專利名稱：玉竹低聚糖硫酸酯衍生物的制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天然物質(zhì)的提取及其衍生物的制備和應(yīng)用。
玉竹Polygonatum odoratum(Mill.)Druce是我國的一種傳統(tǒng)中藥，據(jù)《中華本草》記載，其根狀莖含有玉竹粘多糖(由果糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖醛酸組成)，玉竹果聚糖(由果糖和葡萄糖組成)。
硫酸酯化多糖(sulfated polysaccharides，SPS)或稱多糖硫酸酯(polysaccharides sulfated，PSS)為聚陰離子化合物，是多糖大分子鏈中單糖分子上的某種羥基被硫酸根所取代而形成的一類化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、生物活性多樣、構(gòu)效關(guān)系鮮明的多糖衍生物。除已發(fā)現(xiàn)的抗凝血作用外，近年來不斷發(fā)現(xiàn)硫酸酯化多糖具有多種生物活性，如增強機體免疫功能、抗腫瘤、抗病毒等，使硫酸酯化多糖的研究成為多糖研究領(lǐng)域內(nèi)的一個新熱點。
病毒性疾病的危害具有嚴重性和普遍性，尋找和開發(fā)新的、安全有效的抗病毒藥物使抗病毒活性成為硫酸酯化多糖生物學(xué)活性新近研究的重要方面。自1987年發(fā)現(xiàn)硫酸酯化葡聚糖具有抑制艾滋病病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)活性以來，該類多糖的抗病毒活性方面的研究十分活躍，它有可能成為繼病毒逆轉(zhuǎn)錄酶活性抑制劑、蛋白酶抑制劑的又一類HIV抑制劑，因此，關(guān)于糖類經(jīng)硫酸酯衍生修飾獲得抗病毒活性新型藥物的有關(guān)研究越來越受到人們的重視。目前德國研制的木聚糖硫酸酯臨床試用于艾滋病的治療，獲得了良好的結(jié)果；而日本科學(xué)家研制的產(chǎn)堿桿菌多糖硫酸酯(curdlansulfate)在美國開展了I/II期臨床測試，最近被認為是最具潛在的和實際的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒活性的多糖制劑之一。
向道斌等綜述硫酸酯化多糖抗艾滋病的作用機理主要有干擾病毒對宿主細胞的吸附、抑制病毒抗原的表達、抑制合胞體的形成、抑制逆轉(zhuǎn)錄酶活性，增強免疫功能等。而硫酸酯化多糖對HIV-1囊膜糖蛋白gp120與靶細胞膜上CD4分子之間的相互作用的干擾作用，已經(jīng)深入到HIVgp120的具體結(jié)合部位。根據(jù)硫酸乙酰肝素是宿主細胞膜上介導(dǎo)病毒吸附的受體的有關(guān)研究，多數(shù)學(xué)者推測硫酸酯化多糖可能作為硫酸乙酰肝素的結(jié)構(gòu)類似物與病毒囊膜糖蛋白結(jié)合從而抑制病毒對靶細胞的吸附。由于文獻報道病毒HIV、單純皰疹病毒(Herpessimplex virus，HSV)、人巨細胞病毒(Human cytomega lovirus，HCMV)及蛋白酶抗性蛋白(Proteinase resistant protein，PrP)等，都要與硫酸乙酰肝素作用，這使硫酸酯化多糖極有可能成為作用分子基礎(chǔ)清楚的新型廣譜抗病毒藥物。
本發(fā)明目的就是提供一種玉竹低聚糖的提取及其硫酸酯衍生物的制備方法和玉竹低聚糖硫酸酯衍生物在制造抗病毒藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明可通過以下方式得以實現(xiàn)以玉竹根狀莖干粉為原料，先采用高濃度(≥70％)乙醇回流，過濾，濾渣用一定體積(玉竹千粉的4-20倍)和濃度(30～60％)的乙醇浸提，過濾收集濾液，再用高濃度乙醇(≥70％)沉淀，沉淀用無水乙醇、丙酮、乙醚脫水，烘干即得玉竹低聚糖，再通過氯磺酸-吡啶法進行硫酸酯衍生修飾獲得玉竹低聚糖的硫酸酯衍生物，該衍生物可應(yīng)用于抗病毒藥物。
