專利名稱：親合層析用填充劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及親合層析用填充劑，尤其是涉及結(jié)合有對(duì)于抗體純化有用的特定配體的親合層析用填充劑。
背景技術(shù)：
所謂親合層析，是將與以分離和純化作為目的的物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)(配體) 固定在不溶性載體上，使用填充了這樣獲得的配體固定化載體的柱的層析，可用于例如，蛋白質(zhì)、核酸等生物體相關(guān)物質(zhì)的分離和純化(日本特開平6481638號(hào)公報(bào))。作為親合層析用填充劑，以瓊脂糖凝膠為代表的糖鏈的交聯(lián)粒子得到廣泛使用， 但是它存在著一旦高速流過含有分離和純化對(duì)象分子的溶液，粒子就發(fā)生變形，柱壓力增高，分離和純化的時(shí)間效率差這樣的問題。另一方面，作為能夠以較高流速使用的親合層析用填充劑，有AppliedBiosystems 公司制造的POROS (商品名)。該填充劑使用以疏水性的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物作為主要成分的母粒子。該填充劑存在著被認(rèn)為主要由母粒子引起的發(fā)生非特異吸附的情況，而且，如果以高流速使用，就會(huì)有結(jié)合容量降低的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供至今還沒有的即使是在高流速下的分離和純化，也可以維持高配體結(jié)合容量的親合層析用填充劑。本發(fā)明的一個(gè)方式涉及的親合層析用填充劑是含有包含交聯(lián)性乙烯基單體和含環(huán)氧基的乙烯基單體的單體混合物的共聚物的多孔性母粒子，配體與前述多孔性母粒子結(jié)合，前述多孔性母粒子具有通過使該多孔性母粒子所含的環(huán)氧基開環(huán)而得到的開環(huán)環(huán)氧基。在上述親合層析用填充劑中，可以含有取代或非取代的2，3_ 二羥基丙基作為前述開環(huán)環(huán)氧基。上述親合層析用填充劑中，前述配體可以是含有蛋白質(zhì)A的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。此時(shí)，前述蛋白質(zhì)A的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可以是選自A結(jié)構(gòu)域、B結(jié)構(gòu)域、C 結(jié)構(gòu)域、D結(jié)構(gòu)域、E結(jié)構(gòu)域、和Z結(jié)構(gòu)域中的至少1種。上述親合層析用填充劑中，前述配體可以是用下述通式(1)表示的免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)。R-R2.....(1)(式中，R表示含有4 20個(gè)組氨酸連續(xù)的部位的由4 300個(gè)氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列，R2表示至少含有一個(gè)蛋白質(zhì)A的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的由50 500個(gè)氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列(在此，R2與R結(jié)合的末端是免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的末端))。此時(shí)，上述通式(1)中，R-可以是下述通式(2)表示的基團(tuán)。
R1T-.....(2)(式中，R1表示含有4 20個(gè)組氨酸連續(xù)的部位的由4 100個(gè)氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列(在此，R1中，前述組氨酸連續(xù)部位的末端與r結(jié)合)，r表示包含TEV結(jié)構(gòu)域的由7 200個(gè)氨基酸構(gòu)成的任意的氨基酸序列)。而且，此時(shí)，前述配體是，上述通式(1)中，R表示的氨基酸序列和R2表示的氨基酸序列中的至少一個(gè)可以含有結(jié)構(gòu)域t的配體，所述結(jié)構(gòu)域t包含選自賴氨酸、精氨酸和半胱氨酸中的1種氨基酸且由1 50個(gè)氨基酸構(gòu)成。此外，上述親合層析用填充劑中，前述配體可以是下述通式C3)表示的免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)。R2-R.....(3)(式中，R表示含有4 20個(gè)組氨酸連續(xù)的部位的由4 300個(gè)氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列，R2表示至少含有1個(gè)蛋白質(zhì)A的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的由50 500個(gè)氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列(在此，R2與R結(jié)合的末端是免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的末端))。此時(shí)，上述通式(3)中，-R可以是下述通式⑷表示的基團(tuán)。-r-R1.....(4)(式中，R1表示含有4 20個(gè)組氨酸連續(xù)的部位的由4 100個(gè)氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列(在此，R1中，前述組氨酸連續(xù)的部位的末端與r結(jié)合)，r表示包含TEV結(jié)構(gòu)域的由7 200個(gè)氨基酸構(gòu)成的任意的氨基酸序列)。而且，此時(shí)，前述配體可以是，上述通式(3)中，R表示的氨基酸序列和R2表示的氨基酸序列中的至少一個(gè)含有結(jié)構(gòu)域t的配體，所述結(jié)構(gòu)域t包含選自賴氨酸、精氨酸和半胱氨酸中的1種氨基酸且由1 50個(gè)氨基酸構(gòu)成。本發(fā)明中，所謂“蛋白質(zhì)”，是指具有肽結(jié)構(gòu)單元的所有分子，它是包括了，例如，對(duì)天然型蛋白質(zhì)的部分片段或天然型蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行了人工改變后的變異體的概念。