專利名稱：殘殺威人工抗原合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明殘殺威人工抗原合成方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。專用于制備特異性識(shí)別化學(xué)農(nóng)藥殘殺威的抗體和研制高效、快速檢測(cè)殘殺威含量的免疫速測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
殘殺威(propoxur)屬于氨基甲酸酯類化學(xué)殺蟲(chóng)劑，由德國(guó)拜耳公司首先開(kāi)發(fā)成功，國(guó)家“七五”引進(jìn)品種。殘殺威制劑主要用于經(jīng)濟(jì)作物害蟲(chóng)防治(如水稻上的螟蟲(chóng)、棉蚜、菜蚜、茶橙癭螨、馬尾松毛蟲(chóng)等)以及消滅家庭及公共場(chǎng)所的各種衛(wèi)生害蟲(chóng)(如蟑螂、淺色庫(kù)蚊、蜚蠊等)，具有殺蟲(chóng)譜廣、殘效長(zhǎng)、殺死率高等特點(diǎn)。殘殺威也是世界衛(wèi)生組織(WHO)批準(zhǔn)并推薦的家庭衛(wèi)生害蟲(chóng)防治藥劑之一。目前國(guó)內(nèi)已經(jīng)有廠家進(jìn)行原藥和制劑大規(guī)模生產(chǎn)并得到很好的推廣。
自20世紀(jì)70年代以來(lái)，由于有機(jī)氯農(nóng)藥受到禁用或限用，以及抗有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑的昆蟲(chóng)品種日益增多，現(xiàn)在國(guó)家已經(jīng)對(duì)一些高毒性如克百威等農(nóng)藥進(jìn)行禁用，因而殘殺威等較新興的氨基甲酸酯類農(nóng)藥的用量必然逐年增加，這就使得這類農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)倍受關(guān)注。殘殺威雖然相對(duì)已經(jīng)被禁用的農(nóng)藥來(lái)說(shuō)優(yōu)點(diǎn)明顯，但殘殺威的大量使用及其具有的殘留期較長(zhǎng)、對(duì)蜜蜂等有益生物高毒等特點(diǎn)，國(guó)外對(duì)殘殺威的允許殘留量做了規(guī)定水果、蔬菜(除馬鈴薯與柑橘外)3毫克/千克，萵苣5毫克/千克，結(jié)球甘藍(lán)4毫克/千克，其他植物性食品0.5毫克/千克(參見(jiàn)潘以樓主編的《農(nóng)藥應(yīng)用表解》)。這些都使得殘殺威殘留量的檢測(cè)監(jiān)控顯得十分迫切和必要。
國(guó)內(nèi)外對(duì)殘殺威檢測(cè)方法進(jìn)行了眾多的研究。文獻(xiàn)報(bào)道的對(duì)殘殺威有效成分檢測(cè)方法有直接定胺法、氣相色譜法、高效液相色譜法、薄層層析法等。但只靠這些傳統(tǒng)的檢測(cè)方法已經(jīng)越來(lái)越不能滿足農(nóng)藥殘留大批量、快速檢測(cè)工作的需求。
1971年Ercegovich等首次用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法對(duì)DDT和馬拉硫磷進(jìn)行了殘留分析，這是免疫化學(xué)技術(shù)首次用于農(nóng)藥殘留分析。20世紀(jì)80年代后，免疫化學(xué)分析技術(shù)已成為優(yōu)先研究、開(kāi)發(fā)和利用的農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)，美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)將免疫分析方法與GC、HPLC方法一起列為化學(xué)農(nóng)藥殘留分析的三大支柱技術(shù)，是21世紀(jì)最具競(jìng)爭(zhēng)性和挑戰(zhàn)性的超微量檢測(cè)技術(shù)。利用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)方法不僅可以定性而且可以定量檢測(cè)樣品中的農(nóng)藥殘留，這種分析方法對(duì)儀器設(shè)備要求不高，快速簡(jiǎn)便，一般無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理，靈敏度高，特異性強(qiáng)。而且價(jià)格便宜，易于標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化和適于大容量樣本分析等優(yōu)點(diǎn)。