肉毒毒素的功能表位、與其特異性結(jié)合的單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了肉毒毒素的功能表位FYQ*I，*可以是任意氨基酸，本發(fā)明還公開了與此功能表位特異性結(jié)合的抗肉毒毒素的單克隆抗體。本發(fā)明還公開了上述抗體在制備預(yù)防和/或治療肉毒毒素中毒藥物中的應(yīng)用。
【專利說明】肉毒毒素的功能表位、與其特異性結(jié)合的單克隆抗體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說，本發(fā)明公開了一種新的毒素功能表位、與這個表位特異性結(jié)合的單克隆抗體及其在制備預(yù)防和/或治療毒素中毒藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]肉毒梭菌(Clostridium botulium)是一種厭氧菌,是革蘭氏陽性的孢子形成菌。肉毒毒素(botulium neurotoxin,簡稱BoNT)是由肉毒梭菌分泌的神經(jīng)毒素,是目前自然界中人類已知生物和化學(xué)毒素中的毒性最強的毒素，肉毒毒素對人的半致死劑量LD50僅為0.lng-lng/kg，毒性比氰化物高一萬倍。它作用于外周運動神經(jīng)未稍，神經(jīng)與肌肉的接合處，即突觸處，抑制突觸前膜釋放神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿，從而導(dǎo)致肌肉松馳性麻痹。食品污染、嬰兒腸道感染和傷口感染是自然狀態(tài)下引起人類肉毒中毒的主要因素。一個肉毒毒素分子就能阻斷一個神經(jīng)細胞的功能，抑制神經(jīng)肌肉接合處乙酰膽堿的釋放而產(chǎn)生毒性功能，嚴重中毒者由于其呼吸肌的深度麻痹導(dǎo)致呼吸衰竭而死亡。由于毒素具有超強的神經(jīng)毒性、中毒死亡率高且易于生產(chǎn)的特點，肉毒毒素被FDA歸為A級生物戰(zhàn)劑，同時，也被列為六種最主要的戰(zhàn)劑之一。因此，肉毒毒素?zé)o論是偶發(fā)的中毒事件，還是用其作為生物武器和生物恐怖性的戰(zhàn)劑，其潛在的危害性難以估計。所以肉毒毒素的預(yù)防和治療問題是國家和社會制定防御策略不得不考慮的問題，進行肉毒毒素的防治研究無論對國家的生物安全、公共衛(wèi)生安全及人民生命健康安全都具有重要的現(xiàn)實意義。
[0003]肉毒毒素有7種不同的血清型(BoNT/A-G)，其中A型、B型、E型和F型與人類肉毒中毒有關(guān)，各型肉毒毒素分子在結(jié)構(gòu)和功能上有許多相似之處，均由輕鏈(L鏈，相對分子質(zhì)量為50KD)和重鏈(H鏈，相對分子質(zhì)量為100KD)組成，兩者通過一個二硫鍵相連。重鏈的羧基端(He結(jié)構(gòu)域)，為肉毒毒素的受體結(jié)合功能域，它負責(zé)與神經(jīng)細胞特異地結(jié)合；而重鏈的氨基末端(H`n結(jié)構(gòu)域)為一個跨膜轉(zhuǎn)運功能結(jié)構(gòu)域，具有幫助輕鏈進入細胞質(zhì)的功能；輕鏈則具毒性的功能，它是一種Zn2+依賴性的肽鏈內(nèi)切酶，可特異性地作用于SNARE蛋白復(fù)合體中的一種(VAMP/Synaptobrevin, Syntaxin, Snap-25,此三種蛋白是SNARE學(xué)說的關(guān)鍵蛋白，是神經(jīng)突出小泡靶向和融合的載體(Rothman，1994)，同時也是BoNT內(nèi)肽酶的作用底物)，影響突觸小體的融合，從而抑制乙酰膽堿的釋放，引起以馳緩性神經(jīng)麻痹為主的一系列癥狀，結(jié)合功能域，轉(zhuǎn)運功能域和催化酶切活性功能域呈線性排列，轉(zhuǎn)運區(qū)域位于中間，而酶活性的催化區(qū)域和結(jié)合區(qū)域位于兩側(cè)(C M0NTECUCC0, SCHIAV0G.Structure and function of tetanus and botulinum neurotoxins.Quarterly Reviewsof Biophysics[J]28，423-472 (1995))。
[0004]肉毒梭菌最初產(chǎn)生的毒素是無活性的原毒素(單肽鏈)相對分子量為150KD，隨后經(jīng)肉毒梭菌自身的內(nèi)源性蛋白水解酶消化分解為重鏈和輕鏈，從而產(chǎn)生活性，提高了肉毒毒素的毒力。肉毒毒素的毒理作用主要包括結(jié)合、轉(zhuǎn)位、催化酶切這三個階段。毒素通過He端受體結(jié)合域與神經(jīng)細胞特異受體結(jié)合，在受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用下內(nèi)陷，誘導(dǎo)內(nèi)體的酸性發(fā)生變化，引發(fā)毒素轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象發(fā)生改變，同時囊泡腔在泡膜質(zhì)子泵ATP酶作用下PH值降低，使疏水區(qū)域暴露，在膜上形成一個膜通道，LC通過該通道進入胞質(zhì)，在神經(jīng)細胞內(nèi)，肉毒毒素分解相關(guān)的SNARES蛋白，阻斷神經(jīng)遞質(zhì)的釋放從而導(dǎo)致一系列的中毒臨床癥狀，其中作用機制的起始階段，肉毒毒素與其神經(jīng)細胞表面受體的特異結(jié)合是決定毒素分子毒性發(fā)生的關(guān)鍵步驟，是毒素進入細胞發(fā)揮毒性效應(yīng)的前提。如果在起始階段能阻斷毒素與受體的相互作用，可以達到有效的毒素抑制作用(G SCHIAVO,BENFENATI FjPOULAINB，et al.Tetanus and botulinum—B neurotoxins block neurotransmitter release byproteolytic cleavage of synaptobrevin.Nature[J]359,832-835(1992))0