而且，所謂“免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域”表示單獨(dú)具有免疫球蛋白結(jié)合活性的多肽的功能單元，所謂“免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)”表示與免疫球蛋白具有特異的親和性，且含有“免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域”的蛋白質(zhì)。而且，本發(fā)明中，所謂“TEV結(jié)構(gòu)域”，是指被TEV(煙草蝕刻病毒，Tobacco Etch Virus)蛋白酶識(shí)別的切斷部位。根據(jù)上述親合層析用填充劑，其是含有包含交聯(lián)性乙烯基單體和含環(huán)氧基的乙烯基單體的單體混合物的共聚物的多孔性母粒子，配體與前述多孔性母粒子結(jié)合，前述多孔性母粒子具有通過使該多孔性母粒子所含的環(huán)氧基開環(huán)而得到的開環(huán)環(huán)氧基，因此在親合層析中，即使在高流速下的分離和純化中，也可以維持高配體結(jié)合容量，而這在以前是無法實(shí)現(xiàn)的。


[圖1]圖1是表示本發(fā)明的合成例1中制備的免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)(SPAK、 SPAC, SPAKK, SPATK)的氨基酸序列的圖。[圖2]圖2是表示本發(fā)明的合成例1中制備的免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)(SPAI、 SPA3K、SPA-His-C, SPA-His-Ν)的氨基酸序列的圖。
[圖3]圖3是說明分別插入于3種表達(dá)載體(pETM-11、pETM-10和pET29)中的編碼本發(fā)明的合成例1中涉及的免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA片段的構(gòu)成的圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式涉及的親合層析用填充劑是含有包含交聯(lián)性乙烯基單體和含環(huán)氧基的乙烯基單體的單體混合物的共聚物的多孔性母粒子，配體與多孔性母粒子結(jié)合，多孔性母粒子具有通過使該多孔性母粒子所含的環(huán)氧基開環(huán)而得到的開環(huán)環(huán)氧基。1.親合層析用填充劑1. 1.多孔性母粒子1. 1. 1.構(gòu)成本實(shí)施方式中涉及的親合層析用填充劑(多孔性母粒子)優(yōu)選主要由含有交聯(lián)性乙烯基單體和含環(huán)氧基的乙烯基單體的單體混合物的共聚物構(gòu)成。作為上述交聯(lián)性乙烯基單體，合適的是芳香族聚乙烯基單體、脂肪族聚乙烯基單體，作為芳香族聚乙烯基單體，優(yōu)選二乙烯基苯，并且作為脂肪族聚乙烯基單體，優(yōu)選多元 (甲基)丙烯酸酯化合物。作為多元(甲基)丙烯酸酯化合物，可以列舉乙二醇二(甲基) 丙烯酸酯、二乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、三乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、四乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、二丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、三丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、四丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，4_ 丁二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，6_己二醇二(甲基)丙烯酸酯、三羥甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇四(甲基)丙烯酸酯等，特別優(yōu)選三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、三羥甲基丙烷三丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、乙二醇二丙烯酸酯。上述含環(huán)氧基的乙烯基單體是分子中含有環(huán)氧基的乙烯基單體，可以列舉，例如， (甲基)丙烯酸縮水甘油酯、α-(甲基)丙烯基-ω-縮水甘油基聚乙二醇等(甲基)丙烯酸酯類；乙烯基芐基縮水甘油醚等芳香族乙烯基化合物等，特別優(yōu)選甲基丙烯酸縮水甘油酯、乙烯基芐基縮水甘油醚。作為本實(shí)施方式涉及的親合層析用填充劑，優(yōu)選使用含有優(yōu)選20 50重量％的交聯(lián)性乙烯基單體與50 80重量％的含環(huán)氧基的乙烯基單體的共聚物的多孔質(zhì)有機(jī)聚合物粒子。在此，交聯(lián)性乙烯基單體如果不到單體總量的20重量％，填充劑的強(qiáng)度就差，因此會(huì)存在高流速下，填充劑被破壞，柱壓力上升的情況，另一方面，交聯(lián)性乙烯基單體如果超過單體總量的50重量％，就會(huì)存在難以控制細(xì)孔徑，結(jié)合容量降低的情況。本實(shí)施方式中涉及的親合層析用填充劑也可以含有其它乙烯基單體作為共聚物成分，其它乙烯基單體的含量?jī)?yōu)選是0 30重量％。本實(shí)施方式中涉及的親合層析用填充劑優(yōu)選具有20 80 μ m,更優(yōu)選具有30 60 μ m的粒徑(體積平均粒子徑)。粒徑如果不到20 μ m，在高流速下柱壓力變高，不耐用。 如果粒徑超過80 μ m,結(jié)合容量就差。而且，本發(fā)明中所謂“粒徑”，是用激光衍射/散射粒度分布測(cè)定裝置獲得的體積平均粒徑。本實(shí)施方式中涉及的親合層析用填充劑優(yōu)選具有50 150m2/g，更優(yōu)選80 120m2/g的比表面積。在此，比表面積如果不到50m2/g，就會(huì)有結(jié)合容量差的情況，另一方面，如果超過150m2/g，填充劑強(qiáng)度就差，因此會(huì)存在高流速下填充劑被破壞，柱壓力上升的情況。本發(fā)明中所謂“比表面積”，是將通過水銀孔隙率計(jì)獲得的細(xì)孔徑為10 5000nm的細(xì)孔所具有的表面積除以粒子的干燥重量所得的值。