專利名稱：一種用作結(jié)合對(duì)的特異性結(jié)合反應(yīng)培養(yǎng)基的水溶液的制作方法
專利說(shuō)明一種用作結(jié)合對(duì)的特異性結(jié)合反應(yīng)培養(yǎng)基的水溶液 本發(fā)明涉及用作結(jié)合對(duì)的特異性結(jié)合反應(yīng)培養(yǎng)基的水溶液。
背景技術(shù)：
公知使用一種或多種抗體在一種試樣中檢測(cè)試驗(yàn)物質(zhì)(分析物)的免疫測(cè)定技術(shù)。免疫測(cè)定技術(shù)方法的發(fā)展增強(qiáng)了該試驗(yàn)的敏感性。盡管在近些年來(lái)有所發(fā)展，但仍然希望消除非特異性的結(jié)合反應(yīng)、交叉反應(yīng)以及基質(zhì)之中存在的化合物的影響。免疫測(cè)定法取決于結(jié)合成員對(duì)的第一結(jié)合成員(如一種抗原或配體)與結(jié)合成員對(duì)的第二結(jié)合成員(如一種抗體或受體)特異性結(jié)合的能力。為了測(cè)定這種結(jié)合的延續(xù)，用可檢測(cè)部分標(biāo)記含有這種結(jié)合成員的一方的共軛物。這種結(jié)合成員對(duì)可以是一種抗原和針對(duì)該抗原的抗體。免疫測(cè)定法可以以競(jìng)爭(zhēng)性的免疫測(cè)定法形式或以?shī)A心免疫測(cè)定法形式進(jìn)行。在競(jìng)爭(zhēng)性的免疫測(cè)定法形式中抗原可以被固定到固相材料上，而結(jié)合到固相材料上的可檢測(cè)部分的數(shù)量能夠被檢出、計(jì)量并將其與試樣中存在的抗體的數(shù)量相關(guān)聯(lián)。固相材料的實(shí)例包括珠子、顆粒、微粒等等。在夾心免疫測(cè)定法形式中，將含有例如一種抗體的試樣與一種蛋白質(zhì)例如抗原相接觸。所述抗原被固定在固相材料上。固相材料的實(shí)例包括珠子、顆粒、微粒等等。所述固相材料通常用一種已被可檢測(cè)部分標(biāo)記的第二抗原或抗體生成。然后分別在所述固相材料上第二抗原或抗體分別與相應(yīng)抗體或抗原結(jié)合，在一個(gè)或多個(gè)洗滌步驟以去掉未結(jié)合的物質(zhì)之后，加入一種指示劑物質(zhì)例如顯色物質(zhì)，使其與可檢測(cè)部分反應(yīng)，產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)，如顏色變化。然后檢出該顏色變化，計(jì)量并將其與試樣之中存在的抗體數(shù)量相關(guān)聯(lián)。此外應(yīng)注意還需要各種稀釋劑和緩沖液用于優(yōu)化處理微粒、抗原、共軛物及參與化學(xué)反應(yīng)的其他試驗(yàn)組分。為了在免疫測(cè)定法中獲得最佳結(jié)果，用于結(jié)合伙伴之間結(jié)合反應(yīng)(例如抗體和抗原反應(yīng)或配體和受體生成復(fù)合體)的溶液必須提供一種培養(yǎng)基以優(yōu)化抗體結(jié)合抗原的能力，或必須提供一種培養(yǎng)基以優(yōu)化配體結(jié)合受體的能力，同時(shí)強(qiáng)有力的降低甚至防止非特異性相互作用、低親合性結(jié)合和基質(zhì)效應(yīng)，以免生成錯(cuò)誤信號(hào)。為了消除非特異性相互作用和交叉反應(yīng)，有人在結(jié)合反應(yīng)之后將洗滌劑加入洗滌步驟所用的緩沖液中以去除非特異性結(jié)合。對(duì)于免疫測(cè)定法，像western印記分析、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等，使用含有補(bǔ)充有牛血清白蛋白和0.01到0.05(v/v)Tween20的磷酸鹽緩沖鹽水的溶液作為培養(yǎng)基，用于結(jié)合伙伴(例如抗體和抗原)之間的結(jié)合反應(yīng)。但是常常發(fā)現(xiàn)用現(xiàn)有技術(shù)的這種緩沖液不能避免非特異性或低親合性結(jié)合、交叉反應(yīng)和基質(zhì)效應(yīng)。例如，當(dāng)研究一種涉及多元分析物檢測(cè)的CRP試驗(yàn)時(shí)，由于應(yīng)用多元抗體而帶來(lái)的交叉反應(yīng)和基質(zhì)效應(yīng)看來(lái)已成為一個(gè)問(wèn)題，其不能通過(guò)利用常規(guī)的免疫測(cè)定緩沖液解決。因此本發(fā)明的目的是提供一種溶液，作為用于結(jié)合成員對(duì)的特異性結(jié)合反應(yīng)的培養(yǎng)基使用，其中強(qiáng)有力的降低或甚至防止非特異性結(jié)合、低親合性結(jié)合、交叉反應(yīng)和基質(zhì)效應(yīng)。此外，本發(fā)明的目的是提供一種免疫測(cè)定方法，其中非特異性和低親合性結(jié)合、交叉反應(yīng)和基質(zhì)效應(yīng)被降低或防止。