的偶聯(lián)物及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及脂溶性維生素的偶聯(lián)物及其制備方法與應(yīng)用，尤其涉及維生素D3的 偶聯(lián)物及其制備方法與應(yīng)用。屬于維生素免疫檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 本發(fā)明涉及的下列名稱(chēng)適用于整個(gè)說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)： BSA :牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin), Sigma 公司產(chǎn)品 PBS:磷酸鹽緩沖液（PhosphateBufferedSaline) (0.01M,pH= 7.40) cBSA:經(jīng)乙二胺修飾的牛血清蛋白 透析膜：美國(guó)聯(lián)合炭化（United Carbide)公司產(chǎn)品 維生素D3:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)檢所 CDI :N，N'_羰基二咪唑，Sigma公司產(chǎn)品 DMAP: 4-二甲氨基P比啶，Sigma公司產(chǎn)品 維生素D是一種脂溶性類(lèi)固醇激素前體，主要由皮膚經(jīng)光照后產(chǎn)生。維生素D本身無(wú) 生物活性，必須在肝臟和腎臟相繼接收2次羥基化才能生成具有生物活性的1，25-羥基維 生素D。維生素D的兩種重要形式包括維生素D 3 (膽鈣化醇）和維生素D2 (麥角鈣化醇)。 維生素D3 (膽鈣化醇）主要是由人體自身合成的，人體的皮膚含有一種膽固醇，經(jīng)陽(yáng)光照射 后，就變成了維生素D3。所以，如果孩子能充分接受陽(yáng)光直射皮膚4-6小時(shí)以上的話(huà)，自身 合成的維生素D 3，就基本上能滿(mǎn)足。但是紫外線(xiàn)照射帶來(lái)的皮膚癌上升、空氣的污染、各地 天氣變化等問(wèn)題的影響下，各國(guó)人群接受日照的時(shí)間都在減少，并且很多國(guó)家明確規(guī)定要 限制接受日照的時(shí)間，因此全世界范圍內(nèi)維生素D均呈現(xiàn)廣泛缺乏的現(xiàn)象。
[0003] 中國(guó)營(yíng)養(yǎng)協(xié)會(huì)建議中國(guó)兒童和成人的可耐受最高攝入量為800IU/d。但從國(guó) 際對(duì)D 3的應(yīng)用看來(lái)，大部分國(guó)家在日照較少的季節(jié)，對(duì)嬰幼兒的日攝入量已經(jīng)提高到 800-1000IU/d，而孕婦和普通成人如果檢測(cè)為維生素D3缺乏，在開(kāi)始1-2個(gè)月，日攝入量會(huì) 要求提高到2000 IU/d甚至更多。通過(guò)膳食來(lái)源的維生素D3-般不會(huì)引起中毒，也就是說(shuō) 天然的維生素D3，和食品級(jí)的天然維生素D 3補(bǔ)充劑一般不會(huì)引起中毒。而大劑量的化學(xué)維 生素D3和強(qiáng)化維生素D 3的奶制品有發(fā)生維生素D 3過(guò)量和中毒的可能。因此，檢測(cè)營(yíng)養(yǎng)強(qiáng) 化食品中維生素D3的含量非常有必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]在脂溶性維生素含量檢測(cè)中，儀器法如液相色譜法和質(zhì)譜等是應(yīng)用最廣泛的方 法。雖然這些方法準(zhǔn)確，穩(wěn)定，可靠，但是由于儀器法價(jià)格昂貴，費(fèi)事較長(zhǎng)，且造成有機(jī)溶劑 污染，需要大型儀器設(shè)備，需要專(zhuān)門(mén)的技術(shù)人員，所以難于應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)操作。酶聯(lián)免疫檢測(cè) 法（ELISA)提供了一種極好的檢測(cè)手段。該方法具有快速，準(zhǔn)確，簡(jiǎn)易，不需要專(zhuān)人操作等 優(yōu)點(diǎn)，這使得ELISA法成為一種理想的檢測(cè)手段。酶聯(lián)免疫檢測(cè)法的核心是需要高質(zhì)量的 抗體。維生素D3是一種小分子有機(jī)化合物，不具有免疫原性，稱(chēng)之半抗原。所以，必須把微 生物D3轉(zhuǎn)化為能引發(fā)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的免疫原(又稱(chēng)之為完全抗原)。經(jīng)檢索，世界 上尚未有關(guān)于維生素D3的免疫原合成及抗體制備過(guò)程的報(bào)道，而且維生素D3的ELISA試 劑盒大都購(gòu)于國(guó)外，保存期短，價(jià)格高，遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足檢測(cè)需要，因此研究維生素D3的免疫原 的合成及抗體制備顯得格外重要。
