SO4,輕輕振蕩，用酶標(biāo)儀在OD45 J寸讀數(shù)。
[0022]用EXCEL數(shù)據(jù)整理并分析數(shù)據(jù)。如圖1，兔三免后血清稀釋倍數(shù)達(dá)到105，滿足多克隆抗制備所需。
[0023]3、抗Prn蛋白多克隆抗體的制備及純化
加強(qiáng)免疫后第四天，取全血，獲得血清，將血清緩慢加入等量飽和硫酸銨(邊加邊攪拌)中，4°C攪拌2小時，12000rpm 1min離心，棄上清，PBS重懸，將PBS重懸的粗提IgG加入處理好的透析袋中，透析過夜(4°C )。
[0024]透析完的蛋白樣品離心lOOOrpm，5min，上清再用0.45 μητ^?!器過濾。利用ProteinG Resin (寶生物工程(大連)有限公司)對多抗進(jìn)行進(jìn)一步純化。先將Protein G Resin中的四蒸水流盡，加入適量PBS使柱子內(nèi)流出液0D280吸光值接近O ;加入樣品(反復(fù)5次)，加PBS洗脫雜蛋白至流出液0D280值接近0，用buffer B洗脫目的IgG，將流出液用Tris-HCl調(diào)pH至7?8，0D值小于0.3的流出液棄去。如圖2為純化后多克隆的SDS-PAGE電泳圖。
[0025]實(shí)施例2純化Prn蛋白的免疫親和層析柱的制備及操作方法 1、多克隆抗體與Sepharose 4B凝膠偶聯(lián)
離心獲得5ml Sepharose 4B (GE)干膠，用5g CNBr活化，活化完畢，分別用25ml的注射用水、5ml的丙酮各洗一遍、然后用25ml碳酸氫鈉溶液(0.2M、pH8.9)洗五遍，備用。
[0026]將純化獲得的多克隆抗體透析于碳酸氫鈉溶液(0.2M、pH8.9)中，測濃度，1mg與活化的凝膠混合偶聯(lián)，4°C孵育過夜。偶聯(lián)液2000rpm離心5分鐘取沉淀，收集上清計算偶聯(lián)率，偶聯(lián)率為92%。用20ml碳酸氫鈉溶液(0.2M、pH8.9)重懸沉淀，依次用20ml碳酸氫鈉溶液(0.2M、pH8.9)、碳酸氫鈉-氯化鈉混合液(0.2M碳酸氫鈉、0.5M氯化鈉，pH8.9)、碳酸氫鈉溶液(0.2M、pH8.9)洗一遍。用乙醇胺(50mM、pH7.5)溶液4°C封閉4小時。用PBS洗三遍裝柱備用。
[0027]2、分離純化PRN蛋白的方法
(I)樣品前處理
使用的菌株為百日咳CS株，樣品菌液菌濃度為300X 18個/ml以上，血凝活性達(dá)到1:128以上。
[0028]收集細(xì)菌培養(yǎng)上清經(jīng)純化FHA與PT蛋白后的流出液，用切向流系統(tǒng)(Quixstand中空纖維膜分離系統(tǒng)，GE)，裝30KD中空纖維柱(UFP-30-E-4X2MA，GE)過濾濃縮，至原來體積的十分之一，用50mM Tris-HCl, pH=7.5復(fù)溶，1000rpm離心10分鐘，收集上清。
[0029](2) Prn蛋白的純化
將4°C保存的免疫親和層析柱取出，用10倍體積50mM Tris-HCl，pH=7.5平衡層析柱。將待純化的4倍柱體積樣品加入柱子中(lml/min)，加樣完畢用5倍體積50mM Tris-HCl,pH=7.5，洗脫雜蛋白(2ml/min)，用50mM Tris-HCl，pH=3.5緩沖液，洗脫蛋白，迅速調(diào)pH值至7.5。用SDS-PAGE進(jìn)行分析。層析柱使用完畢用10倍體積PBS平衡層析柱，保存于4°C下次可重復(fù)使用。
[0030]如圖3，條帶I為上樣前的樣品，條帶2為洗脫的雜蛋白，條帶3為洗脫的目的蛋白，條帶4為標(biāo)準(zhǔn)Prn蛋白，可以看出蛋白純化效果較好，蛋白純度95%以上，回收率在90%以上。
【主權(quán)項】