發(fā)明概述本發(fā)明的目的是通過(guò)使用一種水溶液作為用于結(jié)合成員對(duì)的特異性結(jié)合反應(yīng)的培養(yǎng)基而實(shí)現(xiàn)的，其中第一結(jié)合成員識(shí)別其互補(bǔ)的第二結(jié)合成員，該溶液含有a)控制pH的一種緩沖液；b)選自下組的化合物A-由通式I R1-[[CR2R3]p-O]q-R4定義的化合物，其中R1是氫或羥基，各單元中R2獨(dú)立地是氫或羥基，R3是氫、甲基、乙基，R4是氫或烷基，p是2到10的一個(gè)整數(shù)，q是1到100的一個(gè)整數(shù)，附帶條件是該化合物至少攜帶兩個(gè)羥基；-多元醇；-糖類；c)非離子洗滌劑。在化合物A的通式I中，如果R4是氫，相鄰的殘基R2也是氫。如果R1是羥基，相鄰的殘基R2是氫。在一個(gè)優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，化合物A的分子式中的q是從1到50的一個(gè)整數(shù)，更優(yōu)選從1到30。本發(fā)明的發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的水溶液可以降低免疫測(cè)定中的交叉反應(yīng)、基質(zhì)效應(yīng)、非特異性結(jié)合和低親合性結(jié)合。此外，還發(fā)現(xiàn)使用本發(fā)明水溶液時(shí)可以防止嗜異性的抗體(人抗小鼠抗體)帶來(lái)的影響。另外，即使在應(yīng)用于血漿的情況下，用該緩沖液能夠避免風(fēng)濕(rheuma)因子、血紅蛋白、膽紅素和甘油三脂帶來(lái)的負(fù)效果。在這里“結(jié)合成員對(duì)”包括一個(gè)“第一結(jié)合成員”和一個(gè)“第二結(jié)合成員”。兩種結(jié)合成員會(huì)彼此特異性結(jié)合。結(jié)合成員對(duì)的第一結(jié)合成員可以分別是抗原或配體。第二結(jié)合成員(如分別為抗體或受體)特異性地識(shí)別并結(jié)合第一結(jié)合成員(如分別為抗原或配體)。第二結(jié)合成員是相應(yīng)的結(jié)合成員，因此也稱為“相應(yīng)結(jié)合成員”。技術(shù)人員會(huì)理解術(shù)語(yǔ)“第一”結(jié)合成員和“第二”結(jié)合成員分別可以是例如抗原和相應(yīng)抗體，或反之亦然。本發(fā)明的水溶液代表一種通用緩沖液，其在各種基質(zhì)(例如血漿，血清等)中進(jìn)行的免疫測(cè)定和結(jié)合反應(yīng)中作為培養(yǎng)基。在應(yīng)用多分析物的情況下，例如如果使用蛋白質(zhì)芯片，需要同步孵育幾個(gè)(或多個(gè))分析物和幾個(gè)抗體，經(jīng)常發(fā)生非特異性結(jié)合和交叉反應(yīng)。在很多情況下觀察到這種不希望得到的結(jié)合反應(yīng)。利用現(xiàn)有技術(shù)公知的標(biāo)準(zhǔn)ELISA緩沖液不能防止這種交叉反應(yīng)影響。另外在現(xiàn)有技術(shù)中，與其它參照的方法相比，所采用的天然樣品可導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)，這會(huì)引起錯(cuò)誤的測(cè)量值。在此術(shù)語(yǔ)“基質(zhì)”指天然樣品(例如血清)之中存在的所有化合物；術(shù)語(yǔ)“基質(zhì)”特別是指有機(jī)的、尤其是生物化合物，例如蛋白質(zhì)。本發(fā)明的水溶液分別可以用作結(jié)合對(duì)的結(jié)合反應(yīng)的培養(yǎng)基，作為用于免疫測(cè)定和結(jié)合反應(yīng)的樣品稀釋緩沖液以及抗體和抗原的稀釋緩沖液。進(jìn)一步可應(yīng)用于多分析物免疫測(cè)定和蛋白質(zhì)分析(proteomics)，其中能夠防止不希望得到的熒光體標(biāo)記抗體的交叉反應(yīng)。熒光體標(biāo)記抗體往往會(huì)以非特異性方式結(jié)合其它蛋白質(zhì)。使用本發(fā)明的水溶液能夠避免這種影響。在免疫測(cè)定如ELISA和蛋白質(zhì)芯片中，使用本發(fā)明的緩沖液可以展示出進(jìn)一步的積極效果。當(dāng)用本發(fā)明緩沖液孵育帶有固定抗體的表面時(shí)，該固定化抗體的活性有所增強(qiáng)。這使得分析物與固定化抗體的結(jié)合增強(qiáng)。總之，本發(fā)明緩沖液除降低非特異性信號(hào)和非特異性影響之外，還會(huì)增強(qiáng)分析物和抗體之間特異性結(jié)合反應(yīng)陽(yáng)性作用帶來(lái)的特異性信號(hào)。這種固定化抗體活性的所致增強(qiáng)提供更高的相應(yīng)試驗(yàn)的敏感性。本發(fā)明的緩沖液可以用于免疫測(cè)定ELISA、EIA、FIA、側(cè)向流式試驗(yàn)(lateral-flow-test)、蛋白質(zhì)芯片、多分析物試驗(yàn)、western印記、點(diǎn)印記、免疫組織化學(xué)、受體配體試驗(yàn)和免疫PCR。