已有文獻(xiàn)報(bào)道了60多種殺菌劑、殺蟲(chóng)劑、除草劑等的ELISA檢測(cè)方法的建立，其檢測(cè)水平可達(dá)納克(ng)甚至皮克(pg)。國(guó)外一些公司已開(kāi)發(fā)出商品化的農(nóng)藥殘留檢測(cè)試劑盒，如Immunosystems Inc.的Res-I-Mune試劑盒，NeoGen公司的Agriscreen Tickets試劑盒，Millipore公司的EnviroGard試劑盒，Environmental Diagnostics公司的EZ-Screen試劑盒等。我國(guó)在這方面起步較晚，只是90年代后才有越來(lái)越多的單位和研究人員重視并從事農(nóng)藥免疫速測(cè)技術(shù)研究，如劉曙照等已經(jīng)先后報(bào)道了氨基甲酸酯類殺蟲(chóng)劑克百威和甲萘威的免疫檢測(cè)技術(shù)研究等等。2001年，Maria J.Moreno等人成功報(bào)道了識(shí)別殘殺威的單克隆抗體的制備。殘殺威抗原與抗體的制備在國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)報(bào)道，半抗原結(jié)構(gòu)改造與抗原制備是免疫速測(cè)研究技術(shù)的難點(diǎn)和關(guān)鍵所在。

發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問(wèn)題正在使用的化學(xué)農(nóng)藥殘殺威無(wú)法與蛋白質(zhì)(如牛血清白蛋白等)分子直接偶聯(lián)，而殘殺威自身又無(wú)法制備出特異性識(shí)別殘殺威的抗體，本發(fā)明的目的就是解決這樣的問(wèn)題。提供殘殺威人工抗原合成方法，能合成有效的殘殺威抗原，并經(jīng)對(duì)動(dòng)物的免疫可生產(chǎn)出特異性識(shí)別殘殺威農(nóng)藥的抗體。
技術(shù)方案殘殺威抗原合成，包括以下1)鄰-異丙氧基苯氧甲酰氯(分子式C10H11O3Cl，結(jié)構(gòu)式 )的合成稱取雙光氣27.1g，小心加入0.138g活性碳，37℃水浴加熱，用50.0g甲苯收集光氣，甲苯液在24℃水浴中磁力攪拌，尾氣通入堿液，光氣劇毒，且氣味難聞，應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，至雙光氣反應(yīng)完，甲苯相增重24.0g，得34％光氣/甲苯溶液；稱取鄰-異丙氧基苯酚11.056g(約70.554mmol)，溶進(jìn)100ml 10％的NaOH水溶液，40℃水浴加熱磁力攪拌1小時(shí)，冷卻到室溫后緩慢加入上光氣/甲苯溶液，40分鐘加完，開(kāi)始計(jì)時(shí)，4小時(shí)后結(jié)束反應(yīng)。取有機(jī)相減壓蒸餾得20.270g黃色油狀物。GC法測(cè)定目標(biāo)物的含量，5℃冰箱存放備用。
2)γ-(鄰-異丙氧基苯氧甲酰)氨基丁酸(H殘)(分子式C14H19O5N，結(jié)構(gòu)式 )的合成稱取間-甲基苯氧甲酰氯5.105g(約12.1mmol)，溶進(jìn)4ml 4M NaOH溶液，置5℃冰箱冷卻，得A液；稱取γ-丁胺酸2.102g(約22.3mmol)，溶進(jìn)4ml 4M NaOH溶液，置5℃冰箱冷卻，得B液；另取3ml 4MNaOH溶液，置5℃冰箱冷卻，得C液。將A液與C液均分成5等份，每間隔5～10分鐘向B液中同時(shí)各加入1份，整個(gè)反應(yīng)置冰水中，磁力攪拌下進(jìn)行。加樣全部完成開(kāi)始記時(shí)，3小時(shí)后結(jié)束反應(yīng)。用濃鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)終液的pH值為4，目標(biāo)產(chǎn)物用乙酸乙酯(3個(gè)50ml份)抽提；乙酸乙酯相用稀HCl洗滌數(shù)次，用1M NaHCO3溶液(2個(gè)50ml份)抽提；水相再用濃鹽酸酸化，乙酸乙酯再抽提；無(wú)水Na2SO4干燥，所得物減壓蒸餾濃縮至13.8ml，向濃縮液中逐漸加入31ml正己烷，白色結(jié)晶物析出，過(guò)濾。結(jié)晶物經(jīng)低溫干燥得4.771g；再經(jīng)過(guò)甲苯與去離子水5℃下洗滌，低溫干燥后稱重得到H殘較純品3.626g，回收率為76％。