本實(shí)施方式中涉及的親合層析用填充劑優(yōu)選具有100 400nm，更優(yōu)選200 300nm的體積平均細(xì)孔徑。在此，體積平均細(xì)孔徑如果不到lOOnm，就會(huì)存在高流速下結(jié)合容量顯著降低的情況，另一方面，如果超過400nm，就會(huì)存在不論流速如何，結(jié)合容量有可能降低的情況。本發(fā)明中所謂“體積平均細(xì)孔徑”，是通過水銀孔隙率計(jì)獲得的細(xì)孔徑為10 5000nm的細(xì)孔的體積平均細(xì)孔徑。在滿足上述范圍的粒徑、比表面積、和細(xì)孔徑分布時(shí)，成為純化對(duì)象溶液流路的粒子間的間隙和粒子內(nèi)的較大的細(xì)孔徑，與純化對(duì)象分子的結(jié)合表面積的平衡達(dá)到最佳化， 高流速下的結(jié)合容量維持在高水平。本實(shí)施方式中涉及的作為親合層析用填充劑使用的多孔性母粒子的一個(gè)具體例， 可以列舉例如，含有20 50重量％的交聯(lián)性乙烯基單體與50 80重量％的含環(huán)氧基的乙烯基單體的共聚物，粒徑為20 80 μ m,比表面積為50 150m2/g，體積平均細(xì)孔徑為 100 400nm的多孔性有機(jī)聚合物粒子。而且，用水銀孔隙率計(jì)測(cè)定本實(shí)施方式中涉及的親合層析用填充劑時(shí)的細(xì)孔徑為 10 5000nm的細(xì)孔的浸入體積(細(xì)孔體積)優(yōu)選為1. 3 2. 5mL/g。1. 1. 2.制造本實(shí)施方式中涉及的作為親合層析用填充劑使用的多孔性母粒子可以通過例如公知的種子聚合、懸浮聚合等來制造。作為種子聚合法，還可以適當(dāng)?shù)厥褂萌毡咎毓?7-24369號(hào)公報(bào)記載的二段膨脹聚合法。聚合時(shí)，除上述單體以外，將水、致孔劑 (Porogen)作為必需成分，根據(jù)需要使用聚合引發(fā)劑、高分子分散劑、表面活性劑、鹽、種子粒子等。作為致孔劑(Porogen)，可以列舉脂肪族或芳香族烴類、酯類、酮類、醚類、醇類等有機(jī)溶劑。作為這種有機(jī)溶劑，可以列舉例如，甲苯、乙苯、異丙苯、正丙苯、正丁苯、叔丁苯、 仲丁苯、異丁苯、二甲苯、乙基甲苯、甲基異丙苯、叔丁基甲苯、二異丙苯、均三甲苯、環(huán)己烷、 辛烷、異辛烷、乙酸丁酯、鄰苯二甲酸二甲酯、甲乙酮、2-辛酮、3-辛酮、4-辛酮、二異丁基酮、2-壬酮、3-壬酮、4-壬酮、5-壬酮、2-癸酮、3-癸酮、4-癸酮、5-癸酮、2-甲壬酮、3-甲壬酮、4-甲壬酮、5-甲壬酮、6-甲壬酮、佛爾酮、異佛爾酮、苯乙酮、二丁基醚、1-己醇、2-辛醇、癸醇、月桂醇、環(huán)己醇等，優(yōu)選以具有碳原子數(shù)為2以上的烷基的芳香族烴類作為主要成分的溶劑、以碳原子數(shù)為8以上的酮類作為主要成分的溶劑，最優(yōu)選以異丙苯和/或二異丁基酮作為主要成分的溶劑。通過根據(jù)單體的組成對(duì)上述致孔劑(Porogen)的量和種類進(jìn)行選擇，可以獲得本實(shí)施方式中涉及的填充劑所必需的細(xì)孔徑分布和比表面積。作為聚合引發(fā)劑，優(yōu)選過氧化苯甲酰、過氧化月桂酰、過氧化2-乙基己酸叔丁酯、 3，5，5_三甲基己酰過氧化物等的過氧化物類引發(fā)劑、偶氮二異丁腈、偶氮二異戊腈等偶氮類引發(fā)劑。將這些聚合引發(fā)劑溶解于單體混合物或致孔劑(Porogen)中來供給聚合體系。作為高分子分散劑，可以使用皂化度為80 95%的聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮等水溶性聚合物。作為表面活性劑，可以使用十二烷基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉、聚氧乙烯十二烷基醚硫酸酯鹽等陰離子性表面活性劑、聚氧乙烯烷基醚等非離子性表面活性劑等。作為鹽，可以適當(dāng)使用氯化鈉、硫酸鈉等。作為種子粒子，可以使用分子量為1000 100000左右的聚苯乙烯粒子、聚(甲基)丙烯酸烷基酯粒子等。種子聚合中，通過調(diào)整種子粒子的大小和量、單體的量、致孔劑(Porogen)的量，可以獲得本發(fā)明的填充劑所需要的粒徑。懸浮聚合中，通過調(diào)整高分子分散劑和表面活性劑的種類和量、攪拌速度、攪拌葉輪和聚合容器的形狀和大小，可以獲得本發(fā)明的填充劑所需要的粒徑。聚合結(jié)束后，通過用種子粒子和/或致孔劑(Porogen)的良溶劑進(jìn)行清洗，而獲得所希望的細(xì)孔徑分布的多孔性母粒子。1.1.3.與配體的結(jié)合配體結(jié)合在本實(shí)施方式中涉及的親合層析用填充劑上。作為配體的結(jié)合方法，可以列舉，例如，⑴利用多孔性母粒子所含的環(huán)氧基直接作為配體的結(jié)合位點(diǎn)的方法(例如日本特表2006-511935號(hào)中記載的方法)；(2)用甲苯磺?；葘?duì)將多孔性母粒子中所含的環(huán)氧基開環(huán)而生成的醇羥基進(jìn)行活化之后，結(jié)合配體的方法；用氧化劑對(duì)該醇羥基進(jìn)行氧化開裂，然后結(jié)合配體的方法(例如日本特開 2007-211076號(hào)、日本特開2008-032411號(hào)中記載的方法)；(；3)從多孔性母粒子中所含的環(huán)氧基或由該環(huán)氧基開環(huán)而生成的基團(tuán)進(jìn)一步延伸連接子，配體通過該連接子與多孔性母粒子結(jié)合的方法(例如特開2008-032411號(hào)、特開平10-195099號(hào)、特開2004-331953號(hào)中記載的方法)。在任意一種結(jié)合法中，在作為親合層析用填充劑使用前，表面的環(huán)氧基實(shí)質(zhì)上開環(huán)。也就是說，本實(shí)施方式中涉及的親合層析用填充劑具有開環(huán)環(huán)氧基。該開環(huán)環(huán)氧基如上所述，通過在配體與多孔性母粒子結(jié)合之前或之后，使多孔性母粒子中所含的環(huán)氧基開環(huán)而獲得。本發(fā)明中所謂“開環(huán)環(huán)氧基”是指使環(huán)氧基開環(huán)所得的基團(tuán)，更具體的是指，例如通過使氫氧化物離子、氯化物離子、具有巰基或氨基等的親核性化合物等與環(huán)氧基反應(yīng)， 使環(huán)氧基開環(huán)所得的基團(tuán)。