發(fā)明詳述在本發(fā)明一優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，該水溶液進(jìn)一步包括與免疫阻斷非特異抗體結(jié)合有效量的蛋白質(zhì)。此蛋白質(zhì)優(yōu)選選自牛血清白蛋白、卵清蛋白、酪蛋白、胎牛血清。進(jìn)一步優(yōu)選該蛋白質(zhì)以0.1到2％(w/v)的濃度存在于水溶液中，更優(yōu)選0.5到1.5％(w/v)范圍。這些蛋白質(zhì)不能被免疫測(cè)定所用的任何抗體識(shí)別。這種未被識(shí)別的蛋白質(zhì)可以免疫阻斷由樣品之中可能存在的分子或化合物帶來(lái)的非特異性抗體結(jié)合。在另一具體實(shí)施方式
中，該水溶液含有選自下列的鹽NaCl、KCl、NH4Cl。進(jìn)一步優(yōu)選該水溶液具有100mM到1.5mM的離子強(qiáng)度，更優(yōu)選200mM到1M，甚至更優(yōu)選200mM到800mM，特別更優(yōu)選200mM到600mM，最優(yōu)選250mM到500mM。本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)用作用于結(jié)合反應(yīng)的培養(yǎng)基的該緩沖液在200mM到600mM范圍內(nèi)的高離子強(qiáng)度會(huì)進(jìn)一步降低非特異性結(jié)合和交叉反應(yīng)，同時(shí)沒(méi)有負(fù)面影響特異性結(jié)合反應(yīng)。在特定優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，該水溶液緩沖液選自Tris(三(羥甲基)-氨基甲烷)、Pipes(哌嗪-1，4-雙-2-乙烷磺酸)、Mes(4-嗎啉代乙烷磺酸)、Hepes(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪-乙烷磺酸)、磷酸鹽緩沖液。在另一優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，化合物A選自下組聚亞烷基二醇，聚丙二醇，丙二醇，聚乙二醇，乙二醇，單糖，雙糖，三糖，蔗糖，甘露糖，海藻糖，多元醇，甘油和其混合物。在一優(yōu)選具體實(shí)施方式
中化合物A的濃度在0.5到25％(v/v)范圍之內(nèi)，優(yōu)選2.0到20％(v/v)，更優(yōu)選2.0到15％(v/v)，進(jìn)而更優(yōu)選2.0到10％(v/v)，甚至更優(yōu)選2.0到7％(v/v)，最優(yōu)選約5％(v/v)。如果化合物A是液相，該濃度則為％(v/v)。如果該化合物A是固體(例如糖類)，該濃度應(yīng)被理解為％(w/v)。在另一優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，該水溶液含有選自下述的通式化合物作為非離子洗滌劑a)具有取代基R1和R2(R1-Ph-R2)的取代的苯基，其中R1是C1-C9烷基，R2是-O-[CH2-CH2-O]a-H基團(tuán)，其中“a”是5到40的一個(gè)整數(shù)，其中R2相對(duì)于R1在對(duì)位、間位或鄰位； ，其中n、x、y和z都是5到40的一個(gè)整數(shù)，R是脂肪酸殘基。進(jìn)一步優(yōu)選該非離子型洗滌劑選自十二烷基聚(乙二醇醚)m，其中m是5到40的整數(shù)；1-O-n-辛基-β-D-吡喃葡糖苷(n-辛葡糖苷)(n-Octylglucoside)；烷基酚聚(乙二醇-醚)m，其中m是5到40的整數(shù)，優(yōu)選m＝11(Nonidet P40)；1-O-n-十二基-β-D-吡喃葡糖基(1-4)α-D-吡喃葡糖苷；十二烷基聚-(乙二醇醚)m，其中m是5到40的整數(shù)，優(yōu)選m＝23(Brij35；)；聚(氧乙烯)(20)-脫水山梨醇單脂肪酸酯，優(yōu)選選自聚(氧乙烯)(20)-脫水山梨醇一油酸酯(Tween80)，聚(氧乙烯)(20)-脫水山梨醇單月桂酸酯(Tween20)，聚(氧乙烯)(20)-脫水山梨醇單棕櫚酸酯(Tween40)，聚(氧乙烯)(20)-脫水山梨醇一硬脂酸酯)；辛基酚聚(乙二醇醚)m，其中m是5到40的整數(shù)，優(yōu)選m＝10(TritonX-100)。在優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，非離子型洗滌劑的濃度在0.1到1.0％(v/v)范圍之內(nèi)。優(yōu)選非離子型洗滌劑的濃度在0.15到1.0％(v/v)，更優(yōu)選在0.2到1.0％(v/v)范圍內(nèi)，進(jìn)而更優(yōu)選在0.2和0.8％(v/v)范圍內(nèi)，甚至更優(yōu)選0.25％到0.6％(v/v)范圍內(nèi)，最優(yōu)選約0.25％(v/v)。本發(fā)明的一個(gè)重要特點(diǎn)是存在如權(quán)利要求1所述的化合物A和所述非離子型洗滌劑。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)免疫測(cè)定法中孵育溶液的濃度，所述兩種組分(化合物A和非離子型洗滌劑)的每一種均以更高的濃度存在于本發(fā)明的水溶液中。在另一優(yōu)選具體實(shí)施方式
