專利名稱：Sa抗原的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用抗Sa抗體診斷類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中使用的Sa抗原底片，特別是涉及Sa抗原的純化方法。
背景技術(shù)：
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種表現(xiàn)為多關(guān)節(jié)慢性炎癥為主的自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為慢性、對稱性、侵蝕性關(guān)節(jié)炎，大多病情呈進(jìn)行性，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)纖維性僵直、纖維性或骨性強(qiáng)直而嚴(yán)重致殘。RA的診斷，尤其是早期診斷是世界性的難題。RA患者經(jīng)早期診斷、早期積極治療，可以改變病情以降低致殘率?，F(xiàn)行的美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)1987年RA分類診斷標(biāo)準(zhǔn)，主要是依靠臨床表現(xiàn)、X線改變和類風(fēng)濕因子(RF)的檢測進(jìn)行綜合判斷，缺乏可靠的客觀指標(biāo)，往往是符合上述判斷標(biāo)準(zhǔn)時，病人已經(jīng)出現(xiàn)了骨質(zhì)的破壞，使得早期病例難以診斷。RF是分類診斷標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)唯一的血清學(xué)指標(biāo)，但RF可出現(xiàn)于許多結(jié)締組織病及其它疾病中，如急性病毒感染和結(jié)核患者，甚至5％的正常人群中也可能出現(xiàn)，對于診斷RA的特異性很差，不利于早期診斷、早期干預(yù)治療。因此，國內(nèi)外學(xué)者在探討RA特異性診斷指標(biāo)方面進(jìn)行了大量研究工作，相繼發(fā)現(xiàn)了一些RA患者血清中存在的，對RA較為特異的自身抗體，如抗核周因子抗體(APF)，抗角蛋白抗體(AKA)，抗Sa抗體，抗RA33抗體，抗膠原蛋白抗體，抗聚角蛋白微絲蛋白抗體(AFA)，抗環(huán)瓜氨酸肽抗體等。這些自身抗體不同程度地具有一定的早期診斷價值。
1994年，Despres等發(fā)現(xiàn)了抗Sa抗體，認(rèn)為對RA的特異性高達(dá)98.9％，且在早期RA患者中陽性率為23.5％。為此，國內(nèi)外學(xué)者在抗Sa抗體方面進(jìn)行了大量的研究工作，但該項成果卻遲遲未能應(yīng)用于臨床，其主要原因之一是Sa抗原極易分解，Sa抗原的提取過程必須保持在4℃進(jìn)行，且需加入多種蛋白酶抑制劑抑制Sa抗原的降解，提取過程操作困難；其二是Sa抗原需從人胎盤或脾臟中提取，這些組織中蛋白成分豐富，Sa抗原不宜分離、純化，很難得到純的Sa抗原，在臨床上應(yīng)用難以避免批間差異。
用Despres布氏漏斗法制備Sa抗原的方法是取新鮮人胎盤組織，勻漿，4℃10000rpm/min離心60分鐘；取上清液與預(yù)冷活化的DE52混合攪拌60分鐘，布氏漏斗抽濾并用勻漿緩沖液洗滌、抽干；將DE52與洗脫液1混合攪拌60分鐘，布氏漏斗抽濾，洗脫液1洗滌、抽干，棄濾液；DE52再與洗脫液2混合攪拌60分鐘，布氏漏斗抽濾，洗脫液2洗滌，收集濾液；濾液裝入透析袋中，用預(yù)冷的含0.15mmol/L PEMSF蒸餾水透析24～36小時，冷凍干燥(Despres N，BoireG，lopez-longo FJ，et al.The Sa systema novel antigen-antibody system specificfor rheumatoid arthritis.J Rheumatol，1994，211027-1033)。