本發(fā)明的原料藥選用《中國藥典》(2000年版)中所述的傳統(tǒng)中藥玉竹無霉變、色澤淡黃、無雜什的塊根，塊根切片，干燥，粉碎成顆粒狀。玉竹干粉用高濃度乙醇(70％以上的乙醇)進行回流處理，去除色素、單糖等小分子物質(zhì)，過濾，濾液可蒸餾回收乙醇，濾渣用適當(dāng)體積(玉竹干粉的4-20倍)和濃度(30～60％)的乙醇浸提過夜，尼龍布過濾，濾液用2-4倍體積的95％乙醇沉淀，終濃度為73～88％，收集沉淀，上清液可蒸餾回收乙醇，沉淀分別用無水乙醇、丙酮、乙醚脫水，烘干即得玉竹低聚糖。
上述獲得的玉竹低聚糖，以果糖為標準品用蒽酮-硫酸法測定糖含量為80～90％；以牛血清蛋白為標準品Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量為1～2％；氯化鋇-明膠法測定硫含量為0.5～2％；薄層層析法進行單糖組成分析，玉竹低聚糖由果糖、葡萄糖和甘露糖組成；KBr壓片，Nicolet200 SXV FT-IR紅外光譜分析，玉竹低聚糖具有糖類的特征峰，在3500～3400、2920、2844、1460～1350、1150～1000cm-1有吸收，在937cm-1和815cm-1附近具有果糖的呋喃環(huán)對稱伸縮振動和C-H變角振動的吸收峰，在810cm-1和870cm-1附近有甘露糖的特征吸收峰。委托中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所國家色譜中心進行玉竹低聚糖基體輔助激光解吸-飛行時間質(zhì)譜分析，其分子量主要分布在3000～5000。
以上述制備的玉竹低聚糖為原料，采用氯磺酸-吡啶法制備玉竹低聚糖硫酸酯衍生物。在冰浴和攪拌條件下逐滴將氯磺酸按一定比例(1∶10～1∶2)加入吡啶中，再向該硫酸化試劑中加入溶于甲酰胺中的玉竹低聚糖，甲酰胺與玉竹低聚糖的V/W(體積/質(zhì)量)為10∶1～50∶1，吡啶與玉竹低聚糖的V/W為5∶1。冰浴和攪拌條件下反應(yīng)一定時間后，用2-5倍體積的95％乙醇沉淀，乙醇終濃度為63～80％。棄上清液，沉淀用少量蒸餾水溶解，醋酸鈉中和至中性，再用2-5倍體積95％乙醇沉淀，乙醇終濃度為63～80％。沉淀分別用無水乙醇、丙酮、乙醚脫水，烘干即得玉竹低聚糖硫酸酯。
上述獲得的玉竹低聚糖硫酸酯，以果糖為標準品用蒽酮-硫酸法測定糖含量為30-70％；以牛血清蛋白為標準品Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量為0.5-1.5％；氯化鋇-明膠法測定硫含量增加至3-20％，其硫酸酯取代度為0.17～2.79；KBr壓片，Nicolet200 SXV FT-IR紅外光譜分析，玉竹低聚糖硫酸酯不僅具有玉竹低聚糖的吸收峰，另外新增加了1250cm-1、810cm-1附近的吸收峰，分別為S＝O伸縮振動和C-O-S伸縮振動，620cm-1附近的尖峰說明硫酸酯以鈉鹽形式存在。
將以上方法制得的玉竹低聚糖硫酸酯衍生物應(yīng)用于抗病毒試驗，可有效抑制HSV-2引起的Vero細胞病變以及病毒空斑形成，可以開發(fā)為廣譜抗病毒藥物，用于皰疹、流感、肝炎及艾滋病的治療。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點1、該發(fā)明工藝簡單易行，所需原材料價廉易得，用于玉竹低聚糖浸提和沉淀的乙醇可以蒸餾回收，可大大節(jié)約成本。