3)殘殺威人工抗原(H殘-OVA、H殘-BSA)的合成稱取H殘結(jié)晶物60mg和NHS 30mg，用600μl DMF溶解于反應(yīng)裝置中；稱取55mg DCC，用600μl DMF溶解；將DCC/DMF溶液滴加到上反應(yīng)裝置中。反應(yīng)在磁力攪拌下室內(nèi)溫度進(jìn)行5小時(shí)。反應(yīng)終液置5℃冰箱冷卻2小時(shí)以上，經(jīng)1.2萬(wàn)rpm離心5分鐘，取上清活潑酯液并將其均分為2等份，分別緩慢滴加到3.0ml 10mg/ml的BSA溶液與3.0ml 10mg/ml的OVA溶液中反應(yīng)，反應(yīng)緩沖液為0.2M pH8.0的PB液。反應(yīng)在磁力攪拌下室內(nèi)溫度進(jìn)行4小時(shí)(從加樣結(jié)束開(kāi)始記時(shí))。將反應(yīng)液置透析袋內(nèi)，于0.2M pH6.8的PB中4℃攪拌透析，每4小時(shí)換一次透析液，共透析60小時(shí)。透析結(jié)束后將透析袋中的白色乳狀液裝于若干1ml離心管中，于-20℃冰箱中存放備用。所制備的抗原有效期限為3年。
上述抗原用常規(guī)免疫方案即可制備得到特異性識(shí)別殘殺威的抗體。
有益效果 本發(fā)明與現(xiàn)有方法相比，其優(yōu)點(diǎn)和積極效果表現(xiàn)在(1)抗原實(shí)用性強(qiáng)殘殺威抗原合成與抗體制備技術(shù)具有重要的使用價(jià)值和實(shí)際意義。用上述方法能夠合成具有活性基團(tuán)(-COOH)的殘殺威農(nóng)藥類似結(jié)構(gòu)，有效地制備出殘殺威抗原，從而生產(chǎn)出特異性識(shí)別殘殺威農(nóng)藥的抗體，為殘殺威農(nóng)藥免疫速測(cè)試劑盒的研制解決了一個(gè)技術(shù)難點(diǎn)，為殘殺威農(nóng)藥高效快速簡(jiǎn)便的殘留量分析開(kāi)山辟路，必將迅速推動(dòng)我國(guó)殘殺威免疫速測(cè)試劑盒的出現(xiàn)。
(2)抗原穩(wěn)定性好此法合成的殘殺威抗原具有較好的穩(wěn)定性，5℃環(huán)境下4個(gè)月不影響其免疫原性。-20℃冰箱至少可以存放3年。
(3)抗原制備技術(shù)簡(jiǎn)便可行抗原的整個(gè)制備過(guò)程無(wú)需要特別的儀器設(shè)備，成本低廉，容易工廠化規(guī)模生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1殘殺威抗原免疫新西蘭白兔將制備好的抗原H殘-OVA、H殘-BSA分別用來(lái)免疫2kg以上的新西蘭白兔。平均每次抗原用量約3mg(以蛋白質(zhì)的量計(jì))。首次免疫采用由等體積的弗氏完全佐劑乳化的免疫原，于兔皮下多點(diǎn)注射；首免后間隔3周、以后每隔2周用由等體積的弗氏不完全佐劑乳化的免疫原，于兔背部皮下或皮內(nèi)多點(diǎn)以及后腿肌肉注射。從第四次開(kāi)始，每次免疫后一周，兔耳緣靜脈采血測(cè)效價(jià)(瓊脂糖雙擴(kuò)散法或間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法)。待效價(jià)達(dá)到一定程度(以陽(yáng)性結(jié)果所用抗血清的最大稀釋倍數(shù)表示，瓊脂糖雙擴(kuò)散法效價(jià)達(dá)32以上，間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法效價(jià)達(dá)104以上)后，兔心臟采血至其死亡。以此方法制備得高效價(jià)的殘殺威抗體。
實(shí)施例2殘殺威農(nóng)藥競(jìng)爭(zhēng)性與殘殺威抗體結(jié)合采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，對(duì)檢測(cè)曲線進(jìn)行初步探索。方法如下包被用碳酸鹽緩沖液將包被抗原稀釋一定的倍數(shù)，每孔加100μl到96孔酶聯(lián)微量分析板上，至5℃環(huán)境放置過(guò)夜。
洗滌PBS洗滌3次封閉PBS稀釋OVA至1％，200μl/孔，37℃1小時(shí)。
洗滌PBS洗滌3次加樣將農(nóng)藥以10倍逐級(jí)稀釋(殘殺威原藥先用丙酮助溶后再用PBS稀釋)，與含0.5％OVA的PBS稀釋到一定倍數(shù)的相應(yīng)抗血清溶液等體積(斡旋震蕩30秒，充分混勻)室溫(36℃)反應(yīng)0.5小時(shí)后，加入到酶聯(lián)板上100μl/孔(相當(dāng)于農(nóng)藥與抗血清溶液各50μl/孔)，371小時(shí)。
