳述的那些更有利。PEG可以容易地功能化為與摻入scFv蛋白質(zhì)中的任意非天然氨基酸互補(bǔ)的反應(yīng)配偶體。PEG還可以功能化為具有多個(gè)綴合位點(diǎn)，其使得能夠構(gòu)建多價(jià)蛋白質(zhì)雜化物。取決于希望的綴合化學(xué)，可以用同雙功能或異雙功能PEG進(jìn)行PEG功能化。此外，可以使PEG的結(jié)構(gòu)適應(yīng)于線性或分支變異，其可以影響藥物動(dòng)力學(xué)和生物活性。下文進(jìn)一步討論這些PEG化二價(jià)雙特異性構(gòu)建體的制備?？梢酝ㄟ^(guò)用接頭綴合兩個(gè)不同的scFv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域來(lái)構(gòu)建雙特異性scFv。此策略可以以兩步法實(shí)現(xiàn)，其中每個(gè)scFv與雙功能接頭綴合。包含雙特異性綴合物的兩個(gè)scFv各在作為特異性綴合位點(diǎn)的位置上包含至少一個(gè)非天然氨基酸（例如Aha）。接頭可以是同雙功能或異雙功能，且含有與包含在scFv中的非天然氨基酸（Aha）反應(yīng)的互補(bǔ)官能團(tuán)（例如炔）。然后以下反應(yīng)流程可應(yīng)用于產(chǎn)生雙特異性scFv（流程1見下）流程1用來(lái)將scFv與接頭綴合的化學(xué)品與20種天然氨基酸正交。在scFv-PEG綴合物和雙特異性劑的制備中，此處使用氮化物-炔銅介導(dǎo)環(huán)加成。在典型順序中，使包含疊氮基高丙氨酸（Aha）的scFv與用炔功能化的過(guò)量同雙功能PEG接頭反應(yīng)。有限過(guò)量的PEG下的主要產(chǎn)物是單價(jià)PEG化scFv，然后對(duì)其進(jìn)行純化。PEG接頭的自由側(cè)炔與包含Aha的第二scFv進(jìn)行第二次銅介導(dǎo)的氮化物-炔環(huán)加成，產(chǎn)生雙特異性劑。氮化物-炔銅介導(dǎo)環(huán)加成（Meldal和2008；Kolb等2001）以及烯-芳基鹵化物鈀介導(dǎo)Heck反應(yīng)已廣泛應(yīng)用于聚合物、毒素或肽與靶蛋白質(zhì)的位點(diǎn)特異性綴合。銅介導(dǎo)的環(huán)加成反應(yīng)與全部天然氨基酸完全正交，使得此化學(xué)品不能用來(lái)修飾生物分子，除非可以引入包含非天然的氮化物或炔的部分。這樣做時(shí)，該化學(xué)品僅出現(xiàn)在該氮化物或炔的位置上。氮化物和炔可以引入蛋白質(zhì)作為天然氨基酸的類似物，提供用于生物綴合的具體位置。如其他地方所指出，可以可選地通過(guò)PEG化修飾抗-IL-6和抗-IL-23或其衍生物（包括抗-IL-23/IL-12抗體或其衍生物）來(lái)提高半衰期。可以通過(guò)類似的方法來(lái)達(dá)到抗-IL-6和抗-IL-23或其衍生物的PEG化。適宜地，用于本發(fā)明的雙特異性構(gòu)建體和抗體中的PEG基團(tuán)和PEG接頭具有2-200kDa、例如5-60kDa、例如10-40kDa、如約20或約40kDa的分子量。PEG基團(tuán)和接頭可以是直鏈或支鏈。藥物組合物根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體和可藥用載體的藥物組合物和試劑盒。在一些實(shí)施方案中，該藥物組合物或試劑盒進(jìn)一步包含另一成分，如成像試劑或治療劑。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該藥物組合物或試劑盒用于診斷或治療方法。藥物組合物可以是例如包含諸如氯化鈉、糖、氨基酸、表面活性劑等的常規(guī)賦形劑的水性制劑，例如水溶液。藥物組合物還可以是適合通過(guò)加入水或鹽水來(lái)重建的凍干產(chǎn)品。治療方法根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體在治療中的用途。具體而言，本發(fā)明提供TH17、TH22和TH1介導(dǎo)的疾病以及這些TH細(xì)胞的組合介導(dǎo)的疾病的治療。這類可以用本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體治療的疾病的實(shí)例包括炎性和自身免疫性障礙，如多發(fā)性硬化、銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、尋常性天皰瘡、器官移植排斥、克隆病、炎性腸?。↖BD）、腸易激綜合癥（IBS）、紅斑狼瘡和糖尿病。TH17介導(dǎo)的疾病的其他實(shí)例包括肌萎縮性側(cè)索硬化癥或ALS（洛蓋赫里格病）、強(qiáng)直性脊柱炎、Asperger綜合癥、背痛、巴雷特食管、雙向精神障礙、心律失常、乳糜瀉、慢性疲勞綜合癥（CFS/CFIDS/,E）、慢性萊姆?。ㄊ杪菪w病）、克隆病、尿崩癥、I型糖尿病、II型糖尿病、癡呆、抑郁、癲癇、纖維肌痛（FM）、胃食管反流病（GERD）、橋本甲狀腺炎、腸易激綜合癥（IBS）、間質(zhì)性膀胱炎（IC）、炎性腸病、腸易激綜合癥、腎結(jié)石、洛夫格雷恩綜合癥、紅斑狼瘡、躁狂癥、多化學(xué)品過(guò)敏（MCS）、偏頭痛、Morgellon's、多發(fā)性硬化、重癥肌無(wú)力、神經(jīng)病、強(qiáng)迫性障礙（OCD）、骨關(guān)節(jié)炎、驚恐發(fā)作、帕金森病、風(fēng)濕性多發(fā)性肌痛、體位性心動(dòng)過(guò)速綜合癥（POTS）、前列腺炎、銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、雷諾綜合癥/現(xiàn)象、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎（萊特爾綜合癥）、下肢不寧綜合癥、反射交感性營(yíng)養(yǎng)不良（RSD）、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、硬皮病、全鼻竇炎、季節(jié)性情感障礙（SAD）、舍格倫綜合癥、潰瘍性結(jié)腸炎、葡萄膜炎和眩暈。其他疾病包括來(lái)自膿毒病或出血熱的細(xì)胞因子風(fēng)暴、膽汁性肝硬化、斯蒂爾病、COPD、Grave眼病、perionditis、貝赫切特病、哮喘、特應(yīng)性皮炎、化膿性汗腺炎、巨細(xì)胞動(dòng)脈炎和心臟纖維化。TH22介導(dǎo)的疾病的其他實(shí)例包括慢性炎性疾病，如濕疹、硬皮病、哮喘和COPD。因此，在實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療TH17介導(dǎo)的疾病的方法，其包括對(duì)患者施用治療有效量的本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體用于治療TH17介導(dǎo)的疾病。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體在制備用于治療TH17介導(dǎo)的疾病的藥物中的用途。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療TH22細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的方法，其包括對(duì)患者施用治療有效量的本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體用于治療TH22細(xì)胞介導(dǎo)的疾病。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體在制備用于治療TH22細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的藥物中的用途。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療TH17和TH1細(xì)胞二者介導(dǎo)的疾病的方法，其包括對(duì)患者施用治療有效量的本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體用于治療TH17和TH1二者介導(dǎo)的疾病。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體在制備用于治療TH17和TH1二者介導(dǎo)的疾病的藥物中的用途。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療TH17介導(dǎo)的疾病的方法，其包括對(duì)患者施用治療有效量的本發(fā)明的抗-IL-6和抗-IL-23抗體或其衍生物的組合。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的抗-IL-6和抗-IL-23抗體或其衍生物的組合用于治療TH17介導(dǎo)的疾病。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的抗-IL-6和抗-IL-23抗體或其衍生物的組合在制備用于治療TH17介導(dǎo)的疾病的藥物中的用途。因此，在實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療TH22細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的方法，其包括對(duì)患者施用治療有效量的本發(fā)明的抗-IL-6和抗-IL-23抗體或其衍生物的組合。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的抗-IL-6和抗-IL-23抗體或其衍生物的組合用于治療TH22細(xì)胞介導(dǎo)的疾病。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的抗-IL-6和抗-IL-23抗體或其衍生物的組合在制備用于治療TH22細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的藥物中的用途。因此，在實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療TH17和TH1二者介導(dǎo)的疾病的方法，其包括對(duì)患者施用治療有效量的本發(fā)明的抗-IL-6和抗-IL-23抗體或其衍生物的組合。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的抗-IL-6和抗-IL-23抗體或其衍生物的組合用于治療TH17和TH1二者介導(dǎo)的疾病。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的抗-IL-6和抗-IL-23抗體或其衍生物的組合在制備用于治療TH17和TH1二者介導(dǎo)的疾病的藥物中的用途。本發(fā)明還提供治療其病因具有TH17和TH22成分二者的疾病的方法。此外，本發(fā)明的待治療的疾病的病因可以涉及全部三種TH17、TH22和TH1細(xì)胞。在上文所列的每個(gè)實(shí)施方案中，抗-IL-23抗體或其衍生物可以是抗-IL-23/IL-12抗體。劑量方案在本發(fā)明的另一方面，與本領(lǐng)域目前可得的療法相比，可以按有利地低的劑量對(duì)患者施用本發(fā)明的用于治療的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體、抗體和抗體組合，同時(shí)仍達(dá)到相同的療效。通過(guò)本文公開的抗體的更高的活性來(lái)便于更低的劑量，且可能降低副作用的發(fā)生率。備選地，如果希望更高的活性，則可以按與本領(lǐng)域目前可得的療法相比等同或更高的劑量對(duì)患者施用本發(fā)明的用于治療的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體、抗體和抗體組合。這類更高的劑量可以便于降低對(duì)患者施用二價(jià)雙特異性構(gòu)建體、抗體和抗體組合的頻率。在實(shí)施方案中，本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體、抗體和抗體組合可以每月、每?jī)稍?、每周、每?jī)芍?、每天、每?jī)商焓┯?。用于測(cè)定IL-6、IL-23和IL-23/IL-12抗體親和力和生物學(xué)活性的測(cè)定抗體親和力的測(cè)定可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法測(cè)定抗體親和力。為了測(cè)定抗體是否具有希望的親和力，使得它們可能適合包含在本發(fā)明的二價(jià)雙特異性抗體中的目的，提供以下詳述的測(cè)定方法，但應(yīng)理解，對(duì)于待進(jìn)行的相同測(cè)定，將允許該方法的小變動(dòng)（例如，在不同但相似的儀器或不同品牌的常用試劑的使用中）。平衡解離常數(shù)可以通過(guò)使用SensiQPioneer（ICxNomadics,Stillwater,OK）和適合于胺偶聯(lián)的羧化COOH1傳感器（Ibid）的表面等離振子共振來(lái)測(cè)定。用胺偶聯(lián)試劑（SigmaAldrich（N-羥基琥珀酰亞胺（NHS，56480）、N-(3-二甲基氨基丙基)-B’-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC,E7750））；乙醇胺（398136）,St.Louis,MO）或用Biacore胺偶聯(lián)試劑盒（BR-1000-50,GEHealthcare,Waukesha,WI）將G蛋白（6510-10,Biovision,MountainView,CA）偶聯(lián)至COOH1傳感器。簡(jiǎn)言之，以2-10分鐘之間的接觸時(shí)間用2mMEDC和.5mMNHS活化羧化表面。按20-400ug/mL之間的不同濃度將G蛋白稀釋入10mM乙酸緩沖液pH4.3（乙酸鈉，BP334-1；冰醋酸，A490-212；ThermoFisherScientific,Waltham,MA）中，并按5-10μL/分鐘的速率注射在活化的傳感器上5和10分鐘之間的不同接觸時(shí)間。固定至COOH1傳感芯片的G蛋白的量在400-2000反應(yīng)單位（RU）的范圍內(nèi)。應(yīng)以25μL/分鐘的流速用100μL乙醇胺覆蓋剩余活化位點(diǎn)?？梢酝ㄟ^(guò)將mAb與G蛋白包被的芯片結(jié)合，然后將各分析物（IL-6或IL-23）與其各自的mAb結(jié)合來(lái)測(cè)定兔人嵌合mAb的平衡常數(shù)。為了最小化傳質(zhì)效應(yīng)，應(yīng)調(diào)節(jié)各分析物的mAb的表面密度，使得分析物結(jié)合接近飽和，它的對(duì)應(yīng)的RU落在200和300之間。將1至100nM的3x-FLAG-IL-6（見實(shí)施例1）、IL-6（CYT-213,Prospec-TanyTechnogene,Rehovot,以色列）或人嵌合IL-23（34-8239,eBiosciences,SanDiego,CA）稀釋液注射在芯片表面上，并測(cè)量結(jié)合（Ka）和解離（Kd）速率常數(shù)。對(duì)于每個(gè)結(jié)合和解離循環(huán)，應(yīng)用15uL20mMNaOH（5671-02,MallinckrodtBaker,Philliphsburg,NJ）再生芯片表面。測(cè)定溫度應(yīng)維持在25℃，分析物流速為50μL/分鐘，包含2分鐘結(jié)合期和10-30分鐘解離期。可以用上述形式連同準(zhǔn)一級(jí)（pseudo-first-order）1:1相互作用模型軟件（Qdat,ICxNomadics,Stillwater,OK）來(lái)測(cè)定結(jié)合速率/解離速率（ka/kd）和解離常數(shù)（KD）?？梢园粗八鰷y(cè)定scFv的平衡常數(shù)；條件是應(yīng)修改流程，使得表位標(biāo)記的IL-6捕獲在芯片表面上，并監(jiān)測(cè)抗-IL-6scFv從IL-6的解離。簡(jiǎn)言之，使抗M2抗體（200472,AgilentTechnologies,SantaClara,CA）結(jié)合于G蛋白，然后通過(guò)抗-FLAG抗體來(lái)捕獲3xFLAG-IL-6。應(yīng)在1和100nM之間的一系列濃度測(cè)定抗-IL-6scFv。雙特異性scFv的SPR按之前針對(duì)測(cè)量抗-IL-6部分所述進(jìn)行雙特異性scFv的SPR；條件是修改流程來(lái)同時(shí)測(cè)定在雙特異性劑的另一端附著的抗-IL-23scFv（31A12）的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。簡(jiǎn)言之，通過(guò)首先以恒定密度（～240RU）按所述用IL-6固定雙特異性劑來(lái)進(jìn)行雙特異性劑對(duì)IL-23的結(jié)合。用上文詳述的相同參數(shù)以3至25nM的濃度測(cè)定重組人二聚體IL-23（34-8239,eBiosciences,SanDiego,CA）的結(jié)合和解離。IL-6活性的測(cè)定可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法測(cè)定抗體及其衍生物調(diào)節(jié)IL-6活性的能力。為了測(cè)定抗體是否具有希望的調(diào)節(jié)IL-6活性的能力，使得它們可能適合包含在本發(fā)明的二價(jià)雙特異性抗體中的目的，提供以下詳述的測(cè)定方法，但應(yīng)理解，對(duì)于待進(jìn)行的相同測(cè)定，將允許該方法的小變動(dòng)（例如，在不同但相似的儀器或不同品牌的常用試劑的使用中）。可以用ELISA來(lái)評(píng)價(jià)IL-6結(jié)合。將100μl含0.25μg/ml重組IL-6（見實(shí)施例1）的PBS加入ELISA平板。應(yīng)在37℃孵育平板1小時(shí)或在4℃孵育過(guò)夜。應(yīng)向每個(gè)孔中加入100μl/孔的含10%山羊血清（Cat#16210-072,Invitrogen,美國(guó)）的PBS來(lái)封閉。然后應(yīng)在室溫孵育平板1小時(shí)。然后應(yīng)用去離子水漂洗平板5次。向每個(gè)孔中加入50μlPBS/10%山羊血清。然后按50μl/孔加入測(cè)試樣品。然后應(yīng)在室溫孵育平板1小時(shí)。然后應(yīng)用去離子水漂洗平板5次。向每個(gè)孔中加入100μl1:5000稀釋在PBS/10%山羊血清中的過(guò)氧化物酶綴合的山羊抗-兔IgG（Cat.#111-035-008,JacksonImmunoResearch）。然后應(yīng)在室溫孵育平板1小時(shí)，然后用去離子水洗滌5次。按100μl/孔加入TMB底物（ThermoScientific,Rockford,IL.,美國(guó)）。然后應(yīng)用100μl1NH2SO4（JTBaker,Phillipsburg,NJ,美國(guó)）終止反應(yīng)。然后可以用MolecularDevicesM2酶標(biāo)儀在450nm測(cè)量吸光度?？梢杂蒙餃y(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)IL-6抑制（圖3），該生物測(cè)定使用依賴于IL-6的鼠B細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞系（B9細(xì)胞系；Aarden等,1987）。應(yīng)將待測(cè)試中和活性的樣品稀釋在96孔組織培養(yǎng)板中的100μl測(cè)定培養(yǎng)基（RPMI1640w/L-谷氨酰胺，10%FBS、非必需氨基酸、丙酮酸鈉，50μM2-巰基乙醇）中。然后加入50μl含IL-6（Cat.#CYT-274Prospec-TanyTechnogene）的測(cè)定培養(yǎng)基，并在室溫孵育30分鐘。然后從細(xì)胞培養(yǎng)瓶(flask)回收B9細(xì)胞，并在180Xg離心7分鐘，沉淀重懸在不含IL-6的培養(yǎng)基（RPMI1640w/L-谷氨酰胺，10%FBS、非必需氨基酸、丙酮酸鈉，50μM2-巰基乙醇）中。應(yīng)離心和重懸細(xì)胞三次來(lái)去除IL-6。通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排除測(cè)定生存力后，應(yīng)將細(xì)胞調(diào)節(jié)至1X105細(xì)胞/ml。應(yīng)向各孔連同包含無(wú)IL-6培養(yǎng)基的對(duì)照孔中加入50μl體積的B9細(xì)胞（對(duì)應(yīng)于5X103個(gè)細(xì)胞）。然后應(yīng)在37℃、5%CO2孵育平板48小時(shí)。隨后，應(yīng)向每個(gè)孔中加入20μlAlamarBlue（Cat#DAL1100,Invitrogen,美國(guó)），并再孵育平板18小時(shí)。然后可以在MolecularDevices（Sunnyvale,CA,美國(guó)）M2酶標(biāo)儀上在570和600nm讀板。IL-23活性的測(cè)定可以用ELISA測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)IL-23結(jié)合（Aggarwal等,2003）。用直接或間接結(jié)合IL-23的方法包被ELISA平板。對(duì)于間接結(jié)合法，應(yīng)向平板中加入100ml/孔含0.01-0.02ug/ml抗-His抗體（Cat#A00613,GenScriptCorp.,NewJersey,美國(guó)）的PBS。然后應(yīng)在37℃孵育平板1小時(shí)或在4℃孵育過(guò)夜。應(yīng)向各孔中加入100ml/孔含10%山羊血清（Cat#16210-072,Invitrogen,美國(guó)）的PBS來(lái)封閉非特異性結(jié)合，然后應(yīng)用去離子水漂洗平板5次。應(yīng)加入100ml/孔含0.5mg/ml的IL-23p40-p19-His（SEQID4）的PBS/10%山羊血清，并在室溫孵育平板1小時(shí)。對(duì)于直接結(jié)合法，應(yīng)向ELISA平板中加入100ml含0.5mg/ml的IL-23p40-p19-His（SEQIDNO.4）的PBS。然后應(yīng)在37℃孵育平板1小時(shí)或在4℃孵育過(guò)夜。應(yīng)向各孔中加入100ml/孔含10%山羊血清（Cat#16210-072,Invitrogen,美國(guó)）的PBS來(lái)封閉非特異性結(jié)合。然后應(yīng)在室溫孵育平板1小時(shí)。IL-23結(jié)合后，應(yīng)用去離子水漂洗平板5次。應(yīng)向每個(gè)孔中加入50mlPBS/10%山羊血清。然后應(yīng)按50ml/孔加入測(cè)試樣品。然后應(yīng)在室溫孵育平板1小時(shí)，并用去離子水漂洗5次。然后應(yīng)向每個(gè)孔中加入100ml1:5000稀釋在PBS/10%山羊血清中的過(guò)氧化物酶綴合的山羊抗-兔IgG（Cat.#111-035-008,JacksonImmunoResearch）。然后應(yīng)在室溫孵育平板1小時(shí)，然后用去離子水洗滌5次。按100ml/孔加入TMB底物（ThermoScientific,Rockford,IL.,美國(guó)）。然后應(yīng)用100ml1NH2SO4（JTBaker,Phillipsburg,NJ,美國(guó)）終止反應(yīng)。然后可以用MolecularDevicesM2酶標(biāo)儀在450nm測(cè)量吸光度?？