【具體實(shí)施方式】
[0005] 實(shí)施例1 (1)溶液A的制備：在50mL圓形反應(yīng)瓶?jī)?nèi)，攪拌中（120轉(zhuǎn)/分鐘)，加入維生素D3 19. 20 11^(0.0501111]1〇1)，11^'-幾基二咪挫（〇01)16.2 11^以及4-二甲氨基[1比啶（0獻(xiàn)?）0.6 11^ 溶于2mL二甲基甲酰胺（DMF)中，反應(yīng)4小時(shí)生成維生素D3與⑶I的活性中間體。
[0006] (2)溶液 B 的制備：在 25°C下，取 cBSA171mg (0? 0025mmol)溶于 15mL PBS (pH = 7. 4，0. 01M)中。在磁力攪拌下（120轉(zhuǎn)/分鐘）將A液逐滴加入B液中，反應(yīng)6小時(shí)得溶 液B0
[0007] (3)制備維生素D3免疫原：將溶液B用PBS(pH= 7. 40，0. 01M)，透析，每8小時(shí) 更換一次透析液，連續(xù)透3天。然后，用蒸餾水透3天，每8小時(shí)更換一次透析液。收集透 析液凍干，得到150mg白色固體粉末。通過(guò)紫外吸收光譜(吸收值)確定產(chǎn)物偶聯(lián)情況。本 發(fā)明的維生素D3的免疫原在274nm處有特征紫外吸收峰。
[0008] 實(shí)施例2 (1)溶液A的制備：在50mL圓形反應(yīng)瓶?jī)?nèi)，攪拌中（120轉(zhuǎn)/分鐘)，加入維生素D3 19. 20 11^(0.0501111]1〇1)，11^'-幾基二咪挫（〇01)16.2 11^以及4-二甲氨基[1比啶（0獻(xiàn)?）0.6 11^ 溶于2mL二甲基甲酰胺（DMF)中，反應(yīng)6小時(shí)生成維生素D3與⑶I的活性中間體。
[0009] (2)溶液 B的制備：在 28°C下，取 cBSA225. 72mg(0? 0033mmol)溶于 15mL PBS(pH =7. 4，0. 01M)中。在磁力攪拌下（120轉(zhuǎn)/分鐘）將A液逐滴加入B液中，反應(yīng)6小時(shí)得 溶液B。
[0010] (3)制備維生素D3免疫原：將溶液B用PBS(pH= 7. 40，0. 01M)，透析，每8小時(shí) 更換一次透析液，連續(xù)透3天。然后，用蒸餾水透3天，每8小時(shí)更換一次透析液。收集透 析液凍干，得到165mg白色固體粉末。通過(guò)紫外吸收光譜(吸收值)確定產(chǎn)物偶聯(lián)情況。本 發(fā)明的維生素D3的免疫原在274nm處有特征紫外吸收峰。
[0011] 實(shí)施例3 (1)溶液A的制備：在50mL圓形反應(yīng)瓶?jī)?nèi)，攪拌中（120轉(zhuǎn)/分鐘)，加入維生素D3 19. 20 11^(0.0501111]1〇1)，11^'-幾基二咪挫（〇01)16.2 11^以及4-二甲氨基[1比啶（0獻(xiàn)?）0.6 11^ 溶于2mL二甲基甲酰胺（DMF)中，反應(yīng)8小時(shí)生成維生素D3與⑶I的活性中間體。
[0012] (2)溶液 B 的制備：在 30°C下，取 cBSA114. OOmg (0? 0017mmol)溶于 15mL PBS(pH =7. 4，0. 01M)中。在磁力攪拌下（120轉(zhuǎn)/分鐘）將A液逐滴加入B液中，反應(yīng)6小時(shí)得 溶液B。
[0013] (3)制備維生素D3免疫原：將溶液B用PBS(pH= 7. 40，0. 01M)，透析，每8小時(shí) 更換一次透析液，連續(xù)透3天。然后，用蒸餾水透3天，每8小時(shí)更換一次透析液。收集透 析液凍干，得到135mg白色固體粉末。通過(guò)紫外吸收光譜(吸收值)確定產(chǎn)物偶聯(lián)情況。本 發(fā)明的維生素D3的免疫原在274nm處有特征紫外吸收峰。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種維生素D3的偶聯(lián)物，由維生素D3半抗原與產(chǎn)生免疫原性的載體蛋白偶聯(lián)構(gòu)成， 所述載體蛋白物質(zhì)為優(yōu)選蛋白。2. 如權(quán)利要求1所述的維生素D3的偶聯(lián)物，其中所述的蛋白質(zhì)是牛血清蛋白。3. 