專利名稱：一種日本腦炎顆粒疫苗及其制備方法和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種嵌合表達日本腦炎病毒多表位抗原的病毒樣顆粒疫苗及其制備方法 和應用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，專用于人和易感動物的日本腦炎的免疫預防。
背景技術(shù)：
H 1 ^(Japanese Encephalitis, JE) : 一 禾中由 H ^ H iit #(Japanese Encephalitis Virus, JEV)引起的人畜共患蟲媒傳染病，人和馬呈現(xiàn)腦炎癥狀，豬主要表 現(xiàn)為繁殖障礙，其它動物大多隱性感染。該病主要發(fā)生于東南亞地區(qū)，我國是日本腦炎重要 疫區(qū)之一，每年人類的發(fā)病數(shù)僅次于印度。近年來，隨著全球氣候變暖以及生態(tài)環(huán)境變化導 致日本腦炎分布范圍擴大、流行時間變長，危害程度日益增強。日本腦炎病毒雖然存在5個基因型，但該病毒只有一個血清型。大量的研究表明 體液免疫尤其是病原特異性中和抗體水平與人和動物的抗日本腦炎感染水平高度一致，細 胞免疫水平?jīng)Q定了感染機體對該病毒的清除能力。接種疫苗是疫區(qū)內(nèi)人和易感動物預防日本腦炎的重要措施之一。商品化應用的日 本腦炎疫苗有兩種，一種為日本腦炎滅活疫苗，早期為鼠腦純化病毒滅活疫苗，少數(shù)人應 用后有負反應，近來改用中國倉鼠腎細胞(BHK21)或非洲綠猴腎細胞(VERO)為生產(chǎn)基質(zhì)， 一般需要接種2至3次；另一種為日本腦炎弱毒活疫苗，由我國生物制品檢定所研制，毒株 為JEV SA14-14-2，該疫苗一次免疫接種即可產(chǎn)生較好的免疫保護效果，但由于日本腦炎疫 苗弱毒存在潛在毒力反強風險，世界衛(wèi)生組織至今沒有批準該疫苗在全球廣泛應用。基因工程亞單位疫苗由于安全性好、受母源抗體干擾小、能夠配套試劑盒區(qū)分疫 苗免疫和野毒感染等優(yōu)點具有廣闊的應用前景。然而基因工程亞單位抗原免疫原性相對較 弱、抗體應答慢，為了更好的激發(fā)機體的免疫系統(tǒng)，使其對日本腦炎病毒有足夠的抵抗力， 有必要尋求安全高效的方法提高基因工程亞單位疫苗的免疫效果。病毒樣顆粒(Virus-like particle, VLP)是由病毒結(jié)構(gòu)蛋白自行裝配而成的高 度結(jié)構(gòu)化的蛋白顆粒，缺乏病毒核酸，無感染性。一些VLP表面能夠重復高密度展示外源抗 原表位，從而誘導針對外源抗原表位高效免疫應答。近來的研究表明，一些VLP能有效通過 MHC I類和MHC II類途徑遞呈抗原，誘導CTL細胞應答，激發(fā)Thl和Th2型免疫反應，一些 病毒的VLP可誘導樹突狀細胞和單核巨嗜細胞群在體內(nèi)外的成熟和細胞因子的表達。因 此，應用嵌合病毒樣顆?？乖苽湟呙缇哂邪踩咝У奶攸c。人類乙肝病毒的核心抗原(HBc)在病毒感染過程能夠自發(fā)組裝成病毒樣顆粒，包 裹病毒的核酸。HBc自發(fā)形成的病毒樣顆粒有兩種大小，分別為由180個和240和單體核心 抗原組成的二十面體。HBc全長為183 Aa，其中75-82Aa為抗原顯現(xiàn)區(qū)，展示病毒樣粒子表 面，構(gòu)成中間穗狀區(qū)。HBc的C末端39個Aa富含精氨酸，具有結(jié)合包裝病毒核酸的功能，去 除后不影響HBc形成病毒樣顆粒。