將上述布氏漏斗法提取的Sa抗原用10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，可以看到大約8～9種不同分子量的蛋白條帶，且濃度基本相同。將電泳凝膠轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜再通過免疫印跡法檢測抗Sa抗體時，由于蛋白條帶較多，首先可能將與Sa抗原分子量接近的條帶誤認(rèn)為陽性，其次可能由于非特異性抗體的顯色而影響所測條帶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在提取Sa抗原的基礎(chǔ)上，提供一種進(jìn)一步純化Sa抗原的方法，得到純度更高的Sa抗原，通過免疫印跡法檢測顯示非特異性條帶明顯減少，抗Sa抗體的條帶更為清晰易辨。
本發(fā)明是在原Sa粗抗原提取的基礎(chǔ)上，采用親和層析法對Sa粗抗原進(jìn)一步純化，以得到純化的Sa抗原。純化Sa抗原的具體步驟包括a)純化抗Sa抗體在緩沖液B中將Protein G Sepharose 4 Fast Flow浸泡脫氣，裝柱，緩沖液B平衡；取RA患者血清，離心、0.22μm濾膜過濾、緩沖液B透析，得到抗Sa陽性血清；將抗Sa陽性血清上柱孵育30分鐘，先用緩沖液B洗柱，去除雜蛋白，再用洗脫液A洗脫，洗脫液收集到預(yù)置中和緩沖液的收集管中，透析后得到抗Sa IgG。
b)制備親和層析柱取活化的CNBr-Sepharose 4B，在偶聯(lián)緩沖液中與純化的抗Sa IgG混合，4℃搖蕩過夜，用偶聯(lián)緩沖液淋洗，洗脫未結(jié)合蛋白后，將制備好的親和介質(zhì)移入阻斷緩沖液中，室溫孵育2小時，封閉剩余的反應(yīng)位點(diǎn)；之后將親和介質(zhì)用偶聯(lián)緩沖液和醋酸鹽緩沖液交替淋洗，在緩沖液C中浸泡脫氣，裝柱，緩沖液C平衡，制成親和層析柱。
c)Sa抗原的親和層析取Sa粗抗原，在親和層析柱上循環(huán)上樣5小時，用緩沖液C洗柱，洗脫雜蛋白，洗脫液B洗脫，洗脫液收集到預(yù)置中和緩沖液的收集管中，透析后得到純化的Sa抗原。
其中，在步驟a)中使用的緩沖液B為pH7.0，含0.9％NaCl的0.02mol/L PB溶液；洗脫液A為除氣過濾后的pH2.7的0.1mol/L甘氨酸-鹽酸溶液；中和緩沖液為1mol/L Tris，pH9.0。
步驟b)中使用的緩沖液C為pH7.4，含0.9％NaCl的0.02mol/L PB溶液；偶聯(lián)緩沖液為含0.5mol/L NaCl的0.1mol/L NaHCO3，pH8.3；阻斷緩沖液為1％牛血清白蛋白，pH8.0；醋酸鹽緩沖液為含0.5mol/L NaCl的0.1mol/L NaAc，pH4.0。
步驟c)中使用的洗脫液B為除氣過濾后的pH2.5的0.1mol/L甘氨酸-鹽酸溶液。
本發(fā)明從人胎盤組織中提取粗Sa抗原，利用抗原與抗體特異性、可逆性結(jié)合的特點(diǎn)，采用親和層析法對Sa抗原進(jìn)行純化，以達(dá)到分離純化Sa抗原的目的，抗原純化程度高，經(jīng)10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示純化的Sa抗原電泳條帶明顯減少；免疫印跡法檢測也發(fā)現(xiàn)抗Sa抗體的顯色條帶清晰易辨。
使用本發(fā)明純化后的Sa抗原對206例RA患者的血清進(jìn)行檢測，并以粗Sa抗原進(jìn)行對照，結(jié)果見表1。從表1可以看出，粗Sa抗原所測得的72例陽性血清中，純化Sa抗原檢測也全部為陽性，而純化Sa抗原又在粗Sa抗原所測144例陰性血清中測出5例陽性，說明純化Sa抗原可以提高抗Sa抗體的檢測陽性率。
表1 粗抗原與純化抗原檢測抗Sa抗體的比較親和層析法純化Sa抗原 粗Sa抗原陽性7772陰性129 134合計206 206陽性率％37.38 34.95X2值0.084P值 0.786實驗也證實，純化Sa抗原的實驗重復(fù)性較好，Sa抗原凍干粉可以長期保存，轉(zhuǎn)印至膜上的抗原在4℃保存1年后活性不變，新舊抗原檢測抗Sa抗體的符合率為100％。


圖1為粗Sa抗原與純化Sa抗原的10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果；圖2為粗Sa抗原與純化Sa抗原的免疫印跡法抗體檢測結(jié)果。
具體實施例方式