[0005]目前中毒后的治療方面，唯一有效的治療性藥物是中和性抗體，治療成人及嬰兒肉毒毒素中毒，在中毒后24小時內(nèi)可起到顯著的保護作用。目前所使用的中和抗體為馬源的血清抗毒素和BabyBIG，一種來源于健康的志愿者血液的IgG制品，用以治療嬰兒肉毒中毒，但這種藥物供應(yīng)有限。相對于人而言，馬源的血清抗毒素具有強免疫原性，易引起一些副作用，近10 %的人使用后可能產(chǎn)生如蕁麻疹，血清病等過敏性反應(yīng)，而且存在著潛在病毒污染等問題，應(yīng)用受到了極大的限制。因此研發(fā)新一代的防治藥物，單克隆抗體和基因工程抗體是未來的必然趨勢。近年來，國內(nèi)外的研究熱點集中在肉毒毒素中和抗體的研究方面，其中包括:鼠源單克隆抗體的制備和人源化研究，應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)進行毒素抗原的中和抗體表位定位研究，篩選及制備的抗肉毒毒素抗體，進行體內(nèi)體外中和活性比較研究和中和活性的評價等，取得了很大的研究進展 。
[0006]研究表明，BoNT/Hc片段包含保護性抗原基本決定簇(PPAPS)，作為免疫原能引發(fā)顯著保護性免疫應(yīng)答。最理想的重組疫苗是能引發(fā)顯著保護性免疫應(yīng)答的最小片段。Dertzbaugh等的研究將引發(fā)顯著保護性免疫的片段進一步縮小至Β0ΝΤ/Α的Hl 150-1289的139個氨基酸范圍，根據(jù)認為其他類型BoNT的He端也具有較強免疫保護作用。BoNT的重鏈與輕鏈相比，各型之間的同源性較低。重鏈中大約有110個氨基酸殘基是較保守的(He以845個氨基酸殘基計)保守程度最高的為Trp，B型肉毒毒素H鏈的13個Trp中有9個是保守的，雖然毒素重鏈同源性較低，但晶體結(jié)構(gòu)學(xué)研究表明，A、B、E、F和TeNT之間的He可能具有相同的折疊方式，只是延伸的LOOP區(qū)域序列不同(B R SINGH.1ntimate detailsof the most poisonous poison.Nature structural biology[J]7，617(2000))。
[0007]但是，目前無論是肉毒毒素的單克隆抗體，還是基因工程中和性抗體的研發(fā)均處于實驗室研究階段，還沒有一種中和性抗體上市銷售。研制肉毒毒素中和性抗體進展緩慢，其中較大的困難是盡管獲得了一些親和力較高的中和抗體，但無論親和力多高，單一抗體均不能很好地完全中和毒素，而聯(lián)合使用兩至三株抗體則可能大大提高中和活性(Nowakowski A, Wang C.Potent neutralization of botulinum neurotoxinby recombinant oligoclonal antibody.Proc Natl Acad Sci U S A.99(17):11346-11350(2000))。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的之一是公開了肉毒毒素BoNT/B He新的功能表位FYQ*I，*可以是任
意氨基酸。
[0009]本發(fā)明還公開了與上述功能表位特異性結(jié)合的抗肉毒毒素的單克隆抗體。更具體的，本發(fā)明公開了與抗肉毒毒素BoNT/B 的4株單克隆抗體5G10、8E10、8D1、1D12，還公開了單克隆抗體8E10對BoNT/B、BoNT/E、BoNT/F有交叉保護功能。同時對單克隆抗體8E10的基因進行了克隆并測定了其序列，8E10單抗的重鏈可變區(qū)核苷酸序列SEQ ID N0.15，氨基酸序列SEQ ID N0.16，輕鏈可變區(qū)核苷酸序列SEQ ID N0.17，氨基酸序列SEQ ID N0.18，恒定區(qū)為小鼠IgG恒定區(qū)。[0010]本發(fā)明的另外一個目的是公開了上述抗肉毒毒素的單克隆抗體在制備預(yù)防和/或治療肉毒毒素中毒藥物中的應(yīng)用。
[0011]具體地，本發(fā)明的 申請人:首先利用分子生物技術(shù)克隆肉毒毒素基因，利用原核表達了肉毒毒素重組蛋白BoNT/B He、E He、F He，并通過細胞融合-雜交瘤的方法制備了 8株特異性抗肉毒毒素的單克隆抗體，進一步研究了 5G10、8E10、8D1、1D12這4株抗體的體內(nèi)外中和實驗。
[0012]本發(fā)明的 申請人:利用小鼠體內(nèi)攻毒試驗證實4株抗體(5G10、8E10、8D1、1D12)能完全中和4倍LD50(半數(shù)致死量)BoNT/B毒素的攻擊，40倍LD50BoNT/B攻擊下能延長小鼠生存時間達60小時左右。單克隆抗體8E10對BoNT/B、BoNT/E、BoNT/F具有交叉中和保護活性，為最佳。體外抗體阻斷實驗證實8E10不僅能阻斷BoNT/BHc與SH-SY5Y細胞(神經(jīng)母細胞瘤，購自中國科學(xué)院細胞庫)的結(jié)合，也能阻斷BoNT/E He,BoNT/F He與SH-SY5Y細胞的結(jié)合，確證抗體8E10的中和保護功能。
[0013]本發(fā)明的 申請人:還通過蛋白印跡方法鑒定了 8E10抗體對SNARES復(fù)合物(VAMP2、SNAP-25)酶解作用的保護效果，進一步證實了該抗體的交叉中和保護功能。