梢杂蒙餃y(cè)定來(lái)檢測(cè)抗體介導(dǎo)的IL-23與IL-23受體的結(jié)合及產(chǎn)生的生物活性的抑制，該生物測(cè)定基于IL-23誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞表達(dá)IL-17的檢測(cè)。應(yīng)將5x105C57Bl/6脾細(xì)胞在200ml包含異二聚體IL-23（eBiosciencecat.#14-8239或Humanzyme,Chicago,美國(guó)cat.#HZ-1049）稀釋液中培養(yǎng)于96孔板的孔中，并在37℃孵育平板2-3天。所用培養(yǎng)基應(yīng)是RPMI1640、10%FBS、50uM2-巰基乙醇、非必需氨基酸、丙酮酸、慶大霉素和10ng/ml人IL-2（Cat#CYT-209,Prospec-TanyTechnogene）。3天后，應(yīng)按下文所述通過(guò)ELISA測(cè)定培養(yǎng)物上清的IL-17A?？梢杂肊LISA測(cè)定來(lái)檢測(cè)小鼠IL-17。用含1mg/ml抗-mIL-17A（eBioscience#14-7178）的100mlPBS包被平板，并在4℃孵育過(guò)夜或在37℃孵育1小時(shí)。應(yīng)在去離子水中洗滌平板，并用100mlPBS/10%山羊血清封閉1小時(shí)。洗滌平板后，應(yīng)向平板中加入50mlPBS/10%山羊血清和50ml培養(yǎng)物上清，并孵育1小時(shí)。然后應(yīng)洗滌平板，加入100ml/孔含0.5mg/ml抗-mIL-17A-生物素（eBioscience#13-7179）的PBS/10%山羊血清，并在室溫孵育平板1小時(shí)。然后應(yīng)洗滌平板，并與100ml/孔的1:1000稀釋在PBS/10%山羊血清中的鏈霉抗生物素蛋白-HRP（JacksonLabs）反應(yīng)。應(yīng)再次洗滌平板，并通過(guò)加入100ml/孔TMB底物（ThermoScientific,IL,美國(guó)）來(lái)檢測(cè)信號(hào)。用100ml/孔1NH2SO4終止反應(yīng)后，可以在450nM讀取光密度。IL-12（p40）活性的測(cè)定此外，由于IL-23的p40亞基也形成涉及TH1信號(hào)傳導(dǎo)途徑的IL-12的部分，本文公開利用它們調(diào)節(jié)IFN-γ（TH1細(xì)胞活性的產(chǎn)物）水平的能力來(lái)測(cè)量它們對(duì)IL-12的中和能力的測(cè)定。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到適于測(cè)定抗體的中和作用及其對(duì)IFN-γ產(chǎn)生的影響的測(cè)定法，但是，提供以下測(cè)定作為適宜的測(cè)定的實(shí)例。可以用IL-12反應(yīng)細(xì)胞系NK-92（CRL-2407,ATCC,Manassas,Virginia,美國(guó)）測(cè)定抗體的p40中和能力。應(yīng)將50ml來(lái)自B細(xì)胞克隆平板的培養(yǎng)物上清或50ml來(lái)自抗體轉(zhuǎn)染的上清轉(zhuǎn)移至96孔組織培養(yǎng)板。應(yīng)向每個(gè)孔中加入50ml4ng/ml的人IL-12（Cat.#Cyt-362,Prospec-TanyTechnogene,Rehovot,以色列）。然后應(yīng)在室溫孵育平板30-60分鐘，然后應(yīng)向每個(gè)孔中加入100ml中的5x104NK-92細(xì)胞。然后應(yīng)在37℃孵育培養(yǎng)物3天，并針對(duì)人干擾素-γ的產(chǎn)生測(cè)定它們的上清。測(cè)定培養(yǎng)基應(yīng)是RPMI1640、10%FBS、NEAA、丙酮酸、50mM2-巰基乙醇、慶大霉素和10ng/ml人IL-2（Cat#Z00368,GeneScriptCorporation,Piscataway,NJ,美國(guó)）?？梢杂肊LISA測(cè)定來(lái)檢測(cè)人干擾素-γ。用含1mg/ml抗-人干擾素-g（Cat.#Mab1-D1K,Mabtech,Cincinnati,OH,美國(guó)）的100mlPBS包被平板，4℃過(guò)夜或在37℃1小時(shí)。然后應(yīng)在去離子水中洗滌平板，并用100μlPBS/10%山羊血清封閉1小時(shí)。洗滌平板后，應(yīng)向平板中加入50mlPBS/10%山羊血清和50ml培養(yǎng)物上清，并孵育1小時(shí)。然后應(yīng)洗滌平板，加入100ml/孔含0.5mg/ml抗-人干擾素-γ-生物素（Cat#Mab7b6-1-biotin,Mabtech）的PBS/10%山羊血清，然后在室溫孵育平板1小時(shí)。然后應(yīng)洗滌平板，并與100ml/孔的1:1000稀釋在PBS/10%山羊血清中的鏈霉抗生物素蛋白-HRP（JacksonLabs）反應(yīng)。然后應(yīng)再次洗滌平板，并通過(guò)加入100ml/孔TMB底物（ThermoScientific,IL,美國(guó)）來(lái)檢測(cè)信號(hào)。用100ml/孔1NH2SO4終止反應(yīng)后，可以在450nM讀取光密度。對(duì)靈長(zhǎng)類白細(xì)胞介素（IL-6、IL-23和IL-12）的反應(yīng)性針對(duì)靈長(zhǎng)類白細(xì)胞介素的測(cè)定與用于測(cè)量對(duì)人測(cè)定的活性的那些相同，但用靈長(zhǎng)類形式的細(xì)胞因子進(jìn)行測(cè)定。用于人治療的任意細(xì)胞因子拮抗劑的成功研發(fā)將需要最初的毒理學(xué)測(cè)試。在非人物種中最有效地顯示毒理學(xué)。為了便于最初的毒理學(xué)研究，可以針對(duì)它們中和來(lái)自考慮用于研究的物種的IL-6的能力篩選本發(fā)明的抗體。定義除非另有說(shuō)明，以下術(shù)語(yǔ)應(yīng)理解為具有以下含義：“免疫球蛋白”是四聚體分子。在天然存在的免疫球蛋白中，每個(gè)四聚體由兩個(gè)相同的多肽鏈對(duì)組成，每對(duì)具有一條“輕”鏈（約25kDa）和一條“重”鏈（約50-70kDa）。每條鏈的氨基端部分包含主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別的約100至110個(gè)或更多個(gè)氨基酸的可變區(qū)。每條鏈的羧基端部分定義了主要負(fù)責(zé)效應(yīng)子功能的恒定區(qū)。人輕鏈分為K和X輕鏈。重鏈分類為a或E，并分別將抗體的同種型定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在輕鏈和重鏈中，可變區(qū)和恒定區(qū)通過(guò)約12個(gè)或更多個(gè)氨基酸的“J”區(qū)連接，重鏈還包含約10個(gè)或更多個(gè)氨基酸的“D”區(qū)。一般見FundamentalImmunologyCh.7（Paul,W.編輯,第2版RavenPress,N.Y.(1989)）（為了所有目的以其整體引入作為參考）。每個(gè)輕/重鏈對(duì)的可變區(qū)形成抗體結(jié)合部位，使得完整的免疫球蛋白具有兩個(gè)結(jié)合部位。免疫球蛋白鏈顯示通過(guò)三個(gè)高變區(qū)（也稱為互補(bǔ)決定區(qū)或CDR）連接的相對(duì)保守的構(gòu)架區(qū)（FR）的相同的一般結(jié)構(gòu)。來(lái)自每對(duì)的兩條鏈的CDR通過(guò)構(gòu)架區(qū)排列，使得能夠與特異性表位結(jié)合。從N端至C端，輕鏈和重鏈都包含結(jié)構(gòu)域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。按照KabatSequencesofProteinsofImmunologicalInterest（NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1987和1991)）；或Chothia&LeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Chothia等Nature342:878-883(1989)的定義將氨基酸分配至各結(jié)構(gòu)域?！翱贵w”指完整的免疫球蛋白，或指其與完整抗體競(jìng)爭(zhēng)特異性結(jié)合的抗原結(jié)合部分。可以通過(guò)重組DNA技術(shù)或通過(guò)完整抗體的酶切割或化學(xué)切割來(lái)產(chǎn)生抗原結(jié)合部分?？乖Y(jié)合部分尤其包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dAb、互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）片段，單鏈抗體（scFv）、嵌合抗體、雙抗體及包含足以賦予多肽特異性抗原結(jié)合的至少部分免疫球蛋白的多肽。Fab片段是由VL、VH、CL和CHI結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；F(ab')2片段是包含在鉸鏈區(qū)通過(guò)二硫鍵連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；Fd片段由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成；Fv片段由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成；dAb片段（Ward等,Nature341:544-546,1989）由VH結(jié)構(gòu)域組成。單鏈抗體（scFv）是這樣的抗體，其中VL和VH區(qū)通過(guò)使它們成為單蛋白質(zhì)鏈的合成接頭配對(duì)形成單價(jià)分子（Bird等,Science242:423-426,1988和Huston等,Proc.Natl.Acad.Sci.美國(guó)85:5879-5883,1988）。抗體可以具有一個(gè)或多個(gè)結(jié)合部位。如果存在一個(gè)以上結(jié)合部位，則結(jié)合部位可以彼此相同或可以不同。例如，天然存在的免疫球蛋白具有兩個(gè)相同的結(jié)合部位，單鏈抗體或Fab片段具有一個(gè)結(jié)合部位，而“雙特異性”抗體具有兩個(gè)不同的結(jié)合部位?？梢酝ㄟ^(guò)包括雜交瘤融合或Fab'片段連接的多種方法來(lái)產(chǎn)生雙特異性抗體。見例如Songsivilai&LachmannClin.Exp.Immunol.79:315-321(1990)；Kostelny等J.Immunol.148:1547-1553(1992)。“分離的抗體”是這樣的抗體，其：（1）不與在其天然狀態(tài)下伴隨它的天然結(jié)合成分（包括其他天然結(jié)合的抗體）結(jié)合；（2）游離于來(lái)自相同物種的其他蛋白質(zhì)；（3）由來(lái)自不同物種的細(xì)胞表達(dá)；或（4）不存在于自然界中。分離的抗體的實(shí)例包括已用IL-6親和純化的抗-IL-6抗體、已通過(guò)雜交瘤或其他細(xì)胞系體外合成的抗-IL-6抗體及衍生自轉(zhuǎn)基因小鼠的人抗-IL-6抗體。術(shù)語(yǔ)“人抗體”包括具有一個(gè)或多個(gè)衍生自人免疫球蛋白序列的可變區(qū)和/或恒定區(qū)的所有抗體。這些抗體可以以多種方式制備，作為實(shí)例，下文描述兩種方式。人源化抗體是衍生自非人物種的抗體，其中突變了重鏈和輕鏈的構(gòu)架和恒定結(jié)構(gòu)域中的某些殘基來(lái)避免或廢除在人類中的免疫反應(yīng)。備選地，可以通過(guò)將來(lái)自人抗體的恒定結(jié)構(gòu)域與非人物種的可變結(jié)構(gòu)域融合來(lái)產(chǎn)生人源化抗體。如何制備人源化抗體的實(shí)例可以見于美國(guó)專利號(hào)6,054、297,5、886,152和5,877,293中。術(shù)語(yǔ)“嵌合抗體”指包含來(lái)自一種抗體的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域和來(lái)自一種或多種其他抗體的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域的抗體。術(shù)語(yǔ)“Koff”指抗體從抗體/抗原復(fù)合物解離的離去速率常數(shù)。術(shù)語(yǔ)“Kd”指具體的抗體-抗原相互作用的解離常數(shù)。術(shù)語(yǔ)“表位”包括能夠與免疫球蛋白或T細(xì)胞受體特異性結(jié)合的任意蛋白質(zhì)決定簇。表位決定簇通常由諸如氨基酸或糖側(cè)鏈的分子的具有化學(xué)活性的表面結(jié)群組成，且通常具有特異的三維結(jié)構(gòu)特征，以及特異的電荷特征。解離常數(shù)優(yōu)選低于10nM和最優(yōu)選0nM時(shí)，稱抗體特異性結(jié)合抗原。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以按照本說(shuō)明書的教導(dǎo)容易地制備抗體或免疫球蛋白分子的片段或類似物。片段或類似物的優(yōu)選的氨基酸和羧基端存在于功能結(jié)構(gòu)域的邊界附近?？梢酝ㄟ^(guò)將核苷酸和/或氨基酸序列數(shù)據(jù)與公共或?qū)Ｓ行蛄袛?shù)據(jù)庫(kù)比較來(lái)鑒定結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域?！癐L-12”是由通過(guò)二硫鍵連接的p35和p40兩個(gè)亞基組成的異二聚體?？乖蔬f細(xì)胞（主要為髓系）表達(dá)IL-12，其通過(guò)與表達(dá)在T細(xì)胞或天然殺傷細(xì)胞表面的受體復(fù)合物結(jié)合來(lái)參與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。認(rèn)為IL-12的p40亞基結(jié)合IL-12受體β1（IL-12Rβ1）受體，p35亞基結(jié)合第二受體鏈（IL-12Rβ2），產(chǎn)生胞內(nèi)信號(hào)發(fā)放。“IL-23”是由與p19蛋白質(zhì)共價(jià)連接的IL-12的相同的p40蛋白質(zhì)亞基組成的異二聚體。IL-23結(jié)合與IL-12R相關(guān)的受體，該受體共享IL-12Rβ1鏈，且還具有獨(dú)特的IL-23R鏈?！癐L-6”是在包括血細(xì)胞生成、炎癥和腫瘤發(fā)生的免疫調(diào)節(jié)中具有多種生物學(xué)活性的多效細(xì)胞因子。IL-6激活由IL-6受體（IL-6R）和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體亞基gp130組成的受體復(fù)合物。IL-6R以跨膜形式和可溶形式兩種形式存在。IL-6結(jié)合這兩種形式，然后其可以與gp130相互作用來(lái)觸發(fā)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)?！癟H1細(xì)胞”是涉及哺乳動(dòng)物免疫反應(yīng)的T調(diào)節(jié)細(xì)胞（也稱為T輔助細(xì)胞）。它們的特征在于產(chǎn)生IFN-γ?！癟H17細(xì)胞”是涉及哺乳動(dòng)物免疫反應(yīng)的T調(diào)節(jié)細(xì)胞（也稱為T輔助細(xì)胞）。它們的特征在于產(chǎn)生IL-17?！癟H17介導(dǎo)的疾病”是TH17細(xì)胞在疾病的病因中發(fā)揮作用的疾病。“TH22細(xì)胞”是涉及哺乳動(dòng)物免疫反應(yīng)的T調(diào)節(jié)細(xì)胞（也稱為T輔助細(xì)胞）。它們的特征在于產(chǎn)生IL-22?！癟H22介導(dǎo)的疾病”是TH22細(xì)胞在疾病的病因中發(fā)揮作用的疾病。優(yōu)選地，用計(jì)算機(jī)化比較方法來(lái)鑒定存在于其他已知結(jié)構(gòu)和/或功能的蛋白質(zhì)中的序列基序或預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)構(gòu)象結(jié)構(gòu)域。鑒定折疊為已知三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)序列的方法是已知的。Bowie等Science253:164(1991)。優(yōu)選的氨基酸取代是那些，其：（1）降低對(duì)蛋白酶解的敏感性；（2）降低對(duì)氧化的敏感性；（3）改變形成蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)合親和力；（4）改變結(jié)合親和力；和（4）賦予或改變這類類似物的其他物理化學(xué)或功能特性。類似物可以包括具有不同于天然存在的肽序列的序列的多種突變蛋白質(zhì)。例如，可以在天然存在的序列中（優(yōu)選在形成分子間接觸的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域之外的多肽部分中）產(chǎn)生單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代（優(yōu)選保守氨基酸取代）。保守氨基酸取代應(yīng)基本上不改變親本多肽的結(jié)構(gòu)特征（例如，取代氨基酸應(yīng)不傾向于破壞存在于親本序列中的螺旋，或破壞表征該親本多肽的其他類型的二級(jí)結(jié)構(gòu)）。本領(lǐng)域已知的多肽二級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)的實(shí)例描述于Proteins,StructuresandMolecularPrinciples（Creighton編輯,W.H.FreemanandCompany,NewYork(1984)）；IntroductiontoProteinStructure（C.Branden和J.Tooze編輯,GarlandPublishing,NewYork,N.Y.(1991)）；及Thornton等Nature354:105(1991)中；每篇文獻(xiàn)在此引入作為參考。如本文所使用，二十種常規(guī)氨基酸及其縮寫遵循常規(guī)用法。見Immunology-ASynthesis（第2版,E.S.Golub和D.R.Gren編輯,SinauerAssociates,Sunderland,Mass.(1991)），其在此引入作為參考。二十種常規(guī)氨基酸的立體異構(gòu)體（例如D-氨基酸）、非天然氨基酸（如a-,a-雙取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其他非常規(guī)氨基酸）也可以是適合用于本發(fā)明的多肽的成分。非常規(guī)氨基酸的實(shí)例包括：4-羥脯氨酸、-羧基谷氨酸、s-N,N,N-三甲基賴氨酸、s-N-乙酰賴氨酸、O-磷酸絲氨酸、N-乙酰絲氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥基賴氨酸、s-N-甲基精氨酸及其他類似的氨基酸和亞氨基酸（例如4-羥脯氨酸）。在本文所用的多肽表示法中，按照標(biāo)準(zhǔn)用法和慣例，左手方向是氨基端方向，右手方向是羧基端方向。本文提到的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”意指長(zhǎng)度為至少10個(gè)堿基的聚合形式的核苷酸，該核苷酸是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或任一類型的核苷酸的修飾形式。該術(shù)語(yǔ)包括單鏈和雙鏈形式的DNA。本文所用的術(shù)語(yǔ)“分離的多核苷酸”將意指基因組、cDNA或合成來(lái)源的多核苷酸或其某種組合，由于它的來(lái)源，“分離的多核苷酸”：（1）不與該“分離的多核苷酸”見于自然界中的多核苷酸的全部或部分結(jié)合；（2）與在自然界中不連接的多核苷酸有效連接；或（3）不作為更大序列的部分存在于自然界中。本文提到的術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”包含通過(guò)天然存在和非天然存在的寡核苷酸連接連接在一起的天然存在的核苷酸和修飾的核苷酸。寡核苷酸是一般包含200堿基或更少的長(zhǎng)度的多核苷酸亞組。優(yōu)選地，寡核苷酸長(zhǎng)度為10至60個(gè)堿基，最優(yōu)選長(zhǎng)度為12、13、14、15、16、17、18、19或20至40個(gè)堿基。寡核苷酸通常是單鏈，例如對(duì)于探針；但寡核苷酸可以是雙鏈，例如用于構(gòu)建基因突變體。本發(fā)明的寡核苷酸可以是有義或反義寡核苷酸。本文提到的術(shù)語(yǔ)“天然存在的核苷酸”包含脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文提到的術(shù)語(yǔ)“修飾的核苷酸”包含具有修飾或取代的糖基等的核苷酸。本文提到的術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸連接”包含諸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、phosphoroanilothioate、phoshoraniladate、phosphoroamidate等的寡核苷酸連接。見例如LaPlanche等Nucl.AcidsRes.14:9081(1986)；Stec等J.Am.Chem.Soc.106:6077(1984)；Stein等Nucl.AcidsRes.16:3209(1988)；Zon等Anti-CancerDrugDesign6:539(1991)；Zon等OligonucleotidesandAnalogues:APracticalApproach,87-108頁(yè)(F.Eckstein編輯,OxfordUniversityPress,OxfordEngland(1991))；Stec等,美國(guó)專利號(hào)5,151,510；Uhlmann和PeymanChemicalReviews90:543(1990)；其公開內(nèi)容在此引入作為參考。根據(jù)需要，寡核苷酸可以包含用于檢測(cè)的標(biāo)記。除非另有說(shuō)明，單鏈多核苷酸序列的左手端是5'端；雙鏈多核苷酸序列的左手方向稱為5'方向。新生RNA轉(zhuǎn)錄物5'至3'添加的方向稱為轉(zhuǎn)錄方向；DNA鏈上具有與RNA相同的序列且位于RNA轉(zhuǎn)錄物5'端的5'的序列區(qū)域稱為“上游序列”；DNA鏈上具有與RNA相同的序列且位于RNA轉(zhuǎn)錄物3'端的3'的序列區(qū)域稱為“下游序列”?！坝行нB接的”序列包含與目的基因相鄰的表達(dá)控制序列和反式或遠(yuǎn)距離作用來(lái)控制目的基因的表達(dá)控制序列。本文所用的術(shù)語(yǔ)“表達(dá)控制序列”指實(shí)現(xiàn)它們所連接的編碼序列的表達(dá)和加工所必需的多核苷酸序列。表達(dá)控制序列包含適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄起始、終止、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列；有效的RNA加工信號(hào)，如剪接和多腺苷酸化信號(hào)；穩(wěn)定胞質(zhì)mRNA的序列；增強(qiáng)翻譯效率的序列（即Kozak共有序列）；增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的序列；及（如果希望）增強(qiáng)蛋白質(zhì)分泌的序列。