本發(fā)明屬于水產(chǎn)遺傳和分子育種技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種快速篩選光倒刺鲃快速生長個(gè)體的方法和試劑盒及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

光倒刺鲃(spinibarbushollandi)屬鯉形目，鯉科，鲃亞科，倒刺鲃屬。具有個(gè)體大、生長快、食性廣、耐低氧、抗病力強(qiáng)、易養(yǎng)殖等優(yōu)點(diǎn)。分布于長江、錢塘江、閩江、九龍江、珠江、元江、臺灣島及海南島等諸水系。由于光倒刺鲃近親繁殖，肆意雜交導(dǎo)致光倒刺鲃的種質(zhì)資源遭到破壞，使其物種退化，造成減產(chǎn)，易感病等結(jié)果，對于光倒刺鲃的種質(zhì)改善是當(dāng)下亟待解決的問題。

單核苷酸多態(tài)性，全稱(singlenucleotidepolymorphisms，snps)，是指在基因組上單個(gè)核苷酸的變異，包括轉(zhuǎn)換、顛換、缺失和插入，形成的遺傳標(biāo)記，其數(shù)量很多，多態(tài)性豐富。在人類的基因組中每1000個(gè)堿基中，就存在一個(gè)snp。在魚類中，snp可能會影響到魚類的免疫，代謝，耐低氧程度，生長性狀等等，以snp作為分子標(biāo)記進(jìn)行輔助育種，將會極大地提高篩選的速度以及準(zhǔn)確率。

黑素皮質(zhì)激素受體(melanocortin-4receptor，mc4r)，是一種g蛋白偶聯(lián)受體，與體內(nèi)的能量平衡，脂肪代謝，平衡等其他方面有著廣泛的影響。mc4r由于是重要的生長性狀控制基因，該基因的多態(tài)性也會導(dǎo)致生物生長指標(biāo)的多態(tài)性，對mc4r的研究有著很大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，所以近年來在畜牧業(yè)和漁業(yè)對該基因十分關(guān)注。

目前，還沒有關(guān)于光倒刺鲃的mc4rsnp與光倒刺鲃生長特性的相關(guān)研究報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種快速篩選光倒刺鲃快速生長個(gè)體的方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種快速篩選光倒刺鲃快速生長個(gè)體的試劑盒。

本發(fā)明的再一目的在于提供所述的快速篩選光倒刺鲃快速生長個(gè)體的方法以及試劑盒的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種快速篩選光倒刺鲃快速生長個(gè)體的方法，包括如下步驟：

(1)將光倒刺鲃的黑素皮質(zhì)激素受體的啟動子第-686位和第-522位核苷酸分別命名為snp1和snp2，并進(jìn)行檢測；

(2)依據(jù)如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選：

①第snp1位為ct雜合子時(shí)為快速生長群體；為c純合子時(shí)為次快速生長群體；為t純合子時(shí)為劣勢群體；

②第snp2位為ag雜合子時(shí)為快速生長群體；為g純合子時(shí)為次快速生長群體；為a純合子時(shí)為劣勢群體；

③由于微效基因的加性效應(yīng)，當(dāng)snp1位點(diǎn)和snp2位點(diǎn)均為雜合子時(shí)生長速度最快；當(dāng)兩個(gè)位點(diǎn)中只有一個(gè)是雜合子另一個(gè)是生長較快的純合子時(shí)，生長速度次之；其他以此類推，即按生長速度，snp1位點(diǎn)和snp2位點(diǎn)均為雜合子＞snp1位點(diǎn)和snp2位點(diǎn)中一個(gè)為雜合子且另一個(gè)為生長較快純合子(c純合子或g純合子)＞snp1位點(diǎn)和snp2位點(diǎn)均為生長較快純合子(c純合子和g純合子)＞snp1位點(diǎn)和snp2位點(diǎn)中一個(gè)為雜合子且另一個(gè)為生長較慢純合子＞snp1位點(diǎn)和snp2位點(diǎn)中一個(gè)為生長較快純合子且另一個(gè)為生長較慢純合子＞snp1位點(diǎn)和snp2位點(diǎn)均為生長較慢純合子(t純合子和a純合子)。