環(huán)氧基開環(huán)而生成的醇羥基起著使共聚物表面親水化，防止蛋白質(zhì)等的非特異吸附，并且使水中的粒子的韌性提高，防止高流速下的粒子被破壞的作用。作為多孔性母粒子中環(huán)氧基的開環(huán)方法，可以列舉，例如，在水溶劑中，用酸或堿，加熱或室溫下攪拌的方法。 此外，還可以用巰基乙醇等具有巰基的阻斷劑或單乙醇胺等具有氨基的阻斷劑，使環(huán)氧基開環(huán)。如上述(1) (3)中說明的那樣，開環(huán)環(huán)氧基，可以是例如，使環(huán)氧基開環(huán)而生成的基團(tuán)、使配體結(jié)合在該開環(huán)而生成的基團(tuán)上的基團(tuán)、和通過連接子使配體結(jié)合在該開環(huán)而生成的基團(tuán)上的基團(tuán)中的任意一種，優(yōu)選它們中的至少1種。此時(shí)，從可以使共聚物表面親水化，更有效地防止蛋白質(zhì)等的非特異吸附這一點(diǎn)上考慮，優(yōu)選多孔性母粒子含有取代或非取代的2，3_ 二羥基丙基來作為開環(huán)環(huán)氧基。非取代的2，3_ 二羥基丙基可以通過例如， 使縮水甘油基通過水解來開環(huán)的方式獲得。取代的2，3_ 二羥基丙基可以通過例如，把縮水甘油基用巰基乙醇等具有巰基的阻斷劑或單乙醇胺等具有氨基的阻斷劑進(jìn)行開環(huán)而獲得。1. 2.配體作為配體，如果是對(duì)目標(biāo)物具有親合性的物質(zhì)，其種類就沒有特別限制，可以使用例如，蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)G、抗生物素蛋白等蛋白質(zhì)；胰島素等肽；單克隆抗體等抗體；酶；激素；DNA ；RNA ；肝素、路易斯X(LewisX)、神經(jīng)節(jié)苷脂等糖類；亞氨基二乙酸、合成色素、2-氨基苯硼酸、4-氨基芐脒、谷胱甘肽、生物素以及它們的衍生物這樣的低分子化合物。上述例示的配體可以使用它們的整體，但也可以使用通過重組、酶法等獲得的它們的片段。此外， 還可以是人工合成的肽或肽衍生物。作為適于抗體純化的配體，是蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)G，更優(yōu)選是蛋白質(zhì)A的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，最優(yōu)選是在蛋白質(zhì)A的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域末端上添加了含有4個(gè)以上連續(xù)的組氨酸單元的肽的蛋白質(zhì)，作為這種蛋白質(zhì)，可以列舉，例如，后述通式(1)或(3)表示的免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)。1. 2. 1.免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)作為優(yōu)選的配體的一個(gè)例子的免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)(以下，也稱為“蛋白質(zhì) 1”)。由下述通式⑴表示。R-R2.....(1)(式中，R表示含有4 20個(gè)組氨酸連續(xù)的部位的由4 300個(gè)氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列，R2表示至少含有1個(gè)蛋白質(zhì)A的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的由50 500個(gè)氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列(在此，R2與R結(jié)合的末端是免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的末端))。上述通式(1)中，R表示的氨基酸序列中所含的氨基酸的數(shù)目?jī)?yōu)選為8 100個(gè)， R中所含的組氨酸連續(xù)的部位的組氨酸數(shù)目?jī)?yōu)選是4 8個(gè)。此外，上述通式(1)中，R2表示的氨基酸序列中所含的氨基酸數(shù)目?jī)?yōu)選為120 480個(gè)。此外，上述通式(1)中，R-優(yōu)選是下述通式(2)表示的基團(tuán)。R1T-.....(2)(式中，R1表示含有4 20個(gè)組氨酸連續(xù)的部位的由4 100個(gè)氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列(在此，R1中，前述組氨酸連續(xù)的部位的末端與r結(jié)合)，r表示含有TEV結(jié)構(gòu)域的由7 200個(gè)氨基酸構(gòu)成的任意氨基酸序列)。上述通式O)中，R1表示的氨基酸序列所含的氨基酸數(shù)目?jī)?yōu)選為4 25個(gè)，R1所含的組氨酸連續(xù)的部位的組氨酸數(shù)目?jī)?yōu)選為4 8個(gè)，r表示的氨基酸序列所含的氨基酸的數(shù)目?jī)?yōu)選為10 50個(gè)。作為優(yōu)選的配體的另一個(gè)例子的免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)(以下，也稱為“蛋白質(zhì) 2”)。由下述通式(3)表示。R2-R.....(3)(式中，R表示含有4 20個(gè)組氨酸連續(xù)的部位的由4 300個(gè)氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列，R2表示至少含有1個(gè)蛋白質(zhì)A的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的由50 500個(gè)氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列(在此，R2與R結(jié)合的末端是免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的末端))。上述通式(3)中，R表示的氨基酸序列中所含的氨基酸的數(shù)目?jī)?yōu)選為8 100個(gè)， R中所含的組氨酸連續(xù)的部位的組氨酸數(shù)目?jī)?yōu)選是4 8個(gè)。此外，上述通式(1)中，R2表示的氨基酸序列中所含的氨基酸數(shù)目?jī)?yōu)選為120 480個(gè)。