這類控制序列的性質(zhì)取決于宿主生物而不同；在原核生物中，這類控制序列一般包含啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止序列；在真核生物中，這類控制序列一般包含啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列。術(shù)語(yǔ)“控制序列”旨在至少包含其存在為表達(dá)和加工所必需的所有成分，且還可以包含其存在有利的附加成分，例如，前導(dǎo)序列和融合配偶體序列。本文所用的術(shù)語(yǔ)“載體”旨在指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)與它連接的另一核酸的核酸分子。一類載體是“質(zhì)粒”，其指其他DNA區(qū)段可以連接入其中的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一類載體是病毒載體，其中其他DNA區(qū)段可以連接入病毒基因組。某些載體能夠在它們所引入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制（例如，具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動(dòng)物載體）。其他載體（例如非附加型哺乳動(dòng)物載體）可以在引入宿主細(xì)胞時(shí)整合入宿主細(xì)胞的基因組，從而與宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)與它們有效連接的基因的表達(dá)。這類載體在本文中稱為“重組表達(dá)載體”（或簡(jiǎn)稱“表達(dá)載體”）。一般而言，用于重組DNA技術(shù)中的表達(dá)載體通常是質(zhì)粒的形式。在本說(shuō)明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可以互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的載體形式。但是，本發(fā)明旨在包含這類其他形式的表達(dá)載體，如病毒載體（例如復(fù)制缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒），其執(zhí)行等同的功能。本文所用的術(shù)語(yǔ)“重組宿主細(xì)胞”（或簡(jiǎn)稱“宿主細(xì)胞”）旨在指已將重組表達(dá)載體引入其中的細(xì)胞。應(yīng)理解，這類術(shù)語(yǔ)旨在不僅指具體的主題細(xì)胞，還指這種細(xì)胞的后代。由于某些修飾可以因突變或環(huán)境影響而存在于后代中，這種后代事實(shí)上可以與親本細(xì)胞不同，但仍包含在本文所用的術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”的范圍之內(nèi)。本文提到的術(shù)語(yǔ)“選擇性雜交”意指可檢測(cè)且特異地結(jié)合。本發(fā)明的多核苷酸、寡核苷酸及其片段在最小化與非特異性核酸的明顯量的可檢測(cè)的結(jié)合的雜交和洗滌條件下選擇性地與核酸鏈雜交。可以用“高嚴(yán)格性”或“高度嚴(yán)格”條件來(lái)達(dá)到本領(lǐng)域已知和本文所討論的選擇性雜交條件。“高嚴(yán)格性”或“高度嚴(yán)格”條件的實(shí)例是將多核苷酸與另一多核苷酸孵育的方法，其中可以將一種多核苷酸在42℃的雜交溫度下在6XSSPE或SSC、50%甲酰胺、5XDenhardt試劑、0.5%SDS、100pg/ml變性片段化鮭魚精DNA的雜交緩沖液中附著固體表面（如膜）12-16小時(shí)，然后用1XSSC、0.5%SDS的洗滌緩沖液在55℃洗滌兩次。還見Sambrook等,上文,9.50-9.55頁(yè)。如果它們的序列之間存在部分或完全的同一性，則兩個(gè)氨基酸序列同源。例如，85%同源性意指在為了最大匹配比對(duì)兩個(gè)序列時(shí)85%的氨基酸相同。最大匹配中允許缺口（在所匹配的兩個(gè)序列的任一個(gè)中）；優(yōu)選缺口長(zhǎng)度為5或更少，更優(yōu)選2或更少。備選地和優(yōu)選地，以突變數(shù)據(jù)矩陣和6或更大的缺口罰分使用ALIGN程序，如果它們具有超過(guò)5（按標(biāo)準(zhǔn)差單位）的比對(duì)得分，則兩個(gè)蛋白質(zhì)序列（或從它們衍生的長(zhǎng)度為至少30個(gè)氨基酸的多肽序列）同源，如此術(shù)語(yǔ)在本文中所使用。見Dayhoff,M.O.,AtlasofProteinSequenceandStructure,101-110頁(yè)中（卷5,NationalBiomedicalResearchFoundation(1972)）及此卷的增刊2,1-10頁(yè)。如果在用ALIGN程序最佳比對(duì)時(shí)它們的氨基酸大于或等于50%同一性，則更優(yōu)選兩個(gè)序列或其部分同源。本文用術(shù)語(yǔ)“對(duì)應(yīng)于”來(lái)指多核苷酸序列與參考多核苷酸序列的全部或部分同一，或多肽序列與參考多肽序列同一。相反，本文用術(shù)語(yǔ)“與…互補(bǔ)”來(lái)指互補(bǔ)序列與參考多核苷酸序列的全部或部分同一。舉例說(shuō)明，核苷酸序列“TATAC”對(duì)應(yīng)于參考序列“TATAC”，與參考序列“GTATA”互補(bǔ)。用以下術(shù)語(yǔ)來(lái)描述兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸或氨基酸序列之間的序列關(guān)系：“參考序列”、“比較窗”、“序列同一性”、“百分比序列同一性”和“實(shí)質(zhì)同一性”。“參考序列”是用作進(jìn)行序列比較的基礎(chǔ)的限定序列；參考序列可以是更大序列的亞組，例如，作為序列表中給出的全長(zhǎng)cDNA或基因序列的區(qū)段，或可以包含完整的cDNA或基因序列。通常，參考序列的長(zhǎng)度為至少18個(gè)核苷酸或6個(gè)氨基酸，長(zhǎng)度常為24個(gè)核苷酸或8個(gè)氨基酸，長(zhǎng)度常為至少48個(gè)核苷酸或16個(gè)氨基酸。由于兩個(gè)多核苷酸或氨基酸序列可以各（1）包含在兩個(gè)分子之間相似的序列（即，完整多核苷酸或氨基酸序列的部分），且（2）可以進(jìn)一步包含在兩個(gè)多核苷酸或氨基酸序列之間趨異的序列，通常通過(guò)在“比較窗”上比較兩個(gè)分子的序列來(lái)進(jìn)行兩個(gè)（或多個(gè)）分子間的序列比較，以鑒定和比較具有序列相似性的局部區(qū)域。本文所用的“比較窗”指至少18個(gè)相鄰核苷酸位置或6個(gè)氨基酸的概念性區(qū)段，其中可以將多核苷酸序列或氨基酸序列與至少18個(gè)相鄰核苷酸或6個(gè)氨基酸的參考序列相比較，其中為了兩個(gè)序列的最佳比對(duì)，與參考序列（其不包含添加或缺失）相比，比較窗中的20%或更少多核苷酸序列部分可以包含添加、缺失、取代等（即缺口）。可以通過(guò)Smith和WatermanAdv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法、通過(guò)Needleman和WunschJ.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比對(duì)算法、通過(guò)Pearson和LipmanProc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85:2444(1988)相似性搜索方法、通過(guò)這些算法的計(jì)算機(jī)化執(zhí)行（WisconsinGeneticsSoftwarePackage7.0版（GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,Wis.）中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA；Geneworks；或MacVector軟件包）或通過(guò)檢查來(lái)進(jìn)行比對(duì)比較窗的最佳序列比對(duì)，并選擇通過(guò)多種方法產(chǎn)生的最佳比對(duì)（即在比較窗上產(chǎn)生最高的百分比同源性）。術(shù)語(yǔ)“序列同一性”意指兩個(gè)多核苷酸或氨基酸序列在比較窗上同一（即，以核苷酸與核苷酸或殘基與殘基為基礎(chǔ)）。這樣計(jì)算術(shù)語(yǔ)“百分比序列同一性”，在比較窗上比較兩個(gè)最佳比對(duì)的序列，確定在兩個(gè)序列中存在相同核苷酸堿基（例如A、T、C、G、U或I）或殘基的位置數(shù)來(lái)產(chǎn)生匹配位置數(shù)，用匹配位置數(shù)除以比較窗中的位置總數(shù)（即窗口大?。?，并將結(jié)果乘以100來(lái)產(chǎn)生百分比序列同一性。本文所用的術(shù)語(yǔ)“實(shí)質(zhì)同一性”指多核苷酸或氨基酸序列的特征，其中該多核苷酸或氨基酸包含這樣的序列，在至少18個(gè)核苷酸（6個(gè)氨基酸）位置的比較窗上、通常在至少24-48個(gè)核苷酸（8-16個(gè)氨基酸）位置的比較窗上與參考序列相比，該序列具有至少90%至95%序列同一性、更優(yōu)選至少98%序列同一性、更通常至少99%序列同一性，其中通過(guò)在比較窗上將參考序列與可以包含參考序列的總計(jì)20%或更少的缺失或添加的序列相比較來(lái)計(jì)算百分比序列同一性。參考序列可以是更大序列的亞組。應(yīng)用于多肽的術(shù)語(yǔ)“實(shí)質(zhì)同一性”意指兩個(gè)多肽序列在最佳比對(duì)（如通過(guò)使用默認(rèn)缺口權(quán)重的GAP或BESTFIT）時(shí)具有至少80%序列同一性、優(yōu)選至少90%序列同一性、更優(yōu)選至少95%序列同一性、甚至更優(yōu)選至少98%序列同一性和最優(yōu)選至少99%序列同一性。優(yōu)選地，不相同的殘基位置因保守氨基酸取代而不同。保守氨基酸取代指具有相似側(cè)鏈的殘基的可互換性。例如，具有脂肪族側(cè)鏈的一組氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂肪族羥基側(cè)鏈的一組氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺的側(cè)鏈的一組氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族側(cè)鏈的一組氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有堿性側(cè)鏈的一組氨基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；具有含硫側(cè)鏈的一組氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸取代組是：纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。如本文所討論，考慮本發(fā)明涵蓋抗體或免疫球蛋白分子的氨基酸序列中的小變異，只要該氨基酸序列中的變異維持至少90%、更優(yōu)選95%和最優(yōu)選99%序列同一性。具體而言，考慮保守氨基酸取代。保守取代是發(fā)生在在其側(cè)鏈中相關(guān)的氨基酸家族內(nèi)的那些。遺傳編碼的氨基酸一般分為以下家族：（1）酸性=天冬氨酸、谷氨酸；（2）堿性=賴氨酸、精氨酸、組氨酸；（3）非極性=丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和（4）不帶電荷的極性=甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。更優(yōu)選的家族是：絲氨酸和蘇氨酸是脂肪族羥基家族；天冬酰胺和谷氨酰胺是含酰胺家族；丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸是脂肪族家族；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸是芳香族家族。例如，可合理預(yù)期，異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、絲氨酸取代蘇氨酸的分離的取代，或結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸取代氨基酸的類似取代將對(duì)產(chǎn)生的分子的結(jié)合或特性不具有主要作用，尤其是如果該取代不涉及構(gòu)架部位內(nèi)的氨基酸。可以通過(guò)測(cè)定多肽衍生物的比活性來(lái)容易地確定氨基酸改變是否產(chǎn)生功能肽。本文所用的術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”或“標(biāo)記的”指在抗體中摻入另一分子。在實(shí)施方案中，該標(biāo)記是可檢測(cè)標(biāo)志，例如摻入放射性標(biāo)記的氨基酸，或附著于具有可以通過(guò)標(biāo)志的抗生物素蛋白（例如，包含可以通過(guò)光學(xué)或比色方法來(lái)檢測(cè)的縈光標(biāo)志或酶活性的鏈霉抗生物素蛋白）來(lái)檢測(cè)的生物素酰部分的多肽。在另一實(shí)施方案中，該標(biāo)記或標(biāo)志可以是治療性的，例如藥物綴合物或毒素。標(biāo)記多肽和糖蛋白的多種方法為本領(lǐng)域已知，且可以使用。標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素（例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I）、縈光標(biāo)記（FITC、羅丹明、lanthanidephosphors）、酶標(biāo)記（例如辣根過(guò)氧化物酶、-半乳糖苷酶、螢光素酶、堿性磷酸酶）、化學(xué)發(fā)光標(biāo)志、生物素酰基、預(yù)先確定的由第二報(bào)道分子識(shí)別的多肽表位（例如，亮氨酸拉鏈對(duì)序列、第二抗體的結(jié)合部位、金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域、附加表位）、磁性物質(zhì)（如釓螯合物）、毒素（如百日咳毒素、紫杉醇、松胞菌素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根堿、絲裂霉素、表鬼臼毒素吡喃葡糖苷、鬼臼噻吩甙（tenoposide）、長(zhǎng)春花新堿、長(zhǎng)春花堿、秋水仙素、阿霉素、柔紅霉素、二羥炭疽菌素二酮、二羥蒽二酮、光神霉素、放線菌素D、1-脫氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、心得安和嘌呤霉素及其類似物或同系物）。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)多種長(zhǎng)度的間隔臂附著標(biāo)記來(lái)減少潛在的空間位阻。術(shù)語(yǔ)“患者”包括人和獸受試者。在本說(shuō)明書和權(quán)利要求中，術(shù)語(yǔ)“包含”將理解為暗示包含所述整數(shù)或整數(shù)組，但不排除任意其他整數(shù)或整數(shù)組。實(shí)施例從來(lái)自超免疫兔克隆的抗原特異性B細(xì)胞產(chǎn)生抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。通過(guò)抗原淘洗從兔血選擇抗原特異性B細(xì)胞，并在有利于擴(kuò)大激活的B細(xì)胞的培養(yǎng)條件下克隆。實(shí)施例1：IL6和IL23表達(dá)克隆的構(gòu)建及融合蛋白質(zhì)的純化將人IL-6（DQ891463；ABM82389.1，SEQIDNO.343和344）表達(dá)為3xFLAG-IL6-Avi融合。通過(guò)兩步聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增產(chǎn)生表達(dá)構(gòu)建體。將產(chǎn)物插入質(zhì)粒p3xFLAG-CMV-23（Sigma），位于CMV啟動(dòng)子的下游，并與前胰蛋白酶原前導(dǎo)序列和三重FLAG標(biāo)記符合讀框。表達(dá)的IL-6（SEQIDNO.1）包含氨基端三重FLAG標(biāo)記（氨基酸序列dhdgdykdhdidykdddd；SEQIDNO.345）和羧基端Avi標(biāo)記（glndifeaqkiewhe;SEQISNO.346）（ALLO66-MM4-80）。通過(guò)PCR擴(kuò)增IL6編碼區(qū)，并插入p3xFLAG-CMV-23來(lái)表達(dá)3xFLAG-IL6和3xFLAG-IL6-myc融合。（SEQIDNO.2）通過(guò)重疊寡聚物和PCR（DNA2.0）來(lái)產(chǎn)生獼猴IL-6（mmIL-6；NM_001042733.1；NP_001036198；SEQIDNO.346和SEQIDNO.347）的編碼區(qū)。合成的序列編碼含有氨基端信號(hào)序列（mnsfstsafgpvafslglllvlpaafpap；SEQISNO.349）和羧基端FLAG標(biāo)記的mmIL-6。將此構(gòu)建體在CMV啟動(dòng)子（ALLO66-MM4-143）的下游插入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pCEP4（Invitrogen）。（SEQIDNO.3）人IL-23細(xì)胞因子是p19（IL23A；檢索號(hào)NT_029419）和p40（IL12B；NT023133）蛋白質(zhì)的功能性異二聚體。將IL-23二聚體表達(dá)為p40:p19融合，單個(gè)蛋白質(zhì)由編碼氨基酸序列VPGVGVPGVG（SEQIDNO.352）的彈性蛋白接頭（檢索號(hào)NM_001081755；SEQIDNO.351）gttcctggagtaggggtacctggggtgggc分開。用兩步PCR擴(kuò)增策略來(lái)產(chǎn)生p40:p19遺傳融合，同時(shí)在每個(gè)結(jié)構(gòu)域上引入6xHIS。將得到的編碼p40:p19-6xHIS（SEQIDNO.4）和p40-6xHIS:p19的構(gòu)建體引入哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒pCEP4（Invitrogen）。將靈長(zhǎng)類IL23異二聚體表達(dá)為在兩種蛋白質(zhì)之間具有彈性蛋白接頭且包含3’6xHIS標(biāo)記的p40（NP_001038190；NM_001044725）:p19（BV209310）融合。通過(guò)重疊寡聚物和PCR來(lái)合成構(gòu)建體，并克隆入p3xFLAG-CMV-13質(zhì)粒，位于CMV啟動(dòng)子的下游，且與前胰蛋白酶原信號(hào)序列（ALLO87-MM-5-74）（SEQIDNO.5）符合讀框。靶蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物表達(dá)和純化：在HEK293或HEK293c18細(xì)胞中進(jìn)行哺乳動(dòng)物細(xì)胞因子的表達(dá)。用3μl/μgDNA的lipofectamine2000或293fectin（Invitrogen）在按約200,000細(xì)胞/cm2的密度鋪平板的細(xì)胞上進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每一百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞使用2-2.5μgDNA。在含10%胎牛血清的DMEM中37℃孵育細(xì)胞3-4天，并收集生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行靶蛋白質(zhì)的純化。對(duì)于6xHIS標(biāo)記蛋白質(zhì)的純化，向培養(yǎng)基中加入1/10體積的10x結(jié)合緩沖液（500mM磷酸鹽緩沖液pH7.5、3MNaCl、200mM咪唑、1%Tween-20），并在4℃對(duì)PBS過(guò)夜透析。向提取物中加入Ni-NTA小球，4℃顛倒混合2-3小時(shí)。離心收集小球，并在Ni-NTA洗滌緩沖液（50mM磷酸鹽、300mMNaCl、20mM咪唑、0.1%Tween）中洗滌。用洗脫緩沖液（50mM磷酸鹽緩沖液pH7.5、300mMNaCl、500mM咪唑）洗脫與Ni-NTA小球結(jié)合的蛋白質(zhì)。通過(guò)SDS-PAGE和考馬斯藍(lán)染色鑒定含有靶蛋白質(zhì)的級(jí)分，并通過(guò)光密度測(cè)定法定量。組合峰級(jí)分并對(duì)PBS透析，直接用于體外測(cè)定或SPR分析。用M2綴合的小球（Invitrogen）從表達(dá)培養(yǎng)基純化FLAG標(biāo)記的蛋白質(zhì)。簡(jiǎn)言之，直接將M2小球加入表達(dá)培養(yǎng)基中，并在4℃孵育4-16小時(shí)。在FLAG洗滌緩沖液（20mMTrispH7.4、150mMNaCl、0.1%Tween-20、1mM乙二胺四乙酸）中洗滌小球，并通過(guò)用0.1M甘氨酸（pH2.5）或用3xFLAG肽洗滌來(lái)收集結(jié)合的蛋白質(zhì)。然后立即用1/20體積的1MTris堿中和酸洗脫液。通過(guò)SDS-PAGE和考馬斯藍(lán)染色鑒定峰級(jí)分并混合。將這些對(duì)PBS透析，并直接用于體外測(cè)定或SPR分析。實(shí)施例2：抗體親和力的測(cè)定通過(guò)使用SensiQPioneer（ICxNomadics,Stillwater,OK）和適合于胺偶聯(lián)的羧化COOH1傳感器（Ibid）的表面等離振子共振來(lái)測(cè)定平衡解離常數(shù)。用胺偶聯(lián)試劑（SigmaAldrich（N-羥基琥珀酰亞胺（NHS，56480）、N-(3-二甲基氨基丙基)-B’-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC,E7750））；乙醇胺（398136）,St.Louis,MO）或用Biacore胺偶聯(lián)試劑盒（BR-1000-50,GEHealthcare,Waukesha,WI）將G蛋白（6510-10,Biovision,MountainView,CA）偶聯(lián)至COOH1傳感器。簡(jiǎn)言之，以2-10分鐘之間的接觸時(shí)間用2mMEDC和.5mMNHS活化羧化表面。按20-400ug/mL之間的不同濃度將G蛋白稀釋入10mM乙酸緩沖液pH4.3（乙酸鈉，BP334-1；冰醋酸，A490-212；ThermoFisherScientific,Waltham,MA）中，并按5-10μL/分鐘的速率注射在活化的傳感器上5和10分鐘之間的不同接觸時(shí)間。固定至COOH1傳感芯片的G蛋白的量在400-2000反應(yīng)單位（RU）的范圍內(nèi)。以25μL/分鐘的流速用100μL乙醇胺覆蓋剩余活化位點(diǎn)。通過(guò)將mAb與G蛋白包被的芯片結(jié)合，然后將各分析物（IL-6或IL-23）與其各自的mAb結(jié)合來(lái)測(cè)定兔人嵌合mAb的平衡常數(shù)。為了最小化傳質(zhì)效應(yīng)，調(diào)節(jié)各分析物的mAb的表面密度，使得分析物結(jié)合接近飽和，它的對(duì)應(yīng)的RU落在200和300之間。將1至100nM的3x-FLAG-IL-6（見實(shí)施例1）、IL-6（CYT-213,Prospec-TanyTechnogene,Rehovot,以色列）或人嵌合IL-23（34-8239,eBiosciences,SanDiego,CA）稀釋液注射在芯片表面上，并測(cè)量結(jié)合（Ka）和解離（Kd）速率常數(shù)。