一種純化百日咳桿菌Prn蛋白的免疫親和層析柱及蛋白純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種純化百日咳桿菌Prn蛋白的免疫親和層析柱及蛋白純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]百日咳是一種由百日咳桿菌感染引起的急性呼吸道傳染病，主要感染6歲以下的嬰幼兒。對于該病的預(yù)防最經(jīng)濟(jì)有效的方法為注射疫苗。1914年全細(xì)胞百日咳疫苗研制成功，在控制和預(yù)防百日咳發(fā)病方面發(fā)揮的巨大作用，但該疫苗副反應(yīng)比較大，被一些發(fā)達(dá)國家抵制。80年代，日本發(fā)明了無細(xì)胞百日咳疫苗，其去除了引起副反應(yīng)的毒性物質(zhì)，保留了起免疫保護(hù)作用的抗原性，推動了疫苗學(xué)的進(jìn)展。
[0003]無細(xì)胞百日咳疫苗的主要有效成分為百日咳毒素(PT)、絲狀血凝素(FHA)、粘附素(Pm)、凝集原(AGG)等。在我國疫苗中的成分主要是PT、FHA。
[0004]Prn是一種非纖毛性的凝集原，具有較強(qiáng)的免疫原性，在歐美和我國的部分企業(yè)已將其作為百日咳疫苗的重要組分。Prn蛋白產(chǎn)量小，對于它的純化有很多方法。有的利用Aff1-gel blue吸附，用高鹽洗脫，透析后經(jīng)層析聚焦。該方法為非特異性吸附，雜蛋白較多，且引入較多鹽類?，F(xiàn)在大部分企業(yè)對于該蛋白先利用硫酸銨多步沉淀，來濃縮目的蛋白，再利用層析柱過濾，用高鹽洗脫。該方法步驟繁瑣，耗時較多，非特異性吸附，引入雜蛋白污染。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本方法針對現(xiàn)有技術(shù)在純化Prn蛋白中存在的缺點，提供一種純化百日咳桿菌Prn蛋白的免疫親和層析柱及蛋白純化方法，是以Prn蛋白作為抗原，免疫兔制備多克隆抗體，通過實驗優(yōu)化，利用多抗制備了純化Prn蛋白的親和免疫層析柱，該免疫層析柱可以特異性純化Prn蛋白，且引入雜質(zhì)少，為Prn蛋白的純化提供了新方法。
[0006]根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，一種純化百日咳桿菌Prn蛋白的多克隆抗體，是由百日咳桿菌Prn蛋白經(jīng)免疫動物后采血，分離抗血清后純化制得。
[0007]所述的動物是兔。
[0008]根據(jù)本發(fā)明的第二個方面，一種純化百日咳桿菌Prn蛋白的免疫親和層析柱，是由固相載體和與其偶聯(lián)的純化百日咳桿菌Prn蛋白的多克隆抗體組成。
[0009]所述固相載體為纖維素、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、多孔玻璃、瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺-瓊脂糖凝膠。
[0010]所述的載體為CNBr活化的Sepharose 4B。
[0011]根據(jù)本發(fā)明的第三個方面，純化百日咳桿菌Prn蛋白的免疫親和層析柱的制備方法，包括如下步驟:
第I步、Prn蛋白免疫動物后采血，分離抗血清后純化制得多克隆抗體；
第2步、將載體活化，與多克隆抗體進(jìn)行偶聯(lián)，得到免疫親和層析柱。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的第四個方面，一種純化百日咳桿菌Prn蛋白的純化方法，包括如下步驟:
第I步、將百日咳菌株的培養(yǎng)上清液除去FHA與PT蛋白，再送入超濾膜中進(jìn)行濃縮，再將濃縮液離心，收集上清液；
第2步、將上清液送入所述的純化百日咳桿菌Prn蛋白的免疫親和層析柱中，進(jìn)行上樣；
第3步、上樣結(jié)束后，再用洗脫液進(jìn)行洗脫，得到純化蛋白。
[0013]所述的第I步中，超濾膜的截留分子量是30kD ;在進(jìn)行離心之前，需要用50mMTris-HCl、pH=7.5溶液進(jìn)行復(fù)溶處理。
[0014]所述的第2步中，在將上清液上樣前，需要先平衡層析柱，所用的平衡液為50mMTri s-HCl、ρΗ=7.5 的溶液。
[0015]所述的第2步中，上清液的體積是柱體積的4倍。
[0016]所述的第3步中，洗脫過程是先用5倍柱體積的50mM Tris-HCl、pH為7.5的溶液洗脫雜蛋白，再用50mM Tris-HCl、pH為3.5緩沖液，洗脫Prn蛋白。
[0017]發(fā)明效果:一、本發(fā)明應(yīng)用多抗制備的免疫親和層析柱可以高效純化Prn蛋白；二、應(yīng)用多抗制備的免疫親和層析柱純化Prn蛋白，可以縮短操作時間，降低純化成本，減少引入雜質(zhì)的污染，純化蛋白更純。
【附圖說明】
[0018]圖1、成年兔免疫Prn蛋白血清抗體檢測效價與血清稀釋倍數(shù)關(guān)系圖；
圖2、純化后的多克隆抗體SDS-PAGE電泳圖；其中，I泳道為樣品，2泳道是marker ；
圖3、對上清中Prn蛋白純化過程中不同樣品的SDS-PAGE電泳圖；其中，I泳道為上樣前樣品，2泳道是過柱流出液，3泳道是洗脫液，4泳道是標(biāo)準(zhǔn)Prn蛋白。
【具體實施方式】
[0019]下面通過【具體實施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。但本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0020]實施例1多克隆抗體制備
1、免疫兔子
取生產(chǎn)車間制備的Prn蛋白，測蛋白質(zhì)含量，與佐劑按1:1 (V/V)混合，在振蕩器上震蕩一個小時，后超聲(功率為350W，工作時間2s，間歇時間10s，溫度設(shè)置在25°C)乳化，超聲至乳化完全，將乳化好的免疫原滴一滴在預(yù)冷的水中，30分鐘不擴(kuò)散為乳化完全。選擇SPF成年兔作為免疫動物。每次免疫前耳緣靜脈采血。兩次免疫間隔為2周。第一次用弗氏完全佐劑，蛋白劑量為75 μ g/只，總劑量100 μ I/只，于兔脊柱兩旁選4?6點皮下注射；第二次用弗氏不完全佐劑，同第一次免疫抗原劑量與方法；第三次免疫方法同第二次免疫；加強(qiáng)免疫，方法如第二次免疫方法。
[0021]2、免疫兔血清抗體測定將每次免疫前采集的兔血清，用間接ELISA方法檢測血清效價，同時設(shè)陰性對照，間接ELISA程序如下:
包被:用PH值7.2的PBS稀釋Prn蛋白，使其濃度為4 μ g/mL，100 μ I/孔加入到酶標(biāo)板中，4°C孵育過夜后PBS’T洗5次，甩干板上殘余液體。封閉:每孔加入200 μ I封閉液，室溫孵育lh，用同樣方法洗板。一抗:每孔加入100 μ I稀釋好的待檢兔血清(稀釋度為I: 12,1:1O3,1:1O4和1:10 5四個稀釋度)，室溫孵育Ih,用同樣方法洗板。二抗:每孔加入100 μ IHRP標(biāo)記的羊抗兔IgG (1:4000)，室溫孵育lh，用同樣方法洗板。底物顯色:將新配好的TMB以100 μ I/孔加入到ELISA板中，室溫條件下孵育15min。終止:每孔加入50 μ I 3ΜH2