[0014]本發(fā)明的 申請人:利用噬菌體展示技術(shù)對單克隆抗體8E10所識別的抗原表位進行淘選獲得了其一致的表位序列。序列比對結(jié)果表明，該單抗所識別的多肽序列落在BoNT/BHc的受體結(jié)合區(qū)域。更具體地，本發(fā)明的 申請人:通過單克隆抗體抗原表位的淘選、噬菌體克隆ELISA和測序及序列分析推測出BoNT/B He的功能表位。合成肽的阻斷實驗也證實了該表位結(jié)合的特異性。從現(xiàn)有結(jié)晶的三維結(jié)構(gòu)上分析BoNT/B He,BoNT/E He,BoNT/F He的這三段序列具有呈現(xiàn)相似構(gòu)象，表位序列落在位于肉毒毒素表面的Loop環(huán)結(jié)構(gòu)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1、BoNT/B He、BoNT/E He、BoNT/F He 的基因表達載體克隆 BamH I 和 Xho I 雙酶切鑒定結(jié)果。
[0016]圖2、BoNT/B He、BoNT/E He、BoNT/F He 三種蛋白的聚丙烯凝膠電泳、WesternBlotting鑒定及親和層析純化色譜圖。
[0017]圖3、純化的各種單克隆抗體的量。
[0018]圖4、8株單克隆抗體亞型的ELISA分析檢測結(jié)果。
[0019]圖5、8株單克隆抗體與不同血清型肉毒類毒素結(jié)合的ELISA結(jié)果。
[0020]圖6、Western blot鑒定BoNT mAb篩選的單克隆抗體結(jié)合活性結(jié)果。
[0021]圖7、8株單克隆抗體結(jié)合BoNT/B He蛋白的親和力測定。
[0022]圖8、8株抗體對4倍LD50 (半數(shù)致死劑量)BoNT/B的中和保護作用實驗結(jié)果。
[0023]圖9、4株單克隆抗體8E10、5G10、8D1、1D12對4倍LD50 (半數(shù)致死劑量)Β0ΝΤ/Β中和保護實驗結(jié)果。[0024]圖10、4株單克隆抗體8E10、5G10、8D1、1D12對10倍LD50(半數(shù)致死劑量)Β0ΝΤ/B中和保護實驗結(jié)果。
[0025]圖11、4株單克隆抗體8E10、5G10、8D1、1D12對20倍LD50(半數(shù)致死劑量)Β0ΝΤ/B中和保護實驗結(jié)果。
[0026]圖12、4株單克隆抗體8E10、5G10、8D1、1D12對40倍LD50(半數(shù)致死劑量)Β0ΝΤ/B中和保護實驗結(jié)果。
[0027]圖13、三個劑量的 mAb 8E10 (I μ g、10yg、100yg)對 3 個劑量(4 倍、10 倍、20 倍LD50 (半數(shù)致死劑量))的BoNT/E和BoNT/F毒素攻擊的中和保護實驗結(jié)果。
[0028]圖14、細胞流式法檢測 8E10 對 BoNT/B He (A)、BoNT/E He (B)、BoNT/F He (C)與SH-SY5Y細胞結(jié)合的抑制作用。
[0029]圖15、免疫熒光法檢測BoNT/B He蛋白與SH-SY5Y細胞的結(jié)合。
[0030]圖16、細胞免疫熒光共聚焦法檢測8E10對BoNT/B He、BoNT/E He、BoNT/FHc與SH-SY5Y細胞結(jié)合的抑制作用(A、B、C)。
[0031]圖17、8E10對BONT/B、E、F酶解VAMP2 (或Snap25)的保護功能檢測結(jié)果。1.PBS2.BoNT/B/E/F+ 馬源抗毒血清 3.BoNT/B 或 E 或 F+8E10 (I: 100 摩爾比)4.BoNT/B 或 E 或F+8E10(1: 10 摩爾比)5.BoNT/B 或 E 或 F+8E10 (I: I 摩爾比)6.BoNT/B 或 E 或 F。
[0032]圖18、單抗8E10噬菌體表位三輪淘選的富集效率。
`[0033]圖19、單抗8E10特異結(jié)合噬菌體的序列分析。
[0034]圖20、8E10與合成的表位肽結(jié)合的特異性實驗結(jié)果。
[0035]圖21、合成的表位肽競爭性結(jié)合8E10的實驗結(jié)果。
[0036]圖22、單抗8E10的表位在肉毒毒素B、E、F He蛋白的三維結(jié)構(gòu)比對分析
【具體實施方式】
[0037]以下結(jié)合實施例、實驗例進一步對本發(fā)明進行說明，這些實施例、實驗例不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。實施例不包括對傳統(tǒng)方法的詳細描述，如那些用于構(gòu)建載體和質(zhì)粒的方法，將編碼蛋白的基因插入到這樣的載體和質(zhì)粒的方法或?qū)①|(zhì)粒引入宿主細胞的方法以及經(jīng)典的細胞融合和單克隆抗體篩選及純化的方法等。這樣的方法對于本領(lǐng)域中具有普通技術(shù)的人員是眾所周知的，并且在許多出版物中都有所描述，包括Sambrook, J., Fritsch,E.F.and Maniais,T.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd edition,Coldspring Harbor Laboratory Press.[0038]本發(fā)明實施例或?qū)嶒灷形礃?biāo)明來源地的原、輔料均為市售。
[0039]實施例1:BoNT/B/E/F重鏈C端基因克隆表達及蛋白純化
[0040]實施例1.1:BoNT/BHc, BoNT/EHc、BoNT/FHc優(yōu)化序列的全基因合成