上述通式(3)中，-R優(yōu)選是下述通式(4)表示的基團(tuán)。-r-R1.....(4)(式中，R1表示含有4 20個(gè)組氨酸連續(xù)的部位的由4 100個(gè)氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列(在此，R1中，前述組氨酸連續(xù)的部位的末端與r結(jié)合)，r表示含有TEV結(jié)構(gòu)域的由7 200個(gè)氨基酸構(gòu)成的任意氨基酸序列)。上述通式(4)中，R1表示的氨基酸序列所含的氨基酸數(shù)目?jī)?yōu)選為4 25個(gè)，r中所含的組氨酸連續(xù)的部位的組氨酸數(shù)目?jī)?yōu)選為4 8個(gè)，r表示的氨基酸序列中所含的氨基酸的數(shù)目?jī)?yōu)選為10 50個(gè)。上述通式(1)和上述通式(3)中，R表示的氨基酸序列和R2表示的氨基酸序列中的至少一個(gè)優(yōu)選含有包含選自賴氨酸、精氨酸、和半胱氨酸中的1種氨基酸的由1 50個(gè)氨基酸構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域t。此時(shí)，在上述氨基酸序列中可以含有多個(gè)相同或不同的結(jié)構(gòu)域t。此外，如上述通式⑵和上述通式⑷所示，r表示的氨基酸序列中可以含有TEV 結(jié)構(gòu)域。通過使r表示的氨基酸序列中含有TEV結(jié)構(gòu)域，可以通過被TEV蛋白酶切斷來進(jìn)行R與R2的分離，而且TEV結(jié)構(gòu)域是用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明效果(固定化到載體上的量多，而且提高該載體的免疫球蛋白保持能力)的優(yōu)選序列。此外，r表示的氨基酸序列中可以含有TEV 結(jié)構(gòu)域的變異體(Mutant)(與能否被該TEV蛋白酶切斷無關(guān)，與TEV結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列具有70%以上，優(yōu)選90%以上的同源性)。構(gòu)成本發(fā)明蛋白質(zhì)1或2的氨基酸的總個(gè)數(shù)通常為70 1000，在與粒子結(jié)合的用途中使用時(shí)，優(yōu)選是80 600。1. 2. 1. 1.免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)A的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域優(yōu)選是選自A結(jié)構(gòu)域、B結(jié)構(gòu)域、C結(jié)構(gòu)域、D 結(jié)構(gòu)域、和E結(jié)構(gòu)域、和Z結(jié)構(gòu)域中的至少一種。A結(jié)構(gòu)域、B結(jié)構(gòu)域、C結(jié)構(gòu)域、D結(jié)構(gòu)域、 和E結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域氨基酸序列記載于例如，Moks T，Abrahms L，et al. , Staphylococcal protein A consists of fivelgG-binding domains,Eur J Biochem. 1986,156,637-643的圖1中。將該文獻(xiàn)通過這種參照的方式包含在公開內(nèi)容中。此外，由與上述文獻(xiàn)中記載的各結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列具有70%以上(優(yōu)選90%以上)同源性的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)也可以作為本發(fā)明中蛋白質(zhì)A的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域來使用。本實(shí)施方式中涉及的免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)可以具有多個(gè)相同或不同種類的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。例如，蛋白質(zhì)A的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以為(D結(jié)構(gòu)域-A結(jié)構(gòu)域)n(在此，η表示1以上的整數(shù)(優(yōu)選1 6)，D結(jié)構(gòu)域與A結(jié)構(gòu)域之間可以存在任意氨基酸序列)，也就是說，可以為含有包含A結(jié)構(gòu)域和D結(jié)構(gòu)域的重復(fù)單元的結(jié)構(gòu)域。此外，蛋白質(zhì)A的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是天然型的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或者，也可以是重組型的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在此，重組型的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域在免疫球蛋白結(jié)合活性方面可以作為與改變前的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域同等的結(jié)構(gòu)域來對(duì)待，例如，優(yōu)選與天然型蛋白質(zhì)A的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列保持70%以上(優(yōu)選90%以上)的同源性。作為具體例子，除了 Nilsson B.之外，還可以列舉蛋白質(zhì)工程(Protein engineering)，1987 年，第 1 卷，2 號(hào)，107-113 頁(yè)中記載的 Z 結(jié)構(gòu)域、Hober S 等人的美國(guó)專利申請(qǐng)2006/0194955A1中記載的具有耐堿性的Z結(jié)構(gòu)域的變異體(mutant)。 將上述文獻(xiàn)通過這種參照的方式包含在公開內(nèi)容中。