2、獲得的衍生物具有抗單純皰疹病毒2型(Herpes simplex virustype2，HSV-2)活性，可以開發(fā)為抗皰疹藥物，用于治療皰疹病毒性角膜炎、生殖器皰疹以及皰疹病毒引起的其它病毒性疾病，改善病人的生活質(zhì)量。
3、由于硫酸酯化多糖可能作為硫酸乙酰肝素的結(jié)構(gòu)類似物與病毒囊膜糖蛋白結(jié)合從而抑制病毒對靶細胞的吸附，而文獻報道病毒HIV、HSV、HCMV以及PrP等，都是以硫酸乙酰肝素為入侵細胞的受體，因此獲得的衍生物極有可能開發(fā)為作用分子基礎(chǔ)清楚的新型廣譜抗病毒藥物，用于皰疹、流感、肝炎及艾滋病的治療。
實施例1 玉竹低聚糖的制備200g玉竹干粉用4倍體積85％乙醇煮沸回流1小時，再用一定體積的85％乙醇淘洗2～3遍，棄濾液，濾渣用14倍體積50％乙醇浸提過夜。過濾棄濾渣，濾液8500rpm，4℃離心30分鐘，取上清液用2倍體積的95％乙醇沉淀過夜。收集沉淀，用無水乙醇、丙酮、乙醚脫水，50℃烘箱烘干后得16.77g玉竹低聚糖。氯化鋇-明膠法測定硫含量為1.17％，蒽酮-硫酸法測定糖含量為87.88％，F(xiàn)olin-酚法測定蛋白質(zhì)含量為1.77％。該制備流程的總收率為8.39％。玉竹低聚糖的紅外光譜具有多糖的特征峰，飛行時間質(zhì)譜顯示其主要分子量分布在3000～5000，約由18～31個單糖殘基組成，薄層層析分析表明玉竹低聚糖含有果糖、甘露糖和葡萄糖。
實施例2 玉竹低聚糖硫酸酯的制備5mL氯磺酸在冰浴和攪拌條件下逐滴加入10mL吡啶中，2g玉竹低聚糖溶于80mL甲酰胺后加入上述磺酸化試劑中，冰浴及攪拌條件下反應(yīng)6小時。反應(yīng)結(jié)束后將上述反應(yīng)液傾入400mL0℃預(yù)冷的95％乙醇中，置于4℃冰箱中沉淀過夜。棄上清，沉淀用少量蒸餾水溶解，醋酸鈉中和至中性，4倍體積的95％乙醇沉淀。無水乙醇、丙酮、乙醚脫水，50℃烘箱烘干后得1.09g玉竹低聚糖硫酸酯產(chǎn)物。經(jīng)IR光譜分析，確證有硫酸基團取代了單糖殘基的羥基。氯化鋇-明膠法測定硫含量為8.47％，推算得知硫酸基團取代度為0.588％，蒽酮-硫酸法測定糖含量為50％，F(xiàn)olin-酚法測定蛋白質(zhì)含量為1.12％。該制備流程的總收率為39.78％。
實施例3 玉竹低聚糖硫酸酯細胞毒性測定向96孔細胞板中培養(yǎng)至單層的Vero細胞分別加入終濃度為250～4000μg/mL的玉竹低聚糖硫酸酯，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察細胞生長狀態(tài)，72小時后，采用中性紅活細胞染色法測定玉竹低聚糖硫酸酯對Vero細胞無毒的最高濃度，實驗結(jié)果表明，在4000μg/mL濃度以下，玉竹低聚糖硫酸酯對Vero細胞無明顯的毒害作用。
實施例4 玉竹低聚糖硫酸酯的細胞病變抑制實驗Vero細胞在24孔細胞板上培養(yǎng)至單層，然后分組，每組4個復(fù)孔。細胞對照組不加藥物和病毒；病毒對照組感染100TCID50的HSV-2病毒液，不加藥物；實驗組感染病毒同時添加不同終濃度的玉竹低聚糖硫酸酯，在無細胞毒濃度范圍內(nèi)考察玉竹低聚糖硫酸酯對HSV-2引起的Vero細胞病變的抑制作用。置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時后，中性紅染色法測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，濃度在125～2000μg/mL的玉竹低聚糖硫酸酯能很好地抑制HSV-2引起的細胞病變(p＜0.05)。