[0041]參照NCBI 中的 GENEBANK 提供的 BoNT/B (GenBank:⑶271943.1)、BoNT/E (GenBank:x62683.1)、BoNT/F(GenBank:L35496.1)的原始 Aa 序列和天然 DNA 序列分別截取 BoNT/B He 端(第 853-1291Aa 段)BoNT/E He (第 830_1252Aa 段)和 BoNT/F He (第847-1278Aa 段)為優(yōu)化模板，其序列如 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 所示，并且分別設(shè)計引物如下:
[0042]BoNT/B He 引物:[0043]正義(BamHI+EK酶切位點)[0044]5， -AATGGATTC GACGACGACGACAAA agttaacaatacaacagc-3，
[0045]反義(Xhol位點)
[0046]5， -AAT CTCGAG ttattcggtccaaccttttc atcttt aggaataaa-3，
[0047]BoNT/E He 引物:
[0048]正義(BamHI+EK酶切位點)
[0049]5’ -AAT GGATCC GAC GAC GAC GAC AAA tataccgatgataaaattctg-3’
[0050]反義(Xhol位點)
[0051]5， -AAT CTCGAG ttatttttcctgccagccatgttcttcgctaataa-3，
[0052]BoNT/F He 引物:
[0053]正義(BamHI+EK酶切位點)
[0054]5， -AATGGATCCGACGACGACGACAAA agcagctataccaccgataaa-3，
[0055]反義(XhoI位點)
[0056]5， -AAT CTCGAG ttagttttcctgccagccatcttctttgct-3，
[0057]擴增BoNT/B He、BoNT/E He、BoNT/F He基因片段，通過凝膠回收試劑盒(上海華舜生物工程公司)回收片段后，與pGEM-T-easy質(zhì)粒(Promega)連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl后獲得陽性克隆。質(zhì)粒抽提后酶切鑒定，送華大測序的結(jié)果顯示與合成序列完全一致。BoNT/B He,BoNT/E He,BoNT/F He 蛋白的核苷酸序列如 SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5,SEQ ID N0.6所示。
[0058]實施例1.2:BoNT/B He、BoNT/E He、BoNT/F He 的原核表達純化及 Western Blot鑒定
[0059]將實施例1.1所得的序列正確的重組質(zhì)粒BoNT/B He,BoNT/E He,BoNT/F He基因片段用BamHI和XhoI雙酶切后，裝入表達質(zhì)粒pGEX_4T_2 (Promega)，再轉(zhuǎn)化至BL21 (DE3)感受態(tài)細胞，進行PCR或者酶切鑒定，結(jié)果見附圖1。挑單菌落接種于含有l(wèi)OOyg/mLAmp (氨節(jié)青霉素)的LB培養(yǎng)液(蛋白胨(trytone) 10g、酵母提取物(yeast extract) 5g、NaCl 5g，溶于IL去離子水中)，次日菌液0D600為0.6~0.8的時候，在待誘導(dǎo)的菌液中分別加入5個梯度濃度的異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG，Sigma)(濃度為0.2mM 0.4mM0.6mM 0.8mM 1.0mM)小量表達，根據(jù)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結(jié)果確定最佳誘導(dǎo)表達條件。根據(jù)最佳表達誘導(dǎo)條件進行大量培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達后收集上清，經(jīng)GST親和層析柱純化后得到純度高達90 %的BoNT/Hc蛋白(為保證和蛋白的純度僅收集窄峰流出的洗脫液)，經(jīng)Western Blotting鑒定結(jié)果見附圖2。
[0060]實施例2 =BONT鼠源單克隆抗體的篩選和制備
[0061]實施例2.1抗BONT淋巴細胞雜交瘤抗體的制備
[0062]為了制備BoNT中和保護性單抗，采用BoNT/B He蛋白免疫BALB/C小鼠(中國科學(xué)院上海動物中心)，取脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞系融合，用ELISA法對雜交瘤細胞進行篩選，用有限稀釋法克隆化。具體地說，用福氏完全佐劑與抗原(BoNT/Hc)的PBS液等量比例充分混合，以抗原的劑量100 μ g/只，0.2ml/只，腹腔注射首次免疫小鼠。首次免疫3周后進行第二次免疫，用福氏不完全佐劑和抗原液等量混合，劑量與首次免疫相同。在第二次免疫的3周后進行劑量方法同第一次免疫的第三次免疫。在三次免疫后5-7天，抽取小鼠血液分離血清以純化的BoNT/BHc蛋白包被酶標(biāo)板，ELISA檢測小鼠血清抗體滴度。選取血清中抗BoNT/Hc抗體滴度較高小鼠，摘除眼球采血，并分離血作為抗體篩選時的陽性對照，同時分離其脾臟淋巴細胞，利用經(jīng)典的PEG法，將小鼠脾臟淋巴細胞與NS-1細胞進行細胞融合?？扇苄钥乖?BHc)包被酶標(biāo)板(Greiner)后，用ELISA法對雜交瘤細胞進行了第一輪篩選，用有限稀釋法克隆化。最終獲得了 6株(1D12、8D1、1F4、2F4、5G10、2H12)可穩(wěn)定分泌BoNT/B He特異性的雜交瘤細胞，2株(8E10、3F11)可穩(wěn)定分泌BoNT/B He,BoNT/E He,BoNT/FHc交叉結(jié)合活性的雜交瘤細胞。