步驟(1)中所述的光倒刺鲃的黑素皮質(zhì)激素受體基因組序列如下(seqidno.1)所示；或是如下(seqidno.1)所示的序列發(fā)生一個(gè)或若干個(gè)突變、或缺失的序列；下劃線部分為編碼區(qū)，粗體方框部分為發(fā)現(xiàn)的snps位點(diǎn)。

atatctttagatttattcacaaactaaagtgactctctttgcatgaatcgttggattattaatatagccaattcattcaaaaattgactcattcagaaattaaacaagtgattgtcgcagtgaatcactgaatcatttatatatttaaatatactttgaattacttgattttataaacataccatcaaaatgctttaagaaatcatgcacttcctataaaggattttatctatttgttgaaaacaaggcaaccccattcatacactgacctccttctgatatttgcttacattcacccatcagaactgcctctgattggtggagaaagctgggggaggagcctgggctcagtgtgccagacagtggctgtggaggcaagagtatctcactcgcccgcctgccaagtgctggaagctctggagactgcctcgctctgaacactgtttgcacttcaacagtgttgaaacagagtcagcgttttcagattcggtcaactgacgctgtctcctatcctctgattctctgtctgcatgtttctgtctctattttttttacattttatttatttttgttttgtgtaggaggctcttgcagaccactggcggacgtttttgctgatttggaggaagagttatcacagaggtgaggtgacggatgctcacacagcacctgctttgtttgatctacatgacggatgatgttcaatttgaattcacctgactgaagtagacacagatcaaaacactgactacagatattaagggaaatgaacacctcacatcatcatggactgcatcattcataccggaatcacagccagggagctttaccggtgggaaagcctgctcagggcgagagaagatcaacctctggatgctatgagcagctgctcatctccacagaggtcttcctcacactcgggctcgtcagtctcctggagaacattctggtgattgcggctattgtcaagacaagaacttcatctcccatgtacttctttatctgcagtttagccgtagcagacttgttggtcagtgtctccaatgcgtcagaaacagtagtgatggcgctcatcacgggtggcaacctgaccaatcgcgagagcatcatcaagaacatggacaacatttttgactcgatgatctgcagctcgctgttggcctccatttggagtttgttggccattgcggtggaccgctacatcacaatcttctacgctttgcgctaccacaacatcatgacccaacggcgggcgggcaccatcatcacctgcatttggaccttctgcacggtctctggtgtgctctttatcgtgtactcggagagcaccaccgttctcatctgccttatcagcatgttcttcaccatgctggcgcttatggcctcgctctatgtccacatgtttcttctagcccgactgcacatgaagcgcattgccgccctccccggcaacggccctatctggcaggcggcaaatatgaaaggggccatcaccatcactatcctgctgggtgtattcgtggtgtgctgggctccctttttcttgcacctcatcctcatgatctcctgccctcggaacccttattgcatctgtttcatgtcccacttcaacatgtatctgatcctcattatgtgcaactcggccatagaccctctcatctatgccttcaggagccaagagatgaggaagaccttcaaggagatctgctgctgctgctgtggattgacctctctgtgtgtatagcctttttactgtttcacgtcaaggtgctgattgtgagatgttggcttgcaagacaacactaagcaactgtcactggatgcatgctgaaaatgtagaagatctaattacactgcatagcttgtgtgattattctgcgcacacatttatttgatacccagagaaatatgatactatggatgtgctgaccatgaaaaaatgctaatgttaatgactcaaggatttattgacatgctgttttggtgtttatttatatttacaagtctcattcattttacctgctgaataagacatcaaaaagtcaaagtgccaatatttaaaagcattaaatgacagaaaattcatggcactgtgtgtgttgtgattcagtgactcaagcacatgcacaatatttggcaactgtgaatatgttctcttagcaggttggtacttcagttattcagcttgagaaccattgctgcttgataaatgtttcagacttatgaatttatttttgtattttgtaagttatcgttttatttatttatttgtaatgccatttcattgtgcaaataaaaccacatcaaaaccagtaattatgcctcatattttcttgtggaattgctaaaacaatagtagatttgatggtctggtagggattttgcttttgcgtcttagattttattccattttccttcctttccatcttcagagtcgtggaactcaaaaagtaaatgtctatattatctactaaaagactgcctacaagctcttagaagctatttatttaatcagtctgttttgaaggttaccacattgcactgaatagactctcatctagtacgactacaaaaggaa。

