本發(fā)明屬中醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及酸漿屬植物中抗腫瘤活性成分酸漿苦素b(physalinb)的制備方法及其在抗肺部腫瘤制藥中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌癥是目前僅次于心血管疾病的嚴(yán)重危及人類健康的重大疾病。作為一類重大疾病，癌癥包括了200多種不同的腫瘤。各種腫瘤在發(fā)生發(fā)病以及對(duì)治療的反應(yīng)都有不同的特征，機(jī)制十分復(fù)雜。肺癌是全球最常見的惡性腫瘤，隨著近年來大氣環(huán)境的復(fù)雜化，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，其中非小細(xì)胞肺癌占肺癌(nsclc)發(fā)病率的80％，已成為癌癥類死亡的首要原因[clincancerres.2009,15(6):2076-2084.]。2010年美國(guó)肺癌和支氣管癌的新發(fā)病例估計(jì)為22.252萬例，其中男性11.675萬例，女性10.577萬例，死亡15.73萬例[anticancerres.12:1155-1166,1992.]。我國(guó)目前每年新發(fā)肺癌月50萬例，到2025年預(yù)計(jì)我國(guó)每年將有100萬肺癌患者。大多數(shù)nsclc患者就診時(shí)已處于不可切除的局部晚期或遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。對(duì)于新診斷晚期nsclc患者，以泊類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案的中位生存期為7.4-9.9個(gè)月，化療聯(lián)合貝伐單抗治療的中位生存期為12.5個(gè)月；二線化療藥物，如培美曲賽和多西他賽的中位無進(jìn)展生存期約2.2-2.9個(gè)月，治療效果不太理想。臨床期待新一代高效低毒的抗腫瘤藥物盡快研發(fā)、上市。

酸漿苦素(physalins)是存在于酸漿屬(physalis)植物(如：錦燈籠、小酸漿、苦蘵等)及其它相近茄科植物中的一類高氧化水平的13,14-裂環(huán)-16,24-環(huán)麥角甾烷類化合物(c28h30–34o9–12)，自1969年至今，從酸漿屬植物中共分離得到30余個(gè)酸漿苦素類化合物。physalinb是其中活性較好的一個(gè)，研究表明其對(duì)肝癌ha22t細(xì)胞、宮頸癌hela細(xì)胞、鼻咽癌kb細(xì)胞、結(jié)腸癌colo-205細(xì)胞的生長(zhǎng)均具有較好抑制作用，但是目前鮮有對(duì)physalinb抗肺癌活性及其作用機(jī)制的報(bào)道。

前期關(guān)于physalinb的專利(申請(qǐng)公布號(hào)為cn102633861a(申請(qǐng)?zhí)枮?01210119268.8)采用超臨界萃取的方法作為提取方法，并且涉及氯仿、甲醇等有機(jī)溶劑，不但毒性大、成本昂貴，且不易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。另外，目前，還沒有關(guān)于physalinb在抗肺部腫瘤方面應(yīng)用專利的公布。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在不易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)的不足，提供一種酸漿苦素b的制備方法及其在抗肺部腫瘤制藥中的應(yīng)用，解決了目前治療肺部腫瘤疾病缺乏相關(guān)藥物的問題。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：一種酸漿苦素b的制備方法，通過以下途徑獲得：

(1)取粉碎過的酸漿屬植物，加入到3-5倍重量的60vol％乙醇中進(jìn)行熱回流提取兩次，合并兩次提取液，再減壓濃縮至無醇，濃縮后經(jīng)1-3倍體積的乙酸乙酯萃取兩次，再合并兩次萃取液，將乙酸乙酯層減壓蒸干，得到浸膏。

(2)將步驟(1)獲得的浸膏用乙酸乙酯完全溶解，經(jīng)d101大孔吸附樹脂吸附后，依次用10-20倍柱體積的水、20vol％乙醇、40vol％乙醇、50vol％乙醇、60vol％乙醇和70vol％乙醇進(jìn)行洗脫，收集70vol％乙醇洗脫部分進(jìn)行濃縮蒸干，蒸干后以6:1-3:1的比例(硅膠填料重量：濃縮物重量)通過常壓正相硅膠色譜進(jìn)行分離，以體積比分別為30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液依次進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫30個(gè)柱體積，收集石油醚和乙酸乙酯的體積比為15:1、10:1和5:1的洗脫液，合并蒸干后得到酸漿苦素b粗品，進(jìn)一步經(jīng)丙酮重結(jié)晶，即得physalinb單體。