[0063]實施例2.2:單克隆抗體的腹水制備及腹水抗體的純化
[0064]大量擴增單克隆細胞株，按照每只BALB/C小鼠2 X IO6個雜交瘤細胞腹腔注射，10天左右開始收集小鼠腹水，利用Protein A柱,親和層析純化抗BoNT/Hc的單克隆抗體。8種單克隆抗體純化的量見附圖3。利用sigma抗體亞型檢測試劑盒對單抗的亞類進行鑒定均為IgG/κ，結(jié)果見附圖4。
[0065]實施例2.3:鼠源BoNT/Hc單克隆抗體生物結(jié)合活性的檢測
[0066]用BoNT/A、B、E、F類毒素(購自蘭州生物制品研究所)作為抗原分別包被ELISA板，進行ELISA第二輪篩選以鑒定所分泌的單克隆抗體針對的血清型，以及是否有各型之間的交叉結(jié)合活性。實驗結(jié)果如附圖5所示，所有的單抗均與BoNT/B類毒素有較強的結(jié)合反應(yīng)，其中兩株單抗與BoNT/E類毒素和BoNT/F類毒素也有較強的結(jié)合活性。為進一部確定這8株單克隆抗體的生物結(jié)合活性,我們利用Western Blotting技術(shù)驗證先前的ELISA篩選結(jié)果，具體地說，常規(guī)10% SDS-PAPE電泳BoNT/B He、BoNT/E He、BoNT/F He后，轉(zhuǎn)移至PVDF上，5%的脫脂奶粉的TBST液封閉。取ELISA方法證實為強陽性的克隆上清為一抗、孵育、洗后，以HRP標(biāo)記的羊抗鼠的二抗孵育，顯色、曝光。WB鑒定結(jié)果如附圖6所示，1D12、8D1、1F4、2F4、5G10、2H12六株為型特異性的只與BoNT/B He結(jié)合，8E10、3F11兩株抗體與BoNT/B He,BoNT/E He,BoNT/F He交叉結(jié)合。與先前類毒素的ELISA檢測結(jié)果是一致的。`
[0067]實施例2.4抗體與B He抗原親和力活性的測定
[0068]BoNT/B He蛋白包被:裝入新的Chips (GE)，50nM的BoNT/B He蛋白配置于不同pH 的 20mM 乙酸鈉溶液中(ρΗ4.0，4.5，5.0，5.5，6.0)，分別注射于 BIACORE 3000 (GE)，流速10 μ 1/min,回應(yīng)(response)最強的包被條件為最佳抗原與Chips結(jié)合的條件。同時包被鼠源IgG(Genetech)作為參照，控制回應(yīng)(Responses)在500以內(nèi)。
[0069]Chips的再生:分別用IOOmM甘氨酸鹽酸鹽(pH2.2)、0.ImM鹽酸(ρΗ2.2)及6Μ鹽酸胍作為再生溶液摸索Chips再生的最佳條件，流速30 μ 1/min，觀察基線是否穩(wěn)定，以各點回應(yīng)(Responses)之差小于5的再生系統(tǒng)為最佳系統(tǒng)。樣品親和活性的測定:單克隆抗體樣品經(jīng)系列稀釋成不同濃度(I μ Μ，800ηΜ, 400ηΜ, 200ηΜ, IOOnM, 50ηΜ, 25ηΜ)分別注入BIAC0RE儀器，流速30 μ 1/min,再生溶液為6M鹽酸胍，再生后穩(wěn)定時間為3分鐘，注入時間2分鐘，解離時間為10分鐘，同時以BSA(Amresco)作為參照。
[0070]經(jīng)BIAcore檢測,軟件BIAevaluation 3.1數(shù)據(jù)處理,計算出8株抗體的親和常數(shù)Kd，結(jié)合常數(shù)(Kon)，解離常數(shù)(Koff)，見附圖7。其中1F4、2F4、3F11、8E10、5G10的Kd值較高，達10_9數(shù)量級。
[0071]實驗例1:單克隆抗體在小鼠體內(nèi)中和保護性實驗[0072]采用小鼠體內(nèi)攻毒保護實驗，分別檢測8株抗體的單株應(yīng)用時體內(nèi)中和保護活性。具體為:分別將4倍LD50 (由蘭州生物制品所的檢測4倍LD50為最小致死劑量1MLD)的劑量的毒素BoNT/B (蘭州生物制品研究所提供)與100 μ g的單克隆抗體混合，37°C孵育I小時后，進行小鼠腹腔注射，每只小鼠注射液體量不超過500 μ I。注射后，96小時內(nèi)，每12小時觀察小鼠的存活率及存活時間。初步的實驗結(jié)果可以看出，注射毒素組，小鼠在12小時內(nèi)全部死亡，其中2F4、3F11是非中和性抗體，與對照相同，24-36小時內(nèi)，小鼠也無一生存，沒有保護功能，是非中和性抗體。為8E10、5G10、1F4、2H12、8D1、1D12為中和性保護抗體，IOOyg可以保護大部分小鼠免受4倍LD50BoNT/B劑量的攻擊。實驗結(jié)果見附圖8所示 ο
[0073]根據(jù)上述實驗結(jié)果，選取四株具有中和性保護作用的抗體(8E10、5G10、8D1、1D12)，比較這四株BoNT/B的中和保護能力的強弱。具體實驗方法同上，目的是觀察四株抗體不同劑量(1μ g>10y gUOOy g)對不同劑量的BONT/B (4倍LD50、10倍LD50、20倍LD50、40倍LD50)的攻擊保護效果。附圖9結(jié)果表明4株抗體在劑量為100 μ g/只時，可完全保護4倍LD50的Β0ΝΤ/Β攻擊。附圖10結(jié)果表明在10倍LD50劑量的攻擊下，4株100 μ g/只的抗體小鼠保護率為50%-70%。附圖11結(jié)果表明在20倍LD50劑量的攻擊下，4株100 μ g/只的抗體小鼠保護率相近，為20-40%左右，不能完全保護。附圖12結(jié)果表明在40倍LD50BoNT/E (蘭州生物制品研究所提供)的攻擊下，8E10抗體小鼠保護率96小時生存率為零，但它們的死亡時間明顯延遲，且隨著抗體濃度的不斷增加，死亡時間延遲增加。