所述的快速篩選光倒刺鲃快速生長個(gè)體的方法在篩選光倒刺鲃快速生長個(gè)體中的應(yīng)用。

一種快速篩選光倒刺鲃快速生長個(gè)體的試劑盒，是依據(jù)上述方法設(shè)計(jì)得到，含有檢測光倒刺鲃的黑素皮質(zhì)激素受體的第snp1位核苷酸的引物組和檢測光倒刺鲃的黑素皮質(zhì)激素受體的第snp2位核苷酸的引物組。

所述的快速篩選光倒刺鲃快速生長個(gè)體的試劑盒還包括pcr用酶、pcr用緩沖液和pcr用水中的至少一種。

所述的引物組優(yōu)選設(shè)置在相對保守的區(qū)域，從而避免不同來源的光倒刺鲃因?yàn)榛蚨鄳B(tài)性影響擴(kuò)增效果。

所述的檢測光倒刺鲃的黑素皮質(zhì)激素受體的第snp1位核苷酸的引物組是能擴(kuò)增含有第snp1位核苷酸的序列的引物組，優(yōu)選如下：

引物snp1f：5’-tctttatgagtgaattactgaatc-3’；

引物snp1r：5'-aggaagtgcatgatttcttaaag-3'。

所述的檢測光倒刺鲃的黑素皮質(zhì)激素受體的第snp2位核苷酸的引物組是能擴(kuò)增含有第snp2位核苷酸的序列的引物組，優(yōu)選如下：

引物snp2f：5'-gcagtgaatcactgaatcat-3'；

引物snp2r：5'-caccaatcagaggcagttc-3'。

所述的pcr用酶優(yōu)選為taq酶。

所述的pcr用水優(yōu)選為去離子水或蒸餾水。

所述的快速篩選光倒刺鲃快速生長個(gè)體的試劑盒在篩選光倒刺鲃快速生長個(gè)體中的應(yīng)用，具體步驟優(yōu)選如下：

(a)使用檢測光倒刺鲃的黑素皮質(zhì)激素受體的第snp1位核苷酸的引物組和檢測光倒刺鲃的黑素皮質(zhì)激素受體的第snp2位核苷酸的引物組對光倒刺鲃的基因組進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；

(b)將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，得到的測序結(jié)果依據(jù)如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選：

①第snp1位為ct雜合子時(shí)為快速生長群體；為c純合子時(shí)為次快速生長群體；為t純合子時(shí)為劣勢群體；

②第snp2位為ag雜合子時(shí)為快速生長群體；為g純合子時(shí)為次快速生長群體；為a純合子時(shí)為劣勢群體；

③由于微效基因的加性效應(yīng)，當(dāng)snp1位點(diǎn)和snp2位點(diǎn)均為雜合子時(shí)生長速度最快；當(dāng)兩個(gè)位點(diǎn)中只有一個(gè)是雜合子另一個(gè)是生長較快的純合子時(shí)，生長速度次之；其他以此類推。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