截斷的HBc (l_149Aa)能在大腸桿菌中高效表達，并自 主裝配成病毒樣顆粒，HBc (l-149Aa)HBc的中間穗狀區(qū)和截斷的C末段都暴露在病毒粒子 的表面，這些區(qū)域可融合表達外源的抗原表位[Birkett A, Lyons K, Schmidt A, et al. A modified hepatitis B virus core particle containing multiple epitopes of thePlasmodium falciparum circumsporozoite protein provides a highly immunogenic malaria vaccine in preclinical analyses in rodent and primate hosts. Infect Immun 2002; 70 (12) : 6860 - 6870. [PubMed: 12438363]。一些融合外源 B 細胞抗原表位或 T細胞抗原表位的HBc仍可組裝成嵌合VLP，誘導免疫動物產(chǎn)生強烈的免疫應答，尤其是在 HBc分子中間的穗狀區(qū)插入的外源抗原表位誘導的免疫效果最佳。作為一種新型的抗原表 位遞呈系統(tǒng)，HBc-VLP已被成功用于艾滋病、丙型肝炎以及瘧疾新型疫苗的研制，有的已進 入臨床二期研究。
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明的目的是提供一種新型的日本腦炎顆粒疫苗。該疫苗安全高效，不含感染性病 毒核酸，抗原純度高，能夠快速誘導接種機體產(chǎn)生抗日本腦炎病毒感染的保護性免疫應答。 用于人和易感動物對日本腦炎的免疫預防，安全、高效的預防日本腦炎的發(fā)生。技術(shù)方案
本發(fā)明提供了一種用于預防日本腦炎的病毒樣顆粒疫苗，該疫苗的抗原成份為嵌合 JEV中和抗原表位和CTL抗原表位的乙肝病毒核心抗原自主裝配的病毒樣顆粒，通過大腸 桿菌可溶性表達、純化制備。日本腦炎病毒樣顆?？乖蒙睇}水適當稀釋或與免疫佐劑 配伍后制成本發(fā)明所述的日本腦炎顆粒疫苗。有益效果
日本腦炎顆粒疫苗接種小鼠后快速誘導產(chǎn)生病原特異性中和抗體，二免2周后小鼠獲 得對致死劑量日本腦炎病毒攻擊的抵抗力，并顯示出較強的免疫記憶，病原特異性中和抗 體水平顯著升高，100%保護小鼠對日本腦炎強毒的攻擊。


圖1.表達載體PETj8a-VLP-con構(gòu)建示意圖 圖2.表達載體PETj8a-VLP-JEV構(gòu)建示意圖 圖3. HBV核心抗原(A:VLP-con)電鏡照片(X 150，000倍)
圖4嵌合表達日本腦炎病毒表位抗原的病毒樣顆粒(B: VLP-JEV)電鏡照片(X 150，000
倍)
圖5.日本腦炎顆粒疫苗接種小鼠產(chǎn)生的抗日本腦炎病毒EDIII蛋白抗體水平 圖6.日本腦炎顆粒疫苗接種小鼠產(chǎn)生的抗日本腦炎病毒抗體水平 圖7.日本腦炎顆粒疫苗接種小鼠產(chǎn)生的中和抗體水平 圖8.日本腦炎顆粒疫苗接種小鼠的攻毒保護情況。
具體實施例方式本具體實施方式
涉及的實驗方法或步驟，參照《分子克隆實驗指南》(第二版)廣60 頁、672 681頁和822 847頁。實施例1
一、乙肝病毒核心抗原骨架蛋白(HBc-con)原核表達載體PET28a-VLP-C0n的構(gòu)建 參照GenBank數(shù)據(jù)庫中乙肝病毒基因序列(AY707087. 1)人工設計合成乙肝病毒核 心抗原骨架蛋白(HBc-con)編碼基因(其核苷酸序列為kq NO. 3)。與乙肝病毒核心抗原l-149Aa的編碼基因相比，HBc-con編碼基因在231位和238位有2個人工構(gòu)建的酶切位點 BamH I和EcoR I，HBc_con在HBc第78位和79位Aa插入四個氨基酸PEFS ；在乙肝病毒 核心抗原骨架蛋白(HBc-con)編碼基因的兩端分別添加Nco I和)(h0 I位點，以便乙肝病 毒核心抗原骨架蛋白(HBc-con)編碼基因?qū)隤ET-28a載體；乙肝病毒核心抗原骨架蛋白 (HBc-con)編碼基因沒有帶終止密碼子，以便利用PET-28a表達盒下游的his標簽。