進(jìn)一步的，所述酸漿屬植物為錦燈籠、酸漿、小酸漿或苦蘵。

本發(fā)明的另一目的是提供一種上述的酸漿苦素b在制備抗肺部腫瘤藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，所述的抗腫瘤藥物為固體制劑或液體制劑。

進(jìn)一步的，所述抗肺部腫瘤藥物的給藥途徑為非腸道。

本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明的physalinb是可以從酸漿屬(physalis)植物(如小酸漿(physalisminima)、酸漿(physalisalkekengi)、苦蘵(physalisangulata)等)中分離純化得到的，操作簡(jiǎn)便、且純度高。此外，具有來源廣泛，取材便利等優(yōu)點(diǎn)，便于工業(yè)化大量制備。physalinb在制備抗肺部腫瘤藥物中的應(yīng)用具有顯著的抗肺癌作用，由physalinb制備的抗肺部腫瘤藥物制劑有很強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。本發(fā)明通過色譜分析及簡(jiǎn)單的重結(jié)晶技術(shù)提取制備了酸漿苦素b晶體，該技術(shù)簡(jiǎn)化了酸漿苦素b的制備流程，所制備的酸漿苦素b具有較高的抗肺部腫瘤活性。

附圖說明

圖1是physalinb的hplc-dad檢測(cè)圖譜(230nm)；

圖2是physalinb的二級(jí)質(zhì)譜圖(正離子模式)；

圖3(a)是不同濃度physalinb對(duì)a549細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用效果圖；(b)是不同濃度順鉑對(duì)a549細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用效果圖；

圖4(a)是不同濃度physalinb對(duì)a549細(xì)胞凋亡的影響圖；圖4(b)是不同濃度physalinb對(duì)a549細(xì)胞周期中sub-g1相所占比率的影響圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開了physalinb在制備肺部腫瘤藥物中的應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)予以改進(jìn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明中。本發(fā)明的應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

實(shí)施例1physalinb的制備：

(1)提?。?/p>

取干燥錦燈籠(physalisalkekengi)的宿萼5kg，加入到60vol％乙醇15l中進(jìn)行熱回流提取兩次，每次回流2小時(shí)，合并兩次提取液，再減壓濃縮至無醇，濃縮后加1倍體積的乙酸乙酯萃取2次，再合并兩次萃取液，再將乙酸乙酯層減壓蒸干，得560g浸膏。

(2)純化：

將步驟(1)獲得的浸膏用乙酸乙酯完全溶解，經(jīng)d101大孔吸附樹脂吸附后，依次用10倍柱體積的水、20vol％乙醇、40vol％乙醇、50vol％乙醇、60vol％乙醇和70vol％乙醇洗脫，收集70vol％乙醇洗脫部分，減壓濃縮，蒸干，得粉末375kg。以6:1的比例(硅膠填料重量：濃縮物重量)上樣，通過常壓(一個(gè)大氣壓)正相硅膠色譜進(jìn)行分離，以體積比分別為30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液依次進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫30個(gè)柱體積，收集石油醚和乙酸乙酯體積比為15:1、10:1、5:1的洗脫液，合并至干后得4.6g白色粉末(主成分含量82.1％)，再用丙酮重結(jié)晶，得3.4g純度為98.2％的單體化合物(采用峰面積歸一化法計(jì)算，附圖1)。

實(shí)施例2physalinb的制備：

(1)提取：

取干燥錦燈籠(physalisalkekengi)的宿萼5kg，加入到60vol％乙醇25l中進(jìn)行熱回流提取兩次，每次回流2小時(shí)，合并兩次提取液，再減壓濃縮至無醇，濃縮后加3倍體積的乙酸乙酯萃取2次，再合并兩次萃取液，再將乙酸乙酯層減壓蒸干，得582g浸膏。

(2)純化：

浸膏用乙酸乙酯溶解，用d101大孔吸附樹脂吸附后，依次用20倍柱體積的水、20vol％乙醇、40vol％乙醇、50vol％乙醇、60vol％乙醇和70vol％乙醇洗脫，收集70vol％乙醇洗脫部分，減壓濃縮，蒸干，得粉末381kg。以3:1的比例(硅膠填料重量：濃縮物重量)上樣，通過常壓(一個(gè)大氣壓)正相硅膠色譜進(jìn)行分離，以體積比分別為30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液依次進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫30個(gè)柱體積，收集石油醚和乙酸乙酯體積比為15:1、10:1、5:1的洗脫液，合并至干后得5.3g白色粉末(主成分含量79.1％)，再用丙酮重結(jié)晶，得4.2g純度為97.3％的單體化合物。