[0074]用同樣的方法設(shè)計mAb 8E10三個劑量(I μ g、10 μ g、100 μ g)對不同劑量的BoNT/E和BoNT/F(蘭州生物制品研究所提供)(4倍、10倍、20倍LD50)毒素攻擊的中和保護實驗。附圖13結(jié)果表明，具有交叉結(jié)合活性的抗體8E10，也具有交叉中和保護活性，在約20倍LD50的BoNT/E和BoNT/F攻擊時，抗體8E10可延長小鼠的生存時間40-50小時。
[0075]實驗例2:體外細胞與BoNT/Hc結(jié)合的抗體阻斷實驗
[0076]實驗例2.1:細胞流式儀檢測交叉中和保護抗體體外阻斷B He、E He、F He與SH-SY5Y(BoNT的靶細胞)的結(jié)合
[0077]將B He,E He,F He進行FITC標(biāo)記，實驗流程如下:分別將純化的5mg/ml的BoNT/B He,BoNT/E He,BoNT/F He用PH9.0~9.5碳酸鹽緩沖液透極過夜，透析后蛋白移入小燒杯中。稱取適量的FITC(異硫氰酸熒光素，購自寶生物)，加入DMSO(二甲基亞砜)使終濃度為 Img FITC/mL DMSO0 FITC-BoNT/B He, FITC-BoNT/E HC、FITC_BoNT F He 的比例均為25 μ g FITC/mg蛋白(蛋白濃度為5mg/ml)。
[0078]按上述比例將FITC-DMS0溶液逐滴加入透析后的蛋白液中，將標(biāo)記物用PBS加至2.5ml,磁力攪拌器室溫下閉光攪拌2小時,用sephadex G_25柱(GE)除去游離突光素,先用25ml PBS沖洗G-25柱子。收集PBS洗脫的第一熒光素結(jié)合蛋白峰，測定F/P比值(既每個蛋白分子上所標(biāo)記的FITC分子數(shù)量)。合適的F/P比值為2-4。分別設(shè)置陰性對照、陽性對照和實驗組觀察8E10抗體阻斷B He、E He、F He與SH-SY5Y細胞(神經(jīng)母細胞瘤，購自中國科學(xué)院細胞庫)的結(jié)合情況。具體實驗按照下面的方案進行:
[0079]a、陰性對照，培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞+PBS孵育12小時；
[0080]b、陰性對照標(biāo)記的B He、E He、F He (0.5 μ M)與SH-SY5Y細胞孵育12小時后，PBS洗 1500rpmX 5 次，200 μ I PBS 重懸。[0081]C、實驗組:
[0082]BHc+8E10mAb(摩爾比分別為 1: 101: 1001: 200)孵育 Ih
[0083]Hlc+8E10mAb(摩爾比分別為 1: 101: 1001: 200)孵育 Ih
[0084]nic+8E10mAb(摩爾比分別為 1: 101: 1001: 200)孵育 Ih
[0085]每組均用鼠源性IgG(Genetech)作無關(guān)抗體對照。
[0086]各組孵育后，混合液加入SH-SY5Y細胞中再孵育12小時后，PBS洗3次，每次離心1500rpm, 5分鐘，棄上清再加入，加入PBS 200 μ I重懸后，上細胞流式技術(shù)檢測結(jié)果顯示:mAb 8E10對BoNT/B He, BoNT/E He和BoNT/F He都具有顯著的阻斷體外結(jié)合SH-SY5Y細胞的效果，且呈濃度依賴性的阻斷增強功能，當(dāng)抗體的分子為He蛋白分子的10倍時，可顯著觀察到抗體的阻斷效果，為He蛋白分子的200倍時，可在完全阻斷He蛋白分子與細胞受體體外的結(jié)合。結(jié)果見附圖14。
[0087]實驗例2.2:細胞免疫熒光法檢測 BoNT/B He、BoNT/E He、BoNT/F He 與 SH-SY5Y細胞的培養(yǎng)
[0088]首先將正常培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞進行免疫染色后，激光共聚焦顯微鏡下觀察顯示:蛋白BoNT/B He與SH-SY5Y細胞的細胞膜受體蛋白發(fā)生結(jié)合，細胞膜呈現(xiàn)綠色熒光，細胞核因為DAPI (4’ 6-二脒基2-苯基吲哚，購自寶生物)的襯染而呈現(xiàn)蘭色；BSA對照未檢測到與細胞的結(jié)合，僅細胞核被染為蘭色，如圖15所示。
[0089]同樣應(yīng)用該方法檢測交叉中和保護性抗體8E10的體外中和活性，檢測其可否有效地抑制毒素與細胞受體的結(jié)合。具體地說，設(shè)置下面實驗方案。
[0090]對照組
[0091]1:正常培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞，PBS (2%的BSA)孵育過夜；
[0092]2 =FITC熒光標(biāo)記的B He、E He、F He分別與SH-SY5Y細胞4°C孵育過夜。
[0093]實驗組:
[0094]BoNT/B Hc+mAb 8E10(摩爾比 1: 10 ; I: 100)
[0095]BoNT/E Hc+mAb 8E10(摩爾比 1: 10 ; I: 100)
[0096]BoNT/F Hc+mAb 8E 10(摩爾比 1: 10 ; I: 100)