對(duì)于每個(gè)結(jié)合和解離循環(huán)，用15uL20mMNaOH（5671-02,MallinckrodtBaker,Philliphsburg,NJ）再生芯片表面。測(cè)定溫度維持在25℃，分析物流速為50μL/分鐘，包含2分鐘結(jié)合期和10-30分鐘解離期?？梢杂蒙鲜鲂问竭B同準(zhǔn)一級(jí)1:1相互作用模型軟件（Qdat,ICxNomadics,Stillwater,OK）來(lái)測(cè)定結(jié)合速率/解離速率（ka/kd）和解離常數(shù)（KD）。按之前所述測(cè)定scFv的平衡常數(shù)；但是，修改流程，使得表位標(biāo)記的IL-6捕獲在芯片表面上，并監(jiān)測(cè)抗-IL-6scFv從IL-6解離。簡(jiǎn)言之，使抗M2抗體（200472,AgilentTechnologies,SantaClara,CA）結(jié)合于G蛋白，然后通過(guò)抗-FLAG抗體來(lái)捕獲3xFLAG-IL-6。在1和100nM之間的一系列濃度測(cè)定抗-IL-6scFv。按之前針對(duì)測(cè)量抗-IL-6部分所述進(jìn)行雙特異性scFv的SPR；但是，需要修改流程來(lái)測(cè)定抗-IL-23scFv（31A12）的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。簡(jiǎn)言之，通過(guò)首先按所述但以恒定密度（～240RU）用IL-6固定雙特異性劑來(lái)進(jìn)行雙特異性劑對(duì)IL-23的結(jié)合。用上文詳述的相同參數(shù)以3至25nM的濃度測(cè)定重組人二聚體IL-23（34-8239,eBiosciences,SanDiego,CA）的結(jié)合和解離。實(shí)施例3：兔抗人IL-6單克隆抗體的產(chǎn)生3.1兔免疫：在第0、21和42天用SigmaAdjuvantSystem（SigmaS6322）中的100μgIL-6蛋白質(zhì)（重組大腸桿菌衍生的人IL-6，參考序列檢索號(hào)NP000591.1，獲自ProSpec-TanyTechnoGeneLtd.,Rehovot,以色列（Cat.#CYT-213i））免疫一只新西蘭白兔。采血前加強(qiáng)兔不少于10天。按NIH、USDA和IACUC指導(dǎo)將兔飼養(yǎng)在R&RResearchLaboratories（Stanwood,WA,美國(guó)）。3.2B細(xì)胞克?。和ㄟ^(guò)靜脈穿刺從每只兔收集30ml血。通過(guò)密度離心制備外周血單核細(xì)胞（PBMC）（淋巴細(xì)胞-兔，Cat.#CL5050，CedarlaneLaboratoriesLtd.,Ontario,加拿大）。3次免疫后測(cè)定免疫兔血清對(duì)人IL-6的中和活性。在有和無(wú)1:3200稀釋的免疫兔血清的情況下從1ng/ml滴定人IL-6。為了選擇對(duì)IL-6特異的B細(xì)胞，按以下用IL-6包被6cm組織培養(yǎng)皿：將His標(biāo)記的人IL-6（Cat.#CYT-484,Prospec-TanyTechnogene,Rehovot,以色列）捕獲在抗-His抗體包被的平板上。含2μg/ml抗-His抗體（Cat#A00613,GeneScriptCorp.,NewJersey,美國(guó)）的PBS在6cm塑料培養(yǎng)皿中4℃過(guò)夜孵育或37℃孵育1小時(shí)。然后去除抗體溶液，加入4mlPBS+5%BSA1小時(shí)。通過(guò)孵育3ml含2μg/mlHis-IL-6的PBS1小時(shí)，然后用PBS洗滌4次來(lái)捕獲IL-6。將PBMC懸浮在2ml含5%BSA的PBS中，接種在抗原包被的平皿上4℃40分鐘。然后用PBS洗滌平板4至8次，通過(guò)輕輕刮擦去除貼壁細(xì)胞。將這些細(xì)胞按100-500X103細(xì)胞/ml重懸在完全培養(yǎng)基（RPMI1640、10%FBS、非必需氨基酸、丙酮酸、50uMβ-巰基乙醇）中。除100μl含有5x105細(xì)胞/孔絲裂霉素-c處理的EL4-B5細(xì)胞（Zubler等1985）、20ng/ml重組人IL-2（GenScriptCorp,Piscataway,NJ,美國(guó)）和5%來(lái)自兔脾細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的完全培養(yǎng)基外，向96孔板的每個(gè)孔中加入100μl細(xì)胞懸液。簡(jiǎn)言之，將EL4-B5細(xì)胞按1x107細(xì)胞/ml的密度懸浮在含有50μg/ml絲裂霉素-c（Cat#M0503,Sigma-Aldrich）的RPMI中40分鐘，并在完全培養(yǎng)基中洗滌6次。按以下制備兔條件培養(yǎng)基：機(jī)械分離兔脾細(xì)胞，濾過(guò)70μm篩孔，按1x106細(xì)胞/ml重懸在完全培養(yǎng)基（RPMI1640、10%FBS、非必需氨基酸、丙酮酸、50uMβ-巰基乙醇）中。在37℃的CO2（5%）培養(yǎng)箱中用500ng/ml的洛諾霉素和5μg/ml的伴刀豆球蛋白A（Cat#C5275,Sigma-Aldrich）或40ng/ml的PMA刺激細(xì)胞48小時(shí)。對(duì)條件培養(yǎng)基進(jìn)行除菌過(guò)濾，并保存在-20℃用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)于一些實(shí)驗(yàn)，將絲裂霉素-c處理（如EL4-B5）的正常兔脾細(xì)胞按1-2x105細(xì)胞/孔加入克隆平板。將含有抗原選擇的細(xì)胞的平板在37℃、5%CO2下孵育7至10天。然后收集培養(yǎng)物上清來(lái)測(cè)定IL-6結(jié)合（ELISA）以及IL-6活性的抑制。用ELISA來(lái)評(píng)價(jià)IL-6結(jié)合。將100μl含0.25μg/ml重組IL-6（見實(shí)施例1）的PBS加入ELISA平板。在37℃孵育平板1小時(shí)或在4℃孵育過(guò)夜。向每個(gè)孔中加入100μl/孔的含10%山羊血清（Cat#16210-072,Invitrogen,美國(guó)）的PBS來(lái)封閉。室溫孵育平板1小時(shí)。用去離子水漂洗平板5次。向每個(gè)孔中加入50μlPBS/10%山羊血清。然后按50μl/孔加入測(cè)試樣品。室溫孵育平板1小時(shí)。用去離子水漂洗平板5次。向每個(gè)孔中加入100μl1:5000稀釋在PBS/10%山羊血清中的過(guò)氧化物酶綴合的山羊抗-兔IgG（Cat.#111-035-008,JacksonImmunoResearch）。室溫孵育平板1小時(shí)，然后用去離子水洗滌5次。按100μl/孔加入TMB底物（ThermoScientific,Rockford,IL.,美國(guó)）。用100μl1NH2SO4（JTBaker,Phillipsburg,NJ,美國(guó)）終止反應(yīng)。用MolecularDevicesM2酶標(biāo)儀在450nm測(cè)量吸光度。通過(guò)測(cè)量B9細(xì)胞響應(yīng)大腸桿菌或CHO細(xì)胞衍生的IL-6（Prospec-TanyTechnogene,Rehovot,以色列）的增殖，用使用依賴于IL-6的鼠B細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞系（B9細(xì)胞系；Aarden等,1987）的生物測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)IL-6抑制。將待測(cè)試中和活性的樣品稀釋在96孔組織培養(yǎng)板中的100μl測(cè)定培養(yǎng)基（RPMI1640w/L-谷氨酰胺、10%FBS、非必需氨基酸、丙酮酸鈉，50μM2-巰基乙醇）中。然后加入50μl含IL-6（Cat.#CYT-274Prospec-TanyTechnogene）的測(cè)定培養(yǎng)基，并在室溫孵育30分鐘。從細(xì)胞培養(yǎng)瓶回收B9細(xì)胞，并在180Xg離心7分鐘，將沉淀重懸在不含IL-6的培養(yǎng)基（RPMI1640w/L-谷氨酰胺、10%FBS、非必需氨基酸、丙酮酸鈉，50μM2-巰基乙醇）中。離心和重懸細(xì)胞三次來(lái)去除IL-6。通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排除測(cè)定生存力后，將細(xì)胞調(diào)節(jié)至1X105細(xì)胞/ml。向每個(gè)孔連同包含無(wú)IL-6培養(yǎng)基的適當(dāng)?shù)膶?duì)照孔中加入50μl體積的B9細(xì)胞（對(duì)應(yīng)于5X103個(gè)細(xì)胞）。在37℃、5%CO2下孵育平板48小時(shí)。隨后，向每個(gè)孔中加入20μl的AlamarBlue（Cat#DAL1100,Invitrogen,美國(guó)），并再孵育平板18小時(shí)。在MolecularDevices（Sunnyvale,CA,美國(guó)）M2酶標(biāo)儀上在570和600nm讀板。圖1顯示進(jìn)行來(lái)選擇產(chǎn)生適于進(jìn)一步表征的抗體的細(xì)胞的示例性實(shí)驗(yàn)：針對(duì)IL-6結(jié)合（下圖）和IL-6中和（上圖）二者測(cè)試每個(gè)上清。適于進(jìn)一步表征的上清在兩種測(cè)定中都是陽(yáng)性（箭頭和星號(hào)）。3.3從兔B細(xì)胞拯救V區(qū)V區(qū)拯救方法總結(jié)在圖2中。簡(jiǎn)言之，通過(guò)用反轉(zhuǎn)錄酶偶聯(lián)聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）擴(kuò)增來(lái)捕獲來(lái)自IL-6中和測(cè)試和IL-6結(jié)合測(cè)試二者都為陽(yáng)性的上清的IgG可變重鏈和輕鏈?？寺∵@樣獲得的VH和VLcDNA，并連接至人恒定區(qū)構(gòu)建體上，使得最終的cDNA構(gòu)建體編碼圖3中所示的嵌合兔人IgG。設(shè)計(jì)從激活的兔B細(xì)胞拯救免疫球蛋白V區(qū)的引物用于從細(xì)胞裂解后捕獲的mRNA合成cDNA以及隨后的PCR擴(kuò)增步驟，其中最后的PCR加入用于克隆入表達(dá)載體的限制酶位點(diǎn)。由于一只兔子可具有b9同種異型背景（Rader等,2000），有必要設(shè)計(jì)多種cDNA引物和嵌套J區(qū)引物，因?yàn)镴-κ和C-κ區(qū)使用在兔同種異型之間不同（Sehgal等,1990）。表1中顯示選擇用于RT和PCR步驟二者的DNA寡核苷酸引物的列表，右列中標(biāo)出它們的重鏈/輕鏈特異性。按廠家的說(shuō)明用來(lái)自Dynabeads（Cat.#610.21）的mRNADIRECTMicroKit裂解所選擇的陽(yáng)性B細(xì)胞并制備mRNA。為了回收v區(qū)，將產(chǎn)生自單個(gè)抗原陽(yáng)性孔的mRNA用于重鏈和輕鏈二者的一步RT/PCR（QiagenOneStepRT-PCRKit,cat.N.210212）反應(yīng)。對(duì)于反應(yīng)，用定位在兔IgG分子重鏈和輕鏈的恒定區(qū)中的基因特異性引物來(lái)產(chǎn)生單鏈cDNA，然后用嵌套J區(qū)引物與前導(dǎo)肽特異性引物一起進(jìn)行第一輪PCR來(lái)產(chǎn)生兔可變區(qū)。表1：用于V區(qū)拯救的引物組。進(jìn)行第二輪PCR來(lái)將限制位點(diǎn)加至拯救的V區(qū)用于亞克隆入包含人IgG1重鏈或輕鏈的恒定區(qū)的載體。對(duì)重鏈和輕鏈進(jìn)行分開的PCR。對(duì)于重鏈和輕鏈，加至V區(qū)的限制位點(diǎn)分別是HindIII/XhoI和NcoI/BsiW1。包含恒定區(qū)的載體獲自InvivoGen（pFUSE-CHIg-hG1#08E07-SV和pFUSE2-CLIg-hk#08F19-SV）。自己修飾兩種載體用于亞克隆策略。加入限制位點(diǎn)后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行相關(guān)限制酶消化，凝膠純化，并連接入適當(dāng)?shù)妮d體。亞克隆后，將連接的DNA轉(zhuǎn)化入DH5α大腸桿菌（Invitrogen）。將全部轉(zhuǎn)化混合物在含有適當(dāng)抗生素抗性的培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)。收集培養(yǎng)的細(xì)菌，分離并純化（Qiagen試劑盒）質(zhì)粒DNA用于嵌合抗體的瞬時(shí)HEK293表達(dá)。此時(shí)，分離的DNA可以是或不是一種具體V區(qū)同質(zhì)，因?yàn)樗x擇的孔可以包含一個(gè)或多個(gè)不同的B細(xì)胞克隆。為了產(chǎn)生嵌合抗體，用來(lái)自所選擇的孔的重鏈和輕鏈二者的DNA共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)3至5天后收集上清，并通過(guò)ELISA測(cè)定IgG和抗原結(jié)合，以及IL-6中和（方法見上文）。為了檢測(cè)IgG在轉(zhuǎn)染上清中的存在，進(jìn)行ELISA免疫測(cè)定，其利用包被于ELISA平板的抗-人IgGFc捕獲抗體，然后利用上清和人IgG標(biāo)準(zhǔn)品。用抗-人IgG（H&L）-HRP試劑和TMB底物獲得Fc捕獲的抗體的檢測(cè)。在每個(gè)孔可能存在一個(gè)以上獨(dú)特克隆的假設(shè)下，用DNA測(cè)序篩選每個(gè)ELISA陽(yáng)性孔來(lái)確定拯救了多少個(gè)獨(dú)特的重鏈和輕鏈組合。對(duì)于DNA測(cè)序，將之前分離用于轉(zhuǎn)染的DNA重新轉(zhuǎn)化入DH5α大腸桿菌，并接種在含有適當(dāng)抗生素的瓊脂平板上。從每個(gè)轉(zhuǎn)化挑取多個(gè)菌落，并按廠家的說(shuō)明用滾環(huán)DNA擴(kuò)增試劑盒（Templiphy,GEHealthcare）處理用于DNA產(chǎn)生。測(cè)序產(chǎn)生自Templiphy反應(yīng)的DNA，然后進(jìn)行分析來(lái)確定每個(gè)孔的V區(qū)的復(fù)雜性。除制備DNA外，保存用于Templiphy反應(yīng)的細(xì)菌用于以后的DNA分離，因?yàn)槊總€(gè)DNA現(xiàn)在代表獨(dú)特的克隆。序列分析后，使用從Templiphy反應(yīng)保存的細(xì)菌，獲得來(lái)自每個(gè)拯救孔的重鏈和輕鏈二者的每個(gè)獨(dú)特V區(qū)的DNA。匹配重鏈和輕鏈，并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入HEK293。在存在一種以上可能的重鏈和輕鏈組合（非克隆孔）時(shí)，轉(zhuǎn)染獨(dú)特的重鏈和輕鏈對(duì)的每種可能的組合。3至5天后收集上清，通過(guò)ELISA測(cè)定IgG和抗原結(jié)合，以及IL-6中和（方法見上文）。此去褶合步驟后，選擇保持希望的活性的重鏈和輕鏈組合用于人源化。以下抗體克隆符合抗原結(jié)合和抗原中和的標(biāo)準(zhǔn)，選擇它們用于進(jìn)一步研發(fā)：13A8：可變區(qū)重鏈（Vh）鑒定為SEQID6（氨基酸序列）、SEQID7（核苷酸序列）；可變區(qū)輕鏈（Vl）鑒定為SEQID8（氨基酸序列）、SEQID9（核苷酸序列）。13A8克隆顯示高效價(jià)，EC50（計(jì)算為抑制50pg/ml的IL-6的生物活性所必需的濃度）為34pg/ml（圖3A和B），及通過(guò)SPR分析測(cè)定的高親和力抗原結(jié)合特性：Kd1.38x10-4(s-1)；Ka6.33x105(M-1s-1)；和KD218pM。表2IDSEQID序列13A8VH-CDR110CDR1VHSYDMS13A8VH-CDR211CDR2VHYIYTDSSTWYANWAKG13A8VH-CDR312CDR3VHGSTDYAFDTRLDL13A8VK-CDR113CDR1VLQASQSISNELS13A8VK-CDR214CDR2VLRASTLTS13A8VK-CDR315CDR3VLQQGYNSNDVDNV28D2：可變區(qū)輕鏈（Vh）鑒定為SEQID16（氨基酸序列）和SEQID17（核苷酸序列）?？勺儏^(qū)輕鏈（Vl）鑒定為SEQID18（氨基酸序列）和SEQID19（核苷酸序列）。28D2克隆顯示高效價(jià)，EC50（計(jì)算為抑制50pg/ml的IL-6的生物活性所必需的濃度）為65pg/ml（圖3A和B）。表3IDSEQID序列28D2VH-CDR120CDR1VHKNAIA28D2VH-CDR221CDR2VHIIYAGGATTYASWAKG28D2VH-CDR322CDR3VHEYAGDSYYTGYTQLD28D2VK-CDR123CDR1VLQASEDLFSSLA28D2VK-CDR224CDR2VLSASTLAS28D2VK-CDR325CDR3VLLGLYYYLTPDPIYG18D4：可變區(qū)輕鏈（Vh）鑒定為SEQID26（氨基酸序列）和SEQID27（核苷酸序列）?？勺儏^(qū)輕鏈（Vl）鑒定為SEQID28（氨基酸序列）和SEQID29（核苷酸序列）。18D4克隆顯示高效價(jià)，EC50（計(jì)算為抑制50pg/ml的IL-6的生物活性所必需的濃度）為54pg/ml，及通過(guò)SPR分析測(cè)定的高親和力抗原結(jié)合特性：Kd8.49x10-5(s-1)；Ka6.66x105(M-1s-1)；和KD128pM。表4IDSEQID序列18D4VH-CDR130CDR1VHSYAMT18D4VH-CDR231CDR2VHTSYVYSGDTWYASWVKG18D4VH-CDR332CDR3VHVGDYDDYGAHDVFDS18D4VK-CDR133CDR1VLQASESISSWLS18D4VK-CDR234CDR2VLRASTLAS18D4VK-CDR335CDR3VLQQGYTGGNVDNA8C8：可變區(qū)輕鏈（Vh）鑒定為SEQID36（氨基酸序列）和SEQID37（核苷酸序列）?？勺儏^(qū)輕鏈（Vl）鑒定為SEQID38（氨基酸序列）和SEQID39（核苷酸序列）。8C8克隆最初的轉(zhuǎn)染上清顯示抑制生物活性的高效價(jià)。隨后，直接從兔IgG衍生scFv，這些顯示高效價(jià)，EC50（計(jì)算為抑制200pg/ml的IL-6的生物活性所必需的濃度）為510pg/ml（圖12A）。表5IDSEQID序列8C8VH-CDR140CDR1VHSSGVS8C8VH-CDR241CDR2VHYVSIADTISYANWAKG8C8VH-CDR342CDR3VHGFITYSGVL8C8VK-CDR143CDR1VLQASQSISNELS8C8VK-CDR244CDR2VLRTSTLAS8C8VK-CDR345CDR3VLQQGYNSNDVDNV9H4：可變區(qū)輕鏈（Vh）鑒定為SEQID46（氨基酸序列）和SEQID47（核苷酸序列）?？勺儏^(qū)輕鏈（Vl）鑒定為SEQID48（氨基酸序列）和SEQID49（核苷酸序列）。9H4克隆顯示高效價(jià)，EC50（計(jì)算為抑制50pg/ml的IL-6的生物活性所必需的濃度）為109pg/ml（圖3C、D、E），及通過(guò)SPR分析測(cè)定的高親和力抗原結(jié)合特性：Kd4.75x10-5(s-1)；Ka8.16x105(M-1s-1)；和KD58pM。表6IDSEQID序列9H4VH-CDR150CDR1VHSYDMS9H4VH-CDR251CDR2VHYIYTDTSTYYANWAKG9H4VH-CDR352CDR3VHGSTDYAFDTRLDL9H4VK-CDR153CDR1VLQASQSISNELS9H4VK-CDR254CDR2VLRTSTLAS9H4VK-CDR355CDR3VLQQGYNSNDVDNV9C8：可變區(qū)輕鏈（Vh）鑒定為SEQID56（氨基酸序列）和SEQID57（核苷酸序列）?？勺儏^(qū)輕鏈（Vl）鑒定為SEQID58（氨基酸序列）和SEQID59（核苷酸序列）。9C8克隆顯示高活性和抗原結(jié)合特性，EC50（計(jì)算為抑制50pg/ml的IL-6的生物活性所必需的濃度）為400pg/ml（圖3E）；Kd3.17x10-5(s-1)；Ka7.65x105(M-1s-1)；和KD42pM。表7IDSEQID序列9C8VH-CDR160CDR1VHSYDMS9C8VH-CDR261CDR2VHYIYTDSSTYYANWAKG9C8VH-CDR362CDR3VHGSTDYAFDTRLDL9C8VK-CDR163CDR1VLQASQSISNELS9C8VK-CDR264CDR2VLRTSTLAS9C8VK-CDR365CDR3VLQQGYNSNDVDNV3.4對(duì)靈長(zhǎng)類IL-6的反應(yīng)性用于人治療的任意細(xì)胞因子拮抗劑的成功研發(fā)將需要最初的毒理學(xué)測(cè)試。在非人物種中最有效地顯示毒理學(xué)。為了進(jìn)行毒理學(xué)研究，首先有必要證明抗體中和來(lái)自考慮用于研究的物種的IL-6的能力。圖3中顯示針對(duì)非人靈長(zhǎng)類IL-6活性的中和進(jìn)行了測(cè)試的抗-IL-6嵌合抗體中的幾種。實(shí)施例4：兔抗人IL-23單克隆抗體的產(chǎn)生4.1兔免疫在第0、21和42天用SigmaAdjuvantSystem（SigmaS6322）中的100μgIL-23蛋白質(zhì)（桿狀病毒衍生的由p40鏈（檢索號(hào)NM_002187）和p19鏈（檢索號(hào)NM_016584）組成的重組人IL-23，來(lái)自eBiosciences,SanDiegoCA,美國(guó)（Cat.#34-8239））免疫一只新西蘭白兔（NZW）和一只B9兔。免疫至少10天后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行采血。按NIH、USDA和IACUC指導(dǎo)將兔飼養(yǎng)在ResearchLaboratories（Stanwood,WA,美國(guó)）和SpringValleyLaboratories（Woodbine,MD,美國(guó)）。NZW和B9兔表達(dá)不同的免疫球蛋白基因同種異型，其對(duì)應(yīng)于構(gòu)架和CDR區(qū)中的差異，分離mAb結(jié)構(gòu)中對(duì)應(yīng)的差異。據(jù)報(bào)道，由于V區(qū)中缺乏Cys殘基，將b9同種異型兔用于mAb的噬菌體展示克隆更好。所有抗IL-6mAb都克隆自NZW兔，沒有一個(gè)在V區(qū)中存在Cys殘基。測(cè)量了來(lái)自用人IL-23免疫的B9和NZW兔的高效價(jià)血清的IL-23中和活性。來(lái)自免疫兔的血清能夠在接近1:10,000的稀釋度下完全中和由600pg/ml人IL-23誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞分泌的IL-17A。4.2B細(xì)胞克隆按實(shí)施例3中選擇對(duì)IL-23特異的B細(xì)胞。通過(guò)密度離心從每只兔制備外周血單核細(xì)胞（PBMC）（淋巴細(xì)胞-兔，Cat.#CL5050，CedarlaneLaboratoriesLtd.,Ontario,加拿大）。通過(guò)用含2μg/mlIL23（eBioscience）的PBS在4℃過(guò)夜孵育或在37℃孵育1小時(shí)來(lái)產(chǎn)生IL-23包被的平板，用PBS洗滌4次，并用于捕獲B細(xì)胞。將PBMC懸浮在2ml含5%BSA的PBS中，接種在抗原包被的平皿上4℃40分鐘。然后用PBS洗滌平板4至8次，通過(guò)輕輕刮擦去除貼壁細(xì)胞。