實(shí)施例3結(jié)構(gòu)鑒定：

經(jīng)esi-tofms分析得該化合物的分子量為m/z：510.1897，相應(yīng)的分子式為c28h30o9，其二級(jí)質(zhì)譜圖顯示(圖2所示)主要子離子為493，475,451和171等。¹³c-nmr譜(100mhz，dmso-d6)中給出28個(gè)碳信號(hào)，δc160以上出現(xiàn)4個(gè)碳信號(hào)，提示可能存在4個(gè)羰基：δc202.4為六元環(huán)上α、β不飽和酮的羰基碳信號(hào)(c-1)，δc171.8，167.3為酯羰基碳信號(hào)(c-18，c-26)，δc209.4為酮的碳信號(hào)。δc106.3為縮酮碳，此信號(hào)為酸漿苦素類化合物碳譜中的特征性信號(hào)，初步認(rèn)為符合酸漿苦素類化合物的譜學(xué)特征。δc126.7，146.1為與羰基共扼的△^2,3；δc135.5，123.4為△^5,6；¹h-nmr(400mhz，dmso-d6)譜中出現(xiàn)了3個(gè)烯屬碳原子上的多峰質(zhì)子信號(hào)(δh5.60，5.81，6.90)；3個(gè)叔碳上的單峰甲基信號(hào)(δh1.09，l.16，1.79)；δh2.88(1h，d，j＝4.2，h-25)以及δh3.61(ih，d，j＝14.0，h＝27)和δh4.27(1h，dd，j＝14.0，4.2，h-27)，推測(cè)該化合物具有“-och2ch-”結(jié)構(gòu)片斷，從而得出該化合物具有c-27與c-14上氧成環(huán)的結(jié)構(gòu)。經(jīng)與與參考文獻(xiàn)[tetrahedronletters,1969,10(22):1765-1766.]中報(bào)道的physalinb的數(shù)據(jù)比對(duì)，最終確定該化合物為physalinb。

實(shí)施例4藥效試驗(yàn)：

mtt法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率將a549細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入終濃度為0～40umol/lphysalinb，每孔100μl，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)平行孔，培養(yǎng)24h后，向每孔中加入5g/l的mtt10μl繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，向每孔中加入dmso100μl溶解結(jié)晶體，置于搖床振蕩30min，至藍(lán)紫色顆粒完全溶解后，于酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔吸光度值(a)，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(％)＝(1-(加藥孔a值-空白對(duì)照孔a值))/(對(duì)照孔a值-空白對(duì)照孔a值)×100％(n＝3)。

研究結(jié)果見附圖3(a)和(b)，表明以不同濃度physalinb和順鉑分別處理a549細(xì)胞24h后，其中physalinb的ic50為5.87umol/l，而在40umol/l順鉑處理后，抑制率僅為18.1％。綜上所述，physalinb對(duì)a549細(xì)胞具有明顯的抑制作用且這種抑制作用明顯強(qiáng)于順鉑(陽(yáng)性藥物)，且呈濃度依賴性。

實(shí)施例5藥效試驗(yàn)：

流式細(xì)胞儀annexinv-fitc/pi雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率將a549細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入終濃度為0、4、8、16μmol/l的physalinb，每孔1ml，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，按照annexinv-fitc/pi細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)樣測(cè)定，根據(jù)annexinv-fitc(x)/pi(y軸)熒光做對(duì)數(shù)散點(diǎn)圖，可獲得由4個(gè)象限組成的雙參數(shù)圖：左上象限(q1)為細(xì)胞收集過程中產(chǎn)生的損傷細(xì)胞，右上象限(q2)為晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，左下象限(q3)為活細(xì)胞，右下象限(q4)為早期凋亡細(xì)胞，每個(gè)象限的細(xì)胞數(shù)即為受檢總細(xì)胞數(shù)中所占的比例(n＝3)。

流式細(xì)胞儀pi染色法檢測(cè)細(xì)胞周期將a549細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入終濃度為0、5、10、20μmol/lphysalinb，每孔1ml，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，中止培養(yǎng)，胰酶消化，以冷pbs洗滌細(xì)胞3次，70％預(yù)冷乙醇混勻，4℃固定過夜，離心，棄去乙醇上清，加入預(yù)冷的pbs洗沉淀1次，離心去上清，加入rna酶(50mg/l)10μl/孔和pi(50mg/l)300μl/孔，震蕩混勻，室溫、避光反應(yīng)30min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行dna檢測(cè)，用modifit軟件分析各時(shí)相細(xì)胞周期的比例(n＝3)。