乙肝病 毒核心抗原骨架蛋白(HBc-con)編碼基因經(jīng)Nco I和Xho I位點導入PET48a，獲得乙肝 病毒核心抗原骨架蛋白(HBc-con)原核表達載體，命名為PET28a-VLP-C0n，測序結(jié)果表明 與設計一致。二、嵌合日本腦炎病毒抗原表位的病毒樣顆?？乖?VLP-JEV)原核表達載體 PET28a-VLP-JEV 的構(gòu)建
設計三對引物，通過重組PCR方法、酶切和連接的方法分別將日本腦炎病毒E蛋 白上的兩個中和抗原表位和一個CTL抗原表位導入HBc骨架蛋白。兩個中和抗原表位 “ 327SYSGSDGPCKI337” [ffu S-C, Lin C-ff. Neutralizing peptide ligands selected from phage-displayed libraries mimic the conformational epitope on domain III of the Japanese encephalitis virus envelope protein. Virus Res 2001；76:59-69.]禾口 "384VVGRGDKQI392 " [Seif, S. Α.，Morita, K.，Matsuo, S.，Hasebe, F. and Igarashi, Α. , Finer mapping of neutralizing epitope (s) on the C-terminal of Japanese encephalitis virus Ε-protein expressed in recombinant Escherichia coli system. Vaccine 1995. 13: 1515-1521.]展示在HBc的抗原中間穗狀區(qū)，即HBc第78位和79 位 Aa 之間，CTL 抗原表位 “6CICYHASVTDI 68“ [Takada, K. , Masaki, H. , Konishi, Ε., Takahashi, M. and Kurane, I. , Definition of an epitope on Japanese encephalitis virus (JEV) envelope protein recognized by JEV-specific murine CD8+ cytotoxic T lymphocytes. Arch Virol 2000. 145: 523-534.]插入 HBc 的 C 末段。PI: CGATCCATGGACATTGACCCTTNco I Mseq NO. 4
P2:5~-TCTGGATCCTCGATTTTGCACGGGCCATCGCTGCCGCTATAGCTCAAGTTATTACCCAC-3' BamH I 見 seq NO. 5
P3: 5‘-ATAGAATTCGTGGTGGGCCGTGGCGATAAACAGATCTCCCCAGCATCTAGG -3 seq N06
P4: CAACTCGAGAACCACAGTAGTTTCCXho I 見 seq NO. 7
P5: CGATCCATGGACATTGACCCTTNco I 見 seq NO. 8
P6: -CAACTCGAGGATATCGGTCACGCTCGCATGATAGCAAACCACAGTAGTTTCC-3' seq NO. 9