中提供了水溶液，其中所述非離子型洗滌劑與化合物A的比率為1∶15到1∶25，優(yōu)選約1∶20。在一個(gè)特別優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，所述水溶液含有2到7％(v/v)范圍內(nèi)的化合物A和0.2到0.8％(v/v)范圍內(nèi)的非離子型洗滌劑。優(yōu)選該水溶液具有200mM到1mM的離子強(qiáng)度，更優(yōu)選200mM到800mM，尤其更優(yōu)選200mM到600mM，最優(yōu)選250mM到500mM。優(yōu)選所述水溶液含有選自下述的化合物作為化合物A聚亞烷基二醇，聚丙二醇，丙二醇，聚乙二醇，乙二醇，甘油及其混合物，更優(yōu)選選自下述的化合物聚丙二醇，丙二醇，聚乙二醇，乙二醇，最優(yōu)選乙二醇。本發(fā)明的水溶液優(yōu)選不含有二硫蘇糖醇。還優(yōu)選本發(fā)明水溶液不含有β-巰基乙醇。在另一優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，水溶液的pH被調(diào)整在5.6到9.6范圍內(nèi)，優(yōu)選6.0到9.0范圍內(nèi)，進(jìn)一步優(yōu)選6.5到8.0范圍內(nèi)，最優(yōu)選6.8到7.4范圍內(nèi)。所述水溶液的一個(gè)特別優(yōu)選具體實(shí)施方式
是具有降低非特異性結(jié)合、交叉反應(yīng)及基質(zhì)干擾影響的能力。與標(biāo)準(zhǔn)條件相比，本發(fā)明的水溶液尤其能夠防止KD值達(dá)10-7的低親合性結(jié)合。進(jìn)一步優(yōu)選該水溶液能夠防止KD值為10-7M的低親合性結(jié)合，并與標(biāo)準(zhǔn)條件相比，將KD值為10-7M到10-8M范圍內(nèi)的中親合性結(jié)合降低至少90％。更進(jìn)一步優(yōu)選該水溶液能夠防止KD值為10-7M的低親合性結(jié)合，并與標(biāo)準(zhǔn)條件相比，將KD值為10-7M到10-9M范圍內(nèi)的中親合性結(jié)合降低至少90％。在此“標(biāo)準(zhǔn)條件”由以下條件構(gòu)成的水溶液代表50mM PBS(磷酸鹽緩沖鹽水，pH 7.4)，150mM NaCl，1％(w/v)BSA(參見(jiàn)表1參考文獻(xiàn)實(shí)施例)。與用另一標(biāo)準(zhǔn)溶液獲得的測(cè)量值相比，結(jié)果是相同的，即由50mM PBS(pH 7.4)，100mMNaCl，0.05％(v/v)Tween20組成的水溶液。除了降低非特異性低親合性結(jié)合以及基質(zhì)效應(yīng)的影響，尤其優(yōu)選該水溶液能夠增強(qiáng)抗體的結(jié)合活性，優(yōu)選固定化抗體的結(jié)合活性，以及配體和受體之間的結(jié)合活性。使用本發(fā)明溶液可以將固定化抗體的結(jié)合活性增強(qiáng)大約10％或更多。本發(fā)明的目的還可由之前所述本發(fā)明水溶液的濃縮物解決，優(yōu)選2到10倍濃縮，更優(yōu)選3到5倍濃縮。更進(jìn)一步，本發(fā)明的目的通過(guò)利用本發(fā)明水溶液解決，將其作為結(jié)合對(duì)的結(jié)合反應(yīng)的培養(yǎng)基，其中第一結(jié)合成員特異性識(shí)別并結(jié)合其互補(bǔ)的第二結(jié)合成員。優(yōu)選將該水溶液作為抗體抗原結(jié)合反應(yīng)的培養(yǎng)基，在一個(gè)替代性具體實(shí)施方式