洗滌PBS洗滌4次加酶標(biāo)二抗含1％OVA的PBS溶液稀釋HRP-羊抗兔IgG，100μl/孔，37℃1小時(shí)。
洗滌PBS洗滌8次顯色TMB底物溶液100μl/孔，室溫(36℃左右)10分鐘終止反應(yīng)加2M的硫酸，50μl/孔酶聯(lián)儀上450nm處讀數(shù)，并計(jì)算抑制率。當(dāng)殘殺威原藥濃度為10-12g/ml時(shí)仍有大于10％的抑制率。結(jié)果表明，制備的抗體對(duì)殘殺威農(nóng)藥具有很好的識(shí)別作用。可用于研制殘殺威免疫速測(cè)試劑盒。
權(quán)利要求
1.殘殺威人工抗原合成方法，包括1)鄰-異丙氧基苯甲酰氯的合成稱取雙光氣27.1g，加入0.138g活性碳，37℃水浴加熱，用50.0g甲苯收集光氣，甲苯液在24℃水浴中磁力攪拌，尾氣通入堿液，光氣劇毒，且氣味難聞，應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，至雙光氣反應(yīng)完，甲苯相增重24.0g，得34％光氣/甲苯溶液；稱取鄰-異丙氧基苯酚11.056g，溶進(jìn)100ml 10％的NaOH水溶液，40℃水浴加熱磁力攪拌1小時(shí)，冷卻到室溫后緩慢加入上光氣/甲苯溶液，40分鐘加完，開(kāi)始計(jì)時(shí)，4小時(shí)后結(jié)束反應(yīng)；取有機(jī)相減壓蒸餾得20.270g黃色油狀物；GC法測(cè)定目標(biāo)物的含量，5℃冰箱存放備用；2)γ-氨基丁酸(H殘)的合成稱取間-甲基苯甲酰氯5.105g，溶進(jìn)4ml4M NaOH溶液，置5℃冰箱冷卻，得A液；稱取γ-丁胺酸2.102g，溶進(jìn)4ml 4MNaOH溶液，置5℃冰箱冷卻，得B液；另取3ml 4M NaOH溶液，置5℃冰箱冷卻，得C液；將A液與C液均分成5等份，每間隔5～10分鐘向B液中同時(shí)各加入1份，整個(gè)反應(yīng)置冰水中，磁力攪拌下進(jìn)行；加樣全部完成開(kāi)始記時(shí)，3小時(shí)后結(jié)束反應(yīng)；用濃鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)終液的pH值為4，目標(biāo)產(chǎn)物用乙酸乙酯3個(gè)50ml份抽提；乙酸乙酯相用稀HCl洗滌數(shù)次，用1MNaHCO3溶液2個(gè)50ml份抽提；水相再用濃鹽酸酸化，乙酸乙酯再抽提；無(wú)水Na2SO4干燥，所得物減壓蒸餾濃縮至13.8ml，向濃縮液中逐漸加入3lml正己烷，白色結(jié)晶物析出，過(guò)濾；結(jié)晶物經(jīng)低溫干燥得4.771g；再經(jīng)過(guò)甲苯與去離子水5℃下洗滌，干燥后稱重得到H殘結(jié)晶物3.626g；3)殘殺威人工抗原的合成稱取H殘結(jié)晶物60mg和NHS 30mg，用600μl DMF溶解于反應(yīng)裝置中；稱取55mg DCC，用600μl DMF溶解；將DCC/DMF溶液滴加到上反應(yīng)裝置中，反應(yīng)在磁力攪拌下室內(nèi)溫度進(jìn)行5小時(shí)，反應(yīng)終液置5℃冰箱冷卻2小時(shí)以上，經(jīng)1.2萬(wàn)rpm離心5分鐘，取上清活潑酯液并將其均分為2等份，分別緩慢滴加到3.0ml 10mg/ml的BSA溶液與3.0ml 10mg/ml的OVA溶液中反應(yīng)，反應(yīng)緩沖液為0.2M pH8.0的PB液，反應(yīng)在磁力攪拌下室內(nèi)溫度進(jìn)行4小時(shí)，將反應(yīng)液置透析袋內(nèi)，于0.2M pH6.8的PB中4℃攪拌透析，每4小時(shí)換一次透析液，共透析60小時(shí)，透析結(jié)束后將透析袋中的殘殺威人工抗原白色乳狀液裝于若干1ml離心管中，于-20℃冰箱中存放備用。
全文摘要
本發(fā)明殘殺威人工抗原合成方法屬于有機(jī)化學(xué)及免疫學(xué)技術(shù)范疇。根據(jù)有機(jī)化學(xué)反應(yīng)的一般原理，合成殘殺威半抗原及抗原(包括包被抗原與免疫原)，方法，包括鄰－異丙氧基苯甲酰氯的合成，γ－氨基丁酸(H
文檔編號(hào)C07K14/00GK1616482SQ20031010627
公開(kāi)日2005年5月18日 申請(qǐng)日期2003年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月13日
發(fā)明者劉鳳權(quán), 張奇 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)