專利名稱：一種堿性橙Ⅱ人工抗原的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種堿性橙II人工抗原的合成方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
堿性橙II，英文名Basic Orange II，CAS =532-82-1,化學(xué)名為4_苯基偶 氮-1，3-苯二胺鹽酸鹽。堿性橙II是一種偶氮類堿性染料，為致癌物，禁止作為食品添加劑 使用，主要用于紡織品、皮革制品及木制品的染色。根據(jù)美國衛(wèi)生研究所(NIH)化學(xué)品健康 與安全數(shù)據(jù)庫資料表明過量攝取、吸入以及皮膚接觸該物質(zhì)均會造成急性和慢性的中毒 傷害?？赡芴砑拥氖称奉悇e為腐皮。現(xiàn)有的儀器檢測法很難實現(xiàn)對堿性橙II的免疫檢測， 未見相關(guān)免疫檢測方法的報道。為了彌補這一空白，設(shè)計了以對氨基苯丁酸及間苯二胺為 原料，通過重氮化法制備人工半抗原，用碳二亞胺法合成堿性橙II免疫檢測的完全抗原。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種堿性橙II人工抗原的合成方法。所制備的產(chǎn)品用于堿性 橙II的免疫分析方法研究，為今后人們的研究提供了必需的人工抗原。本發(fā)明的技術(shù)方案一種堿性橙II人工抗原的合成方法，以對氨基苯丁酸及間苯 二胺為原料，通過重氮化法制備人工半抗原，用碳二亞胺法將人工半抗原與載體蛋白牛血 清白蛋白BSA偶聯(lián)，用分光光度法測定偶聯(lián)物的偶聯(lián)比，制得堿性橙II人工抗原，步驟為
(1)人工半抗原的制備
A液將50mg對氨基苯丁酸溶于2mL無水乙醇，調(diào)pH=l 2，加亞硝酸鈉溶液，直到反 應(yīng)液取樣使淀粉碘化鉀試紙變藍(lán)，繼續(xù)反應(yīng)lh。B液間苯二胺35mg溶于2mL無水乙醇，制得B液。將A液逐滴加入B液中，反應(yīng)過程保持pH 8 9，反應(yīng)池制得堿性橙II - 丁酸人 工半抗原。(2)人工抗原的制備
C液堿性橙II -丁酸人工半抗原8mg，6 mg碳二亞胺(EDC)Jmg N-N琥珀酰酐(NHS) 溶于2 mL磷酸鹽緩沖液PBS (0. 01M)中，磁力攪拌3 h。D液20mg BSA溶于0. 05M pH 9. 6碳酸鹽緩沖液中，4°C下保存待用。冰浴條件下將C液逐滴加入D液中，然后置4°C下冰孵3h，制即得堿性橙II - 丁 酸-BSA偶聯(lián)物混合液，即是堿性橙II人工抗原混合液。透析袋前處理取IOcm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60°C的去離子水沖洗 3min,保存在4°C去離子水中備用。將堿性橙II - 丁酸-BSA偶聯(lián)物混合液移入透析袋中，用每次2L的0. OlM的PBS 溶液透析2次，再用每次2L的去離子水透析2次，共透析3天。最后冷凍干燥透析袋中的 液體制成粉末，制得到堿性橙II - 丁酸-BSA偶聯(lián)物，即是堿性橙II人工抗原。(3)堿性橙II人工抗原的鑒定堿性橙II人工抗原采用分光光度法鑒定其偶聯(lián)結(jié)果，利用標(biāo)準(zhǔn)蛋白得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算其偶聯(lián)比。偶聯(lián)比測定是估算偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子的比率(偶聯(lián)比率)的方法，雖然 測定方法種類很多，但都是依據(jù)檢測偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子含量(或相對含量)的原理 建立起來的。分光光度法是利用物質(zhì)對光的吸收與其濃度呈比例關(guān)系的原理分別測定被偶 聯(lián)的兩種分子濃度.在大分子與小分子偶聯(lián)物中，兩種分子均有各自不同的紫外掃描光譜， 并表現(xiàn)出光譜圖迭加的性質(zhì)。偶聯(lián)物蛋白濃度測定配制濃度為0，40，60，80，100 μ g · mL—1的牛血清白蛋白溶 液1. 