1.使用Protein G Sepharose 4 Fast Flow純化抗Sa抗體取5mLRA患者血清，經(jīng)免疫印跡法檢測抗Sa抗體陽性，且抗體滴度較高，＞1∶64，免疫雙擴(kuò)法及免疫印跡法檢測ENA多肽陰性后，離心，0.22μm濾膜過濾，將濾液在含有0.9％NaCl的0.02mol/L PB緩沖液(pH7.0)中透析過夜，得到抗Sa陽性血清。
將5mL Protein G Sepharose 4 Fast Flow在玻璃燒結(jié)漏斗上用蒸餾水反復(fù)淋洗，抽干，置于上述的緩沖液中浸泡脫氣后，裝入層析柱，再用緩沖液平衡5個柱床體積，制成Protein G Sepharose層析柱。
將透析過的抗Sa陽性血清上Protein G Sepharose層析柱，孵育30分鐘后，以核酸蛋白檢測儀監(jiān)測層析柱流出液，用上述緩沖液淋洗層析柱，去除雜蛋白，一直淋洗至流出液回落到基線并運(yùn)行穩(wěn)定后，用除氣過濾后的0.1mol/L甘氨酸-鹽酸洗脫液(pH2.7)，以1.3mL/min的流速洗脫抗Sa抗體，使用核酸蛋白檢測儀監(jiān)測收集蛋白洗脫峰，共收集到12mL洗脫液，將洗脫液全部收集到預(yù)置1mol/L Tris中和緩沖液(pH9.0)的收集管中，混勻、透析后得到純化的抗Sa IgG。
取透析后的收集液，經(jīng)免疫印跡法檢測抗Sa抗體陽性；檢測到蛋白及IgG含量為1.875mg/mL×12mL＝22.5mg。
2.制備親和層析柱稱取約2g CNBr-Sepharose 4B，活化后，在含0.5mol/L NaCl的0.1mol/LNaHCO3偶聯(lián)緩沖液(pH8.3)中與純化的抗Sa IgG混合，4℃搖蕩過夜后，置于玻璃燒結(jié)漏斗上，用上述的偶聯(lián)緩沖液反復(fù)淋洗，洗脫未結(jié)合蛋白后，收集洗脫液，檢測洗脫下的蛋白含量為3.2385mg。則抗Sa IgG的偶聯(lián)率為偶聯(lián)率＝(偶聯(lián)前蛋白含量-偶聯(lián)后洗下的蛋白含量)/偶聯(lián)前蛋白含量×100＝(22.5mg-3.2385mg)×100/22.5mg＝85.61％將制備好的親和介質(zhì)移入1％牛血清白蛋白阻斷緩沖液(pH8.0)中，室溫下孵育2小時，封閉剩余的反應(yīng)位點(diǎn)，之后用偶聯(lián)緩沖液和含0.5mol/L NaCl的0.1mol/L NaAc緩沖液(pH4.0)交替淋洗后，在含0.9％NaCl的0.02mol/L PB緩沖液(pH7.4)中浸泡脫氣，裝柱，再用緩沖液平衡后，制成親和層析柱。
3. Sa抗原的親和層析取采用文獻(xiàn)方法制備并透析脫鹽后的Sa粗抗原，在親和層析柱上循環(huán)上樣5小時，以核酸蛋白檢測儀監(jiān)測層析柱流出液，用上述緩沖液淋洗層析柱，洗脫雜蛋白，一直淋洗至流出液回落到基線并運(yùn)行穩(wěn)定后，用除氣過濾后的0.1mol/L甘氨酸-鹽酸洗脫液(pH2.5)，以1mL/min的流速洗脫，使用核酸蛋白檢測儀監(jiān)測洗脫液蛋白含量，并將含蛋白洗脫峰部分的洗脫液全部收集到預(yù)置1mol/L Tris中和緩沖液(pH9.0)的收集管中，混勻、透析后得到純化的Sa抗原。
純化后的Sa抗原經(jīng)濃縮后，用10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫印跡法檢測蛋白分子量及抗原活性，分裝，-70℃保存。
以Marker遷移距離做標(biāo)準(zhǔn)曲線，將粗Sa抗原與純化后的Sa抗原用10％SDS-聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色后，得到圖1的結(jié)果。由圖1可以看出，與粗抗原相比，Sa抗原條帶處蛋白量明顯濃集，條帶數(shù)有所減少。圖中，第4泳道為低分子量Marker，第3泳道為粗Sa抗原，第6泳道為純化后的Sa抗原。