[0097]37°C孵育I小時，加入細胞4°C過夜PBS洗滌三次后，激光共聚焦熒光顯微鏡觀察。實驗結(jié)果(附圖16所示)可以看至Ij 8E10均能抑制BoNT/B He、BoNT/EHc、BoNT/F He與SH-SY5Y的結(jié)合，而BSA對照及無關(guān)抗體則不能抑制這種結(jié)合，仍能觀察到因BoNT/Hc與SH-SY5Y細胞結(jié)合而產(chǎn)生的綠色熒光。由于BoNT/Hc是BoNT的非毒性基團，其功能是與細胞膜表面的受體結(jié)合，進而幫助毒性基團BoNT/Hn進入細胞。本專利獲得的抗體，其作用就是阻礙BoNT與細胞的結(jié)合，阻斷BoNT發(fā)揮作用。因此通過抗體阻斷BoNT/Hc與靶細胞SH-SY5Y的結(jié)合實驗，就能體現(xiàn)抗體的綜合保護作用。)
[0098]實驗例3:Western Blotting檢測mAb 8E10對全毒素酶解底物的保護效果
[0099]已知SH-SY5Y細胞可表達多種SNARE蛋白。預(yù)實驗中，我們摸索確定了三種毒素作用于SH-SY5Y細胞底物SNAP-25、VAMP和syntaxin臨界毒力值BoNT/B為625倍LD50、BoNT/E為250倍LD50、BoNT/F為800倍LD50。具體的實施按照下面實驗方案進行:
[0100]陰性對照組:PBS
[0101]陽性對照照:625倍LD50 BoNT/B+0.1 IU馬源抗毒血清；500倍LD50 BoNT/E+0.1IU的馬源抗毒血清；BoNT/F 800倍LD50+0.1 IU馬源抗毒血清。
[0102]實驗樣品組:(抗體與毒素的比分別為1: 1、10: UlOO: I)
[0103]把上述各組的毒素和抗體混合物混合均勻，37°C孵育I小時，裂解細胞，用SDS提取細胞總蛋白后進行蛋白電泳和Western Blotting,凝膠圖像處理系統(tǒng)結(jié)果顯示8E10抗體對三種毒素具有一定的交叉中和保護功能，從免疫印跡結(jié)果上看，隨著抗體量的增加，保護功能加強。(如附圖17所示，1.PBS 2.BoNT/B/E/F+馬源抗毒血清3.BoNT/B或E或F+8E10(1: 100 摩爾比)4.BoNT/B 或 E 或 F+8E10(1: 10 摩爾比)5.BoNT/B 或 E 或F+8E10(1: I 摩爾比)6.BoNT/B 或 E 或 F)。
[0104]實驗例4:BoNT/B/E/F型交叉保護性中和抗原表位的篩選和鑒定
[0105]實驗例4.1:單克隆抗體8E10抗原表位的淘選
[0106]以8E10單抗作為篩選分子，采用噬菌體隨機12肽庫(購自NEB，Ph.D.-12?PhageDisplay Peptide Library Kit)經(jīng)過三輪親和淘選,與單克隆抗體8E10特異結(jié)合的卩遼菌體克隆被富集，滴度與得率均逐步升高。具體的說，將100μ I用0.lmol/L NaHCO3(碳酸氫鈉)溶液(pH 8.6)稀釋成lOOyg/ml的單抗8E10加入96孔酶聯(lián)板中，4°C孵育過夜。棄包被液，加入200μ I含1% BSA(牛血清白蛋白)的TBS緩沖液(50mM Tris-HCl (pH 7.5)，150mM NaCl)，37°C封閉2小時。然后用TBST(TBS緩沖液+0.1%吐溫-20)緩沖液快速洗滌10次，加入100 μ I用TBS緩沖液稀釋的含2X IO11PFU的噬菌體溶液，室溫孵育I小時。IXTBST(吐溫-20 0.1% )、1XTBST(吐溫-20 0.3% )、I X TBST (吐溫-20 0.5% )分別洗滌5次。加入100 μ I洗脫液(0.2mol/L甘氨酸鹽酸鹽，pH 2.2，10g/L BSA)，室溫放置10分鐘以洗脫結(jié)合的噬菌體，加入15 μ I中和液(lmol/1 Tris-HcI，pH 9.1)中和。取10 μ L測滴度，其余擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)聚乙二醇/氯化鈉(PEG/NaCl)沉淀，測滴度，同時進行第二輪淘選，相同過程進行第三輪淘選。對結(jié)果進行總結(jié):經(jīng)過三輪淘選，特異性結(jié)合于單克隆抗體8E10的噬菌體得到了有效富`集。與8E10特異結(jié)合的噬菌體克隆第一輪至第三輪的滴度依次為3.6X105pfu、2.6X107pfu、4.7X109pfu。從附圖18中可以看出，第三輪的富集效率是第一輪的13050倍。
[0107]實驗例4.2:陽性克隆篩選和序列分析
[0108]從實驗例4.1第三輪淘選產(chǎn)物中隨機挑取60個藍色噬菌斑，經(jīng)擴增后對噬菌體上清進行ELISA檢測，最終獲得了 48個單抗8E10特異的陽性噬菌體。將陽性克隆擴增后，提取單鏈DNA，以-96gIII引物對它們進行序列測定。結(jié)果顯示，在所選的64個陽性克隆中，包括了 6個獨特的序列，它們包含有一致序列SXWY(其中X可以是任意氨基酸)。將一致序列同BoNT/B He蛋白序列進行比對后發(fā)現(xiàn)，表位落于B He蛋白FCISKffYLKEVK區(qū)域(SEQID N0.7)，見附圖 19。
[0109]實驗例4.3單克隆抗體mAb 8E10與表位肽的特異性結(jié)合分析及競爭結(jié)合實驗
[0110]為了驗證SXWY是8EIO單克隆抗體的抗原表位，我們化學(xué)合成了 BoNT/BHc上的I個12肽(FCISKffYLKEVK, SEQ ID N0.7)，將其命名為BP。另外對照肽5A8，其序列為(VATWLNPDPSQK, SEQ ID N0.8)。經(jīng)HPLC (高壓液相色譜法)純化，純度大于95%。