將細(xì)胞接種在兔脾細(xì)胞條件培養(yǎng)基和IL4-B5細(xì)胞（見實(shí)施例1）中，并在37℃、5%CO2下孵育7至10天。然后收集培養(yǎng)物上清，并測(cè)試IL-23結(jié)合（ELISA）及IL-23活性的抑制。用ELISA測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)IL-23結(jié)合（Aggarwal等,2003）。用直接或間接結(jié)合IL-23的方法包被ELISA平板。對(duì)于間接結(jié)合法，向平板中加入100μl/孔含0.01-0.02ug/ml抗-His抗體（Cat#A00613,GenScriptCorp.,NewJersey,美國(guó)）的PBS。37℃孵育平板1小時(shí)或4℃孵育過(guò)夜。向各孔中加入100μl/孔含10%山羊血清（Cat#16210-072,Invitrogen,美國(guó)）的PBS來(lái)封閉非特異性結(jié)合，然后用去離子水漂洗平板5次。加入100μl/孔含0.5μg/ml的IL-23p40-p19-His（SEQID4）的PBS/10%山羊血清，并在室溫孵育1小時(shí)。對(duì)于直接結(jié)合法，向ELISA平板中加入100μl含0.5μg/ml的IL-23p40-p19-His（SEQIDNO.4）的PBS。37℃孵育平板1小時(shí)或4℃孵育過(guò)夜。向各孔中加入100μl/孔含10%山羊血清（Cat#16210-072,Invitrogen,美國(guó)）的PBS來(lái)封閉非特異性結(jié)合。室溫孵育平板1小時(shí)。IL-23結(jié)合后，用去離子水漂洗平板5次。向每個(gè)孔中加入50μlPBS/10%山羊血清。然后按50μl/孔加入測(cè)試樣品。室溫孵育平板1小時(shí)，并用去離子水漂洗5次。向每個(gè)孔中加入100μl1:5000稀釋在PBS/10%山羊血清中的過(guò)氧化物酶綴合的山羊抗-兔IgG（Cat.#111-035-008,JacksonImmunoResearch）。室溫孵育平板1小時(shí)，然后用去離子水洗滌5次。按100μl/孔加入TMB底物（ThermoScientific,Rockford,IL.,美國(guó)）。用100μl1NH2SO4（JTBaker,Phillipsburg,NJ,美國(guó)）終止反應(yīng)。用MolecularDevicesM2酶標(biāo)儀在450nm測(cè)量吸光度。用生物測(cè)定來(lái)檢測(cè)抗體介導(dǎo)的IL-23與IL-23受體的結(jié)合及產(chǎn)生的生物活性的抑制，該生物測(cè)定基于IL-23誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞表達(dá)IL-17的檢測(cè)。將5x105C57Bl/6脾細(xì)胞在200μl包含異二聚體IL-23（eBiosciencecat.#14-8239或Humanzyme,Chicago,美國(guó)cat.#HZ-1049）稀釋液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)于96孔板的孔中，并在37℃孵育平板2-3天。培養(yǎng)基是RPMI1640、10%FBS、50uM2-巰基乙醇、非必需氨基酸、丙酮酸、慶大霉素和10ng/ml人IL-2（Cat#CYT-209,Prospec-TanyTechnogene）。3天后，按下文所述通過(guò)ELISA測(cè)定培養(yǎng)物上清的IL-17A。為了測(cè)定IL-23抑制，將測(cè)試mAb樣品按多種稀釋度加至含有150-1200pg/mlIL-23的小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物，并將IL-17A的分泌與未用mAb處理的培養(yǎng)物相比較。用ELISA測(cè)定來(lái)檢測(cè)小鼠IL-17。用含1μg/ml抗-mIL-17A（eBioscience#14-7178）的100μlPBS在4℃過(guò)夜包被平板或在37℃包被1小時(shí)。在去離子水中洗滌平板，并用100μlPBS，10%山羊血清封閉1小時(shí)。洗滌平板后，向平板中加入50μlPBS/10%山羊血清和50μl培養(yǎng)物上清，并孵育1小時(shí)。洗滌平板，加入100μl/孔含0.5μg/ml抗-mIL-17A-生物素（eBioscience#13-7179）的PBS/10%山羊血清，室溫孵育平板1小時(shí)，洗滌，并與100μl/孔1:1000稀釋在PBS/10%山羊血清中的鏈霉抗生物素蛋白-HRP（JacksonLabs）反應(yīng)。再次洗滌平板，并通過(guò)加入100μl/孔TMB底物（ThermoScientific,IL,美國(guó)）來(lái)檢測(cè)信號(hào)。用100μl/孔1NH2SO4終止反應(yīng)后，在450nM讀取光密度。用Graphpad（Prism,Mountainview,CA）軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖和分析。從IL-23免疫的兔克隆B細(xì)胞，并測(cè)試B細(xì)胞克隆上清的IL-23中和及IL-23結(jié)合。圖7顯示來(lái)自實(shí)驗(yàn)的實(shí)例96孔板，其中測(cè)試每種上清的IL-23結(jié)合（下圖）和IL-23中和（上圖）二者，適于進(jìn)一步表征的上清在兩種測(cè)試中都為陽(yáng)性。4.3從激活的B細(xì)胞拯救V區(qū)基本上按實(shí)施例3中，通過(guò)RT-PCR來(lái)捕獲來(lái)自IL-23中和測(cè)定和IL-23結(jié)合測(cè)定二者都為陽(yáng)性的B細(xì)胞的IgG可變重鏈和輕鏈。圖5A-I顯示所獲得的幾種抗IL-23中和性mAb的人IL-23中和活性的實(shí)例。如圖6中所示，在它們與靈長(zhǎng)類IL-23的結(jié)合中進(jìn)一步表征了幾種抗體。如圖8A中所示，進(jìn)一步測(cè)試中和IL-23的單克隆抗體的人IL-12的中和。mAb31A12特異性中和IL-23，而45G5和22H8中和IL-23和IL-12二者。可以通過(guò)幾種實(shí)驗(yàn)方法（如交叉競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定或與線性肽結(jié)合）來(lái)達(dá)到本發(fā)明的抗體識(shí)別的表位的作圖?？梢酝ㄟ^(guò)單克隆抗體或其抗體片段和抗原復(fù)合物的共結(jié)晶來(lái)獲得詳細(xì)的表位作圖。備選方法在mAb的存在下用氘標(biāo)記后使用抗原肽的液相色譜質(zhì)譜（LCMS）分析。非氘殘基代表受mAb保護(hù)的那些。選擇以下符合抗原結(jié)合、抗原中和及IL-23的選擇性結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)的單克隆抗體用于進(jìn)一步研發(fā)：31A12：可變區(qū)重鏈（Vh）鑒定為SEQID86（氨基酸序列）；SEQID87（核苷酸序列）；可變區(qū)輕鏈（Vl）鑒定為SEQID88（氨基酸序列）；SEQID89（核苷酸序列）。31A12mAb顯示高效價(jià)和抗原結(jié)合特性，EC50（計(jì)算為抑制600pg/ml的IL-23的生物活性所必需的濃度）為3286pg/ml，及通過(guò)SPR分析測(cè)定的高親和力抗原結(jié)合特性：Kd2.02x10-4(s-1)；Ka4.79x105(M-1s-1)；和KD422pM。表8IDSEQID序列31A12VHCDR190CDR1VHSYWMT31A12VHCDR291CDR2VHTIATSSTYYASWAKG31A12VHCDR392CDR3VHGLTTDYDLDL31A12VKCDR193CDR1VLQASEDIESYLA31A12VKCDR294CDR2VLSASTLTS31A12VKCDR395CDR3VLLGADDTTTV49B7：可變區(qū)輕鏈（Vh）鑒定為SEQID96（氨基酸序列）和SEQID97（核苷酸序列）?？勺儏^(qū)輕鏈（Vl）鑒定為SEQID99（氨基酸序列）和SEQID99（核苷酸序列）。49B7mAb顯示高效價(jià)，EC50（計(jì)算為抑制600pg/ml的IL-23的生物活性所必需的濃度）為988pg/ml。表9IDSEQID序列49B7VHCDR1100CDR1VHDYDMS49B7VHCDR2101CDR2VHIVYDIGTIYYAPWAEG49B7VHCDR3102CDR3VHEAPGYSDGDI49B7VKCDR1103CDR1VLQASETVDNNKRLS49B7VKCDR2104CDR2VLGAATLAS49B7VKCDR3105CDR3VLGGYKDSTDVG16C6：可變區(qū)輕鏈（Vh）鑒定為SEQID106（氨基酸序列）和SEQID107（核苷酸序列）?？勺儏^(qū)輕鏈（Vl）鑒定為SEQID108（氨基酸序列）和SEQID109（核苷酸序列）。16C6mAb顯示高效價(jià)，EC50（計(jì)算為抑制150pg/ml的IL-23的生物活性所必需的濃度）為219pg/ml。表10IDSEQID序列16C6VHCDR1110CDR1VHTVSGFSLNSYSMS16C6VHCDR2111CDR2VHVIGLGGSAYYASWAK16C6VHCDR3112CDR3VHATYSDDNI16C6VKCDR1113CDR1VLQASQSISSWLS16C6VKCDR2114CDR2VLRASTLAS16C6VKCDR3115CDR3VLLGGDGNVSN34E11：可變區(qū)輕鏈（Vh）鑒定為SEQID116（氨基酸序列）和SEQID117（核苷酸序列）。可變區(qū)輕鏈（Vl）鑒定為SEQID118（氨基酸序列）和SEQID119（核苷酸序列）。34E11克隆顯示高效價(jià)，EC50（計(jì)算為抑制150pg/ml的IL-23的生物活性所必需的濃度）為50pg/ml。表11IDSEQID序列34E11VHCDR1120CDR1VHTYDIN34E11VHCDR2121CDR2VHYIYRGSPYYADWAKG34E11VHCDR3122CDR3VHNLYSVNVL34E11VKCDR1123CDR1VLQASQSISSRLA34E11VKCDR2124CDR2VLSASTLAS34E11VKCDR3125CDR3VLLGSYSNTIRT35H4：可變區(qū)輕鏈（Vh）鑒定為SEQID126（氨基酸序列）和SEQID127（核苷酸序列）?？勺儏^(qū)輕鏈（Vl）鑒定為SEQID128（氨基酸序列）和SEQID129（核苷酸序列）。相對(duì)于在同一B細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)中分離的其他mAb，35H4克隆在所克隆的mAb的轉(zhuǎn)染上清中顯示高效價(jià)。表12IDSEQID序列35H4VHCDR1130CDR1VHDYDMS35H4VHCDR2131CDR2VHIVYDIGTIYYAPWAEG35H4VHCDR3132CDR3VHEAPGYSDGDI35H4VKCDR1133CDR1VLQASETVGNNNRLS35H4VKCDR2134CDR2VLGAATLAS35H4VKCDR3135CDR3VLGGYKDSTDVG實(shí)施例5：兔抗人IL-23/IL-12單克隆抗體的產(chǎn)生如圖8A中所示，可能將中和IL-23的抗體進(jìn)一步分為IL-23特異的那些及中和IL-23和IL-12二者的那些。IL-12和IL-23具有共同的p40多肽，而在與p40共價(jià)連接的第二鏈中不同（圖7A）。IL-23的p19鏈和IL-12的p35鏈都是四螺旋束細(xì)胞因子樣多肽。p19和p40亞基通過(guò)二硫鍵與共同的p40亞基連接。由于兩個(gè)分子間共享p40鏈而存在中和IL-12和IL-23二者的抗體。IL-12和IL-23受體具有共同鏈（IL-12Rβ1），此外，各具有獨(dú)特的受體成分（IL-23R和IL-12Rβ2）（圖7B）。這些差異導(dǎo)致IL-12和IL-23所用靶細(xì)胞和信號(hào)傳導(dǎo)途徑的顯著差異。這些受體具有與JAK2或TYK2酪氨酸激酶配對(duì)用于STAT激活的跨膜信號(hào)發(fā)放結(jié)構(gòu)域。從用重組IL-23免疫的兔分離結(jié)合IL-23和IL-12二者的抗體（見實(shí)施例4）。選擇對(duì)IL-23和IL-12二者顯示結(jié)合和功能活性的B細(xì)胞克隆進(jìn)行進(jìn)一步表征。針對(duì)IL-23的中和測(cè)試來(lái)自B細(xì)胞的嵌合IgG的初級(jí)拯救轉(zhuǎn)染。對(duì)成功中和IL-23的那些進(jìn)行測(cè)序和亞克隆，并重新轉(zhuǎn)染，定量轉(zhuǎn)染上清中的mAb。確認(rèn)這些mAb的抗IL-23活性（圖8B-E），然后針對(duì)IL-12（圖8F-G）和靈長(zhǎng)類IL-23（圖8H，I）的中和進(jìn)行測(cè)試。選擇以下符合抗原結(jié)合、抗原中和及IL-12和IL-23的選擇性結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)的單克隆抗體用于進(jìn)一步研發(fā)：22H8：可變區(qū)重鏈（Vh）鑒定為SEQID136（氨基酸序列）；SEQID137（核苷酸序列）；可變區(qū)輕鏈（Vl）鑒定為SEQID138（氨基酸序列）；SEQID139（核苷酸序列）。mAb22H8顯示高效價(jià)和抗原結(jié)合特性，EC50（計(jì)算為抑制50pg/ml的IL-6的生物活性所必需的濃度）為603pg/ml，及通過(guò)SPR分析測(cè)定的高親和力抗原結(jié)合特性：Kd8.94x10-5(s-1)；Ka4.03x105(M-1s-1)；和KD221pM。表13IDSEQID序列22H8VHCDR1140CDR1VHTYTMN22H8VHCDR2141CDR2VHAISYDGGTAYANWAKG22H8VHCDR3142CDR3VHGFYVYAYIGDAFDP22H8VKCDR1143CDR1VLQSSQTVYKNNLLS22H8VKCDR2144CDR2VLLASTLAS22H8VKCDR3145CDR3VLLGGYDDDADTA45G5：可變區(qū)重鏈（Vh）鑒定為SEQID146（氨基酸序列）；SEQID147（核苷酸序列）；可變區(qū)輕鏈（Vl）鑒定為SEQID148（氨基酸序列）；SEQID149（核苷酸序列）。mAb45G5顯示高效價(jià)和抗原結(jié)合特性，EC50（計(jì)算為抑制50pg/ml的IL-6的生物活性所必需的濃度）為385pg/ml。表14IDSEQID序列45G5VHCDR1150CDR1VHVYPIN45G5VHCDR2151CDR2VHIINDVDDTAYSAWAKG45G5VHCDR3152CDR3VHGYLSYAYAGDAFDP45G5VKCDR1153CDR1VLQSSQSIYNNNLLS45G5VKCDR2154CDR2VLFASTLAS45G5VKCDR3155CDR3VLLGGYDDDADTA1H1：可變區(qū)重鏈（Vh）鑒定為SEQID156（氨基酸序列）；SEQID157（核苷酸序列）；可變區(qū)輕鏈（Vl）鑒定為SEQID158（氨基酸序列）；SEQID159（核苷酸序列）。mAb1H1顯示高效價(jià)和抗原結(jié)合特性，EC50（計(jì)算為抑制50pg/ml的IL-6的生物活性所必需的濃度）為603pg/ml。表15IDSEQID序列1H1VHCDR1160CDR1VHTASGLTLGSYSMT1H1VHCDR2161CDR2VHVIGVGGTLNYASWAQ1H1VHCDR3162CDR3VHGTYSGDSI1H1VKCDR1163CDR1VLQASQSISSWLA1H1VKCDR2164CDR2VLRASILTS1H1VKCDR3165CDR3VLLGGDGHVSN4F3：可變區(qū)重鏈（Vh）鑒定為SEQID166（氨基酸序列）；SEQID167（核苷酸序列）；可變區(qū)輕鏈（Vl）鑒定為SEQID168（氨基酸序列）；SEQID169（核苷酸序列）。mAb4F3顯示高效價(jià)和抗原結(jié)合特性，EC50（計(jì)算為抑制50pg/ml的IL-6的生物活性所必需的濃度）為2339pg/ml。表16IDSEQID序列4F3VHCDR1170CDR1VHGYTMI4F3VHCDR2171CDR2VHIISSSGNTYYASWVKG4F3VHCDR3172CDR3VHGSGAYISDYFNV4F3VKCDR1173CDR1VLQASQSIDSWLS4F3VKCDR2174CDR2VLSASKLAP4F3VKCDR3175CDR3VLQSYYDVNAGYG5C5：可變區(qū)重鏈（Vh）鑒定為SEQID176（氨基酸序列）；SEQID177（核苷酸序列）；可變區(qū)輕鏈（Vl）鑒定為SEQID178（氨基酸序列）；SEQID179（核苷酸序列）。mAb5C5顯示高效價(jià)和抗原結(jié)合特性，EC50（計(jì)算為抑制50pg/ml的IL-6的生物活性所必需的濃度）為1907pg/ml。表17IDSEQID序列5C5VHCDR1180CDR1VHSYTMI5C5VHCDR2181CDR2VHIISAGGSAYYASWVNG5C5VHCDR3182CDR3VHGSGTYTSDYFNI5C5VKCDR1183CDR1VLQASQSIDSWLA5C5VKCDR2184CDR2VLSASKLAT5C5VKCDR3185CDR3VLQSYYDANAGYG14B5：可變區(qū)重鏈（Vh）鑒定為SEQID186（氨基酸序列）；SEQID187（核苷酸序列）；可變區(qū)輕鏈（Vl）鑒定為SEQID188（氨基酸序列）；SEQID189（核苷酸序列）。mAb14B5顯示高效價(jià)和抗原結(jié)合特性，EC50（計(jì)算為抑制50pg/ml的IL-6的生物活性所必需的濃度）為767pg/ml。表18IDSEQID序列14B5VHCDR1190CDR1VHDYTMI14B5VHCDR2191CDR2VHIISSSGNTYYATWVKG14B5VHCDR3192CDR3VHGSGAYISDYFNV14B5VKCDR1193CDR1VLQASQSIDSWLS14B5VKCDR2194CDR2VLAASKLAT14B5VKCDR3195CDR3VLQSYYDVNAGYG5.1IL-12生物測(cè)定用IL-12反應(yīng)細(xì)胞系NK-92（CRL-2407,ATCC,Manassas,Virginia,美國(guó)）測(cè)定抗體的IL-12中和能力。將50μl來(lái)自B細(xì)胞克隆平板的培養(yǎng)物上清或50μl來(lái)自抗體轉(zhuǎn)染的上清轉(zhuǎn)移至96孔組織培養(yǎng)板。向每個(gè)孔中加入50μl4ng/ml的人IL-12（Cat.#Cyt-362,Prospec-TanyTechnogene,Rehovot,以色列）。室溫孵育平板30-60分鐘，然后向每個(gè)孔中加入100μl中的5x104NK-92細(xì)胞。37℃孵育培養(yǎng)物3天，并針對(duì)人干擾素-γ的產(chǎn)生測(cè)定上清。測(cè)定培養(yǎng)基是RPMI1640、10%FBS、NEAA、丙酮酸、50μM2-巰基乙醇、慶大霉素和10ng/ml人IL-2（Cat#Z00368,GeneScriptCorporation,Piscataway,NJ,美國(guó)）。干擾素-γELISA用ELISA測(cè)定來(lái)檢測(cè)人干擾素-γ。用含1μg/ml抗-人干擾素-γ（Cat.#Mab1-D1K,Mabtech,Cincinnati,OH,美國(guó)）的100μlPBS在4℃過(guò)夜包被平板或在37℃包被1小時(shí)。在去離子水中洗滌平板，并用100μlPBS，10%山羊血清封閉1小時(shí)。洗滌平板后，向平板中加入50μlPBS/10%山羊血清和50μl培養(yǎng)物上清，并孵育1小時(shí)。洗滌平板，加入100μl/孔含0.5μg/ml抗-人干擾素-γ-生物素（Cat#Mab7b6-1-biotin,Mabtech）的PBS/10%山羊血清，室溫孵育平板1小時(shí)，洗滌，并與100μl/孔1:1000稀釋在PBS/10%山羊血清中的鏈霉抗生物素蛋白-HRP（JacksonLabs）反應(yīng)。再次洗滌平板，并通過(guò)加入100μl/孔TMB底物（ThermoScientific,IL,美國(guó)）來(lái)檢測(cè)信號(hào)。用100μl/孔1NH2SO4終止反應(yīng)后，在450nM讀取光密度。實(shí)施例6：人源化scFv的改造人源化簡(jiǎn)介從分離自來(lái)自免疫兔的外周血B細(xì)胞的mRNA捕獲兔免疫球蛋白可變區(qū)（V區(qū)）。將這些兔B細(xì)胞以低密度接種在96孔板中，并按之前所述激活。用反轉(zhuǎn)錄酶PCR（RT-PCR）從每個(gè)孔的mRNA擴(kuò)增V區(qū)cDNA，來(lái)自恒定區(qū)的基因特異性引物用于第一鏈合成，3’端的嵌套J區(qū)特異性引物和5’前導(dǎo)序列引物用于PCR步驟。然后將V區(qū)克隆入人IgG重鏈、κ或λ輕鏈載體盒，在HEK293細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，針對(duì)總IgG表達(dá)和各自靶標(biāo)的中和測(cè)試上清。然后測(cè)序有效的中和劑來(lái)確定存在于亞克隆它們的孔中的復(fù)雜性水平。一旦確定獨(dú)特的輕鏈和重鏈的數(shù)目，即再次在HEK293中瞬時(shí)表達(dá)存在的所有可能的組合，測(cè)定中和和IgG含量。然后進(jìn)一步測(cè)定有效的中和劑的其他希望的活性。針對(duì)來(lái)自非人靈長(zhǎng)類的IL-6的中和測(cè)試抗-人IL-6抗體。不僅針對(duì)非人靈長(zhǎng)類IL-23的中和，還針對(duì)人IL-12的中和測(cè)定抗-人IL-23抗體，因?yàn)镮L-12二聚體和IL-23二聚體二者具有相同的p19鏈。發(fā)明人遵循兩種策略：它們通過(guò)以VLVH或VHVL取向PCR遺傳融合重鏈和輕鏈V區(qū)，在兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間引入由序列g(shù)ly-gly-gly-gly-ser（G4S）的四個(gè)串聯(lián)重復(fù)組成的20個(gè)氨基酸的接頭，直接從選擇的重鏈（VH）和輕鏈（VK或VL）構(gòu)建兔scFv。兔scFv在評(píng)估從嵌合抗體轉(zhuǎn)化為scFv形式是否對(duì)V區(qū)對(duì)的功能特性或生物物理特性具有副作用中有幫助。然后在HEK293中瞬時(shí)表達(dá)scFv，并測(cè)定圖12A中所示的功能。選擇有效的中和劑進(jìn)行人源化（見6.1部分）。備選地，以scFv形式直接人源化兔V區(qū)（見下文6.2）。可以以包括全長(zhǎng)抗體和單鏈Fv（scFv）二者的許多不同形式人源化免疫球蛋白V區(qū)。由于所述發(fā)明依賴于原核重組蛋白質(zhì)表達(dá)，不希望得到全長(zhǎng)抗體結(jié)構(gòu)。但是，本發(fā)明確實(shí)描述以抗體形式成功人源化兔V區(qū)。無(wú)論什么形式，本發(fā)明涉及去除任意天然存在的甲硫氨酸殘基，用其他氨基酸取代它們。由于甲硫氨酸殘基常見于免疫球蛋白V區(qū)的構(gòu)架區(qū)和CDR內(nèi)，有必要為這些殘基找到適合的取代，其中它們的存在不影響希望的蛋白質(zhì)的表達(dá)、穩(wěn)定性或功能。然后可以優(yōu)化這種不含甲硫氨酸的scFv用于在甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)菌菌株中表達(dá)，純化，重折疊，并測(cè)試生物學(xué)活性。