研究結(jié)果：physalinb對(duì)a549細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用的結(jié)果見附圖4(a)，4～40umol/lphysalinb處理24h后，q2+q4相比率隨著physalinb濃度的升高逐漸增加的同時(shí)，細(xì)胞周期中sub-g1相所占比率也在逐漸增加(圖4(b))，且與空白對(duì)照組相比具有顯著性差異(p<0.01)。提示physalinb對(duì)a549細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)具有濃度依賴性。

實(shí)施例6藥效試驗(yàn)：

dapi細(xì)胞核染色法觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變細(xì)胞處理同“實(shí)施例5”，physalinb作用24h后，吸去培養(yǎng)液，用pbs清洗3次，迅即加入40g/l的多聚甲醛液固定15min后，吸去固定液，以pbs清洗3次，用blockingbuffer對(duì)細(xì)胞進(jìn)行封閉1h，加入150ul/孔一抗lc3(1:1000/1:500)4℃孵育過夜，棄去一抗，以pbs清洗4次，室溫下孵育二抗(fitc,goat,1:150)1h，以pbs清洗4次，1×pbs+dapi(1:1000)室溫條件下染色15min，用pbs清洗3次，甘油封片，在olympus-fv1000倒置雙子光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)并隨機(jī)拍照。

研究結(jié)果：以physalinb不同濃度(5、10、20umol/l)處理a549細(xì)胞24h后，在olympus-fv1000倒置雙子光共聚焦顯微鏡下觀察，可見部分細(xì)胞皺縮，出現(xiàn)核固縮、染色質(zhì)凝集等細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化；lc3抗體(自噬標(biāo)記物)的熒光值明顯增強(qiáng)，細(xì)胞受到藥物作用自噬作用明顯增強(qiáng)，呈現(xiàn)濃度依賴性，說明誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞自噬是physalinb抗癌作用的機(jī)制之一。

實(shí)施例7化合物physalinb粉針劑的制備：

physalinb500mg

甘露醇5.0g

將physalinb500mg加400ml注射用水溶解，加入甘露醇5.0g，溶解后定容至500ml，除菌過濾，冷凍干燥即得。

實(shí)施例8化合物physalinb注射用水針劑的制備：

physalinb500mg

吐溫-80/泊洛沙姆18850ml/80ml

加注射用水至500ml

取physalinb500mg溶于50ml吐溫-80或者80ml泊洛沙姆188中，加0.1-0.5％的活性炭除去熱原，經(jīng)微孔濾膜超濾后，補(bǔ)充注射用水至500ml，灌裝于安瓿瓶中或輸液瓶中，熔封/軋蓋，經(jīng)檢驗(yàn)合格后，包裝即得。

實(shí)施例9化合物physalinb注射用水針劑的制備：

將1.0g環(huán)糊精與50ml注射用水混合，形成澄清溶液

在上述溶液中加入1.0gphysalinb，攪拌24小時(shí)

注射用水定容至500ml，用0.22μm濾膜過濾除菌后，灌裝于安瓿瓶中或輸液瓶中，熔封/軋蓋，經(jīng)檢驗(yàn)合格后，包裝即得。

綜上所述，本發(fā)明實(shí)施例提供physalinb在制備抗肺部腫瘤藥物中的應(yīng)用具有顯著的抗腫瘤作用，由physalinb以及含有physalinb提取物制備的治療肺部腫瘤的藥物制劑，具有很強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。

本發(fā)明用于制備抗肺部腫瘤的藥物時(shí)，將酸漿苦素與液體賦形劑制備成固體或液體制劑。優(yōu)選地本發(fā)明提供的抗肺部腫瘤的藥物注射劑為凍干粉針劑或水針劑。本發(fā)明制備抗肺部腫瘤的藥物時(shí)是與液體的賦形劑一起構(gòu)成的，這里使用的液體賦形劑在本領(lǐng)域是眾所周知的，主要有水、甘油、丙二醇、單糖漿、乙二醇、聚乙二醇、山梨糖醇等。

對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點(diǎn)來看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。不應(yīng)將權(quán)利要求中的任何附圖標(biāo)記視為限制所涉及的權(quán)利要求。