5mL，加入5mL考馬斯亮藍(lán)染色液，立即混勻，30°C水浴溫?zé)?min，每個濃度做平行樣. 在595nm處測吸光值，繪制蛋白濃度與吸光值的關(guān)系曲線。將抗原溶液按一定比例稀釋，在 595nm處測定抗原溶液的吸光值，從曲線上得到抗原溶液的相應(yīng)的蛋白濃度。摩爾吸收系數(shù)ε 配制堿性橙II濃度為0，10,20,30 μ g · mL—1的20%乙醇溶液， 通過紫外掃描可知堿性橙II的最大吸收波長為391nm，在391nm處測吸光值，每個濃度做平 行樣.摩爾吸光系數(shù)計算為ε =吸光值/摩爾濃度。偶聯(lián)比測定配制200 μ g · πιΓ1牛血清白蛋白的20%乙醇 溶液，將偶聯(lián)產(chǎn)物用20%乙醇稀釋到200 μ g · πι Λ在391nm處測吸 光值，以20%乙醇為空白，測出的吸光值為A1, A2,則偶聯(lián)比率r為 r = [(4 - 4 )/>F(200 χ ΙΟ"3/66200}.其中 ε 為摩爾吸光系數(shù)(L · !^0,66200 為牛血清 白蛋白分子量，200X 10_3為牛血清白蛋白濃度(μ g · mL—1)。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明成功合成了堿性橙II的人工抗原，合成步驟簡潔，有 效，可完全用于免疫分析中，為以后人們的研究提供了方便的途徑，可以滿足國內(nèi)對其研究 的需要。


圖1堿性橙II人工半抗原液質(zhì)鑒定圖。圖2堿性橙II人工抗原制備前后的紫外掃描圖。圖3利用間接ELISA方法測得的堿性橙II標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。
具體實施例方式(1)人工半抗原的制備
A液將50mg對氨基苯丁酸溶于2mL無水乙醇，調(diào)pH=l 2，加亞硝酸鈉直到使淀粉碘 化鉀試紙變藍(lán)，反應(yīng)Ih。B液間苯二胺35mg溶于2mL無水乙醇，制得B液。將A液逐滴加入B液中，反應(yīng)過程保持pH 8 9，反應(yīng)池制得人工半抗原。(2)完全抗原的制備
C液人工半抗原8 mg，6 mg EDC, 4mg NHS溶于2 mL PBS (0· 01M)中，磁力攪拌3 h。D液20mg BSA溶于0. 05M pH 9. 6碳酸鹽緩沖液中，4°C下保存待用。冰浴條件下將C液逐滴加入D液中，然后置4°C下冰孵3h，即得人工抗原混合液。透析袋前處理取IOcm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60°C的去離子水沖洗 3min，保存在4°C去離子水中備用。
將人工抗原混合液移入透析袋中，用2X 2L的0. OlM的PBS溶液和2X 2L的去離 子水透析3天。最后冷凍干燥透析袋中的液體制成粉末，即得到人工抗原。(3)堿性橙II人工抗原的鑒定
偶聯(lián)比測定是估算偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子的比率(偶聯(lián)比率)的方法，雖然測定 方法種類很多，但都是依據(jù)檢測偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子含量(或相對含量)的原理建立 起來的。分光光度法是利用物質(zhì)對光的吸收與其濃度呈比例關(guān)系的原理分別測定被偶聯(lián)的 兩種分子濃度.在大分子與小分子偶聯(lián)物中，兩種分子均有各自不同的紫外掃描光譜，并表 現(xiàn)出光譜圖迭加的性質(zhì)。偶聯(lián)物蛋白濃度測定配制濃度為0，40，60，80，100 μ g-mL"1的牛血清蛋白溶液 1. 5ml，加入5ml考馬斯亮藍(lán)染色液，立即混勻，30°C水浴溫?zé)?分鐘，每個濃度做平行樣. 在595nm處測吸光值，繪制蛋白濃度與吸光值的關(guān)系曲線。將抗原溶液按一定比例稀釋，在 595nm處測定抗原溶液的吸光值，從曲線上得到抗原溶液的相應(yīng)的蛋白濃度，本實施例計算 得抗原溶液的蛋白濃度為4. 2mg · mL—1。摩爾吸收系數(shù)ε 配制堿性橙濃度為0，10，20，30 μ gmr1的20%乙醇溶液，通過 紫外掃描可知堿性橙的最大吸收波長為391nm，在391nm處測吸光值，每個濃度做平行樣. 摩爾吸光系數(shù)計算為ε =吸光值/摩爾濃度。本實施例計算得ε =10538. 9 ΜπιοΓ1。偶聯(lián)比測定配制200 μ g-mL"1牛血清白蛋白的20%乙醇溶液，將偶聯(lián)產(chǎn)物用20% 乙醇稀釋到200 μ g'mL—1，在391nm處測吸光值，以20%乙醇為空白，測出的吸光值為A1, A2,