成功的人源化和隨后的甲硫氨酸取代提供了部分治療載體，該載體可以通過(guò)插入用作非天然氨基酸插入位點(diǎn)的單個(gè)甲硫氨酸密碼子來(lái)進(jìn)行化學(xué)修飾，該非天然氨基酸具有用于共價(jià)連接其他互補(bǔ)分子（如活化的PEG部分）的化學(xué)反應(yīng)位點(diǎn)。然后可以通過(guò)PEG聚合物保留端的類似反應(yīng)基團(tuán)與另一個(gè)這種scFv共價(jià)連接來(lái)進(jìn)一步修飾此PEG化scFv。然后可以純化此雙特異性PEG化產(chǎn)物并重折疊，以產(chǎn)生穩(wěn)定、具有生物學(xué)活性的治療性蛋白質(zhì)。6.1全長(zhǎng)抗體人源化方法可以將兔-人嵌合單克隆抗體人源化為全長(zhǎng)抗體。這需要用人VH和VL構(gòu)架區(qū)交換兔構(gòu)架區(qū)，保留兔CDR，且通常包括保留特定兔構(gòu)架殘基。正如存在多種用于人源化嚙齒類V區(qū)的策略，存在可以通過(guò)其來(lái)部分或完全人源化兔-人嵌合抗體的其他可能的方法。我們?cè)诖嗣枋鲇脕?lái)以抗體形式人源化抗-人IL-6克隆9C8的方法。通過(guò)將VH和VL的構(gòu)架區(qū)換為人構(gòu)架序列（有限地回復(fù)突變?yōu)橥脴?gòu)架序列）來(lái)人源化9C8（高親和力和高效價(jià)的嵌合mAb）。通過(guò)首先將它們的一級(jí)氨基酸序列與見于人V區(qū)中的那些（Altschul等,1990）相比較來(lái)達(dá)到人源化NZW兔V區(qū)。根據(jù)構(gòu)架區(qū)（FR1、FR2、FR3和FR4）內(nèi)的序列相似性、互補(bǔ)決定區(qū)（CDR1、CDR2和CDR3）內(nèi)的序列長(zhǎng)度和含量以及已知對(duì)支持IgV規(guī)范環(huán)結(jié)構(gòu)至關(guān)重要的關(guān)鍵FR殘基來(lái)進(jìn)行可能相容的人V區(qū)構(gòu)架的選擇。用這些數(shù)據(jù)來(lái)為輕鏈和重鏈V區(qū)二者選擇人構(gòu)架，并通過(guò)使用重疊寡核苷酸引物（表19）的PCR來(lái)將兔CDR移植到圖15中所示的這些構(gòu)架上。對(duì)于9C8的人源化，將兔的Vκ構(gòu)架換為人構(gòu)架DPK8VK1，而兔的VH構(gòu)架換為人的DP42VH3-53構(gòu)架。所有CDR均為兔。產(chǎn)生了兩種形式（v1和v2）的重鏈（見下文）。這兩種形式在鄰近CDR1VH的構(gòu)架區(qū)（殘基H23-20）中不同。此處的內(nèi)源9C8兔構(gòu)架區(qū)是用于v2的氨基酸序列TVSGIDLS。對(duì)于v1，將此序列的前兩個(gè)構(gòu)架殘基（兔中的TV）換為在同源的人VH3構(gòu)架位置中高度保守的AA。將親本嵌合9C8mAb與人源化形式9C8mAbv1和mAbv2并排比較（圖9B）。兩種形式都保留完全活性。9C8v1和v2中的構(gòu)架和CDR1VH變異：9C8v1FWVH回復(fù)突變（H23-30）：AASGIDLS（SEQIDNO.355）CDR1VH（H31-35）：SYDMS9C8v2FW-VH回復(fù)突變（H23-30）：TVSGIDLS（SEQIDNO.356）CDR1VH（H31-35）：SYDMS圖9B顯示親本嵌合9C8mAb與包含鄰近VH區(qū)CDR1的2個(gè)不同的兔回復(fù)突變（在位置H23-H30）的人源化9C8mAb（9C8mAbv1和9C8mAbv2）的并排比較。通過(guò)按之前所述將重鏈和輕鏈DNA二者瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞來(lái)表達(dá)人源化單克隆抗體9C8mAbv1（在VH殘基23-24處包含TV）和9C8mAbv2（23-24為AA）。針對(duì)50pg/ml的IL-6的中和測(cè)試人源化單克隆抗體，如所示，這些改變（TVSGIDLS（mAbv2）或AASGIDLS（mAbv1））不影響功能活性（圖9B）。圖9C中進(jìn)一步將9C8mAbv1與人源化mAb18D4相比較。表19用來(lái)將兔CDR移植到所選擇的人V區(qū)構(gòu)架上的寡核苷酸引物。用于擴(kuò)增人源化V區(qū)的引物編碼與前一實(shí)施例中用來(lái)捕獲兔V區(qū)并在圖10中顯示的那些相同的限制酶位點(diǎn)。以這種方式將人源化輕鏈連接至含有Cκ的表達(dá)載體，人源化重鏈V區(qū)連接至含有Cγ1的表達(dá)載體，并按之前所述轉(zhuǎn)化入大腸桿菌。然后篩選和測(cè)序分離的菌落。表20從人源化mAbv1（TV）和mAbv2（AA）衍生人源化9C8scFv。產(chǎn)生的scFv保留鄰近VH1CDR1的兔構(gòu)架1殘基（23-30）。這些scFv也在H34和H82處保留內(nèi)源甲硫氨酸殘基。然后從這些scFv產(chǎn)生9C8的最終形式的人源化scFv，但取代新的構(gòu)架DPK5,6/DP47。這些新的人源化scFvs（9C8HumscFvv3-1和9C8HumscFvv3-2）顯示有效的抗IL-6中和活性（圖9D）。6.2V區(qū)的一步人源化及從兔-人嵌合mAb產(chǎn)生scFv還可以以scFv形式直接人源化兔V區(qū)。雖然所使用的人源化方法通常與用于人源化單克隆抗體的那些相同，但并非所有人源化抗體都易于轉(zhuǎn)化為scFv。此外，抗體的人源化具有對(duì)恒定區(qū)與移植的CDR的相互作用負(fù)責(zé)的要求。按實(shí)施例6.1中所述用V-base（http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/）及IgBLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）將重鏈和輕鏈V區(qū)二者的序列與人種系序列和表達(dá)的序列相比較。大多數(shù)克隆的兔VH和VL區(qū)分別密切匹配人IGVH3（IGHV3-66，IGHV3-49）和IGVK1（DPK-9）家族的成員，但因其在位置L4上缺乏甲硫氨酸而用DPK-8（VK1LocusL8，V-BASE數(shù)據(jù)庫(kù)）作為輕鏈構(gòu)架（見6.1部分）。設(shè)計(jì)人源化scFv編碼5’NotI限制酶位點(diǎn)，隨后是Kozak盒（Kozak,1987）、IgVK3前導(dǎo)序列（L2）、人VK1-JK4構(gòu)架、20個(gè)氨基酸的柔性(gly4ser)4接頭、人VH3-JH4構(gòu)架及嵌套在VH3-FR4的C端最后兩個(gè)絲氨酸殘基內(nèi)的3’XhoI限制位點(diǎn)（圖15）。所有scFvDNA都通過(guò)使用重疊DNA寡核苷酸延伸的從頭DNA合成（Dillon和Rosen,1990）來(lái)構(gòu)建，用NotI和XhoI（NEB,Ipswich,MA）消化，在1%瓊脂糖-TAE凝膠上分離，從凝膠切下，并按廠家的說(shuō)明用MinEluteGelExtraction試劑盒（Qiagen,wherever,CA）純化。用T4DNALigase（NEB,Ipswich,MA）將此DNA連接至NotI-XhoI消化的pcDNA3.1(-)（Invitrogen,Carlsbad,CA）。該pcDNA3.1(-)載體盒已修飾為編碼與scFv的C端符合讀框的短的富含脯氨酸的接頭，該接頭后面跟隨6XHis標(biāo)記（gly-pro-pro-pro-pro-his-his-his-his-his-his）。將連接的pcDNA3.1-6_13A8轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌TOP10（Invitrogen,Carlsbad,CA），并在LB瓊脂+100μg/ml羧芐青霉素（Teknova,Hollister,CA）上37℃過(guò)夜選擇。從這些平板挑取分離的菌落，接種入2mlYT培養(yǎng)基+100μg/ml羧芐青霉素（Teknova），在振蕩培養(yǎng)箱中37℃過(guò)夜培養(yǎng)。用PureLinkQuickPlasmidMiniprep柱（Invitrogen）從幾個(gè)克隆分離DNA，然后通過(guò)限制酶切消化針對(duì)0.8KbpscFv片段的存在進(jìn)行篩選。然后在PCR循環(huán)測(cè)序后按廠家的說(shuō)明用BigDyeTerminatorv3.1試劑盒（ABI）在AppliedBiosystems3130GeneticAnalyzer（AppliedBiosystems,FosterCity,CA）上測(cè)序產(chǎn)生正確限制圖譜的克隆。用VNTIv10（Invitrogen）分析產(chǎn)生的DNA序列，并與它們的參考核苷酸和氨基酸序列相比較。序列確認(rèn)后，按廠家的流程用Lipofectamine2000（Invitrogen）將各scFv轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，轉(zhuǎn)染前一天，將對(duì)數(shù)期HEK293細(xì)胞按每孔500,000個(gè)細(xì)胞的密度在完全培養(yǎng)基（DMEM+Glutamax+非必需氨基酸+Pen-Strep+10%FBS–LifeSciences）中接種入12孔培養(yǎng)板（Corning,Lowell,MA），并在37℃CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜孵育。細(xì)胞大致80%匯合時(shí)，將4μgscFvDNA稀釋在100μLOpti-MEM中，4μLLipofectamine2000稀釋在100μLOpti-MEM中，然后將兩種稀釋液組合為轉(zhuǎn)染混合物，并在室溫孵育20分鐘。然后從12孔板去除培養(yǎng)基，換為1ml/孔SFM4-Transfectx-293無(wú)血清培養(yǎng)基（Hyclone,Logan,UT），將轉(zhuǎn)染混合物逐滴加至各孔。將轉(zhuǎn)染平板放回37℃CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)3天，按前述實(shí)施例中所述測(cè)試功能活性。如13A8（圖11A-B）、28D2和9C8v3-1（圖11C）所示，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，用一步法人源化的抗IL-6scFv保留IL-6中和活性。通過(guò)表面等離振子共振（SPR）測(cè)量結(jié)合親和力也證明13A8和9C8抗IL-6scFv的成功人源化（表21）。用于親和力測(cè)試的人源化13A8和9C8scFv包含6x組氨酸標(biāo)記，從轉(zhuǎn)染的HEK上清純化（用前述實(shí)施例中所述的方法），并通過(guò)基本按實(shí)施例2中所述進(jìn)行的SPR來(lái)測(cè)試。表21：人源化和哺乳動(dòng)物表達(dá)的抗IL-6scFv（甲硫氨酸取代前）及其親本嵌合mAb的親和力和效價(jià)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的抗IL-2331A12人源化scFv保留與親本mAb相當(dāng)?shù)膶?duì)人和靈長(zhǎng)類IL-23二者的IL-23中和活性（圖12）。此外，31A12scFv保留至少與親本嵌合mAb一樣好的皮摩爾親和力（圖22）。表22：人源化和哺乳動(dòng)物表達(dá)的抗IL-23scFv31A12及親本嵌合mAb的親和力和效價(jià)。如圖13中所描述，45G5人源化scFv保留對(duì)IL-23的有效生物學(xué)活性。表23：人源化V區(qū)氨基酸和核苷酸序列：抗IL-6AZ_IDSEQ_ID人源化_13A8VHAA259人源化_13A8VHnt260人源化_13A8VLAA261人源化_13A8VLnt262人源化_28D2VHAA263人源化_28D2VHnt264人源化_28D2VLAA265人源化_28D2VLnt266抗IL-23AZ_IDSEQ_ID人源化_31A12VHAA267人源化_31A12VHnt268人源化_31A12VLAA269人源化_31A12VLnt270抗IL-12/23AZ_IDSEQ_ID人源化_22H8VHAA271人源化_22H8VHnt272人源化_22H8VLAA273人源化_22H8VLnt274人源化_45G5VHAA275人源化_45G5VHnt276人源化_45G5VLAA277人源化_45G5VLnt2786.3人源化scFv中的甲硫氨酸取代人免疫球蛋白（Ig）V區(qū)通常在輕鏈和重鏈二者的CDR1中、在VH-FR3中相對(duì)保守的殘基（人VH3家族，氨基酸H82）上、以及在κ輕鏈的L4位置上包含甲硫氨酸殘基。由于這些人源化scFv最終將用甲硫氨酸類似物共價(jià)連接，必須通過(guò)另一天然存在的氨基酸來(lái)取代成熟scFv內(nèi)的所有甲硫氨酸殘基。此氨基酸取代必須對(duì)產(chǎn)生的scFv的功能或穩(wěn)定性具有最小的影響或無(wú)影響。為了避免輕鏈氨基酸位置L4上的甲硫氨酸殘基，將CDR移植入在該位置具有亮氨酸殘基的人種系構(gòu)架DPK8（GenBankX93626）。為了取代重鏈H82位置上的甲硫氨酸殘基，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并寡核苷酸引物，使得甲硫氨酸變?yōu)楫惲涟彼幔╥le）、亮氨酸（leu）、纈氨酸（val）或苯丙氨酸（phe）。這四種氨基酸可以見于來(lái)自其他物種的IgVH區(qū)中的H82位置上，以及一些表達(dá)的人抗體中。在HEK293細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)這些新的不含甲硫氨酸的scFv，然后將中和活性與它們的親本scFv的中和活性相比較。根據(jù)效價(jià)和表達(dá)，通過(guò)改變可干擾翻譯效率的密碼子選擇和潛在二級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)優(yōu)化不含甲硫氨酸的DNA序列用于在大腸桿菌中表達(dá)。為了取代VH位置H82M上的替代氨基酸，設(shè)計(jì)重疊簡(jiǎn)并引物（以上引物54、55）來(lái)與側(cè)翼引物（以上引物1、2，分別為seqID200和201）一起通過(guò)PCR在位置H82上引入亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸或苯丙氨酸。按上文所述克隆PCR產(chǎn)物，并測(cè)序DNA來(lái)確定所選擇的每個(gè)克隆編碼哪個(gè)氨基酸。人源化抗IL-6scFv13A8（如其他幾個(gè)scFv）在VH位置H34和H82上具有兩個(gè)甲硫氨酸。使用上文所述導(dǎo)致亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸或苯丙氨酸取代甲硫氨酸的簡(jiǎn)并寡核苷酸引物，通過(guò)PCR來(lái)取代這些殘基。然后用廠家的流程將這些不含甲硫氨酸的scFv（下文表24）轉(zhuǎn)染（Lipofectamine2000,Invitrogen,Carlsbad,CA）入HEK293細(xì)胞，并針對(duì)IL-6中和測(cè)定得到的72小時(shí)上清，與野生型親本scFv對(duì)照上清相比較。幾乎所有取代都導(dǎo)致活性的完全保留（圖14A-D）。表24：所測(cè)試的13A8scFv甲硫氨酸取代H34L通常是良好耐受的取代。與含甲硫氨酸的親本scFv相比，在抗IL-23人源化的scFv,31A12中，與H34L組合，用不同氨基酸取代H82導(dǎo)致活性的完全保留（圖14E）。以相似的方式，與最初的嵌合mAb相比，與H34L組合，用L或V取代45G5H82導(dǎo)致活性的完全保留（圖14F）。用H82L和H34L取代9C8人源化scFv中的Met也保留有效活性（圖14G）。22H8scFv在位置H82上天然不具有Met殘基。用L或V替換H34上的Met導(dǎo)致有效的IL-23中和活性的完全保留（圖14H）。每個(gè)領(lǐng)先候選VH區(qū)的具體VH突變顯示在表25X中，其顯示H23-30和H49上的兔回復(fù)突變，以及H34和H82甲硫氨酸取代。對(duì)于每個(gè)最終的領(lǐng)先候選scFv，選擇亮氨酸作為在H82和H34兩個(gè)位置上取代的氨基酸。通過(guò)按照大腸桿菌優(yōu)選的那些修飾密碼子選擇來(lái)優(yōu)化領(lǐng)先候選scFvDNA序列用于在大腸桿菌中表達(dá)。此時(shí)，研究用于通過(guò)甲硫氨酸類似物（如Aha）體內(nèi)取代的單個(gè)Met殘基的放置。將通過(guò)PCR合成的DNA（如上文所述）克隆入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，如pQE載體。通過(guò)DNA序列確認(rèn)表達(dá)載體中的合成DNA基因序列。最后，將表達(dá)載體中的合成基因轉(zhuǎn)化入甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型大腸桿菌（如B834）進(jìn)行重組蛋白質(zhì)產(chǎn)生。表25X：領(lǐng)先人源化兔VH序列的氨基酸突變這些突變是回復(fù)突變?yōu)橥眯蛄校℉23-30和H49）或許多VH序列共有的Met取代（H34、H82）。*na指在兔或人序列中不是Met而不需要取代的位置。表25A：scFv氨基酸序列scFvAZ_IDSEQ_ID13A8scfv大腸桿菌28028D2scfv大腸桿菌28231A2scfv大腸桿菌28422H8scfv大腸桿菌28645G5scfv大腸桿菌288表25B：適于大腸桿菌表達(dá)的nt序列scFvAZ_IDSEQ_ID13A8scfv大腸桿菌27928D2scfv大腸桿菌28131A2scfv大腸桿菌28322H8scfv大腸桿菌28545G5scfv大腸桿菌287scFv必須在可以在大腸桿菌中產(chǎn)生蛋白質(zhì)期間摻入非天然氨基酸（NNAA）的位置上具有單個(gè)Met殘基。此NNAA將成為生物綴合的特異性位點(diǎn)。選擇用于這些產(chǎn)物的NNAA是允許使用銅催化的環(huán)加成生物綴合的疊氮基高丙氨酸（Aha）。為了產(chǎn)生含有一個(gè)Aha殘基的scFv，對(duì)用于大腸桿菌表達(dá)的含有單個(gè)甲硫氨酸密碼子的scFvDNA進(jìn)行密碼子優(yōu)化，合成，并克隆入甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型大腸桿菌菌株，如B384。將細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，轉(zhuǎn)換為含Aha的無(wú)甲硫氨酸培養(yǎng)基，并通過(guò)加入1mMIPTG來(lái)誘導(dǎo)scFv表達(dá)。然后分離含有希望的scFv的包涵體（IB），該scFv在希望的位置上具有功能性Aha基團(tuán)。據(jù)測(cè)定，可以在許多可能的位置上將單個(gè)甲硫氨酸殘基引入scFv，其包括但不限于N端和C端，或連接VL和VH結(jié)構(gòu)域的接頭中。構(gòu)建人源化28D2的全部三種單Met形式并在大腸桿菌中表達(dá)，引入AhaNNAA取代甲硫氨酸殘基，并測(cè)試功能活性。全部三種形式都保留全部生物學(xué)活性（圖15）。此外，它們還保留高親和力。表26：在不同位置具有Aha的28D2的親和力scFvKa(M-1s-1)Kd(s-1)KD(pM)28D29,18x1051,002x10-410928D2N-Aha1,46x1068,99x10-46228D2-CAha1,45x1067,60x10-55228D2-LAha1,30x1066,88x10-553實(shí)施例7：人源化scFv的PEG化和再折疊雙特異性制劑總體概述通過(guò)用接頭將兩個(gè)不同的scFv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互綴合來(lái)構(gòu)建雙特異性scFv。以兩步法實(shí)現(xiàn)此策略，其中每個(gè)scFv與雙功能性接頭綴合。包含在雙特異性綴合物中的兩個(gè)scFv各在作為特異性綴合位點(diǎn)的位置上包含單個(gè)非天然氨基酸（Aha或其他）。接頭可以是同雙功能接頭或異雙功能接頭，且含有與包含在scFv中的非天然氨基酸（Aha）反應(yīng)的互補(bǔ)官能團(tuán)（炔）。如以下實(shí)施例中詳述，發(fā)明人成功地用該反應(yīng)方案來(lái)成功產(chǎn)生了幾種雙特異性scFv（下文方案1）。用于這些實(shí)施例中的接頭是PEG（聚乙二醇）。PEG具有希望在最終的雙特異性產(chǎn)物中得到并解決scFv所特有的問題的幾種化學(xué)性質(zhì)。PEG化改善蛋白質(zhì)溶解性并提高scFv穩(wěn)定性，減少scFv聚集和沉淀。此外，已顯示PEG化提高scFv雙特異性產(chǎn)物的血清半衰期。諸如PEG的長(zhǎng)和柔性的接頭增加了兩個(gè)抗體片段的物理分隔，允許它們相互獨(dú)立地重折疊。這解決了通過(guò)遺傳融合連接的雙特異性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重折疊（其常趨向于存在兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的不受控和不希望的交聯(lián)）中常出現(xiàn)的重要問題之一。由于化學(xué)合成的靈活性，PEG接頭的使用具有附加的優(yōu)勢(shì)。PEG可以容易地功能化為與摻入scFv蛋白質(zhì)中的任意非天然氨基酸互補(bǔ)的反應(yīng)配偶體。PEG還可以功能化為具有多個(gè)綴合位點(diǎn)，其使得能夠構(gòu)建多價(jià)蛋白質(zhì)雜合。取決于希望的綴合化學(xué)，可以用同雙功能或異雙功能PEG進(jìn)行PEG功能化?？梢允筆EG的結(jié)構(gòu)適應(yīng)于線性或分支變異，其可以影響藥物動(dòng)力學(xué)和生物活性。用來(lái)將scFv與接頭綴合的化學(xué)品與20種天然氨基酸正交。在scFv-PEG綴合物和雙特異性劑的制備中，此處使用氮化物-炔銅介導(dǎo)環(huán)加成。在典型順序中，使包含疊氮基高丙氨酸（Aha）的scFv與用炔功能化的過(guò)量同雙功能PEG接頭反應(yīng)。純化單價(jià)PEG化材料，然后使PEG接頭的自由側(cè)炔與包含Aha的第二scFv進(jìn)行第二次銅介導(dǎo)的氮化物-炔環(huán)加成，產(chǎn)生雙特異性劑。流程1步驟1概述制備雙特異性劑的第一步是用同雙功能（例如二炔）或異雙功能（例如至少單炔）PEG位點(diǎn)特異性PEG化含有非天然氨基酸（如疊氮基高丙氨酸（Aha））的scFv。通過(guò)一系列CHT和SEC層析純化單價(jià)PEG化scFv，然后進(jìn)行該方法的第二步。還針對(duì)它們重折疊的能力評(píng)估單價(jià)材料。最后，通過(guò)生物測(cè)定評(píng)價(jià)重折疊材料的活性。用過(guò)量PEG二炔（2-100當(dāng)量）進(jìn)行含有非天然氨基酸疊氮基高丙氨酸（Aha）的scFv的PEG化。使用了多種PEG分子量。用于綴合的氮化物-炔環(huán)加成由銅(I)介導(dǎo)，銅(I)來(lái)自諸如CuI的銅(I)源，或通過(guò)用諸如DTT、半胱氨酸、β-巰基乙醇、谷胱甘肽、胱胺、三-羧乙基膦的還原劑還原銅(II)源（CuSO4）來(lái)衍生。反應(yīng)混合物中還包含諸如三[(1-芐基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺（TBTA）的配體。已顯示諸如TBTA的配體穩(wěn)定反應(yīng)性銅類別，并提高反應(yīng)產(chǎn)率。