Pl 和 P2 引入 JEV 中和抗原表位“ 327SYSGSDGPCKI337，，；見 seq NO. 10 P3 和 P4 引入 JEV 中和抗原表位“384VVGRGDKQI3i32” ；見 seq NOll P5 和 P6 引入 JEV CTL 抗原表位 “6° CYHASVTDI 68”。見 seq NO. 12。所述的PCR 的條件均為 94°C、5min ;94°C、30sec, 50°C、30sec, 72°C、30sec, 30 個 循環(huán)；72°C、7 min。重組基因經(jīng)Nco I和Bio I位點導入ΡΕΤ48ει，獲得嵌合日本腦炎病毒抗原表位 的病毒樣顆粒抗原(VLP-JEV)原核表達載體，命名為PET28a-VLP-JEV，經(jīng)測序驗證正確。
三、日本腦炎顆粒抗原在大腸桿菌中的可溶性表達與純化
將PET28a-VLP-Con和PET28a_VLP_JEV轉(zhuǎn)化大腸桿菌(BL21 DE3 )，將陽性菌株在LB培 養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)至細菌濃度為0D600 ^ 0. 4，然后在18 20°C環(huán)境中用終濃度為0. ImM異 丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達12tTl5h。離心收集菌體，超聲波裂解，將大腸桿菌裂解 液上清12000rpm離心30分鐘后，用終濃度為20%的硫酸胺沉淀顆?？乖?、生理鹽水溶解后 0. 22 μ m過濾，應用kpharose CL-4B分子篩層析純化，獲得顆?？乖?，其氨基酸序列為kq NO. 1、核苷酸序列為kq NO. 2。HBc-con和VLP-JEV能在大腸桿菌中高效可溶性表達，并自 主裝配成病毒樣顆粒(圖1)
四、日本腦炎顆粒疫苗小鼠免疫保護試驗 試驗方案
6周齡BALB/C小鼠，分為5組，每組5只，分別免疫接種生理鹽水稀釋的VLP-Con、 VLP-JEV以及ISA206佐劑乳化VLP-JEV，每只小鼠免疫的顆?？乖烤鶠?0 μ g ；商品疫 苗對照組為豬用日本腦炎弱毒疫苗(武漢科前獸醫(yī)生物制品有限公司)，每只小鼠接種1/10 豬用劑量；空白對照每只小鼠接種100μ L生理鹽水。首免后2周加強免疫一次，各組疫苗 種類與劑量與初免相同。二免后2周免疫小鼠用10倍半數(shù)致死劑量(LD5tl)的日本腦炎強 毒(JEV NJ08株)腦內(nèi)接種攻毒，觀察3周。免疫接種前、首免后1周、二免后1周及攻毒后 1周分別眼眶靜脈采血，分離血清檢測抗體。ELISA抗體的檢測采用純化的重組ED3蛋白為 包被抗原。中和抗體的檢測采用病毒(JEV SA14-14-2)空斑減少試驗，將病毒空斑減少50% 的最大血清稀釋系數(shù)定義為中和抗體效價，每組取3個樣品測定。試驗結(jié)果 ELISA抗體
無佐劑的日本腦炎顆粒疫苗和配伍ISA206佐劑的日本腦炎顆粒疫苗免疫小鼠均產(chǎn)生 了針對重組日本腦炎病毒ED3抗原和日本腦炎病毒的抗體反應(圖2和圖3 )。初次免疫接種 后1周，免疫無佐劑的日本腦炎顆粒疫苗組小鼠產(chǎn)生的日本腦炎抗體水平略高于與ISA206 佐劑的日本腦炎顆粒疫苗，但二免后1周佐劑組日本腦炎抗體水平高于無佐劑組。日本腦 炎顆粒疫苗免疫小鼠產(chǎn)生的針對ED3抗原的抗體水平與日本腦炎商品化疫苗相近，但針對 全病毒的抗體水平顆粒疫苗低于商品化疫苗，推測日本腦炎病毒存在其它的顯性抗原表 位。中和抗體
接種日本腦炎顆粒疫苗和商品化弱毒疫苗小鼠均產(chǎn)生了日本腦炎病毒中和抗體(圖 4)，二免后1周應用ISA206佐劑的日本腦炎顆粒疫苗免疫小鼠的中和抗體滴度為1:40，與 商品化疫苗相近，無佐劑日本腦炎顆粒疫苗組小鼠的中和抗體稍低，為1:20。日本腦炎顆粒 疫苗接種小鼠在攻毒后一周病毒特異中和抗體水平均有顯著提高，表明日本腦炎顆粒疫 苗能誘導較強的免疫記憶反應。攻毒保護