中該水溶液作為受體配體結(jié)合反應(yīng)的培養(yǎng)基。在其它優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，該水溶液作為樣品、試劑、配體、受體、抗原、抗體的稀釋緩沖液。該水溶液還可優(yōu)選在免疫測(cè)定法中結(jié)合反應(yīng)進(jìn)行之后作為洗滌緩沖液。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種在結(jié)合對(duì)的特異性結(jié)合反應(yīng)過(guò)程中降低非特異性結(jié)合和/或交叉反應(yīng)和/或基質(zhì)干擾影響的方法，其中第一結(jié)合成員識(shí)別其互補(bǔ)的第二結(jié)合成員，該方法包括利用本發(fā)明水溶液作為該特異性結(jié)合反應(yīng)的培養(yǎng)基。本發(fā)明另一方面是本發(fā)明的水溶液可以作為試劑盒的一個(gè)組分。在此術(shù)語(yǔ)“試劑盒”是指各種試劑及相關(guān)物質(zhì)，如緩沖液、包含固定化結(jié)合成員的載體以及進(jìn)行試驗(yàn)所需要的各試劑的集合。因此，本發(fā)明提供一種通過(guò)免疫測(cè)定至少一種待測(cè)分析物的檢測(cè)試劑盒，其中待測(cè)分析物是結(jié)合成員對(duì)的第一結(jié)合成員，其中該第一結(jié)合成員特異性結(jié)合其互補(bǔ)的結(jié)合成員，該試劑盒包含a)含有本發(fā)明水溶液的容器；b)在其上固定有所述互補(bǔ)結(jié)合成員以捕獲分析物的載體；以及c)任選地，能夠免疫識(shí)別與互補(bǔ)結(jié)合成員結(jié)合的分析物的試劑，其中所述試劑(抗體)軛合一種檢測(cè)手段；以及d)任選地，能與所述檢測(cè)手段反應(yīng)以產(chǎn)生可檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物的試劑。一種典型試劑盒例如可用作ELISA試劑盒用于檢測(cè)比如在血清中的抗體。在該情況下根據(jù)b)所述載體在其上含有互補(bǔ)結(jié)合成員，例如病毒抗原，用于捕獲分析物。所述分析物是血清上抗體。根據(jù)c)，能免疫識(shí)別所述分析物的試劑則是一種抗-抗體，其能夠識(shí)別所述被捕獲的抗體。
實(shí)現(xiàn)發(fā)明的最佳方式本發(fā)明特征在于作為用于結(jié)合成員對(duì)的特異性結(jié)合反應(yīng)的培養(yǎng)基使用的水溶液，其中第一結(jié)合成員識(shí)別其互補(bǔ)第二結(jié)合成員，包括a)控制pH的緩沖液；b)選自下述的化合物A由通式I R1-[[CR2R3]p-O]q-R4定義的化合物，其中R1是氫或羥基，各單元中R2獨(dú)立地是氫或羥基，R3是氫、甲基、乙基，R4是氫或烷基，p是2到10的一個(gè)整數(shù)，q是1到100的一個(gè)整數(shù)，附帶條件是該化合物至少攜帶兩個(gè)羥基；-多元醇；-糖類；c)非離子洗滌劑。在結(jié)合對(duì)的特異性結(jié)合反應(yīng)過(guò)程中降低非特異性結(jié)合和/或交叉反應(yīng)和/或基質(zhì)干擾影響的本發(fā)明方法，其中第一結(jié)合成員識(shí)別其互補(bǔ)的第二結(jié)合成員，即，用于免疫測(cè)定，該方法的特征在于包括利用上述水溶液。優(yōu)選地，發(fā)現(xiàn)含有2到7％(v/v)范圍內(nèi)的化合物A和0.2到0.8％(v/v)范圍內(nèi)的非離子型洗滌劑的水溶液有用的。優(yōu)選該水溶液具有200mM到1mM的離子強(qiáng)度，更優(yōu)選200mM到800mM，尤其更優(yōu)選200mM到600mM，最優(yōu)選250mM到500mM。優(yōu)選所述水溶液含有選自下述的化合物作為化合物A聚亞烷基二醇，聚丙二醇，丙二醇，聚乙二醇，乙二醇，甘油及其混合物，更優(yōu)選選自下述的化合物聚丙二醇，丙二醇，聚乙二醇，乙二醇，最優(yōu)選乙二醇。下述實(shí)施例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。但是，所述實(shí)施例僅僅用于說(shuō)明，并非限制本發(fā)明的范圍。


圖1顯示在夾心試驗(yàn)中與CRP結(jié)合的檢測(cè)抗體C6的數(shù)量，450nm下吸光度對(duì)CRP濃度[ng/ml]作圖。所述檢測(cè)抗體C6與蛋白質(zhì)CRP的結(jié)合反應(yīng)是在標(biāo)準(zhǔn)條件下如實(shí)施例1所述進(jìn)行，分別使用本發(fā)明的樣品緩沖液(參見(jiàn)表1)。根據(jù)本發(fā)明溶液的樣品緩沖液I到III很好地降低了基質(zhì)效應(yīng)的影響。樣品緩沖液I顯示出最佳靈敏度。參照緩沖液的低靈敏度由強(qiáng)烈的基質(zhì)效應(yīng)造成。
圖2顯示在由多克隆的檢測(cè)抗體P2的非特異性結(jié)合所引起的高背景信號(hào)下兩種不同緩沖液的影響，所述P2非特異性結(jié)合捕獲抗體P3(根據(jù)實(shí)施例2)。在該實(shí)驗(yàn)中無(wú)分析物存在。與參照實(shí)施例緩沖液II的高背景信號(hào)相比，樣品緩沖液I顯著地降低了非特異性結(jié)合。