本發(fā)明是依據(jù)本發(fā)明發(fā)明人發(fā)現(xiàn)光倒刺鲃的黑素皮質(zhì)激素受體的第snp1位和第snp2位核苷酸對光倒刺鲃的生長具有影響所做出的發(fā)明創(chuàng)造。本發(fā)明有利于快速篩選光倒刺鲃快速生長個(gè)體。

附圖說明

圖1是第snp1位核苷酸為純合子c時(shí)的測序圖。

圖2是第snp1位核苷酸為純合子t時(shí)的測序圖。

圖3是第snp1位核苷酸為雜合子c/t時(shí)的測序圖。

圖4是第snp2位核苷酸為純合子g時(shí)的測序圖。

圖5是第snp2位核苷酸為純合子a時(shí)的測序圖。

圖6是第snp2位核苷酸為雜合子g/a時(shí)的測序圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1

本次實(shí)驗(yàn)采用334條1.5齡同時(shí)放養(yǎng)、同池飼養(yǎng)的光倒刺鲃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，具體步驟如下：

(1)每一尾光倒刺鲃剪少許尾鰭隨即在光倒刺鲃上打上標(biāo)簽。并對采集的尾鰭進(jìn)行標(biāo)號，與每一尾光倒刺鲃一一對應(yīng)，并用阿拉伯?dāng)?shù)字標(biāo)記。

(2)每尾光倒刺鲃取尾鰭2mg，然后分別加入50μl通用一步法dna提取液(生工生物工程(上海)股份有限公司)，80℃溫育15min。簡短振蕩混勻后取裂解物直接進(jìn)行pcr。

pcr的體系如下：

pcr的反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性2min；94℃變性20s、51℃復(fù)性20s、72℃延伸25s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。

(3)將得到的pcr產(chǎn)物吸取4μl使用1％瓊脂糖電泳檢測，正常顯示為接近200bp的條帶。將檢測合格的pcr產(chǎn)物直接測序。

(4)對測序結(jié)果的分析如下：

測序結(jié)果中，單峰為純合子，套峰為雜合子，第snp1位snp的純合子c如圖1，純合子t如圖2，雜合子c/t如圖3。第snp2位的snp純合子g如圖4，純合子a如圖5，雜合子a/g如圖6。箭頭表示snp位點(diǎn)。

第snp1位為ct雜合子時(shí)為快速生長群體；為c純合子時(shí)為次快速生長群體；為t純合子時(shí)為劣勢群體；第snp2位為ag雜合子時(shí)為快速生長群體；為g純合子時(shí)為次快速生長群體；為a純合子時(shí)為劣勢群體。結(jié)合標(biāo)記，篩選出快速生長個(gè)體。snps與體重，全長，體長，體寬，體高統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1。第snp1位snp中ct雜合子在體重，全長，體長，體寬，體高的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)上顯著高于兩種純合子個(gè)體，純合子c在體寬上顯著高于純合子t。在第snp2位snp中，ag雜合子在體重，全長，體長，體寬，體高的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)上顯著高于兩種純合子個(gè)體，純合子g在體寬上顯著高于純合子a(p<0.05)。

表1生長指標(biāo)與snp1和snp2不同基因型的關(guān)聯(lián)

注：相同的字母表示差異不顯著，不同的字母表示差異顯著。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>廣州大學(xué)

<120>一種快速篩選光倒刺鲃快速生長個(gè)體的方法和試劑盒及應(yīng)用

<130>1

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>2580

<212>dna

<213>光倒刺鲃

<220>

<221>y=c/t

<222>(83)..(83)

<220>

<221>r=a/g

<222>(247)..(247)

<400>1

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gtgaatcactgaatcatttatatatttaaatatactttgaattacttgattttataaaca180

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gctattgtcaagacaagaacttcatctcccatgtacttctttatctgcagtttagccgta1020

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atggcctcgctctatgtccacatgtttcttctagcccgactgcacatgaagcgcattgcc1440

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<220>

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<400>5

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