此外，由與上述文獻(xiàn)中記載的各結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列具有70%以上(優(yōu)選90%以上)同源性的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)也可以作為本發(fā)明中蛋白質(zhì)A的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域來使用。1. 2. 1.2.蛋白質(zhì)1或2的制造作為用于制造本發(fā)明的蛋白質(zhì)1或2的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可以利用記載于例如， Frederick Μ· Ausbel 等人的 Current Protocols In Molecular Biology 或 Sambrook等人編輯的《分子克隆》(冷泉港出版社，第3版，2001)等中的公知的基因重組技術(shù)。例如，本發(fā)明的蛋白質(zhì)1或2可以使用美國(guó)專利第5151350號(hào)說明書中記載的基因重組技術(shù)來制造。 也就是說，通過將用含有編碼作為目標(biāo)的改變蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)1或幻的核酸序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌等宿主，并且用適當(dāng)?shù)囊后w培養(yǎng)基培養(yǎng)該細(xì)胞，可以從培養(yǎng)后的細(xì)胞中， 大量且經(jīng)濟(jì)地獲得本發(fā)明的蛋白質(zhì)1或2。作為優(yōu)選的表達(dá)載體，可以使用可在細(xì)菌內(nèi)復(fù)制的已知載體中的任意一種，可以列舉，例如，美國(guó)專利第5151350號(hào)說明書中記載的質(zhì)?；?Sambrook等人編輯的《分子克隆》(冷泉港出版社，第3版，2001)等中記載的質(zhì)粒。此外， 為了通過將核酸導(dǎo)入到細(xì)菌中來轉(zhuǎn)化細(xì)菌，可以使用本技術(shù)領(lǐng)域中已知的任意一種方法， 例如，可以利用Sambrook等人編輯的《分子克隆》(冷泉港出版社，第3版，2001)等中記載的公知方法。培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，回收表達(dá)的蛋白質(zhì)的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。也就是說，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中涉及的核酸對(duì)免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)1或2)或其等功能變異體進(jìn)行編碼。本發(fā)明中，免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)的所謂“等功能變異體(functional variant) ”是指，通過部分氨基酸的添加、刪除、取代、氨基酸殘基的化學(xué)修飾等而被改變的免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)，與改變前的免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)的氨基酸序列保持70%以上，優(yōu)選90%以上的同源性，而且在免疫球蛋白結(jié)合活性方面，可以作為與改變前的免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)同等的蛋白質(zhì)來對(duì)待。具體而言，由于蛋白質(zhì)A的1個(gè)免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域是由約60個(gè)氨基酸構(gòu)成的小蛋白質(zhì)，因此可以，例如將編碼所希望的氨基酸序列的DNA分割成數(shù)十個(gè)堿基構(gòu)成的合成寡核苷酸來進(jìn)行合成，通過由DNA連接酶進(jìn)行的連接反應(yīng)將它們連接起來插入質(zhì)粒中， 獲得作為目標(biāo)的表達(dá)載體。此時(shí)，以在大腸桿菌中有效表達(dá)該蛋白質(zhì)為目的，使用采用大腸桿菌的最適密碼子的核酸序列，是對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言一般進(jìn)行的方法。此外，如后述的本發(fā)明的實(shí)施例中所示，可以從金黃色葡萄球菌(Straphylococcus aureus)的基因組 DNA中，使用PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)，構(gòu)建編碼所希望的氨基酸序列的DNA序列。而且，如上所述，本發(fā)明的蛋白質(zhì)1或2可以是含有1個(gè)以上(優(yōu)選2 12個(gè)，更優(yōu)選2 5個(gè))的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。編碼這種蛋白質(zhì)的cDNA，可以通過串聯(lián)地連接規(guī)定個(gè)數(shù)的編碼1個(gè)免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的cDNA (互補(bǔ)DNA)來容易地制成。通過將這樣制成的cDNA插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)質(zhì)粒中來利用，可以容易地制造含有1個(gè)以上的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。例如，后述的實(shí)施例中所示的具有序列號(hào)1 8的氨基酸序列的蛋白質(zhì)、或由序列號(hào)1 8中缺失、取代或添加了 1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的且具有免疫球蛋白結(jié)合活性的蛋白質(zhì)，可以作為本發(fā)明的免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)來適當(dāng)使用。1.2. 1.3.作用效果使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)1或2作為配體的填充劑與親合層析中以往的填充劑相比， 免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)的保持量多，而且該蛋白質(zhì)的保持能力好。因此，由于能夠提高目標(biāo)蛋白質(zhì)的捕捉量，從而可以增大目標(biāo)蛋白質(zhì)(抗體)的結(jié)合容量。其結(jié)果是，能夠有效地以低成本大量地純化出純度高的目標(biāo)蛋白質(zhì)。2.實(shí)施例以下，列舉實(shí)施例，更具體地說明本實(shí)施方式中這種親合層析用填充劑。而且，以下記載是概括性表示本發(fā)明的方式，沒有特殊理由，這種記載不限定本發(fā)明。