則偶聯(lián)比率r為r = [(J1 -為)/ε]/(200 χ ΙΟ—3/66200 ,本實施例計算得r ^ 11.2。其中ε為摩爾吸光系數(shù)(1^111011,66200為牛血清蛋白的分子量，200Χ10_3為牛 血清蛋白濃度(ygmr1)
我們的試驗結(jié)果表明我們制得堿性橙II - 丁酸-BSA偶聯(lián)物產(chǎn)生了針對堿性橙II很好 的抗體，相關(guān)實驗結(jié)果數(shù)據(jù)見表1和圖3。表1不同兔子抗血清的效價
免疫原血清編碼效價工作濃度包被原濃度抗血清稀釋濃度1號1號兔子抗血清320001:40001:80002號2號兔子抗血清160001:20001:4000
權(quán)利要求
1. 一種堿性橙II人工抗原的合成方法，其特征在于以對氨基苯丁酸及間苯二胺為原 料，通過重氮化法制備人工半抗原，用碳二亞胺法將人工半抗原與載體蛋白牛血清白蛋白 BSA偶聯(lián)，用分光光度法測定偶聯(lián)物的偶聯(lián)比，制得堿性橙II人工抗原，步驟為(1)人工半抗原的制備A液將50mg對氨基苯丁酸溶于2mL無水乙醇，調(diào)pH 1 2，加亞硝酸鈉溶液，直到反 應(yīng)液取樣使淀粉碘化鉀試紙變藍(lán)，繼續(xù)反應(yīng)Ih ；B液間苯二胺35mg溶于2mL無水乙醇，制得B液；將A液逐滴加入B液中，反應(yīng)過程保持pH 8 9，反應(yīng)池制得堿性橙II - 丁酸人工半 抗原；(2)人工抗原的制備C液堿性橙II - 丁酸人工半抗原8mg，6 mg碳二亞胺，^ig N-N琥珀酰酐NHS溶于2 mL 0. OlM磷酸鹽緩沖液PBS中，磁力攪拌3 h ；D液20mg BSA溶于0. 05M pH 9. 6碳酸鹽緩沖液中，4°C下保存待用；冰浴條件下將C液逐滴加入D液中，然后置4°C下冰孵3h，制得堿性橙II - 丁酸-BSA 偶聯(lián)物混合液，即是堿性橙II人工抗原混合液；透析袋前處理取IOcm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60°C的去離子水沖洗 3min，保存在4°C去離子水中備用；將堿性橙II - 丁酸-BSA偶聯(lián)物混合液移入透析袋中，用每次2L的0. OlM的PBS溶液 透析2次，再用每次2L的去離子水透析2次，共透析3天；最后冷凍干燥透析袋中的液體制 成粉末，制得到堿性橙II - 丁酸-BSA偶聯(lián)物，即是堿性橙II人工抗原；(3)人工抗原的鑒定堿性橙II人工抗原采用分光光度法鑒定其偶聯(lián)結(jié)果，利用標(biāo)準(zhǔn)蛋 白得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算其偶聯(lián)比。
全文摘要
一種堿性橙Ⅱ人工抗原的合成方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以對氨基苯丁酸及間苯二胺為原料，通過重氮化法制備堿性橙Ⅱ-丁酸人工半抗原，用碳二亞胺法將其與載體蛋白牛血清白蛋白BSA偶聯(lián)，制得堿性橙Ⅱ-丁酸-BSA偶聯(lián)物，用分光光度法測定偶聯(lián)物的偶聯(lián)比。試驗結(jié)果表明我們制得堿性橙Ⅱ-丁酸-BSA偶聯(lián)物產(chǎn)生了針對堿性橙Ⅱ很好的抗體，即是堿性橙Ⅱ人工抗原。本發(fā)明成功合成了堿性橙Ⅱ人工抗原，合成步驟簡潔，有效，完全可用于免疫分析當(dāng)中，為以后人們的研究提供了必需的堿性橙Ⅱ人工抗原，可以滿足國內(nèi)對其研究的需要。
文檔編號C07K14/76GK102120765SQ201010600988
公開日2011年7月13日 申請日期2010年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月23日
發(fā)明者劉微波, 匡華, 宋珊珊, 林菲, 王利兵, 胥傳來, 趙書閣, 趙媛 申請人:江南大學(xué)