通過(guò)加入諸如磷酸鈉緩沖液、Tris或HEPES的緩沖試劑來(lái)將反應(yīng)pH保持在3-10之間，或可選地保持在6-9之間。可以用諸如SDS的其他賦形劑來(lái)增強(qiáng)反應(yīng)條件和蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)。在scFv序列主鏈中任何地方摻入非天然氨基酸（如Aha）的能力隨后使得能夠在此預(yù)定的位置上發(fā)生PEG化。在這些實(shí)施例中，在scFv的C端和N端顯示了PEG化，但也可以發(fā)生在其他規(guī)劃好的位置。已成功地用此一般化的方法來(lái)PEG化幾種抗IL-6scFv和抗IL-23scFv。（方案2）流程2反應(yīng)后，可以從未反應(yīng)的scFv和PEG分離單價(jià)PEG化scFv。這防止在隨后的雙特異性劑制備步驟中形成副產(chǎn)物。為此，通常離心或過(guò)濾混合物來(lái)去除固體顆粒，并用諸如DTT的過(guò)量還原劑處理溶液。然后對(duì)溶液進(jìn)行一系列層析步驟。純化單價(jià)scFv-PEG的第一步是將還原的反應(yīng)混合物上樣在CHT柱上，CHT柱捕獲反應(yīng)的scFv和scFv-PEG產(chǎn)物，但不結(jié)合所有未反應(yīng)的PEG?？梢酝ㄟ^(guò)磷酸鹽從CHT柱洗脫來(lái)部分或完全溶解反應(yīng)的scFv和產(chǎn)物scFv-PEG?；旌舷Ｍ募?jí)分，然后上樣在大小排阻柱（SEC）上，大小排阻柱可以分開殘留的未反應(yīng)scFv。SEC后，物質(zhì)具有足夠的純度用于下一步或進(jìn)行重折疊實(shí)驗(yàn)。7.1抗IL-6scFv的綴合7.1.128D2cAha與30kDaPEG綴合在具有磁力攪拌子的250mL玻璃燒杯中放入磷酸鈉緩沖液（250mM，pH7.4，7.1mL）和SDS溶液（10%重量/體積，3.3mL）。加入28D2cAha的溶液（2.81mg/mL，1當(dāng)量，53mL）和30KPEG炔的溶液（NOF，2mM，60mg/mL，8.7當(dāng)量，22mL）。迅速加入TBTA三唑配體和碘化銅的DMSO溶液（兩種成分均為80mM，2.8mL）來(lái)進(jìn)行沉淀。使混合物靜置5分鐘，然后開始攪拌。過(guò)夜攪拌混合物（18小時(shí)），然后通過(guò)SDS-PAGE（還原）和激光光密度測(cè)定法來(lái)測(cè)定，其顯示56%的產(chǎn)率。將反應(yīng)混合物倒入50mL離心管并離心（12,000g，10分鐘）。將上清倒在DTT（1.5g）上，并在氮?dú)庀聰嚢?小時(shí)。通過(guò)CHT和SEC層析的組合來(lái)達(dá)到純化。7.1.2用PEG二炔PEG化28D2cAha在具有磁力攪拌子的50mL圓底瓶中加入水（9.7mL）和28D2cAha的溶液（2.58mg/mL，1當(dāng)量，8.7mL）。向此溶液中加入20KPEG二炔的溶液（3mM,60mg/mL，4當(dāng)量，1mL）。加入TBTA三唑配體（48mg），并使溶液靜置幾分鐘。加入碘化銅的DMSO溶液（40mM，DMSO溶液，1.1mL），蓋上圓底瓶，過(guò)夜攪拌混合物（16小時(shí)）。通過(guò)SDS-PAGE（還原）和光密度測(cè)定法來(lái)分析反應(yīng)混合物，其顯示42%的產(chǎn)率。將反應(yīng)混合物倒入50mL離心管并離心（12,000g，10分鐘）。將上清加至DTT（462mg）上，并在氮?dú)庀聰嚢?小時(shí)，然后-20℃保存。7.1.3用20KPEG二炔PEG化13A8nAha在具有磁力攪拌子的400mL玻璃燒杯中放入磷酸鈉緩沖液（50mM，pH7.4，14mL）、十二烷基硫酸鈉溶液（10%重量/體積，42mL）和二硫蘇糖醇溶液（250mM，2.7mL）。加入13A8nAha的溶液（3mg/mL，1當(dāng)量，86mL）和20KPEG二炔的溶液（3mM，60mg/mL，26當(dāng)量，75mL）。加入TBTA三唑配體（537mg），并使混合物在不攪拌的情況下靜置。加入硫酸銅溶液（80mM，6.4mL），并用鋁箔覆蓋燒杯。室溫下過(guò)夜攪拌混合物（16小時(shí)）。以激光光密度測(cè)定法進(jìn)行凝膠分析，通過(guò)SDS-PAGE（還原）來(lái)評(píng)價(jià)混合物，其顯示69%的產(chǎn)率（圖16A）。將反應(yīng)混合物倒入離心瓶，離心（10000g，15分鐘）。將上清倒入已加入DTT（3.4g）的250mL瓶中，并在氮?dú)庀聰嚢?小時(shí)。通過(guò)在陶瓷羥基磷灰石（CHT-I，Bio-Rad）層析后進(jìn)行大小排阻層析（SEC）（Superdex200）來(lái)達(dá)到進(jìn)一步純化。7.1.4用20KPEG二炔PEG化13A8cAha在具有螺蓋和磁力攪拌子的1000mL玻璃瓶中放入磷酸鈉緩沖液（50mM，pH=7.4，58mL）、SDS溶液（10%重量/體積，112mL）和二硫蘇糖醇溶液（250mM，7.2mL）。向瓶中加入scFv13A8cAha的溶液（3.5mg/mL，1當(dāng)量，206mL）和20KPEG二炔的溶液（3mM，60mg/mL，25當(dāng)量，200mL）。加入TBTA三唑配體（1.4g），并使混合物在不攪拌的情況下靜置。5分鐘后，加入硫酸銅溶液（80mM，17mL），蓋上瓶蓋，中等速度過(guò)夜攪拌混合物。通過(guò)SDS-PAGE（還原）來(lái)評(píng)價(jià)藍(lán)灰色溶液，激光光密度測(cè)定法分析測(cè)定反應(yīng)具有70%的產(chǎn)率（圖16B）。將反應(yīng)混合物倒入一對(duì)離心瓶并離心（10000g，15分鐘）。將上清倒入具有螺蓋的2L玻璃瓶中。加入DTT（9g），用氮?dú)飧采w容器，并攪拌1小時(shí)。通過(guò)實(shí)施例7.1.3中的CHT和SEC層析的組合來(lái)達(dá)到反應(yīng)混合物的純化。7.1.5用40KPEG二炔PEG化13A8cAha在具有螺蓋和磁力攪拌子的500mL聚碳酸酯離心瓶中放入scFv13A8cAHA的溶液（8.8mg/mL，1當(dāng)量，142mL）、磷酸鈉緩沖液（500mM貯存液，pH=7.4，23mL）和SDS溶液（20%重量/體積貯存液，8.8mL）。將40KPEG二炔（9.35g）作為固體加入攪拌的溶液。攪拌溶液至所有PEG溶解，加入TBTA三唑配體（446mg），使混合物在不攪拌的情況下靜置5分鐘。重新開始攪拌，加入新鮮半胱氨酸溶液（250mM貯存液，534uL）。加入硫酸銅溶液（160mM貯存液，2.6mL），用氮?dú)飧采w混合物，并以中等速度攪拌4小時(shí)。取樣反應(yīng)混合物進(jìn)行SDS-PAGE（還原），通過(guò)激光光密度測(cè)定法進(jìn)行凝膠分析來(lái)測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)率（51%）（圖16C）。從反應(yīng)容器去除攪拌子，高速離心（10000g，15分鐘）混合物。將上清倒入500mL聚碳酸酯瓶中。加入DTT（3g），用氮?dú)飧采w容器，并攪拌1小時(shí)。通過(guò)前述實(shí)施例中的CHT和SEC層析的組合來(lái)完成反應(yīng)混合物的純化。7.1.6用20KPEG二炔PEG化13A8LAha在具有磁力攪拌子的250mL圓底瓶中放入高純度水（12.5mL）、SDS溶液（10%重量/體積貯存液，17.3mL）和scFv13A8LAHA溶液（4.11mg/mL貯存液，26.3mL）。向反應(yīng)混合物中加入20KPEG二炔溶液（3mM，60mg/mL貯存液，30mL）。加入TBTA三唑配體（214mg），使混合物在不攪拌的情況下靜置。重新開始攪拌，加入二硫蘇糖醇溶液（250mM貯存液，1.08mL），然后加入硫酸銅溶液（80mM貯存液，2.53mL）。用隔膜密封圓底瓶，過(guò)夜攪拌。次日通過(guò)SDS-PAGE（還原）來(lái)評(píng)價(jià)反應(yīng)混合物。通過(guò)激光光密度測(cè)定法分析來(lái)分析所得到的凝膠，顯示60%的反應(yīng)產(chǎn)率（圖16D）。將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)入離心瓶（250mL）并離心（12000g，15分鐘）。將上清倒入250mL瓶中，加入DTT（1.5g）。用氮?dú)飧采w容器，并攪拌至固體溶解。通過(guò)前述制備中的CHT和SEC層析的組合來(lái)達(dá)到反應(yīng)混合物的純化。7.2與抗-IL-23scFvAha的反應(yīng)7.2.1IL-2331A12cAhascFv與20kDaPEG-二炔綴合在具有螺蓋和磁力攪拌子的1000mL玻璃瓶中放入磷酸鈉緩沖液（50mM，pH=7.4，65mL）、SDS溶液（10%溶液，80mL）和二硫蘇糖醇溶液（250mM，5.1mL）。輕輕攪拌溶液，加入IL-23-31A12cAha溶液（pH=7.4，4mg/mL，1當(dāng)量，121mL）和20KPEG二炔溶液（60mg/mL，26當(dāng)量，142mL）。暫停攪拌，加入TBTA（1.1g）。使材料靜置（～5分鐘），加入硫酸銅溶液（80mM，12mL），并重新開始攪拌。蓋上瓶蓋，室溫下攪拌混合物16小時(shí)。通過(guò)SDS-PAGE（還原）來(lái)分析反應(yīng)混合物，并通過(guò)光密度測(cè)定法來(lái)分析所得到的凝膠，其顯示59%的起始材料轉(zhuǎn)化為希望的PEG化產(chǎn)物（圖16B）。將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)入離心瓶（500mL）并離心（10,000g，15分鐘）。將得到的上清轉(zhuǎn)入無(wú)菌聚碳酸酯瓶，加入二硫蘇糖醇（6.3g），并在氮?dú)庀聰嚢枞芤?小時(shí)。通過(guò)實(shí)施例7.1.3中所進(jìn)行的CHT和SEC層析來(lái)達(dá)到進(jìn)一步純化。7.2.2用20KPEG二炔PEG化45G5cAha在具有磁力攪拌子的250mL圓底瓶中放入磷酸鈉緩沖液（50mM，pH7.4，74mL），開始攪拌，加入二硫蘇糖醇溶液（250mM，1.9mL）。向攪拌的溶液中加入scFv45G5cAha溶液（1.8mg/mL，1當(dāng)量，53mL）和20KPEG二炔溶液（3mM，60mg/mL，25當(dāng)量，27mL）。暫停攪拌，加入TBTA三唑配體（382mg），使混合物靜置5分鐘。加入硫酸銅溶液（80mM，4.5mL），用橡膠隔膜蓋上瓶子。在最低速設(shè)置下過(guò)夜攪拌混合物（16小時(shí)）。通過(guò)SDS-PAGE（還原膠）來(lái)測(cè)定反應(yīng)，并通過(guò)光密度測(cè)定法來(lái)分析凝膠，其顯示40%的產(chǎn)率（圖16E）。將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)入離心瓶，在傾斜轉(zhuǎn)子上離心（10,000g，15分鐘）。將得到的上清轉(zhuǎn)入新的聚碳酸酯瓶，加入攪拌子和DTT（2.4g），并在氮?dú)庀聰嚢?小時(shí)。通過(guò)實(shí)施例7.1.3中所進(jìn)行的CHT層析后進(jìn)行大小排阻層析來(lái)達(dá)到純化。7.4折疊折疊可以這樣發(fā)生，取變性的scFv-PEG（例如在8M尿素中），將它交換進(jìn)入（例如，通過(guò)透析或切向流過(guò)濾）含有氧化還原系統(tǒng)（例如半胱氨酸/胱氨酸）的部分變性緩沖液（例如3M尿素）中，然后將它交換進(jìn)入非變性緩沖液（例如磷酸緩沖鹽溶液）中。7.4.128D2c-PEG的折疊折疊了C端綴合30kDa線性PEG二炔的scFv28D2。先純化28D2c-PEG，將緩沖液換為含9M尿素和二硫蘇糖醇（DTT）、pH7.2的緩沖液。然后將28D2c-PEG稀釋至0.05-1mg/mL蛋白質(zhì)的起始濃度。然后在室溫下將起始材料過(guò)夜透析入由3M尿素、30mMTrispH8.5、2-6mM半胱氨酸和1-3mM胱氨酸組成的第一折疊緩沖液。然后在室溫下將材料過(guò)夜透析入由20mM磷酸鈉和150mMNaClpH7.4組成的最終緩沖液。通過(guò)非還原SDS-PAGE和SEC觀察重折疊材料為單體。單體28D2c-PEG的回收在0.05-0.25mg/mL蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)折疊濃度下最高。用6:1至2:3mM范圍內(nèi)的半胱氨酸:胱氨酸濃度達(dá)到了相似的結(jié)果。作為具體實(shí)例，用3mM胱氨酸和2mM半胱氨酸在0.1mg/mL蛋白質(zhì)下折疊材料時(shí)，通過(guò)SEC測(cè)定單體回收為37%，產(chǎn)物的EC50為116pg/mL（圖17A），通過(guò)SPR（基本按實(shí)施例1.4中進(jìn)行）測(cè)量的結(jié)合親和力在表27中給出。表27：通過(guò)從尿素透析重折疊的折疊28D2c-PEG的結(jié)合親和力。Ka(M-1s-1)Kd(s-1)KD(pM)28D2c-PEG5.07x1059.78x10-5193.328D2cAha1.05x1067.10x10-567.4折疊還可以這樣發(fā)生，取變性的scFv-PEG，迅速將它稀釋入部分變性緩沖液，然后將它交換入非變性緩沖液。用于此方法的起始材料可以包含在尿素或胍中變性或在SDS中變性的scFV-PEG。將含9M尿素和DTT、pH7.2的緩沖液中的1mg/mL的28D2c-PEG迅速稀釋入由3M尿素、30mMTrispH8.5、2-6mM半胱氨酸和1-3mM胱氨酸組成的第一折疊緩沖液至0.05-0.1mg/mL，然后在室溫下在相同的緩沖液中過(guò)夜透析。然后在室溫下將材料過(guò)夜透析入由20mM磷酸鈉和150mMNaCl，pH7.4組成的最終緩沖液。作為具體實(shí)例，用2mM半胱氨酸和2mM胱氨酸在0.1mg/mL下折疊材料時(shí)，通過(guò)SEC測(cè)定單體回收為38%，產(chǎn)物的EC50為138pg/mL。將含0.1%SDS和DTT、pH7.25的緩沖液中的0.52mg/mL蛋白質(zhì)的28D2c-PEG迅速稀釋入由3M尿素、30mMTrispH8.5、2-6mM半胱氨酸和1-3mM胱氨酸組成的第一折疊緩沖液，然后在相同的緩沖液中過(guò)夜透析。使用200X稀釋，將SDS終濃度降低至0.0005%?？蛇x地，該折疊緩沖液還含有400mM精氨酸/或150mMNaCl。備選地，該折疊緩沖液包含2mM谷胱甘肽和2mM氧化谷胱甘肽代替半胱氨酸/胱氨酸。然后將材料在5℃透析3天，進(jìn)入由20mM磷酸鈉和150mMNaCl，pH7.4組成的最終緩沖液。然后用MilliporeCentriprep濃縮器（10,000MWCO）將材料濃縮20倍。作為具體實(shí)例，在用3mM胱氨酸和2mM半胱氨酸折疊材料時(shí)，通過(guò)SEC測(cè)定單體回收為20%，產(chǎn)物的EC50為256pg/mL。通過(guò)SPR測(cè)定了這些樣品的IL-6結(jié)合動(dòng)力學(xué)，并在表28中給出。（SPR基本按實(shí)施例1.4中進(jìn)行）表28：通過(guò)從SDS迅速稀釋重折疊的28D2c-PEG的結(jié)合親和力。Ka(M-1s-1)Kd(s-1)KD(pM)28D2c-PEG3.26x1051.04x10-5319.4還可以通過(guò)從在胍中變性的起始材料交換和/或稀釋來(lái)發(fā)生。在含6M鹽酸胍和DTT、pH8.0的緩沖液中制備28D2c-PEG。然后將材料透析入（或迅速稀釋，然后透析入）折疊緩沖液，然后透析入PBS。折疊緩沖液中的蛋白質(zhì)濃度為0.05-0.25mg/mL，且折疊緩沖液由3M尿素、30mMTrispH8.5、2mM半胱氨酸和2mM胱氨酸組成?？蛇x地，折疊緩沖液還含有400mM精氨酸，且還可選地含有150mMNaCl。作為具體實(shí)例，在蛋白質(zhì)濃度為0.25mg/mL時(shí)，通過(guò)SEC測(cè)定單體回收為22%，產(chǎn)物的EC50為150pg/mL。7.4.2其他PEG化scFv的折疊還通過(guò)相似的方法折疊了N端或C端綴合20kDa線性PEG的scFv13A8n、13A8c、13A8L和31A12c。在含8M尿素和DTT的緩沖液中制備scFv-PEG，并稀釋至0.05-0.5mg/mL總蛋白質(zhì)。然后在室溫下將它們透析入含3M尿素、30mMTrispH8.5、2-6mM半胱氨酸和1-3mM胱氨酸的折疊緩沖液。備選地，還可以使用pH8或9、4M或2M尿素、1%多乙氧基醚和/或4℃透析。還可以通過(guò)透析入不含尿素、加入或不加入多乙氧基醚的折疊緩沖液中來(lái)折疊蛋白質(zhì)。通過(guò)透析入PBS或含氧化還原系統(tǒng)（2-6mM半胱氨酸和1-3mM胱氨酸）的PBS來(lái)完成折疊。具體實(shí)例在表29中給出。表29*通過(guò)SDSPAGE測(cè)定13A8L回收蛋白質(zhì)在0.05-0.1mg/mL下折疊的回收最佳。在折疊緩沖液中不存在尿素的情況下折疊31A12c-PEG導(dǎo)致產(chǎn)物中存在更多二硫鍵連接的高分子量種類。評(píng)估PEG化scFv在不同溫度下的穩(wěn)定性，并與哺乳動(dòng)物表達(dá)的非PEG化scFv相比較。兩個(gè)PEG化種類（13A8c-PEG和31A12c-PEG）在13-20天的時(shí)期內(nèi)保留其全部活性（圖17B和17C）。PEG化scFv的Tm測(cè)量結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了這些分子的穩(wěn)定性。發(fā)現(xiàn)31A12-PEG具有69.9℃的Tm。發(fā)現(xiàn)13A8-PEG具有66.1℃的Tm。7.4.3非PEG化scFv的折疊可以用相似的折疊方法來(lái)折疊非PEG化scFv[例如13A8c和22H8c]。如果希望，這些方法可以用來(lái)折疊綴合前的蛋白質(zhì)。作為具體實(shí)例，以0.1mg/mL的總蛋白質(zhì)濃度在含3M尿素、4mM半胱氨酸、2mM胱氨酸和30mMTrispH8.5的折疊緩沖液中折疊3個(gè)批次的13A8c，然后透析入PBS。折疊流程可重現(xiàn)，通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定來(lái)自三個(gè)批次的單體13A8c回收產(chǎn)率分別為37%、35%和44%。與親本mAb相比，重折疊的非PEG化22H8cscFv保留高效價(jià)。實(shí)施例8：scFv-PEG-scFv雙特異性抗IL-6/IL23綴合物的產(chǎn)生產(chǎn)生抗IL-6/抗IL-23scFv綴合物的下一步是將包含非天然氨基酸（如Aha）的scFv與實(shí)施例7中制備的scFv-PEG炔綴合物綴合。綴合反應(yīng)后，通過(guò)層析組合來(lái)純化混合物，然后進(jìn)行重折疊過(guò)程來(lái)產(chǎn)生希望的scFv-PEG-scFv雙特異性劑。評(píng)估最終的材料的生物活性和藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，以及在疾病模型中的功效。雙特異性劑制備中的第二個(gè)化學(xué)步驟是將純化的單價(jià)（scFv-PEG）與第二scFv綴合。通過(guò)使單價(jià)scFv-PEG的自由側(cè)炔經(jīng)銅介導(dǎo)的Huisgen環(huán)加成與第二scFv的Aha反應(yīng)來(lái)達(dá)到偶聯(lián)。成功制備了幾種單價(jià)scFv-PEG綴合物，可以使用抗-IL-6-scFv-PEG或抗-IL-23scFv-PEG。同樣，含有Aha的蛋白質(zhì)可以是抗-IL-6scFv或抗-IL-23scFv。對(duì)于第二反應(yīng)，反應(yīng)條件與第一步驟中銅介導(dǎo)的環(huán)加成不同。在步驟一中，反應(yīng)條件利用過(guò)量PEG二炔和諸如SDS的添加劑來(lái)輔助反應(yīng)。但是，使用過(guò)量的炔在經(jīng)濟(jì)上不可行，或從純化角度看不希望。因此，第二步驟使用比例更為緊縮的炔和氮化物（炔:氮化物為1:1至1:3）反應(yīng)成分。此外，發(fā)現(xiàn)第二步綴合在更高稀釋度下進(jìn)行得最好。此外，最后放棄了用于該方法第一步的TBTA三唑配體。通過(guò)類似于實(shí)施例7中所使用的層析組合來(lái)進(jìn)行反應(yīng)混合物的純化。先將反應(yīng)混合物上樣在CHT柱上，并用磷酸鹽梯度洗脫?；旌舷Ｍ募?jí)分，然后上樣在SEC柱上。然后為折疊條件進(jìn)一步處理此材料。在本文所述方法中，綴合先于折疊。PEG接頭的存在便于隨后的重折疊步驟，scFv獨(dú)立地重折疊，具有最小的鏈間交聯(lián)。8.1抗IL-23、抗IL-6雙特異性31A12c-PEG-28D2c的制備在具有磁力攪拌子的1L玻璃燒杯中放入磷酸鈉緩沖液（125mM，pH7.4，486mL）。加入28D2cAha溶液（4.2mg/mL，5.1mL）和31A12c-PEG溶液（0.49mg/mL，44mL）。加入TBTA三唑配體和碘化銅的溶液（兩種成分為80mM，16mL），形成沉淀。過(guò)夜攪拌混合物（16小時(shí)）。通過(guò)SDS-PAGE（還原）和光密度測(cè)定法來(lái)分析反應(yīng)混合物（產(chǎn)率=29%）。將反應(yīng)混合物分入兩個(gè)離心瓶（500mL），離心（10000g，30分鐘），棄上清。向一個(gè)瓶中加入SDS溶液（8%重量/體積）、TPPTS溶液（含500mMTPPTS的1MHEPES，pH7.4，25mL）和磷酸鈉緩沖液（10mM，25mL）。垂下并渦旋瓶子直至材料溶解或完全懸浮。將內(nèi)容物轉(zhuǎn)入第二離心瓶/沉淀，用2份磷酸鈉緩沖液（10mM，12.5mL）漂洗第一離心瓶。渦旋第二離心瓶直至沉淀溶解。將材料離心（10,000g，5分鐘）。保留上清用于進(jìn)一步純化。8.2抗IL-23、抗IL-6雙特異性31A12c-PEG-13A8c的制備向具有螺蓋和小號(hào)攪拌子的2000mL玻璃瓶中加入水（814mL）和二硫蘇糖醇溶液（250mM，12mL），輕輕攪拌。加入scFv13A8cAha溶液（0.85mg/mL，35mL），然后加入31A12c-PEG綴合物溶液（0.55mg/mL，55mL）。加入MES緩沖液（80mM，pH7.5，56mL）和硫酸銅（80mM，28mL）。蓋上瓶子，以最慢攪拌速度過(guò)夜攪拌混合物（16小時(shí)）。通過(guò)SDSPAGE（還原）和光密度測(cè)定法來(lái)分析反應(yīng)物，其顯示51%的產(chǎn)率。以相似的產(chǎn)率同時(shí)進(jìn)行另外兩個(gè)1000mL反應(yīng)。將部分混合反應(yīng)混合物（3000mL）倒入離心瓶（每個(gè)250mL瓶～200mL），并在旋桶式離心機(jī)中離心（SorvallRC-3BP，5000g，15分鐘）。棄上清。向沉淀中加入另外的混合反應(yīng)混合物，并再次離心。重復(fù)該順序，直至處理完所有反應(yīng)混合物。向沉淀中加入600mL以下緩沖液：10mM磷酸pH=7.4、2%SDS和250mMDTT。加入攪拌子，攪拌混合物30分鐘，然后加溫至50℃5分鐘，然后在室溫下攪拌。用玻璃棒破碎固體。加入TPPTS（Strem，350mM，pH7.6，25mL），攪拌混合物1小時(shí)，此時(shí)所有固體溶解。將材料進(jìn)一步純化。用陶瓷羥基磷灰石（CHT-I，BioRad）層析和大小排阻（Superdex6prep）層析來(lái)純化雙特異性產(chǎn)物。8.3抗IL-23、抗IL-6雙特異性13A8c-PEG-31A12c的制備在配有磁力攪拌子的2000mL螺蓋玻璃瓶中放入水（830mL），加入二硫蘇糖醇溶液（250mM，12mL），同時(shí)輕輕攪拌溶液。加入scFv31A12cAha溶液（0.88mg/mL，45mL）和13A8c-PEG綴合物溶液（0.7mg/mL，30mL）。