實施例5 玉竹低聚糖硫酸酯病毒空斑抑制實驗Vero細胞在24孔細胞板上培養(yǎng)至單層分組備用。玉竹低聚糖硫酸酯衍生物用90℃融化、43-45℃保溫的底層固體培養(yǎng)基稀釋至不同終濃度。將病毒稀釋至約30-50PFU/孔，加入含糖底層固體培養(yǎng)基，混勻后立即加入對應(yīng)孔內(nèi)。細胞對照組只加底層固體培養(yǎng)基；病毒對照組只加含病毒底層固體培養(yǎng)基；實驗組加含病毒和相應(yīng)終濃度玉竹低聚糖硫酸酯的底層固體培養(yǎng)基。待底層固體培養(yǎng)基凝固后置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)2天，加入含1∶25000中性紅的上層固體培養(yǎng)基，凝固后置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱倒置遮光培養(yǎng)1天，觀察病毒空斑形成情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)200μg/mL的玉竹低聚糖硫酸酯能完全抑制HSV-2引起的病毒空斑形成，100、50、25μg/mL的玉竹低聚糖硫酸酯也產(chǎn)生了不同程度的空斑形成抑制作用(p＜0.05)。
權(quán)利要求
1.一種玉竹低聚糖硫酸酯衍生物的制備方法，其特征是以玉竹根狀莖干粉為原料，先采用高濃度乙醇回流，過濾，濾渣用玉竹干粉4-20倍的30～60％濃度的乙醇浸提，過濾收集濾液，再用高濃度乙醇沉淀，沉淀用無水乙醇、丙酮、乙醚脫水，烘干即得玉竹低聚糖；再通過氯磺酸-吡啶法進行硫酸酯衍生修飾獲得玉竹低聚糖的硫酸酯衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉竹低聚糖硫酸酯衍生物的制備方法，其特征是用于沉淀的高濃度乙醇濃度為70％以上；30～60％濃度的乙醇浸提過夜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉竹低聚糖硫酸酯衍生物的制備方法，其特征是以玉竹低聚糖為原料，在冰浴和攪拌條件下逐滴將氯磺酸按1∶10～1∶2比例加入吡啶中，再向該硫酸化試劑中加入溶于甲酰胺中的玉竹低聚糖，甲酰胺與玉竹低聚糖的體積/質(zhì)量(V/W)為10∶1～50∶1，吡啶與玉竹低聚糖的V/W為5∶1，冰浴和攪拌條件下反應(yīng)一定時間后，用2-5倍體積的95％乙醇沉淀，乙醇終濃度為63～80％，棄上清液，沉淀用少量蒸餾水溶解，醋酸鈉中和至中性，再用2-5倍體積95％乙醇沉淀，乙醇終濃度為63～80％。沉淀分別用無水乙醇、丙酮、乙醚脫水，烘干即得玉竹低聚糖硫酸酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求1制得玉竹低聚糖硫酸酯衍生物，其特征是應(yīng)用于抗病毒試驗，可有效抑制HSV-2引起的Vero細胞病變以及病毒空斑形成，可以開發(fā)為廣譜抗病毒藥物，用于皰疹、流感、肝炎及艾滋病的治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及天然物質(zhì)的提取及其衍生物的制備和應(yīng)用。通過以玉竹根狀莖干粉為原料，先采用高濃度乙醇回流，過濾，濾渣用一定體積和濃度的乙醇浸提，過濾收集濾液，再用高濃度乙醇沉淀，沉淀用無水乙醇、丙酮、乙醚脫水，烘干即得玉竹低聚糖，再通過氯磺酸－吡啶法進行硫酸酯衍生修飾獲得玉竹低聚糖的硫酸酯衍生物，該衍生物可應(yīng)用于抗病毒藥物。
文檔編號C08B37/00GK1398901SQ01108650
公開日2003年2月26日 申請日期2001年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月19日
發(fā)明者楊敏, 何開澤, 蒙義文 申請人:中國科學(xué)院成都生物研究所