實(shí)施例 實(shí)施例1降低基質(zhì)效應(yīng) 向微孔板(C8 StarWell Module，NUNC)的各孔中加入100μl稀釋的捕獲抗體C2(最終濃度1μg/ml在PBS-緩沖液中)并用板密封墊覆蓋。捕獲抗體靶向CRP(c-反應(yīng)蛋白)。然后在室溫下孵育該板5小時(shí)。去除密封墊，以每孔300μl的洗滌緩沖液(10mM磷酸鹽，350mMNaCl，0.05％Tween，pH 7.4)洗滌該板4次。然后向各孔加入200μl阻斷溶液(PBS-緩沖液，pH 7.4，1％BSA)。用板密封墊覆蓋后4℃孵育過(guò)夜。在兔血清(0-5ng/ml)中稀釋分析物CRP(c反應(yīng)蛋白)并在室溫下孵育30min。在不同的樣品緩沖液以及參照實(shí)施例緩沖液(參見(jiàn)表1)中稀釋生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體C6(靶向CRP)。在各制備物中的最終濃度是4μg/ml。含有CRP的兔血清標(biāo)準(zhǔn)物被含有檢測(cè)抗體的樣品緩沖液以1∶2稀釋。在室溫下將其孵育30min。去除板密封墊并用300μl洗滌緩沖液洗滌該板4次。輕敲該板，使其干燥，徹底去除殘余洗滌緩沖液。向各孔加100μl CRP制劑。用板密封墊覆蓋該板并在室溫下輕微振蕩孵育4h。然后再次洗滌該板。向各孔加入100μl稀釋的NeutrAvidinTM-辣根過(guò)氧化酶軛合物(最終濃度0.05μg/ml在PBS緩沖液中)。在室溫下輕微振蕩孵育該板1h。然后再次洗滌該板。將等體積的ImmunoPureTMBSubstrat的兩種溶液混合，并立即加100μl到各孔中。在室溫下孵育該板直至出現(xiàn)期望的顏色。顏色從澄清變化為亮藍(lán)。在最后的步驟中，向各孔加入150μl 2M H2SO4停止反應(yīng)，用ELISA板讀數(shù)器(Molecular設(shè)備)在450nm下閱讀吸光度。圖1畫(huà)出了不同緩沖液對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響。表1顯示該試驗(yàn)的結(jié)果。在表1中非特異性結(jié)合、低親合性結(jié)合及基質(zhì)效應(yīng)的降低在“結(jié)果”一欄中用“+”表示。與參照實(shí)施例緩沖液(″-″)相比，“+”的數(shù)目表示非特異性結(jié)合、低親合性結(jié)合及基質(zhì)效應(yīng)降低的數(shù)量。圖1顯示與CRP結(jié)合的檢測(cè)抗體C6的數(shù)量，在450nm下吸光度對(duì)CRP的濃度[ng/ml]作圖。樣品緩沖液I顯示出最佳靈敏度。參照緩沖液的低靈敏度由強(qiáng)烈的基質(zhì)效應(yīng)造成。
實(shí)施例2降低多克隆檢測(cè)抗體的非特異性結(jié)合 接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，向微孔板(C8 StarWell Module，NUNC)的各孔中加入250μl稀釋的捕獲抗體P3(多克隆兔抗蛋白酶，自有制劑，最終濃度1g/ml在PBS-緩沖液中)并用板密封墊覆蓋。在室溫下孵育該板4小時(shí)。去除密封墊后，以每孔300μl的洗滌緩沖液(10mM磷酸鹽，350mM NaCl，0.05％Tween，pH 7.4)洗滌該板4次。然后向各孔加入200u l阻斷溶液(PBS-緩沖液，pH 7.4，1％BSA)。再次用密封墊覆蓋后4℃孵育過(guò)夜。分別在參照實(shí)施例緩沖液I I或樣品緩沖液I(參見(jiàn)表1)中稀釋生物素標(biāo)記的多克隆檢測(cè)抗體P2(多克隆兔抗蛋白酶，自有制劑)(在各制劑中的最終濃度為10μg/ml)，并加入各孔(250μl每孔；五倍的重復(fù)實(shí)驗(yàn))。在室溫下孵育該板2h。去除板密封墊并用300μl洗滌緩沖液洗滌4次。輕敲該板，使其干燥，徹底去除殘余洗滌緩沖液。向各孔加入250μl稀釋的NeutrAvidinTM-辣根過(guò)氧化酶軛合物(最終濃度0.5μg/ml在PBS緩沖液中)。在室溫下輕微振蕩孵育該板1h。然后再次洗滌該板。將等體積的ImmunoPureTMB Substrat的兩種溶液混合，并直接加100μl到各孔中。在室溫下孵育該板直至出現(xiàn)期望的顏色。顏色從澄清變化為亮藍(lán)。在最后的步驟中，向各孔加入150μl 2M H2SO4停止反應(yīng)，用ELISA板讀數(shù)器(Molecular設(shè)備)在450nm下閱讀吸光度。圖2顯示了在由多克隆的檢測(cè)抗體P2的非特異性結(jié)合所引起的高背景信號(hào)下兩種不同緩沖液的影響，所述P2非特異性結(jié)合捕獲抗體P3。圖2表明本發(fā)明的樣品緩沖液I能夠降低背景信號(hào)。在該實(shí)驗(yàn)中未使用分析物。另外使用多克隆血清作為抗體。多克隆血清包含許多不同的抗體，這些抗體均靶向靶蛋白質(zhì)。許多抗體能夠以低或更低的親合性結(jié)合，有些抗體則能以中親合性結(jié)合，而只有一種或少數(shù)抗體能以高親合性結(jié)合。如圖2所示，通過(guò)利用本發(fā)明的緩沖液，可以防止相應(yīng)抗體的低親合性結(jié)合，至少降低中親合性結(jié)合。因此，由于本發(fā)明水溶液的特性，一旦將一種分析物加入這樣的試驗(yàn)中，信噪比將會(huì)提高。