2. 1.評(píng)價(jià)方法2. 1. 1.粒徑用激光衍射/散射粒度分布測(cè)定裝置(Beckman Coulter公司制造LS13320)，測(cè)定粒子的體積平均粒徑。2.1.2.比表面積、體積平均細(xì)孔徑、細(xì)孔徑眾數(shù)值使在后述的合成例4 8和比較合成例1中分別制備的親合層析用填充劑在 40°C下真空干燥M小時(shí)而獲得干燥粒子，用水銀孔隙率計(jì)(島津制作所社制造AutoPore IV9520)求出干燥粒子的比表面積、體積平均細(xì)孔徑、和細(xì)孔徑眾數(shù)值。測(cè)定范圍在細(xì)孔徑范圍下規(guī)定為10 5000nm。2. 1. 3.結(jié)合容量2. 1.3. 1.測(cè)定法 1使用GEHealthcare Bioscience公司制造的AKTAprime plus，測(cè)定線流速 150cm/ hr和500cm/hr、1000cm/hr下人IgG抗體的結(jié)合容量。柱容量為lmL，人IgG抗體(Lampire Biological Laboratories公司制)采用用25mM檸檬酸緩沖液(pH6. 0)稀釋成lmg/mL的制品，用吸光度監(jiān)控器，根據(jù)洗脫前端濃度突破(breakthrough) 5W/v%時(shí)的人IgG抗體吸附量和填充劑體積，求出結(jié)合容量。2. 1.3. 2.測(cè)定法 2用內(nèi)徑 0. 5cm、高度 5cm 的柱，采用 GE Healthcare Bioscience 公司制 AKTAprime plus，測(cè)定線流速300cm/hr下人IgG抗體的結(jié)合容量。人IgG抗體(Lampire Biological Laboratories公司制)采用用25mM檸檬酸緩沖液(pH6. 0)稀釋到lmg/mL的制品，用吸光度監(jiān)控器，根據(jù)洗脫前端濃度突破10w/V%時(shí)的人IgG抗體吸附量和填充劑體積，求出結(jié)合容量。2.2.實(shí)驗(yàn)例2.2. 1.合成例1(免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)的制備)通過后述的制備例1 4，制備具有圖1和圖2所示的氨基酸序列的免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)(SPAK(序列號(hào)1)、SPAC (序列號(hào)2)、SPAKK (序列號(hào)3)、SPATK (序列號(hào)4)、 SPA2K (序列號(hào) 5)、SPA3K (序列號(hào) 6)、SPA-His-C (序列號(hào) 7)、SPA-His-N (序列號(hào) 8))。而且，圖1和圖2中，R和R2與上述通式⑴或上述通式(2)中的R和R2對(duì)應(yīng)(R1、 R2和r對(duì)應(yīng)于上述通式(2)或上述通式中的R1、R2和r)，r中的下劃線表示TEV結(jié)構(gòu)域(TEV蛋白酶(肽鍵水解合成酶)切斷部位)，R2中的下劃線表示域間連接子或C末端連接子(結(jié)構(gòu)域t)，參照表2)。通過MALDI-T0F質(zhì)譜分析，確認(rèn)了這些蛋白質(zhì)各個(gè)氨基酸序列一致，具有圖1和圖 2所示的氨基酸序列。2. 2. 1. 1.制備例1 (PCR擴(kuò)增和限制性內(nèi)切酶的消化)通過PCR來擴(kuò)增金黃色葡萄球菌(Straphylococcus aureus,ATCC, 10832)來源的蛋白質(zhì)A(D結(jié)構(gòu)域+A結(jié)構(gòu)域)的cDNA。為了輔助后述的亞克隆，引物(參照表2)被設(shè)計(jì)成具有對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶部位。如表1 所示，分別編碼 SPAK、SPAC、SPA2K、SPA3K、SPAKK、和 SPATK 的 DNA 片段由限制性內(nèi)切酶NcoI和Hindi 11 (New-England BioLab制)所消化，并被插入到載體pETM-ll(參照?qǐng)D 3，以饋贈(zèng)形式從D. Shibly,EMBL Heidelberg，Heidelberg，Germany 獲得) 中。而且，如表1所示，編碼SPA-His-N的DNA片段由限制性內(nèi)切酶NcoI和HindIII 所消化，并被插入到載體pETM-10(參照?qǐng)D3，以饋贈(zèng)形式從D. Shibly, EMBL Heidelberg, Heidelberg, Germany 獲得)中。并且，如表1所示，為了形成在C末端上具有組氨酸標(biāo)簽(由組氨酸6殘基構(gòu)成的肽)的免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)的SPA-His-C，使用載體pET29(參照?qǐng)D3，Novagen公司制造)?？梢詫?duì)載體pED9使用的限制性內(nèi)切酶是NdeI (New-England Bio Lab制造)和 XhoI (New-England Bio Lab 制造)。而且，圖3中所示的3種表達(dá)載體全都含有卡那霉素抗性基因作為選擇性標(biāo)記。此外，圖3所示的免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)的氨基酸序列中，“Tev”表示TEV蛋白酶識(shí)別部位(氨基酸序列ENLYFQG)。TEV蛋白酶識(shí)別氨基酸序列ENLYFQG，將Q與G之間切斷。通過設(shè)計(jì)基于SPAK插入序列的1對(duì)引物，而導(dǎo)入上述限制性內(nèi)切酶。此外，使用表2所示的引物(序列號(hào)9 17)來進(jìn)行PCR擴(kuò)增。而且，SPA-His-N的DNA片段還可以通過用限制性內(nèi)切酶(表1)消化含有SPAK的質(zhì)粒來直接獲得。本合成例中，SPA-His-N的DNA片段通過用限制性內(nèi)切酶(表1)消化含有SPAK的質(zhì)粒來直接獲得。[表1]