1.一種純化百日咳桿菌Prn蛋白的多克隆抗體，其特征在于，是由百日咳桿菌Prn蛋白經(jīng)免疫動物后采血，分離抗血清后純化制得。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化百日咳桿菌Prn蛋白的多克隆抗體，其特征在于:所述的動物是兔。3.—種純化百日咳桿菌Prn蛋白的免疫親和層析柱，其特征在于:是由固相載體和與其偶聯(lián)的權(quán)利要求1所述的純化百日咳桿菌Prn蛋白的多克隆抗體組成。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的純化百日咳桿菌Prn蛋白的免疫親和層析柱，其特征在于:所述固相載體為纖維素、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、多孔玻璃、瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺-瓊脂糖凝膠。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的純化百日咳桿菌Prn蛋白的免疫親和層析柱，其特征在于:所述固相載體為CNBr活化的Sepharose 4B。6.權(quán)利要求3所述的純化百日咳桿菌Prn蛋白的免疫親和層析柱的制備方法，其特征在于:包括如下步驟:第I步、Prn蛋白免疫動物后采血，分離抗血清后純化制得多克隆抗體；第2步、將載體活化，與多克隆抗體進(jìn)行偶聯(lián)，得到免疫親和層析柱。7.一種純化百日咳桿菌Prn蛋白的純化方法，其特征在于:包括如下步驟: 第I步、將百日咳菌株的培養(yǎng)上清液除去FHA與PT蛋白，再送入超濾膜中進(jìn)行濃縮，再將濃縮液離心，收集上清液； 第2步、將上清液送入權(quán)利要求3所述的純化百日咳桿菌Prn蛋白的免疫親和層析柱中，進(jìn)行上樣； 第3步、上樣結(jié)束后，再用洗脫液進(jìn)行洗脫，得到純化蛋白。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的純化百日咳桿菌Prn蛋白的純化方法，其特征在于:所述的第I步中，超濾膜的截留分子量是30kD ;在進(jìn)行離心之前，需要用50mM Tris-HCl, pH=7.5溶液進(jìn)行復(fù)溶處理。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的純化百日咳桿菌Prn蛋白的純化方法，其特征在于:所述的第2步中，在將上清液上樣前，需要先平衡層析柱，所用的平衡液為50mM Tris-HCl、pH=7.5的溶液；上清液的體積是柱體積的4倍。10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的純化百日咳桿菌Prn蛋白的純化方法，其特征在于:所述的第3步中，洗脫過程是先用5倍柱體積的50mM Tris-HCl, pH為7.5的溶液洗脫雜蛋白，再用50mM Tris-HCl、pH為3.5緩沖液，洗脫P(yáng)rn蛋白。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種純化百日咳桿菌Prn蛋白的免疫親和層析柱及蛋白純化方法。是以Prn蛋白作為抗原，免疫兔制備多克隆抗體，通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，利用多抗制備了純化Prn蛋白的親和免疫層析柱，該免疫層析柱可以特異性純化Prn蛋白，且引入雜質(zhì)少，為Prn蛋白的純化提供了新方法。
【IPC分類】C07K1/22, C07K16/12, C07K1/34, C07K1/36
【公開號】CN105131110
【申請?zhí)枴緾N201510473326
【發(fā)明人】王雪云, 胡守彬, 陶亮, 梁海巖, 董文娟, 李良
【申請人】山東亦度生物技術(shù)有限公司
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年8月5日