表1該表表明實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果(＝非特異性、低親合性結(jié)合及基質(zhì)效應(yīng)的降低)

權(quán)利要求
1.一種作為用于結(jié)合對(duì)的特異性結(jié)合反應(yīng)的培養(yǎng)基使用的水溶液，其中第一結(jié)合成員識(shí)別其互補(bǔ)的第二結(jié)合成員，該溶液含有a)一種控制pH的緩沖液；b)選自下組的化合物A-由通式I R1-[[CR2R3]p-O]q-R4定義的化合物，其中R1是氫或羥基，各單元中R2獨(dú)立地是氫或羥基，R3是氫、甲基、乙基，R4是氫或烷基，p是2到10的一個(gè)整數(shù)，q是1到100的一個(gè)整數(shù)，附帶條件是該化合物至少攜帶兩個(gè)羥基；-多元醇；-糖類；c)非離子洗滌劑。
2.權(quán)利要求1的水溶液，進(jìn)一步包含一種免疫阻斷非特異性抗體結(jié)合的有效量的蛋白質(zhì)。
3.權(quán)利要求2的水溶液，其中所述蛋白質(zhì)選自牛血清白蛋白，卵清蛋白、酪蛋白、胎牛血清。
4.權(quán)利要求2或3的水溶液，其中所述蛋白質(zhì)的濃度在0.1到2％(w/v)范圍之內(nèi)，優(yōu)選在0.5到1.5％(w/v)范圍內(nèi)。
5.權(quán)利要求1到4的任一項(xiàng)的水溶液，其中所述溶液包含選自NaCl、KCl、NH4Cl的鹽。
6.權(quán)利要求1到5的任一項(xiàng)的水溶液，其中所述溶液具有100mM到1.5M的離子強(qiáng)度，優(yōu)選200mM到1M，更優(yōu)選200mM到800mM，進(jìn)一步更優(yōu)選200mM到600mM，最優(yōu)選250mM到500mM。
7.權(quán)利要求1到6的任一項(xiàng)的水溶液，其中所述緩沖液選自Tris(三(羥甲基)-氨基甲烷)，Pipes(哌嗪-1，4-雙-2-乙烷磺酸)，Mes(4-嗎啉代乙烷磺酸)，Hepes(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪-乙烷磺酸)，磷酸鹽緩沖液。
8.權(quán)利要求1到7的任一項(xiàng)的水溶液，其中所述化合物A選自下組聚亞烷基二醇，聚丙二醇，丙二醇，聚乙二醇，乙二醇，單糖，雙糖，三糖，蔗糖，甘露糖，海藻糖，多元醇，甘油和其混合物。
9.權(quán)利要求1到8的任一項(xiàng)的水溶液，其中所述化合物A的濃度在0.5到25％(v/v)范圍之內(nèi)，優(yōu)選在2.0到20％(v/v)范圍內(nèi)，更優(yōu)選在2到15％(v/v)范圍內(nèi)，進(jìn)一步更優(yōu)選2.0到10％(v/v)范圍內(nèi)，甚至更優(yōu)選2.0到7.0％(v/v)范圍內(nèi)，最優(yōu)選約5％(v/v)。
10.權(quán)利要求1到9的任一項(xiàng)的水溶液，其中所述非離子型洗滌劑為通式化合物，其選自a)具有取代基R1和R2(R1-Ph-R2)的取代的苯基，其中R1是C1-C9烷基，R2是-O-[CH2-CH2-O]a-H基團(tuán)，其中“a”是5到40的一個(gè)整數(shù)，其中R2相對(duì)于R1在對(duì)位、間位或鄰位；b) 其中n、x、y及z都是5到40的整數(shù)，R是脂肪酸殘基。
11.權(quán)利要求1到9的任一項(xiàng)的水溶液，該非離子型洗滌劑選自十二烷基聚(乙二醇醚)m，其中m是5到40的整數(shù)；1-O-n-辛基-β-D-吡喃葡糖苷(n-辛葡糖苷)；烷基酚聚(乙二醇-醚)m，其中m是5到40的整數(shù)，優(yōu)選m＝11(Nonidet P40)；1-O-n-十二烷基-β-D-吡喃葡糖基(1-4)α-D-吡喃葡糖苷；十二烷基聚-(乙二醇醚)m，其中m是5到40的整數(shù)，優(yōu)選m＝23(Brij35；)；聚(氧化乙烯)(20)-脫水山梨醇單脂肪酸酯，優(yōu)選選自聚(氧化乙烯)(20)-脫水山梨醇一油酸(Tween80)，聚(氧化乙烯)(20)-脫水山梨醇單月桂酸(Tween20)，聚(氧化乙烯)(20)-脫水山梨醇單棕櫚酸(Tween40)，聚(氧化乙烯)(20)-脫水山梨醇一硬脂酸)；辛基酚聚(乙二醇醚)m，其中m是5到40的整數(shù)，優(yōu)選m＝10(TritonX-100)。