[0111]在抗體與多肽結(jié)合實驗中，單克隆抗體8E10只與BP肽作用，不與對照肽5A8反應(yīng)；并且，抗體與多肽的結(jié)合隨著抗體濃度的升高而0D450值升高，由此可見，抗體8E10與多肽BP的結(jié)合是特異性，并且是濃度依賴的(附圖20所示)。在短肽競爭結(jié)合試驗中，合成多肽BP隨著濃度升高抑制8E10與BoNT/B He結(jié)合的能力逐漸增強，其IC50 (抑制50%時的濃度)小于2.5 μ g/ml ;然而對照肽則不能抑制8E10與BoNT/B He的結(jié)合(附圖21所示)O
[0112]以上數(shù)據(jù)證明:單克隆抗體8E10的抗原結(jié)合位點位于多肽BP所對應(yīng)的氨基酸序列上。
[0113]實驗例4.4:計算機模擬抗原識別表位
[0114]以PDB 據(jù)庫中，BoNT/B, BoNT/E,和 BoNT/F 蛋白晶體結(jié)構(gòu)(1EPW, 3FFZ, 3FVQ)為模板，由曬菌體展示所篩選出的表位結(jié)果，利用Discovery Studio 2.0 (Accelrys, SanDiego, CA)軟件模擬單克隆抗體所識別的表位區(qū)域在BoNT/B He BoNT/E He BoNT/F He蛋白結(jié)構(gòu)中的構(gòu)象位點，并對它們進行了比較。三維結(jié)構(gòu)比對分析結(jié)果顯示在肉毒毒素B序列的SXWY序列在E/Hc、F/Hc蛋白的氨基酸一級結(jié)構(gòu)中都有性質(zhì)類似的序列存在，而在三級結(jié)構(gòu)中，也都處于肉毒毒素B、E、F蛋白的受體結(jié)合區(qū)，以此預(yù)測這可能是8E10具有交叉中和保護功能的原因。見附圖22所示。
[0115]實驗例4.5:8E10單抗的可變區(qū)基因克隆和序列測定
[0116]收集8E105X 106 ~IXlO7 雜交瘤細胞，用 Trizol (Invitrogen Cat.N0.15596-026)抽提其總RNA，根據(jù)小鼠抗體恒定區(qū)序列，設(shè)計引物如下:
[0117]HGSPl:5’ -GATACTGTGATCTGTTTG-3’ (SEQ ID N0.9)
[0118]HGSP2:5’ -TCGCAGATGAGTCTGGAC-3’ (SEQ ID N0.10)
[0119]HGSP3:5，-ATGAACAC ACTCACATTG-3，(SEQ ID N0.11)
[0120]LGSPl:5’ -GAGGTTATGACTTTCATAGTCAGC-3，(SEQ ID N0.12)
[0121]LGSP2:5，-AACACTGTCCAGGACACCATCTCG-3’ (SEQ ID N0.13)
[0122]LGSP3:5’ -TCTGGGATAGAAGTTGTTCATGAG-3’ (SEQ ID N0.14)
[0123]按照Invitrogen 5，RACE kit (Cat.N0.18374-058)的使用說明，分別以 HGSPl，LGSPl 為引物,合成第一鏈 cDNA ;在 TdT (Invitrogen)和 dCTP (Invitrogen)作用下,給第一鏈cDNA 3，端加poly C尾；分別以HGSP2，HGSP3、LGSP2, LGSP3為5，引物，通過巢式PCR得到重鏈可變區(qū)(VH)、輕鏈可變區(qū)(VL)的PCR產(chǎn)物^fPCR產(chǎn)物裝入pGEM-T easy載體中；挑取克隆抽提質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶鑒定得到陽性克隆，通過測序確定其序列。8E10單抗的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列為SEQ ID N0.15，氨基酸序列為SEQ ID N0.16。8E10單抗的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列為SEQ ID N0.17，氨基酸序列為SEQID N0.18。
【權(quán)利要求】
1.一種肉毒毒素BoNT/B He功能表位FYQ*I，*可以是任意氨基酸。
2.與權(quán)利要求1所述的功能表位特異性結(jié)合的抗肉毒毒素的單克隆抗體。
3.權(quán)利要求2所述的抗肉毒毒素的單克隆抗體，其重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQIDN0.16，其輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID N0.18。
4.抗肉毒毒素的單克隆抗體，其重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQID N0.16，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQID N0.18,恒定區(qū)為小鼠IgG恒定區(qū)。
5.一種DNA分子，編碼權(quán)利要求3所述的單克隆抗體。
6.權(quán)利要求5所述的DNA分子，其編碼重鏈可變區(qū)的核苷酸序列為SEQID N0.15，編碼輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列為SEQ ID N0.17。
7.權(quán)利要求2-4任一所述的抗肉毒毒素的單克隆抗體在制備預(yù)防和/或治療毒素中毒藥物中的用途。
【文檔編號】C07K16/12GK103509086SQ201210198873
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月15日
【發(fā)明者】郭亞軍, 戴建新, 陳長春, 王華菁, 張?zhí)斐? 夏天, 張大鵬, 錢衛(wèi)珠 申請人:上?？贵w藥物國家工程研究中心有限公司