小鼠攻毒保護試驗結(jié)果(圖5)顯示接種ISA206佐劑日本腦炎顆粒疫苗和商品化弱 毒疫苗小鼠用10倍LD5tl的日本腦炎病毒強毒(JEV NJ08株)攻毒后均沒有死亡，100%免 疫保護；無佐劑日本腦炎顆粒疫苗免疫組小鼠的存活率為70%;接種無日本腦炎抗原表位 的顆粒抗原組小鼠全部死亡。日本腦炎顆粒疫苗能夠誘導小鼠產(chǎn)生良好的免疫保護，添加ISA206佐劑日本腦炎顆粒疫苗的免疫保護效果優(yōu)于無佐劑日本腦炎顆粒疫苗，與商品化弱 毒疫苗相似，這與疫苗接種后誘導的日本腦炎特異性中和抗體水平較為一致。
權(quán)利要求
1.一種日本腦炎顆粒疫苗，其特征在于其氨酸酸序列Skq NO. 1。
2.一種日本腦炎顆粒疫苗，其特征在于其核苷酸序列為SeqNO. 2。
3.—種日本腦炎顆粒疫苗的制備方法，其特征在于由日本腦炎病毒兩個中和抗原表位 和一個CTL抗原表位分別通過基因重組技術(shù)展示在乙肝病毒核心抗原l-149Aa的中間穗狀 區(qū)和C末段制備獲得；其具體步驟如下(1)通過重組PCR的方法或全基因合成方法將日本腦炎病毒囊膜蛋白的中和抗原表位 “ 327SYSGSDGPCKI337”和“384VVGRGDKQI392 ”的編碼基因插入乙肝病毒核心抗原l-149Aa的中間 穗狀區(qū)第78位和79位Aa之間，將日本腦炎病毒囊膜蛋白的CTL抗原表位“6° CYHASVTDI 68”的編碼基因插入乙肝病毒核心抗原l_149Aa編碼基因C末段；(2)將上述基因插入原核表達載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導表達，通過westen-Blot鑒 定獲得日本腦炎病毒抗原表位的重組蛋白，通過大腸桿菌裂解上清的電鏡觀察鑒定表達抗 原形成病毒樣顆粒；(3)陽性菌株20°C誘導培養(yǎng)16 18小時，離心收集菌體，用生理鹽水稀釋為10g/L；超 聲波裂解破碎菌體，12000rpm離心10分鐘收集上清液；用濃度為20%的硫酸胺沉淀蛋白， 用0. OlM pH7. 2的PBS溶解沉淀，0. 22Mm濾膜過濾后應用kpharose CL-4B層析柱純化病 毒樣顆?？乖?，其氨基酸序列為NO. 1。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種日本腦炎顆粒疫苗的制備方法，其特征在于所述的嵌合 日本腦炎抗原表位的乙肝病毒核心抗原在大腸桿菌中低溫可溶性表達時能自發(fā)形成病毒 樣顆粒。
5.一種日本腦炎顆粒疫苗的應用，其特征在于將日本腦炎顆粒疫苗用適量生理鹽水稀 釋或與免疫佐劑配伍，用于人或易感動物日本腦炎的免疫預防。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種嵌合表達日本腦炎病毒多表位抗原的病毒樣顆粒疫苗及其制備方法和應用。本發(fā)明涉及的疫苗抗原為嵌合表達日本腦炎病毒中和抗原表位和CTL抗原表位的乙肝病毒核心抗原自發(fā)裝配而成的病毒樣顆粒，通過大腸桿菌可溶性表達、純化制備。日本腦炎病毒樣顆粒抗原用生理鹽水適當稀釋或與免疫佐劑配伍后制成本發(fā)明所述的日本腦炎顆粒疫苗。動物試驗表明，該疫苗安全高效，接種小鼠產(chǎn)生較高水平的日本腦炎病毒中和抗體，100%保護小鼠對日本腦炎強毒的攻擊。
文檔編號C07K14/005GK102127554SQ20101059968
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月22日
發(fā)明者張羽, 曹瑞兵, 陳溥言 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學