12.權(quán)利要求1到11的任一項(xiàng)的水溶液，其中所述非離子型洗滌劑的濃度在0.1約1.0％(v/v)范圍之內(nèi)，優(yōu)選在0.15到1.0％(v/v)范圍內(nèi)，更優(yōu)選在0.2約1.0％(v/v)范圍內(nèi)，進(jìn)一步更優(yōu)選0.2到0.8％(v/v)范圍內(nèi)，甚至更優(yōu)選0.25％到0.6％(v/v)范圍內(nèi)，最優(yōu)選約0.25％(v/v)。
13.權(quán)利要求1到12的任一項(xiàng)的水溶液，其中所述非離子型洗滌劑與化合物A的比率為1∶15到1∶25，優(yōu)選約1∶20。
14.權(quán)利要求1到13的任一項(xiàng)的水溶液，其中所述溶液不含有二硫蘇糖醇。
15.權(quán)利要求1到14的任一項(xiàng)的水溶液，其中pH被調(diào)整在5.6到9.6范圍內(nèi)，優(yōu)選6.0到9.0范圍內(nèi)，更優(yōu)選6.5到8.0范圍內(nèi)，最優(yōu)選6.8到7.4范圍內(nèi)。
16.權(quán)利要求1到15的任一項(xiàng)的水溶液，具有降低非特異性結(jié)合、交叉反應(yīng)及基質(zhì)干擾影響的能力。
17.權(quán)利要求1到16的任一項(xiàng)的水溶液，能夠防止KD值達(dá)10-7M的低親合性結(jié)合。
18.權(quán)利要求1到17的任一項(xiàng)的水溶液，能夠防止KD值高至10-7M的低親合性結(jié)合，并將KD值為10-7M到10-8M范圍內(nèi)的中親合性結(jié)合降低至少90％。
19.權(quán)利要求1到18的任一項(xiàng)的水溶液，能夠防止KD值為高至10-7M的低親合性結(jié)合，并將KD值為10-7M到10-9M范圍內(nèi)的中親合性結(jié)合降低至少90％。
20.權(quán)利要求1到19的任一項(xiàng)的水溶液，能夠增強(qiáng)抗體的結(jié)合活性(親合性)，優(yōu)選固定化抗體的結(jié)合活性(親合性)。
21.權(quán)利要求1到20的任一項(xiàng)的水溶液的濃縮物，優(yōu)選2到10倍濃縮物，更優(yōu)選3到5倍濃縮物。
22.權(quán)利要求1到20的任一項(xiàng)的水溶液作為用于結(jié)合對(duì)的結(jié)合反應(yīng)的培養(yǎng)基的用途，其中第一結(jié)合成員特異性識(shí)別并結(jié)合其互補(bǔ)的第二結(jié)合成員。
23.權(quán)利要求1到20的任一項(xiàng)的水溶液用作抗體抗原結(jié)合反應(yīng)的培養(yǎng)基的用途。
24.權(quán)利要求1到20的任一項(xiàng)的水溶液用作受體配體結(jié)合反應(yīng)的培養(yǎng)基的用途。
25.權(quán)利要求1到20的任一項(xiàng)的水溶液用作樣品及試劑優(yōu)選配體、受體、抗原、抗體的稀釋緩沖液或用作洗滌緩沖液的用途。
26.一種在結(jié)合對(duì)的特異性結(jié)合反應(yīng)過(guò)程中降低非特異性結(jié)合和/或交叉反應(yīng)和/或基質(zhì)干擾影響的方法，其中第一結(jié)合成員識(shí)別其互補(bǔ)的第二結(jié)合成員，所述方法包括利用權(quán)利要求1到20的水溶液作為該特異性結(jié)合反應(yīng)的培養(yǎng)基。
27一種通過(guò)免疫測(cè)定至少一種待測(cè)分析物的檢測(cè)試劑盒，其中待測(cè)分析物是結(jié)合成員對(duì)的第一結(jié)合成員，其中該第一結(jié)合成員特異性結(jié)合其互補(bǔ)的結(jié)合成員，該試劑盒包含a)含有權(quán)利要求1到20的任一項(xiàng)的緩沖液的容器；b)在其上固定有所述互補(bǔ)結(jié)合成員以捕獲分析物的載體；以及c)任選地，能夠免疫識(shí)別與互補(bǔ)結(jié)合成員結(jié)合的分析物的試劑，其中所述試劑軛合一種檢測(cè)手段；以及d)任選地，能與所述檢測(cè)手段反應(yīng)以產(chǎn)生可檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物的試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種作為用于結(jié)合對(duì)的特異性結(jié)合反應(yīng)培養(yǎng)基使用的水溶液，其中第一結(jié)合成員識(shí)別其互補(bǔ)第二結(jié)合成員，該溶液含有a)一種控制pH的緩沖液；b)選自下述基團(tuán)的化合物A由通式IR
文檔編號(hào)G01N33/53GK1922487SQ200480042127
公開(kāi)日2007年2月28日 申請(qǐng)日期2004年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月26日
發(fā)明者P·勞赫, T·波利夫克, A·策爾默 申請(qǐng)人:康多爾生物技術(shù)有限公司