應(yīng)用免疫印跡法(Western Blot)對粗Sa抗原和純化后的Sa抗原進(jìn)行抗原特異性鑒定，根據(jù)低分子量Marker繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線及陽性血清條帶對反應(yīng)條帶進(jìn)行分析、確認(rèn)，結(jié)果如圖2所示。圖中，左側(cè)為低分子量Marker，第1條帶為陰性血清，第2條帶為陽性血清，用第3、4號條帶與第7、8號條帶檢測同一份血清，相同的上樣量，第3、4號條帶為粗Sa抗元，第7、8號條帶為經(jīng)親和層析純化后的Sa抗原。免疫印跡結(jié)果顯示，粗Sa抗原所測抗Sa抗體的顯色帶顏色較淺，且條帶較多，不以辨別，而純化后的Sa抗原所測抗Sa抗體的顯色帶顏色較深，且條帶僅一條，更為清晰易辨。
權(quán)利要求
1.一種Sa抗原的純化方法，是采用親和層析法對提取的Sa粗抗原進(jìn)一步純化，以得到純化的Sa抗原，其特征是包括以下步驟a)純化抗Sa抗體在緩沖液B中將Protein G Sepharose 4 Fast Flow浸泡脫氣，裝柱，緩沖液B平衡；取RA患者血清，離心、0.22μm濾膜過濾、緩沖液B透析，得到抗Sa陽性血清；將抗Sa陽性血清上柱孵育30分鐘，先用緩沖液B洗柱，再用洗脫液A洗脫，洗脫液收集到預(yù)置中和緩沖液的收集管中，透析后得到抗SaIgG；b)制備親和層析柱取活化的CNBr-Sepharose 4B，在偶聯(lián)緩沖液中與純化的抗Sa IgG混合，4℃搖蕩過夜，偶聯(lián)緩沖液淋洗后移入阻斷緩沖液中，室溫孵育2小時，制成親和介質(zhì)；制成的親和介質(zhì)用偶聯(lián)緩沖液和醋酸鹽緩沖液交替淋洗后，在緩沖液C中浸泡脫氣，裝柱，緩沖液C平衡，制成親和層析柱；c)Sa抗原的親和層析取Sa粗抗原，在親和層析柱上循環(huán)上樣5小時，緩沖液C洗柱，洗脫液B洗脫，洗脫液收集到預(yù)置中和緩沖液的收集管中，透析后得到純化的Sa抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Sa抗原純化方法，其特征是所述的緩沖液B為pH7.0，含0.9％NaCl的0.02mol/L PB溶液；緩沖液C為pH7.4，含0.9％NaCl的0.02mol/L PB溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Sa抗原純化方法，其特征是所述的洗脫液A為pH2.7的0.1mol/L甘氨酸-鹽酸溶液；洗脫液B為pH2.5的0.1mol/L甘氨酸-鹽酸溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Sa抗原純化方法，其特征是所述的偶聯(lián)緩沖液為含0.5mol/L NaCl的0.1mol/L NaHCO3，pH8.3。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Sa抗原的純化方法，其特征是所述的阻斷緩沖液為1％牛血清白蛋白，pH8.0。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Sa抗原的純化方法，其特征是所述的中和緩沖液為1mol/L Tris，pH9.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Sa抗原的純化方法，其特征是所述的醋酸鹽緩沖液為含0.5mol/L NaCl的0.1mol/L NaAc，pH4.0。
全文摘要
本發(fā)明涉及Sa抗原的純化方法，是在Despres布氏漏斗法提取Sa粗抗原的基礎(chǔ)上，采用CNBr－Sepharose 4B與抗Sa IgG偶聯(lián)制成親和層析柱，對Sa粗抗原進(jìn)一步純化，得到純度更高的Sa抗原。經(jīng)10％SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，顯示本發(fā)明純化的Sa抗原電泳條帶明顯減少，免疫印跡法檢測也發(fā)現(xiàn)抗Sa抗體的顯色條帶清晰易辨。
文檔編號C07K14/435GK1696156SQ200510012499
公開日2005年11月16日 申請日期2005年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月8日
發(fā)明者李小峰, 魏華, 胡學(xué)芳, 高圓, 陳竹, 國華 申請人:李小峰