如權(quán)利要求2所述的維生素D3的偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)通式為（I);(I) 其中m:為與一個(gè)牛血清蛋白結(jié)合的分子數(shù)，n為整數(shù)1~20 BSA為牛血清蛋白（BovineSerumAlbumin),分子量范圍是 6. 6KDa~6.9KDa 上述偶聯(lián)物顯示出如下物化特征： 外觀：白色粉末固體 紫外吸收光譜：265nm。4. 如權(quán)利要求3所述的維生素D3的偶聯(lián)物，其特征是：所述n優(yōu)選為整數(shù)10~20,分子 量范圍是 6. 7KDa~6. 8KDa。5. 權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的維生素D3的偶聯(lián)制備方法，其特征是，將維生素D3與 產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)連接起來(lái)，結(jié)合為具有誘發(fā)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的偶聯(lián)物，并 保持該偶聯(lián)物的生物活性不變。6. 如權(quán)利要求5所述維生素D3的偶聯(lián)物的制備方法，該方法步驟如下： 溶液A的制備：將維生素D3，N，N'_羰基二咪唑（⑶I)以及4-二甲氨基吡啶（DMAP)，以 摩爾比為I:2 :0. 1的比例溶于ImL二甲基甲酰胺（DMF)中，反應(yīng)生成維生素D3與⑶I的 活性中間體，備用； cBSA的制備：在冰浴條件下，先將乙二胺溶于pH為7. 38~7. 56,濃度為0. 01M~0. 02M磷酸緩沖液中，用濃鹽酸調(diào)pH為7. 38~7. 56 ;以乙二胺：BSA:EDC的摩爾比為15~25: 1: 15~25的量稱(chēng)取BSA和EDC，然后加入乙二胺溶液中，在20°C± 5°C條件下攪拌反應(yīng)2~4 小時(shí)；將乙二胺與BSA的反應(yīng)溶液在(TC~4°C條件下，用上述磷酸鹽緩沖液攪拌透析70~80 小時(shí)，然后用蒸餾水透析20~30小時(shí)，每隔6小時(shí)換一次液； 最后，收集凍干，得到白色固體粉末； 溶液B的配制：把cBSA溶于pH為7. 38~7. 56,濃度為0. 01M-0. 02M的磷酸鹽緩沖液中， 配成10. 0 ± 5.Omg/mL的溶液，備用； 按維生素〇3與(^5六的摩爾比為20~35:1量分別取溶液A和溶液B，在20°C± 5°C條 件下，把溶液A逐滴加入到不斷攪拌狀態(tài)下的溶液B中，反應(yīng)6~8小時(shí)，得到溶液C; 溶液C用磷酸鹽緩沖液攪拌透析70~80小時(shí)，然后用蒸餾水透析20~30小時(shí)，每隔6小 時(shí)更換一次透析液； 收集凍干，得到白色固體物質(zhì)。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種通式（I）的維生素D3的偶聯(lián)物，由維生素D3半抗原與產(chǎn)生抗原性的載體物質(zhì)優(yōu)選牛血清蛋白偶聯(lián)構(gòu)成，其中n為與一個(gè)牛血清蛋白分子結(jié)合的維生素D3的分子數(shù)，n為整數(shù)1~20，BSA為牛血清蛋白，分子量范圍是6.6KDa~6.9KDa。本發(fā)明還公開(kāi)了所述的偶聯(lián)物制備方法，即將維生素D3與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)連接起來(lái)，結(jié)合為具有誘發(fā)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的偶聯(lián)物。本發(fā)明具有特異性好、準(zhǔn)確度高，快速簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，為用所述偶聯(lián)物制備維生素D3的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑提供了基礎(chǔ)。
【IPC分類(lèi)】C07K14/765, C07K16/44, C07K1/107
【公開(kāi)號(hào)】CN105131108
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510521823
【發(fā)明人】郗日沫, 董亞慶, 尹永梅, 孟萌, 李小剛, 張麗沙, 王玉芬, 宋兆瑞, 龍浩, 許坤
【申請(qǐng)人】南開(kāi)大學(xué), 天津三箭生物技術(shù)有限公司, 李小剛
【公開(kāi)日】2015年12月9日
【申請(qǐng)日】2015年8月24日