加入MES緩沖液（80mM，56mL）和硫酸銅溶液（80mM，28.1mL），蓋上瓶子。輕輕連續(xù)過(guò)夜攪拌。反應(yīng)混合物的SDSPAGE分析和光密度測(cè)定法顯示48%的產(chǎn)率。該反應(yīng)與另外兩個(gè)1L反應(yīng)和另外七個(gè)500mL反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，平均產(chǎn)率為49%（圖18A）。按以下處理混合的6500mL反應(yīng)體積。在兩個(gè)離心瓶（500mL）中每瓶放入約450mL反應(yīng)混合物。在轉(zhuǎn)桶式離心機(jī)中離心（5000g，15分鐘）。棄上清，向每個(gè)收集離心瓶中加入另外的反應(yīng)混合物，并再次離心材料。重復(fù)該順序，直至將所有混合的反應(yīng)體積離心，保留沉淀（x2）。向每瓶中加入攪拌子和以下緩沖液（700mL）：250mMDTT、2%SDS、10mM磷酸鈉緩沖液。室溫?cái)嚢?0分鐘。放入水浴（40℃），攪拌10分鐘。再攪拌30分鐘，此時(shí)無(wú)固體殘留?；旌蟽蓚€(gè)溶液，然后上樣在CHT柱上。用磷酸鹽梯度洗脫。混合希望的級(jí)分，通過(guò)大小排阻柱進(jìn)一步純化。8.4抗IL-23、抗IL-6雙特異性13A8n-PEG-31A12c的制備在配有小號(hào)磁力攪拌子的2000mL螺蓋玻璃瓶中放入水（640mL）和DTT溶液（250mM，9.6mL）。向此混合物中加入31A12cAha溶液（0.88mg/mL，27mL）和13A8c-PEG綴合物溶液（0.42mg/mL，56mL）。加入MES緩沖液（80mM，45mL）和硫酸銅溶液（80mM，23mL），蓋上瓶子。以最低攪拌速度輕輕過(guò)夜攪拌混合物（16小時(shí)）。SDS-PAGE和光密度測(cè)定法顯示47%的產(chǎn)率。按之前所述同樣地制備另外兩個(gè)反應(yīng)，并通過(guò)凝膠分析得到分別為51%和47%的產(chǎn)率。組合三個(gè)反應(yīng)體積并按以下處理。在兩個(gè)離心瓶（250mL）中每瓶放入約200mL反應(yīng)混合物。在轉(zhuǎn)桶式離心機(jī)中離心（5000g，15分鐘）。棄上清，向每個(gè)收集離心瓶中加入另外的反應(yīng)混合物，并再次離心材料。重復(fù)該順序，直至將來(lái)自三個(gè)反應(yīng)的所有反應(yīng)混合物離心，保留沉淀。向每瓶中加入攪拌子和以下緩沖液（220mL）：250mMDTT、2%SDS、10mM磷酸鈉緩沖液。室溫?cái)嚢?0分鐘。放入水浴（40℃），攪拌10分鐘。固體殘留。從水浴取出，加入TPPTS溶液（250mM，pH=7.4，5mL）。攪拌（1小時(shí)），此時(shí)無(wú)固體殘留?；旌先芤?，然后上樣在CHT柱上。用磷酸鹽梯度洗脫材料，得到雙特異性劑和附加蛋白質(zhì)成分的半純化混合物。通過(guò)SEC進(jìn)一步純化，得到希望的雙特異性產(chǎn)物。8.5抗IL-12/23、抗IL-6雙特異性13A8n-PEG-45G5c的制備在具有大號(hào)磁力攪拌子的2000mL玻璃燒杯中放入水（898mL）和DTT溶液（250mM，12mL）。加入45G5cAha溶液（0.9mg/mL，33mL）和13A8n-PEG溶液（0.98mg/mL，30mL）。加入硫酸銅溶液（80mM，28mL），并過(guò)夜攪拌混合物（16小時(shí)）。與前述反應(yīng)平行進(jìn)行第二個(gè)相同的反應(yīng)。通過(guò)SDS-PAGE（還原）和光密度測(cè)定法來(lái)評(píng)估反應(yīng)混合物（反應(yīng)1產(chǎn)率24%，反應(yīng)2產(chǎn)率25%）（圖18B）。將約400mL反應(yīng)混合物倒入離心瓶（500mLx2，使兩個(gè)反應(yīng)混合物保持分開）。放入轉(zhuǎn)桶式離心機(jī)中離心（5000g，15分鐘）。棄上清。重復(fù)該順序，直至處理完全部反應(yīng)混合物，只留下沉淀。向沉淀中加入以下緩沖液（200mL）：20mM磷酸鈉緩沖液、2%SDS、250mMDTT。輕輕攪拌30分鐘。在水浴（40℃）中加溫?cái)嚢?0分鐘?；氐绞覝?，攪拌至固體溶解。將減少的材料混合，通過(guò)CHT和SEC層析來(lái)達(dá)到進(jìn)一步純化。8.6抗IL-12/23、抗IL-6雙特異性13A8c-PEG-22H8的制備在具有螺蓋和磁力攪拌子的2000mL瓶中放入水（950mL）和DTT溶液（250mM，14mL），輕輕攪拌。向此攪拌溶液中加入scFv22H8cAha溶液（0.75mg/mL，60mL）和13A8c-PEG綴合物溶液（0.69mg/mL，35mL）。加入MES緩沖液（80mM，65mL）和硫酸銅溶液（80mM，32mL），蓋上瓶子，過(guò)夜攪拌混合物。SDSPAGE分析和光密度測(cè)定法顯示60%的產(chǎn)率（圖18C）。同時(shí)進(jìn)行另外5個(gè)相同比例的1150mL反應(yīng)，平均產(chǎn)率為54%。與之前所述類似地處理組合的6900mL反應(yīng)體積。在兩個(gè)500mL離心瓶（500mL）中放入約450mL（x2）反應(yīng)體積。在轉(zhuǎn)桶式離心機(jī)中離心混合物（5000g，15分鐘）。棄上清，向每個(gè)收集離心瓶中加入另外的反應(yīng)混合物，并再次離心。重復(fù)該步驟，直至處理完全部6900mL。向每個(gè)沉淀中加入以下緩沖液（700mL）：250mMDTT、2%SDS、10mM磷酸鈉緩沖液。室溫?cái)嚢?0分鐘。用藥勺破碎固體，重新開始攪拌1小時(shí)。組合兩個(gè)溶液，上樣在CHT柱上，通過(guò)磷酸鹽梯度洗脫。通過(guò)SEC層析來(lái)達(dá)到半純化的雙特異性劑的進(jìn)一步純化。8.7抗IL-23、抗IL-6雙特異性13A8c-40KPEG-31A12c的制備在配有磁力攪拌子的5000mL螺蓋玻璃瓶中放入磷酸鈉緩沖液（5mM貯存液，2100mL）。加入單價(jià)中間體13A8c-40KPEG溶液（0.34mg/mL貯存液，138mL）和scFv31A12cAHA溶液（3.2mg/mL貯存液，26.1mL）。加入MES緩沖液（80mM貯存液，141mL）和二硫蘇糖醇溶液（250mM貯存液，12mL），同時(shí)輕輕攪拌溶液。加入硫酸銅溶液（80mM貯存液，70mL），蓋上瓶子，輕輕連續(xù)過(guò)夜攪拌。反應(yīng)混合物的SDSPAGE分析和光密度測(cè)定法顯示58%的產(chǎn)率。該反應(yīng)與另外兩個(gè)2.5L反應(yīng)和另外一個(gè)1.0L反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，平均產(chǎn)率為58%（圖18D）。離心混合的8500mL反應(yīng)體積來(lái)收集所有固體。將固體溶解在以下處理緩沖液（1700mL）中：250mMDTT、2%SDS、10mM磷酸鈉緩沖液。通過(guò)CHT和SEC層析的組合來(lái)純化最終的溶液。8.8抗IL-23、抗IL-6雙特異性31A12c-20KPEG-13A8L的制備在具有磁力攪拌子的8x30mM管中放入水（87uL）和MES緩沖液（80mM貯存液，5.6uL）。向此管中加入31A12c-20KPEG溶液（0.550mg/mL貯存液，3.8uL）和scFv13A8LAHA溶液（4.11mg/mL貯存液，0.95uL）。加入DTT溶液（250mM貯存液，1.2uL）和硫酸銅溶液（80mM貯存液，2.8uL），蓋上管，使管在室溫下過(guò)夜攪拌。次日取樣反應(yīng)混合物進(jìn)行SDS-PAGE。通過(guò)激光光密度測(cè)定法來(lái)分析所得到的凝膠，顯示雙特異性劑的產(chǎn)率為37%（圖18E）。8.9雙特異性scFv的折疊通過(guò)與上文給出的那些相似的方法來(lái)折疊經(jīng)線性20kDaPEG接頭與13A8綴合的31A12（二者都在C端綴合）。按0.05-0.1mg/mL的總蛋白質(zhì)在含8M尿素和DTT、pH7.3的緩沖液中制備該雙特異性分子。除雙特異性分子外，此階段的材料可以包含某個(gè)量的殘留的未反應(yīng)31A12-PEGscFv。然后通過(guò)在室溫下過(guò)夜透析入3M尿素、30mMTrispH8.5、4mM半胱氨酸、2mM胱氨酸來(lái)折疊材料?？蛇x地，還向折疊緩沖液中加入1%多乙氧基醚、500mMTris或500mM精氨酸，或者可以在4℃進(jìn)行折疊。進(jìn)一步將折疊反應(yīng)透析入20mM磷酸鈉、150mMNaCl，pH7.4（PBS）。作為具體實(shí)例，在室溫下在3M尿素、30mMTrispH8.5、4mM半胱氨酸、2mM胱氨酸中重折疊4個(gè)批次的0.1mg/mL31A12c-PEG-13A8c，然后透析入PBS。重折疊流程可重現(xiàn)，產(chǎn)生相似的單體雙特異性scFv回收產(chǎn)率和EC50（表30，圖19A和19B）?；厥諉误w蛋白質(zhì)，與親本分子相比，得到的分子保留高生物活性。重要地，折疊在高量31A12c-PEGscFv的存在下也可進(jìn)行。此外，表面等離振子共振數(shù)據(jù)進(jìn)一步確認(rèn)了雙特異性劑的兩端對(duì)IL-6（13A8）和IL-23（31A12）兩個(gè)靶標(biāo)的生物活性（表31）。表30：來(lái)自不同批次的單體雙特異性scFv回收和EC50。表31：31A12c-PEG-13A8c雙特異性劑的結(jié)合親和力。Ka(M-1s-1)Kd(s-1)KD(pM)對(duì)IL-6的親和力2.9x1055.14x10-5214.9對(duì)IL-23的親和力7.73x1057.11x10-591.8將用20kDa線性PEG接頭制備的雙特異性劑的體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)與裸scFv的PK相比較。scFv單獨(dú)非?？斓嘏懦?，終端t1/2為約2小時(shí)，Cmax為500pg/ml，tmax為1-2小時(shí)，8小時(shí)內(nèi)幾乎完全清除（圖20A）。雙特異性劑顯示長(zhǎng)得多的體內(nèi)半衰期，終端t1/2為約24小時(shí)，Cmax為1500pg/ml，tmax為24小時(shí)，100小時(shí)時(shí)血清中有可檢測(cè)的水平（圖20B）。雙特異性scFv的藥物動(dòng)力學(xué)行為的這種改善將使它成為比簡(jiǎn)單的scFv更強(qiáng)力和有效的治療劑。相同的折疊方法可以用于PEG化的雙特異性13A8n-PEG20-31A12c（在13A8的N端而不是C端PEG化）。在3M尿素、30mMTrispH8.5、4mM半胱氨酸、2mM胱氨酸中折疊2個(gè)批次的0.1mg/mL的蛋白質(zhì)，然后透析入PBS。兩個(gè)批次都產(chǎn)生通過(guò)SEC的>95%的單體回收，與哺乳動(dòng)物衍生的13A8scFv的59pg/ml的EC50相比，雙特異性劑中和IL-6的EC50分別為1674和1691pg/mL（圖21），中和IL-23的EC50分別為4956和3249pg/mL。單體蛋白質(zhì)以良好的產(chǎn)率回收。8.8其他雙特異性scFv構(gòu)建體的重折疊通過(guò)與用于基于31A12的雙特異性劑的那些相似的方法來(lái)折疊13A8n-PEG-45G5c。在3M尿素、30mMTrispH8.5、4mM半胱氨酸、2mM胱氨酸中折疊0.1mg/mL的蛋白質(zhì)，然后透析入PBS。這產(chǎn)生通過(guò)SEC的29%的單體回收，對(duì)IL-6的EC50為933pg/mL，對(duì)IL-23的EC50為5,662pg/mL（圖22A和B）。通過(guò)與以上類似的方法來(lái)折疊13A8c-PEG-22H8c。在含8M尿素和DTT的緩沖液中制備13A8c-PEG-22H8c，并稀釋至0.05-0.1mg/mL總蛋白質(zhì)。然后在室溫下將它們透析入含3M尿素、30mMTrispH8.5、2-6mM半胱氨酸和1-3mM胱氨酸的折疊緩沖液中。備選地，還可以使用pH8或9、0.01-1%多乙氧基醚和/或4℃透析。通過(guò)透析入PBS來(lái)完成折疊。作為具體實(shí)例，在室溫下在3M尿素、30mMTrispH8.5、4mM半胱氨酸、2mM胱氨酸、0.05%多乙氧基醚中折疊0.1mg/mL的13A8c-PEG-22H8c，然后透析入含0.05%多乙氧基醚的PBS中。這產(chǎn)生通過(guò)SEC的35%的單體回收，中和IL-6的EC50為246pg/mL，中和IL-23的EC50為234pg/mL（圖23A和B）。通過(guò)與用于20K雙特異性劑的那些相似的方法來(lái)折疊13A8c-40KPEG-31A12c。在4℃下在3M尿素、30mMTrispH8.5、4mM半胱氨酸、2mM胱氨酸中折疊0.1mg/mL的蛋白質(zhì)，然后在4℃下透析入PBS中。這產(chǎn)生通過(guò)SEC的56.3%的回收，對(duì)IL-6的EC50為137.5pg/mL，對(duì)IL-23的EC50為2699pg/mL（圖24A和B）。此外，還可以通過(guò)在室溫和4℃二者下透析入含0.5M鹽酸胍的重折疊緩沖液來(lái)在更高濃度（0.5mg/mL）下重折疊13A8c-40KPEG-31A12c。將13A8c-40KPEG-31A12c雙特異性劑的體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)與13A8c-20KPEG-31A12c、13A8c-PEG和裸28D2的PK相比較（圖25A和B）。按1mg/kg（雙特異性劑和裸scFv）或0.5mg/kg（13A8c-PEG）在大鼠中皮下施用測(cè)試制品。給藥后定期采血，用B9IL-6中和測(cè)定針對(duì)測(cè)試制品的存在測(cè)定血清。結(jié)果顯示，裸scFv快速清除，而雙特異性劑和13A8c-PEG具有顯著更長(zhǎng)的半衰期和AUC。相對(duì)于13A8c-20KPEG-31A12c，13A8c-40KPEG-31A12c還顯示顯著增強(qiáng)的AUC（圖25B）。重折疊的雙特異性綴合物顯示了優(yōu)良的穩(wěn)定性，在4℃下至多為6個(gè)月。13A8-PEG-31A12雙特異性劑在抗IL-6和抗IL-23兩種測(cè)定中顯示一致的效價(jià)。在SDS-PAGE分析或SEC層析中觀察到非常少的降解。實(shí)施例9：體外測(cè)量的雙特異性scFv對(duì)Th17和Th22細(xì)胞的產(chǎn)生的作用可以通過(guò)用抗-CD3加抗CD28刺激全PBMC或純化的T細(xì)胞，或通過(guò)混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物中的異源細(xì)胞來(lái)使Th17和Th22T細(xì)胞亞群在體外分化（圖26A）。這類T細(xì)胞的分化還需要加入尤其是針對(duì)Th17細(xì)胞良好表征的許多關(guān)鍵的調(diào)節(jié)細(xì)胞因子。這些調(diào)節(jié)細(xì)胞因子主要衍生自髓樣細(xì)胞，它們的加入可以用髓樣細(xì)胞連同刺激那些細(xì)胞釋放它們的調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的化合物的加入來(lái)代替。用LPS與抗CD3一起刺激全PBMC來(lái)分化為Th17細(xì)胞。在還加入IL-1和TGFβ時(shí)獲得最佳結(jié)果，因?yàn)樵S多研究人員之前已顯示這些衍生自髓樣細(xì)胞的細(xì)胞因子促進(jìn)Th17從純化的幼稚T細(xì)胞分化。加入刺激物來(lái)誘導(dǎo)髓樣細(xì)胞釋放它們的調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，Th17和Th22T細(xì)胞還可以在異源混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物（MLC）中分化。向MLC中加入肽聚糖作為刺激物，因?yàn)橐阎T導(dǎo)IL-1、IL-6、TNF及其他調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和促炎癥細(xì)胞因子的分泌。在目的是研究Th22細(xì)胞的誘導(dǎo)時(shí)，還需要加入IL-2。用抗CD3/28加LPS和TGFβ刺激PBMC。5天后，用PMA+洛諾霉素再刺激它們來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)分析IL-17的表達(dá)。PBMC培養(yǎng)物中Th17細(xì)胞的百分比由于這些培養(yǎng)條件而提高三倍（圖26B）。IL-6的包含與IL-23拮抗劑組合阻止Th17細(xì)胞提高三倍。在抗CD3/28刺激中還觀察到Th22細(xì)胞（圖26C）。用異源白細(xì)胞體外刺激體外人T細(xì)胞也誘導(dǎo)高水平的產(chǎn)生IL-17的T細(xì)胞（圖26D）。單種IL-6和IL-23拮抗劑的加入抑制抗CD3/28培養(yǎng)物系統(tǒng)中的Th17和Th22分化。31A12和13A8scFv這2種拮抗劑的組合比兩種拮抗劑中任一種單獨(dú)更有效（圖27）。通過(guò)與前一實(shí)驗(yàn)相同的拮抗劑來(lái)抑制MLC中的Th17的情況也如此（圖28）。在抑制MLC中的Th17細(xì)胞中，13A8c-20kPEG-31A12c雙特異性劑比親本嵌合mAb13A8和31A12的組合更有活性，且比兩種mAb中任一種單獨(dú)更好（圖29）。這證明了通過(guò)使用本發(fā)明的二價(jià)雙特異性構(gòu)建體獲得的有益作用。實(shí)施例10：體內(nèi)測(cè)量的scFv對(duì)Th17和Th22細(xì)胞的產(chǎn)生的作用為了在體內(nèi)評(píng)價(jià)TH17和TH22分外的抑制，利用了異種移植模型，其中將人造血干細(xì)胞移植入免疫缺陷小鼠，免疫缺陷小鼠轉(zhuǎn)而獲得人免疫系統(tǒng)。用與植入小鼠的人免疫細(xì)胞異源的人皮膚移植這些人源化NOD-scidIL2rgnull（NSG）小鼠（圖30）。然后用IL-6和IL-23的PEG化scFv拮抗劑（13A8c-PEG和31A12c-PEG）的混合物處理它們。然后人免疫系統(tǒng)將通過(guò)人T細(xì)胞分化為效應(yīng)細(xì)胞來(lái)排斥此異源人皮膚。IL-6和IL-23拮抗劑抑制Th17細(xì)胞的分化，Th17細(xì)胞的分化是異源皮膚移植的一個(gè)結(jié)果，但這些拮抗劑不抑制皮膚異源移植的排斥，反映了它們的靶向免疫抑制作用。簡(jiǎn)言之，照射新生NSG小鼠，注射衍生自臍帶血的人造血干細(xì)胞，然后在第12周針對(duì)外周血中的移入水平進(jìn)行篩選（Brehm等,2010）。用人異源皮膚移植成功移入的小鼠，并每2天接受100μg抗IL-6和抗IL-23（13A8c-PEG和31A12c-PEG）。皮膚移植后30天，回收脾，用PMA/洛諾霉素刺激單細(xì)胞懸液，并測(cè)定胞內(nèi)細(xì)胞因子。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析CD3+/CD4+細(xì)胞的IL-17和IL-22產(chǎn)生。在未用細(xì)胞因子拮抗劑處理的小鼠中，如流式細(xì)胞術(shù)圖譜（圖31A）中和代表各亞群中的Th細(xì)胞數(shù)的匯編數(shù)據(jù)（圖31B）中所示，出現(xiàn)非常顯著的TH17和TH22細(xì)胞水平。皮膚移植后用抗IL-6（13A8cscFv-PEG）和抗IL-23（31A12c-PEG）的組合處理小鼠30天。處理的小鼠中TH17和TH22細(xì)胞的分化完全被抑制。這些數(shù)據(jù)首次清楚地顯示，IL-6和IL-23為這些TH17和TH22細(xì)胞的體內(nèi)分化所需。此外，這些數(shù)據(jù)將此動(dòng)物模型確認(rèn)為能夠引起和調(diào)節(jié)人T細(xì)胞分化的模型。最后，這些數(shù)據(jù)顯示了此處使用的IL-6和IL-23拮抗劑在體內(nèi)完全抑制這些細(xì)胞因子的作用的有效性。用13A8c-20kPEG-31A12c抗IL-6/抗IL-23雙特異性劑獲得了相似的結(jié)果。如圖32A-C中所示，雙特異性分子在抑制Th17分化上比單價(jià)抗IL-23試劑更有效。但是，圖32D-L顯示雙特異性劑并非廣泛地免疫抑制，因?yàn)門H17/22以外的細(xì)胞類型的白細(xì)胞標(biāo)志未顯著減少。實(shí)施例11：體內(nèi)銀屑病模型中測(cè)量的scFv對(duì)Th17和Th22細(xì)胞效應(yīng)子功能的作用為了在炎癥部位評(píng)價(jià)Th17效應(yīng)子功能的抑制，使用了scid/hu銀屑病模型，其中將人銀屑病皮膚移植到免疫缺陷的scid小鼠上。皮膚移入和銀屑病炎癥持續(xù)至多2個(gè)月。用藥物處理小鼠兩周，通過(guò)組織學(xué)分析來(lái)測(cè)量對(duì)炎癥的作用，如圖33中所示，其中可以在表皮厚度的顯著減少中清楚地觀察到13A8c-20kPEG-31A12c抗IL-6/抗IL-23雙特異性劑的作用。還可以從組織切片定量該作用。如通過(guò)病理學(xué)家在移植物仍在小鼠上時(shí)的半定量臨床評(píng)分（圖34A）、或通過(guò)上述組織切片中表皮厚度的定量測(cè)量（圖34B）來(lái)測(cè)定，13A8c-20kPEG-31A12c與它的單價(jià)抗IL-6抑制劑成分或與IL-6拮抗劑mAb（Tocilizumab（Actemra））的比較顯示3A8c-20kPEG-31A12c顯著優(yōu)于兩種IL-6拮抗劑中任一種單獨(dú)。此外，13A8c-20kPEG-31A12c比TNF拮抗劑Enbrel更快發(fā)揮作用來(lái)抑制炎癥（圖34C-D）。實(shí)施例12：體內(nèi)測(cè)量的雙特異性scFv對(duì)IL-23介導(dǎo)的耳炎的產(chǎn)生的作用將人IL-23皮內(nèi)注射入小鼠耳時(shí)，IL-23將引起炎癥，因?yàn)槿薎L-23可以作用于小鼠IL-23受體。通過(guò)用IL-23每天注射耳、注射4天來(lái)測(cè)量13A8c-PEG-31A12c抑制人IL-23誘導(dǎo)的耳炎的能力。然后測(cè)量耳腫（圖35A）。在IL-23處理開始前一天和IL-23處理開始后一天開始處理小鼠，此處理有效阻斷耳腫（圖35B）。如圖35C中所示，13A8c-PEG-31A12c至少與IL-12/23拮抗劑mAb，Stelera（Ustekinumab）一樣有效。重要地，即使僅在IL-23處理開始前一天施用時(shí)，用13A8c-PEG-31A12c（用20kDaPEG或40kDaPEG制備）處理小鼠也是非常有效的耳腫抑制劑（圖35D）。實(shí)施例13：AZ17的IL-23特異性scFv成分的表位作圖31A12mAb結(jié)合之前未描述過(guò)的獨(dú)特表位。雖然31A12和49B7對(duì)IL-23抑制特異而不抑制人IL-12（圖36B），但使用的所有mAb都與人IL-12結(jié)合（圖36B）。這些數(shù)據(jù)清楚地顯示，這些mAb與p40鏈結(jié)合。與還抑制IL-12的22H8相比，31A12和49B7與人IL-12相對(duì)弱地結(jié)合。但是，全部三種mAb都與猴IL-12強(qiáng)烈結(jié)合（圖36B），且還抑制猴IL-12生物活性（圖36C）。因此，31A12和49B7區(qū)分人和猴IL-12活性。31A12和49B7似乎結(jié)合在人IL-12中部分遮蔽，而在猴IL-12以及來(lái)自兩個(gè)物種的IL-23中暴露的p40表位。此外，AZ17不抑制Ustekinumab的結(jié)合，Ustekinumab是抑制人IL-12和IL-23二者的p40特異性mAb。參考文獻(xiàn)補(bǔ)充參考文獻(xiàn)