權(quán)利要求
1.親合層析用填充劑，其是含有包含交聯(lián)性乙烯基單體和含環(huán)氧基的乙烯基單體的單體混合物的共聚物的多孔性母粒子，配體與所述多孔性母粒子結(jié)合，所述多孔性母粒子具有通過使該多孔性母粒子所含的環(huán)氧基開環(huán)而獲得的開環(huán)環(huán)氧基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的親合層析用填充劑，其含有取代或非取代的2，3-二羥基丙基作為所述開環(huán)環(huán)氧基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的親合層析用填充劑，所述配體是含有蛋白質(zhì)A的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的親合層析用填充劑，所述蛋白質(zhì)A的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域是選自A結(jié)構(gòu)域、B結(jié)構(gòu)域、C結(jié)構(gòu)域、D結(jié)構(gòu)域、E結(jié)構(gòu)域、和Z結(jié)構(gòu)域中的至少1種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的親合層析用填充劑，所述配體是下述通式(1) 表示的免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)R-R2.....(1)式中，R表示含有4 20個(gè)組氨酸連續(xù)的部位的由4 300個(gè)氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列、R2表示至少含有1個(gè)蛋白質(zhì)A的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的由50 500個(gè)氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列，在此，R2與R結(jié)合的末端是免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的末端。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的親合層析用填充劑，上述通式⑴中，R-是下述通式(2)表示的基團(tuán)R1T-.....(2)式中，R1表示含有4 20個(gè)組氨酸連續(xù)的部位的由4 100個(gè)氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列，在此，R1中，所述組氨酸連續(xù)的部位的末端與r結(jié)合、r表示含有TEV結(jié)構(gòu)域的由7 200個(gè)氨基酸構(gòu)成的任意的氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的親合層析用填充劑，所述配體是所述通式(1)中，R表示的氨基酸序列和R2表示的氨基酸序列中的至少一個(gè)含有結(jié)構(gòu)域t的配體，所述結(jié)構(gòu)域t包含選自賴氨酸、精氨酸和半胱氨酸中的1種氨基酸且由1 50個(gè)氨基酸構(gòu)成。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的親合層析用填充劑，所述配體是下述通式(3) 表示的免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)R2-R.....(3)式中，R表示含有4 20個(gè)組氨酸連續(xù)的部位的由4 300個(gè)氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列，R2表示至少含有1個(gè)蛋白質(zhì)A的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的由50 500個(gè)氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列，在此，R2與R結(jié)合的末端是免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的末端。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的親合層析用填充劑，所述通式(3)中，-R是下述通式(4)表示的基團(tuán)-r-R1.....(4)式中，R1表示含有4 20個(gè)組氨酸連續(xù)的部位的由4 100個(gè)氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列，在此，R1中，所述組氨酸連續(xù)的部位的末端與r結(jié)合、r表示含有TEV結(jié)構(gòu)域的由7 200個(gè)氨基酸構(gòu)成的任意的氨基酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的親合層析用填充劑，所述配體是所述通式(3)中，R表示的氨基酸序列和R2表示的氨基酸序列中的至少一個(gè)含有結(jié)構(gòu)域t的配體，所述結(jié)構(gòu)域t 包含選自賴氨酸、精氨酸和半胱氨酸中的1種氨基酸且由1 50個(gè)氨基酸構(gòu)成。
全文摘要
親合層析用填充劑是含有包含交聯(lián)性乙烯基單體和含環(huán)氧基的乙烯基單體的單體混合物的共聚物的多孔性母粒子，配體結(jié)合在所述多孔性母粒子上，所述多孔性母粒子具有使該多孔性母粒子所含的環(huán)氧基開環(huán)而得到的開環(huán)環(huán)氧基。
文檔編號(hào)C07K14/31GK102165312SQ200980137428
公開日2011年8月24日 申請(qǐng)日期2009年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月25日
發(fā)明者岡野友亮, 安陪毅由, 宮路正昭, 河合孝廣, 王勇, 田守功二, 福田哲夫, 籾山昌輝 申請(qǐng)人:Jsr株式會(huì)社